CN110438185A - 一种提取林蛙卵中的多肽成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提取林蛙卵中多肽成分的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤1)将林蛙卵与球磨助剂混后置于冷冻高能球磨机球磨0.5‑3h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；步骤2)以乙醇为提取剂微波提取获得林蛙卵蛋白肽粗提物，减压除去溶剂中的醇；步骤3)加入蛋白酶进行酶解纯化，用NaOH溶液维持pH值在5.5‑7.0，沸水浴中加热灭酶，灭酶后的酶解液离心，将得到的沉淀经冷冻干燥得到高纯度的具有抗氧化活性的林蛙卵多肽组分；其中，所述的蛋白酶选自纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种或者多种，加酶量0.2‑1.0％。

Description

一种提取林蛙卵中的多肽成分的方法
技术领域
本发明属于生物活性肽制备领域，具体涉及一种机械化学辅助联合微波辅助提取林蛙卵中的多肽成分的制备方法。
背景技术
生物活性肽(bioactivity peptides)是指那些具有特殊生理功能的肽类，这些小肽不仅易于消化吸收，而且还具有多种人体代谢和生理调节功能，如促进免疫、抗坏血酸、抗菌、降血压、抗氧化等作用；国内外研究工作者已经从多种食物蛋白酶解液中分离出具有抗氧化性的肽片段，其中蛋白酶解法应用最多，由于酶的用量大、价格昂贵，限制了多肽的商业化大规模提取。
机械化学辅助提取技术是将机械力和化学反应相结合后应用到天然药物活性成分提取的一门新技术，罐内的球体由于其惯性作用对位于光滑的碾磨罐内额壁上的样品进行带有高能量的撞击，并以此粉碎样品。球磨罐的转动加上球磨球的运动对样品产生了高强度的混合作用；通过使用多个小球甚至可以进一步的提高混合的效果。球与球之间的摩擦撞击作用可以有效导致细胞的破碎。
DPPH是稳定的自由基。其乙醇溶液呈紫色，可见光区的最大吸收峰为515nm。当一种自由基清除剂添加到DPPH中时。溶液中，溶液的颜色变浅，515nm处的吸光度变小，吸光度的降低程度与除去自由基的程度呈线性关系。因此，它可用于检测自由基的清除，从而评估物质的抗氧化能力。其能力由清除率(SR)表示。清除率越大，抗氧化能力越强。
CN105296585A公开了一种林蛙卵多肽及其制备方法和应用，包括如下步骤：1)粉碎筛分，将13g脱脂干燥林蛙卵用手提式高速中药粉碎机粉碎，过60目筛；2)酶解，将步骤1)中制备的林蛙卵粉末加蒸馏水稀释2.5倍，加热至25℃并保持恒温，用lmol/L NaOH溶液或lmol/L HCl溶液调节体系pH值为6，按照酶活添加量10400U/g料加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶：木瓜蛋白酶的酶活比为1.13，底物浓度10％，酶解温度45℃，pH 7.70，反应时间为3.5h；3)灭酶，反应至3.5h后，用lmol/L NaOH溶液或lmol/L HCl溶液调节pH值为7.0，水浴终止反应，水浴温度为85℃，水浴时间8min；4)两次离心，合并沉淀，离心温度4℃、转速为8000r/min，时间为15min，首次离心后用蒸馏水洗涤沉淀进行二次离心；5)将沉淀冷冻干燥，制得林蛙卵多肽冻干粉，研磨为均匀粉末，制得所述林蛙卵多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种机械化学辅助联合微波辅助提取林蛙卵中的多肽成分制备方法，采用本工艺将机械化学用于辅助林蛙卵破壁和有效组分溶出，大大缩短了生产步骤；并且显著性提高产品提取率，工艺简单、操作方便、易于实现工业化生产。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种提取林蛙卵中多肽成分的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤1)将林蛙卵与球磨助剂混后置于冷冻高能球磨机球磨0.5～3h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂微波提取获得林蛙卵蛋白肽粗提物，减压除去溶剂中的醇；
步骤3)加入蛋白酶进行酶解纯化，用NaOH溶液维持pH值在5.5～7.0，沸水浴中加热灭酶，灭酶后的酶解液离心，将得到的沉淀经冷冻干燥得到高纯度的具有抗氧化活性的林蛙卵多肽组分；
其中，所述的蛋白酶选自纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种或者多种，加酶量0.2-1.0％。
通过以上实施，本发明获得了林蛙卵多肽蛋白质量含量达到70-91％。
在本发明一些实施方式中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活为10000U/g；酶解时间为60min，酶解过程通过加入提取剂水溶液维持pH值为7.0。
在本发明一些实施方式中，所述的球磨助剂选自氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠中的一种或者两种以上；优选地，所述的球磨助剂选自为氯化钠、氢氧化钠；更优选为氢氧化钠。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)的微波提取温度为20-80℃，优选为30-60℃。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)的提取溶剂乙醇体积浓度为40％～90％，优选60％～80％。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)的微波提取时间为20～100min，优选50-80min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)的微波提取料液比为1:10～1:30，优选1:15～1:30。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)的微波功率为300～800W，优选300～500W。
在本发明一些实施方式中，所述为含水率不大于1％的冻藏林蛙卵粉末，将冷藏的林蛙胎卵常温条件下解冻，而后置于高能冷冻球磨机中球磨，球磨转速100、200、300、400、500rpm，优选300-500rpm，提取溶剂的质量用量为林蛙卵的质量的10-60倍，优选30-40倍。
在本发明一些具体实施方式中，将含水率不大于1％的林蛙卵在常温条件下解冻，与研磨助剂混合，用高能冷冻球磨机进行球磨磨粉，球磨速度500rpm条件下球磨30-40min，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体，以乙醇为提取剂，适当料液比以及适当微波功率下处理适当时间后，加入蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定，沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，取沉淀冷冻干燥得到高纯度的林蛙卵抗氧化活性多肽组分。
