CN114517218A - 一种沙棘低聚肽粉及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙棘低聚肽粉及其制备方法和用途。所述低聚肽粉肽含量在70wt％以上，其中75％以上沙棘肽的分子量小于700Dalton。所述方法包括使用高效逆流提取法提取沙棘蛋白，过滤、酶解，再将蛋白酶解液经膜设备高效分离纯化，最后浓缩喷雾，得到低聚肽粉。本发明的方法操作简便，高收率低成本，产品质量稳定，工艺绿色环保，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度、低分子量的沙棘抗氧化肽产品，其多肽含量在70wt％以上，分子量小于700Dalton在75％以上。本发明还涉及到沙棘蛋白的制备并催化酶解，生成低聚抗氧化肽粉的制备方法，该肽粉可用作食品、保健食品、药品或者化妆品。
背景技术
沙棘Hippophae rhamnoides L.为胡颓子科沙棘属多年生灌木或乔木，又名酸醋柳、黑刺、酸刺、其察日嘎纳(蒙名)、达尔布(藏名)、吉汗(维吾尔名)等，主要分布在我国的西北、东北、西南、华北等地区，全国分布约有130万公顷，占世界总面积的95％以上，素有“沙棘王国”之称。沙棘在古代就是藏医、蒙医的常用药材，公元8世纪的藏医名著《四部医典》记载：沙棘有健脾养胃、破淤止血、祛痰、利肺、化湿、壮阴、升阳的作用。1977年，沙棘被首次载入《中国药典》，此后各版药典均有收录。现代医学表明，沙棘具有活血化瘀、清热止泻、生津止渴等功效，同时能够治疗消化不良、咳嗽痰多、肠炎、胃痛、停经等疾病。在沙棘中含有沙棘总黄酮、不饱和脂肪酸等成分，能够有效防治高血压、高血脂、高血糖等心血管疾病。此外，沙棘可以有效缓解胸闷、心悸、气短等病症。对于心脏疾病患者具有极高的预防作用。另外，在沙棘中提取的有关活性成分具有超强抗癌效果，对人体中癌细胞有一定抑制与杀死作用，尤其是对食道癌、直肠癌、肝癌等癌症患者效果显著，同时还可减缓患者在化疗过程中的毒副作用，有助于癌症患者康复。
沙棘果油是从沙棘籽中提取的油脂，是沙棘的精华，食用安全性高，具有抗氧化、调节血脂、促进微循环、保肝抗炎、调节免疫以及抗癌等作用。据统计，每吨沙棘鲜果可产生30kg沙棘湿籽，提取油脂后会产生13.8kg沙棘籽粕，因此沙棘籽粕的年产量达到1.5万吨。沙棘籽粕中含有20％的纤维素、10％的半纤维素和不到40％的蛋白质。虽然沙棘籽粕中蛋白质含量丰富，但由于多酚的存在，蛋白质的利用率比较低。这是由于酚类化合物在碱性条件下被氧化成醌，醌能缩合形成高相对分子质量的褐色素，这些褐色产物保持高活性并易与蛋白质中的巯基和氨基结合，降低蛋白质的消化率和利用率。因此，在围绕沙棘果资源进行浅层开发利用的过程中产生大量的沙棘籽粕被废弃或仅做饲料使用，造成对于沙棘籽粕没有得到合理高效的利用。
为了有效利用沙棘籽粕中的蛋白资源，将蛋白加工成多肽，不但能够提高蛋白质在人体内的消化利用率而且产出的多肽会因选取蛋白质的不同而可能具有某种生理活性。获得比沙棘原蛋白在营养、功能性及生物活性上更加优良的低聚肽粉，已尝试了多种制备方法。专利CN 108277248 A将沙棘籽粉碎至超微粉，加入蒸馏水、纤维素酶、植酸酶与单宁酶预处理后，依次经蛋白酶水解、超声波提取、膜过滤、树脂纯化、干燥后得到沙棘肽。工艺繁琐，不易操作，超微粉碎、多种酶水解和树脂纯化，成本高，不易大规模生产，同时使用树脂纯化和乙醇不符合食品法规，难以推广。专利CN 104099393 B用Prote AX蛋白酶水解后，经5000Da的超滤膜分离得到沙棘多肽溶液，该专利使用的Prote AX蛋白酶为进口蛋白酶，来源不广泛，容易受国外酶厂商限制，成本高。
可见，以上沙棘低聚肽的制备条件苛刻，工艺步骤繁琐，很难实现大规模生产，因此寻找一套工艺简单、低成本、高含量、较高活性的沙棘低聚肽的制备方法已经成为寻找大规模生产的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高纯度、低分子量的沙棘低聚肽粉。
本发明的另一目的是提供了一种高纯度、低分子量的沙棘低聚肽粉的制备方法。
本发明的另一目的是提供了本发明沙棘低聚肽粉用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。
本发明的另一目的是提供了含有本发明沙棘低聚肽粉的药物和食品组合物。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种沙棘低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在70wt％以上，其中75％以上沙棘肽的分子量小于700Dalton，其分子量分布如下：
分子量Dalton分布
数均分子量范围：20～1100
重均分子量范围：45～1200
所述沙棘低聚肽粉的制备方法，其特征包括下述步骤：将脱脂后的沙棘粕，使用高效逆流提取法提取蛋白质，过滤、酶解，再将蛋白酶解液依次经过微滤膜与超滤膜高效分离纯化，最后浓缩喷雾，得到沙棘低聚肽粉。
所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
沙棘粕的预处理：将沙棘籽风干后，压榨或者超临界脱油，得到脱脂沙棘粕；
高效逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的沙棘粕，记录为A，与水按重量比为1∶5～1∶15混合，调节pH至9～12于室温提取1～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕，记录为B，调节pH至9～12于室温提取1～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕，记录为C，调节pH至9～12于室温提取1～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10～1∶20的水，搅拌均匀，得到沙棘蛋白液；
蛋白酶解：将上述沙棘蛋白液加热至80°以上保持至少2min，再冷却至40～55℃，将pH值调节至中性，加入沙棘粕重量0.5～2％的生物酶；搅拌酶解3～6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。
分离纯化：将蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，透过液在30～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，进行干燥，得到沙棘低聚肽粉，产率20～40wt％。
所述的制备方法，其特征在于：所述的酶解所用的生物酶可以为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、无花果蛋白酶、罗汉果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
所述的制备方法，其特征在于：所述的浓缩方法可以为真空浓缩、常压浓缩、膜浓缩法，优选地使用真空浓缩法。