较为具体的，推荐本发明所述方法更优选按照以下步骤进行：将含水率不大于1％的林蛙卵在常温条件下解冻，与研磨助剂混合，用高能冷冻球磨机进行球磨磨粉，球磨速度500rpm条件下球磨30-40min，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体，以乙醇为提取剂，适当料液比以及适当微波功率下处理适当时间后，加入蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定，沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，取沉淀冷冻干燥得到高纯度的林蛙卵抗氧化活性多肽组分；所述的提取溶剂的质量用量为林蛙卵的质量的10-60倍，优选30-40倍。
将林蛙卵室温下解冻后，将原料与适量球磨助剂混合，用高能冷冻球磨机进行球磨，再经微波提取得到多肽粗提物，最后经过蛋白酶纯化，离心后所得沉淀冷冻干燥即为高活性林蛙卵多肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明将机械化学原理应用到辅助林蛙卵细胞破壁和抗氧化活性有效组分的提取，有效解决林蛙卵提取过程中细胞破壁难、多肽组分溶出效果不佳的行业难题；本发明生产周期短，减少了有效组分的降解，保留多肽的抗氧化活性；本发明对林蛙卵有效组分进行了酶解纯化，提高了林蛙卵有效组分的稳定性，延长了半衰期。
本发明中所述提取方法工艺将机械化学原理用于辅助林蛙卵破壁，使得有效组分多肽的提取工艺简化，大大缩短了生产步骤；并且显著性提高产品提取率，经微波提取和蛋白酶纯化后的多肽组分纯度高，保护其抗氧化活性及清除自由基能力，工艺简单、操作方便、易于实现工业化生产。
附图说明
图1为林蛙卵粉末球磨前(a)和球磨后(b)的电镜扫描图(SEM)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明方案进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例中林蛙卵抗氧化活性多肽的分离纯化和测定方法为：
蛋白质的测定：采用凯氏定氮法，参照GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》；灰分的测定：采用灼烧称质量法，参照GB/T 5009.4-2003《食品中灰分的的测定》；水分的测定：采用直接干燥法，参照GB/T 5009.3-2003《食品中水分的测定》；脂肪含量测定：采用索氏抽提法，参照GB5009.6-85《食品中脂肪的测定》。
对DPPH自由基清除能力的测定：
DPPH溶液的配制：准确称取8mg DPPH试剂，将其溶于无水乙醇中，转移至200mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，用MIX-28涡旋振荡器振荡，得到浓度为0.0101mmol/L.DPPH原液最好在3小时内用完。
具塞试管中加入2mL 2×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液，加入2mL的酶解液混匀，室温放置30min，用移液枪准确抽取1ml样品溶液和3ml DPPH溶液，在室温下避光混合储存30min，测量517nm处的吸光度，并取每个样品平行测量3次取平均值。
波长517nm处测定吸光度(Ai)。测定入2mL 2×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇混合液的吸光度(Ac)。测定酶解液与2mL无水乙醇混合液的吸光度(Aj)。DPPH自由基清除率按式(2)计算。并使用IBM SPSS Statistics 19来计算IC50(Half maximalinhibitory concentration，半数最大抑制浓度)。
实施例1
步骤1)将10.0g林蛙卵与20％氯化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨30min，如图1所示，林蛙卵粉末球磨前(a)和球磨后(b)的电镜扫描图(SEM)，球磨后，林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂，料液比1:10，在40℃下300W微波提取40min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的乙醇；
步骤3)加入10000U/g木瓜蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定，沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为77.71％，DPPH自由基清除率达到95.53％，半数抑制浓度为1.326mg/ml。
实施例2
步骤1)将10.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨30min，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂，料液比1:10，400W微波提取30min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入10040U/g中性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为69.21％，DPPH自由基清除率达到95.95％，半数抑制浓度为1.567mg/ml。
实施例3
步骤1)将10.0g林蛙卵与80％碳酸氢钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨1h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂，料液比1:15，在40℃下微波提取40min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入碱性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)然后再沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为77.65％，DPPH自由基清除率达到93.37％，半数抑制浓度为1.256mg/ml。
实施例4
步骤1)将10.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨1h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂，料液比1:15，在40℃下500W微波提取50min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入碱性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)然后再沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为77.71％，DPPH自由基清除率达到92.77％，半数抑制浓度为1.223mg/ml。
实施例5
步骤1)将10.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨1.5h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以40％乙醇为提取剂，料液比1:20，在40℃下500W微波提取50min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入碱性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为76.31％，DPPH自由基清除率达到95.34％，半数抑制浓度为1.241mg/ml。
实施例6
步骤1)将10.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨2h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以60％乙醇为提取剂，料液比1:20，在40℃下600W微波提取50min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入碱性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为85.81％，DPPH自由基清除率达到94.32％，半数抑制浓度为1.421mg/ml。
实施例7
步骤1)将10.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨2.5h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以60％乙醇为提取剂，料液比1:25，在40℃下600W微波提取60min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入碱性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定；
步骤3)沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为84.61％，,DPPH自由基清除率达到91.12％，半数抑制浓度为1.234mg/ml。
实施例8
步骤1)将20.0g林蛙卵与40％氢氧化钠混合，加入粒径为10mm的中号粒径球磨珠30颗，100rpm条件下球磨3h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇80％为提取剂，料液比1:30，在40℃下600W微波提取60min，得到林蛙卵蛋白肽粗提物；旋蒸除去溶剂中的醇，加入中性蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0；
步骤3)沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，沉淀冷冻干燥得到较高纯度的抗氧化活性多肽，林蛙卵抗氧化活性多肽的蛋白质含量为87.61％，DPPH自由基清除率达到93.31％，半数抑制浓度为1.123mg/ml。
对比例
步骤1)粉碎筛分，将13g脱脂干燥林蛙卵用手提式高速中药粉碎机粉碎，过60目筛；
步骤2)酶解，将步骤1)中制备的林蛙卵粉末加蒸馏水稀释3倍，加热至30℃并保持恒温，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液调节体系pH值为6，按照酶活添加量10000u/g料加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶：木瓜蛋白酶的酶活比为1.13，底物浓度10％，酶解温度48.8℃，pH7.70，反应时间为4h；
步骤3)灭酶，反应至4h后，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液调节pH值为7.0，水浴终止反应，水浴温度为90℃，水浴时间10min；
步骤4)两次离心，合并沉淀，离心温度4℃、转速为8000r/min，时间为15min，首次离心后用蒸馏水洗涤沉淀进行二次离心；
步骤5)将沉淀冷冻干燥，制得林蛙卵多肽冻干粉，研磨为均匀粉末，制得所述林蛙卵多肽。
以上实施例中获得的林蛙卵多肽的蛋白质百分比为59.42％。
表1 实施例中林蛙卵自由基清除率和IC50

Claims (10)

1.一种提取林蛙卵中多肽成分的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)将林蛙卵与球磨助剂混后置于冷冻高能球磨机球磨0.5～3h，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体；
步骤2)以乙醇为提取剂微波提取获得林蛙卵蛋白肽粗提物，减压除去溶剂中的醇；
步骤3)加入蛋白酶进行酶解纯化，用NaOH溶液维持pH值在5.5～7.0，沸水浴中加热灭酶，灭酶后的酶解液离心，将得到的沉淀经冷冻干燥得到高纯度的具有抗氧化活性的林蛙卵多肽组分；
其中，所述的蛋白酶选自纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种或者多种，加酶量0.2～1.0％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活为10000U/g；酶解时间为60min，酶解过程通过加入提取剂水溶液维持pH值为7.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的球磨助剂选自氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠中的一种或者两种以上；优选地，所述的球磨助剂选自为氯化钠、氢氧化钠；更优选为氢氧化钠。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的微波提取温度为20-80℃，优选为30-60℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的提取溶剂乙醇体积浓度为40％～90％，优选60％～80％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的微波提取时间为20～100min，优选50-80min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的微波提取料液比为1:10～1:30，优选1:15～1:30。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的微波功率为300～800W，优选300～500W。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述为含水率不大于1％的冻藏林蛙卵粉末，将冷藏的林蛙胎卵常温条件下解冻，而后置于高能冷冻球磨机中球磨，球磨转速100～500rpm，优选300～500rpm，提取溶剂的质量用量为林蛙卵的质量的10-60倍，优选30-40倍。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将含水率不大于1％的林蛙卵在常温条件下解冻，与研磨助剂混合，用高能冷冻球磨机进行球磨磨粉，球磨速度500rpm条件下球磨30-40min，使得林蛙卵的卵膜和卵核成为均一体，以乙醇为提取剂，适当料液比以及适当微波功率下处理适当时间后，加入蛋白酶，加酶量为1.0％，在55℃下酶解60min，并用1mol/L的NaOH溶液维持pH值在7.0恒定，沸水浴中加热灭酶10min，灭酶后的酶解液10000rpm离心15min，取沉淀冷冻干燥得到高纯度的林蛙卵抗氧化活性多肽组分。
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