所述的制备方法，其特征在于：所述的干燥方法可以为真空干燥、加热干燥、晾干、风干、冷冻干燥和喷雾干燥法，优选地使用喷雾干燥法。
一种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的沙棘低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
所述的组合物，其特征在于：其剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液，以及液体、乳液、膏霜、粉、块状等化妆品剂型。
所述的沙棘低聚肽粉用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品的应用；用于改善和治疗生殖系统和性能力相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品的应用；用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品的应用；用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品的应用；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善、或治疗肝肾肺损伤引起的相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节血脂、血糖、血压的食品、保健食品或药品的应用；用于制备术后恢复营养品和促进伤口快速愈合的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用；用于制备美白、祛斑、抗皱、控油、保湿、祛痘的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用。
所述的组合物用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品的应用；用于改善和治疗生殖系统和性能力相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品的应用；用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品的应用；用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品的应用；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善、或治疗肝肾肺损伤引起的相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节血脂、血糖、血压的食品、保健食品或药品的应用；用于制备术后恢复营养品和促进伤口快速愈合的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用；用于制备美白、祛斑、抗皱、控油、保湿、祛痘的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明使用高效逆流法提取沙棘蛋白，相比普通的碱提酸沉法，蛋白质的提取率提高了10％以上，同时减少了用水量，节约生产成本。
(2)本发明仅使用蛋白复溶液进行酶解，没有将蛋白进行干燥，这样不仅减少了蛋白质干燥时的损失，也简化了制备工艺。
(3)本发明在酶解前将蛋白复溶液进行了高温处理，发明人做过比较，比未处理直接酶解获得的沙棘低聚肽的收率提高了50％。
(4)本发明使用单酶和复合酶进行酶解，单酶或者复合酶均能在含量、分子量、产率、活性上得到保证，酶解工艺稳定，两种酶均为食用酶，来源广泛、成本低，酶解时，添加量仅为沙棘籽粕质量的1～2％。
(5)本发明使用微滤膜进行过滤，初步去除酶解液中的不溶物，再使用2000～20000Dalton超滤膜去除大分子量蛋白和肽。
(6)本发明没有使用冷冻干燥或者真空干燥法制备产品，使用喷雾干燥法不仅节约了干燥时间，而且产品质粒均匀。
(7)本发明根据GB/T 22492-2008附录A测定多肽的分子量分布，根据附录B先测定酸溶性蛋白和游离氨基酸的含量，最后差值即为肽含量。此分子量和肽含量的测定方法认可度高。
分子量Dalton分布
数均分子量范围：20～1100
重均分子量范围：45～1200
(8)本发明测得肽含量在70wt％以上，其中75％以上的沙棘低聚肽肽的分子量小于700Dalton，是高纯度、低分子量的低聚肽。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特殊说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售商品。
制备实施例1：
将100kg压榨脱脂后的沙棘籽粕(记录为A)，与水按重量比为1∶15混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置1.5h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶20的水，搅拌均匀。将上述沙棘蛋白液加热至85℃，并保持10min后，冷却至50℃，将pH值调节至中性，加入100g中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解5h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，截留液在80℃下浓缩至固含为3.4％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的深棕色沙棘肽粉，产率为32wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为71wt％，小于700Dalton分子量占78％。
制备实施例2：
将100kg冷榨脱脂后的沙棘粕(记录为A)，与水按重量比为1∶5混合，调节pH至11于室温提取1.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为B)，调节pH至11于室温提取1.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为C)，调节pH至11于室温提取1.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4.5，静置0.5h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀。将上述沙棘蛋白液加热至95℃，并保持2min后，冷却至至45℃，将pH值调节至中性，加入沙棘粕重量的100g中性木瓜复合蛋白酶(两种蛋白酶的质量比为1∶1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经20000Dalton超滤膜处理后，透过液经膜浓缩至固含为4.1％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的深棕色沙棘肽粉，产率为30wt％。采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为70.6wt％，小于700Dalton分子量占76％。
制备实施例3：
将100kg冷榨脱脂后的沙棘粕(记录为A)，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶15的水，搅拌均匀。将上述沙棘蛋白液加热至80℃，并保持10min后，冷却至至50℃，将pH值调节至8.0，加入沙棘粕重量的100g中性碱性复合蛋白酶(两种蛋白酶的质量比为1∶1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，碱性蛋白酶的活力为60万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液在80℃下浓缩至固含为5％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的深棕色沙棘肽粉，产率为35wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为73wt％，小于700Dalton分子量占81.3％。
制备实施例4：
将100kg冷榨脱脂后的沙棘粕(记录为A)，与水按重量比为1∶8混合，调节pH至9于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为B)，调节pH至9于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为C)，调节pH至9于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3.5，静置1h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀。将上述沙棘蛋白液加热至90℃，并保持5min后，冷却至至45℃，将pH值调节至8.0，加入沙棘粕重量的100g碱性菠萝复合蛋白酶(碱性蛋白酶的活力为60万u/g，菠萝蛋白酶的活力为100万u/g)，搅拌酶解4h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液在80℃下浓缩至固含为5％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的深棕色沙棘肽粉，产率为26wt％。采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为71wt％，小于700Dalton分子量占78.5％。
制备实施例5：
将100kg压榨脱脂后的沙棘籽粕(记录为A)，与水按重量比为1∶6混合，调节pH至9于室温提取1h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为B)，调节pH至9于室温提取1h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕(记录为C)，调节pH至9于室温提取1h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为4，静置2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀。将上述沙棘蛋白液加热至80℃，并保持10min后，冷却至40℃，将pH值调节至中性，加入100g中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液在50℃下浓缩至固含为4.6％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的深棕色沙棘肽粉，产率为32wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为73wt％，小于700Dalton分子量占77.7％。
生物活性实施例：
1、DPPH自由基清除实验
1.1 DPPH乙醇溶液的配制：精密称取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL乙醇，超声30s，用乙醇定容至刻度，摇匀，待用。本品须现配现用。
1.2供试品溶液的配制：精密称取适量沙棘肽粉，置于50mL棕色容量瓶中，加入30mL乙醇，超声5min，用乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
1.3操作步骤：准确吸取2mL供试品溶液和2mL DPPH溶液混合均匀；准确吸取2mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀；准确吸取2mL DPPH溶液和2mL乙醇混合均匀，室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示DPPH和溶剂混合后溶液的吸光度。
2、SRSA超氧阴离子自由基清除实验
2.1 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
2.2 150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.3 60μmoL/LPMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并周蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.4 468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.5供试品溶液的配制：精密称取适量沙棘肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
2.6工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值。
2.7操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
3、ABTS+自由基清除实验
3.1 PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
3.2 ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
3.3 ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
3.4供试品溶液的配制：精密称取适量沙棘肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
3.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
分别配制不同浓度的制备实施例1-5的沙棘肽产品进行DPPH、SRSA以及ABTS+自由基清除实验，测定其IC50值，结果如表1所示：
表1沙棘肽粉自由基清除实验结果
由表1可知，制备实施例1-5所得的沙棘肽粉均有较好的自由基清除活性。虽然酶解时的酶的种类不同，但不影响影响低聚肽的生物活性。可见，沙棘肽粉有可能防止人体中细胞老化、改善记忆力、延缓衰老、保护心血管、防止老年痴呆等作用，更深层的生物活性正在研究之中。
Claims (10)
1.一种沙棘低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在70wt％以上，其中75％以上沙棘肽的分子量小于700Dalton，其分子量分布如下：
分子量Dalton分布
数均分子量范围：20～1100
重均分子量范围：45～1200。
2.权利要求1所述沙棘低聚肽粉的制备方法，其特征包括下述步骤：将脱脂后的沙棘粕，使用高效逆流提取法提取蛋白质，过滤、酶解，再将蛋白酶解液依次经过膜设备高效分离纯化，最后浓缩喷雾，得到沙棘低聚肽粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
沙棘粕的预处理：将沙棘籽风干后，压榨或者超临界脱油，得到脱脂沙棘粕；
高效逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的沙棘粕，记录为A，与水按重量比为1∶5～1∶15混合，调节pH至9～12于室温提取1～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的沙棘粕，记录为B，调节pH至9～12于室温提取1～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的沙棘粕，记录为C，调节pH至9～12于室温提取1～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10～1∶20的水，搅拌均匀，得到沙棘蛋白液；
蛋白酶解：将上述沙棘蛋白液加热至80°以上保持至少2min，再冷却至40～55℃，将pH值调节至中性，加入沙棘粕重量0.1～2％的生物酶；搅拌酶解3～6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
分离纯化：将蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，透过液在30～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，进行干燥，得到沙棘低聚肽粉，产率20～40wt％。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的酶解所用的生物酶可以为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、无花果蛋白酶、罗汉果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的浓缩方法可以为真空浓缩、常压浓缩、膜浓缩法，优选地使用真空浓缩法。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的干燥方法可以为真空干燥、加热干燥、晾干、风干、冷冻干燥和喷雾干燥法，优选地使用喷雾干燥法。
7.一种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的沙棘低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：其剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液，以及液体、乳液、膏霜、粉、块状等化妆品剂型。
9.权利要求1-3任一所述的沙棘低聚肽粉用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品的应用；用于改善和治疗生殖系统和性能力相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品的应用；用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品的应用；用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品的应用；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善、或治疗肝肾肺损伤引起的相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节血脂、血糖、血压的食品、保健食品或药品的应用；用于制备术后恢复营养品和促进伤口快速愈合的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用；用于制备美白、祛斑、抗皱、控油、保湿、祛痘的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用。
10.权利要求7或8所述的组合物用于制备预防或治疗自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善或者治疗神经相关疾病的食品、保健食品或者药品的应用；用于改善和治疗生殖系统和性能力相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备改善或治疗记忆力衰退的食品、保健食品或药品的应用；用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防或治疗缓解大脑或者运动疲劳的食品、保健食品或药品的应用；用于制备增强免疫力的食品、保健食品或药品的应用；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防肌肉流失、修复肌肉损伤、增长肌肉组织的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用；用于制备预防、改善、或治疗肝肾肺损伤引起的相关疾病的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节血脂、血糖、血压的食品、保健食品或药品的应用；用于制备术后恢复营养品和促进伤口快速愈合的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用；用于制备美白、祛斑、抗皱、控油、保湿、祛痘的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用。
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