CN112708651A - 一种瓜蒌蛋白粉和多肽粉及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瓜蒌蛋白粉和多肽粉及其制备方法和应用，瓜蒌多肽粉的制备方法为：将瓜蒌籽干燥、脱脂，获得瓜蒌籽粕；将瓜蒌籽粕与纯化水混合，调节至碱性，恒温提取，提取完成后过滤；将滤液调节为酸性，静置沉淀后弃去上清液，得到蛋白沉淀物；向蛋白沉淀物中加入纯化水，搅拌均匀形成蛋白复溶液；向蛋白复溶液中加入蛋白酶，搅拌酶解后得到蛋白酶解液；将蛋白酶解液微滤、浓缩、干燥后得到瓜蒌多肽粉。本发明先提取出瓜蒌籽中的蛋白质，再对蛋白质进行酶解制取多肽粉，提取出纯度高、分子量小且分子量分布范围窄的瓜蒌多肽粉，产品具有良好的功能性及生物活性，可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品。
Description
技术领域
本发明涉及食品深加工领域，尤其是涉及一种瓜蒌蛋白粉和多肽粉及其制备方法和应用。
背景技术
瓜蒌为葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Marim)或双边栝楼(Trichosanthes rosthornii Harms)的干燥成熟果实，属于常用中药材，始载于《神农本草经》，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠等功效，用于治疗肺热咳嗽、痰浊黄稠、胸痹心痛、结胸痞满、乳痈、肺痈、肠痈肿痛、大便秘结等病症。汉代张仲景《伤寒杂病论》中治疗“胸痹”、“心痛”的名方瓜蒌薤白白酒汤和瓜蒌薤白半夏汤就以瓜蒌为主要成分。现代研究表明，瓜蒌具有改善心血管系统、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡以及祛痰、增强免疫等多种药理活性。
瓜蒌籽为其干燥成熟种子，瓜蒌籽重在润肺化痰、滑肠通便，用于燥咳痰粘、肠燥便秘。《中国药典》记载将瓜蒌皮与瓜蒌籽(35:65)的水提物制备成瓜蒌片，用于冠心病，心绞痛的治疗，疗效较好。瓜蒌籽主要产于山东、四川、安徽等地，含有丰富的油脂、甾醇、三萜、苷类等物质，其中含脂肪油约为26％，不饱和脂肪酸约占67％，包括瓜蒌酸、油酸、亚油酸、亚麻油酸，因此许多研究着重于瓜蒌籽油的萃取及其性质分析。瓜蒌籽提油副产物中含有65％左右的蛋白质及钙、铁、铜、锌等无机元素，而目前大部分是将其副产物作为废弃物，对其中很有价值的成分未能充分提取利用，造成巨大资源浪费和环境污染。
植物蛋白对各种年龄层次的人都是有益的，对青少年更是生长发育、增强体质不可缺少的物质。对于中年人来说，蛋白质能使脑力劳动者增强记忆，使体力劳动者增强耐力。对于老年人来说，补充优质蛋白质可推迟衰老，防治多种老年病的发生。随着人们生活水平的提高，对蛋白质的需求量也不断增加。因此高效从瓜蒌籽提油副产物中的蛋白质和多肽，具有技术含量高，附加值高的特点，具有明显的经济效益和社会效益，研究开发前途广泛。
目前已有利用瓜蒌籽提取多肽的研究，例如，在中国专利文献上公开的“一种瓜蒌籽多肽的制备方法”，其公开号CN105192244A，包括以下步骤：(1)脱脂：采用低温冷榨技术对瓜蒌籽进行脱脂处理；(2)粉碎溶解：制得瓜蒌籽混悬液；(3)均质处理：将所得到的瓜蒌籽混悬液用均质机进行二级均质处理；(4)酶解：用复合酶处理得到的瓜蒌籽混合液；(5)离心过滤；(6)高温灭菌；(7)超滤精炼；(8)浓缩干燥。但现有的工艺提取出的多肽纯度低、分子量较大且分布较广，导致产品的功能性及生物活性不足，限制了产品的使用。
发明内容
本发明是为了克服现有的瓜蒌籽多肽提取工艺提取出的多肽纯度低、分子量较大且分布较广，导致产品的功能性及生物活性不足，限制了产品的使用的问题，提供一种瓜蒌蛋白粉和多肽粉及其制备方法和应用，提取出纯度高、分子量小且分子量分布范围窄的瓜蒌多肽粉，产品具有良好的功能性及生物活性，可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种瓜蒌多肽粉，采用GB/T 22492-2008附录B中的多肽含量检测方法和GB/T22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法，测得肽含量在90wt％以上，其中75％以上分布在500Dalton分子量以下，其分子量分布如下所示：
分子量Dalton分布
本发明还提供了一种上述瓜蒌多肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1：使用碱提酸沉法从瓜蒌籽中得到蛋白沉淀物；
S2：将蛋白沉淀物酶解，分离纯化得到所述瓜蒌多肽粉。
作为优选，S1中制备蛋白沉淀物的方法为：
(1)将瓜蒌籽干燥、脱脂，获得瓜蒌籽粕；
(2)将瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:5～1:20混合，调节pH至8～10，恒温30～50℃提取1～2h，提取完成后离心过滤，滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液待用；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为3～5，静置沉淀1～2h后弃去上清液，得到蛋白沉淀物；S2中蛋白沉淀物的酶解方法为：
(4)向蛋白沉淀物中加入纯化水，搅拌均匀形成蛋白复溶液，蛋白沉淀物和纯化水的体积比为1:5～1:15；
(5)将蛋白复溶液加热至40～55℃，加入制备蛋白沉淀物时使用的瓜蒌籽粕质量的0.1～2％的蛋白酶，搅拌酶解4～6h后，煮沸灭活10～30min，离心，取上清液得到蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液经膜处理、浓缩、干燥后得到所述瓜蒌多肽粉。
作为优选，步骤(5)所述的蛋白酶选自食品级的酶活力≥20万u/g的中性蛋白酶、酶活力≥40万u/g的木瓜蛋白酶、酶活力≥30万u/g的菠萝蛋白酶、酶活力≥20万u/g的碱性蛋白酶、酶活力≥50万u/g的胃蛋白酶、酶活力≥3000u/g的胰酶中的一种或多种。
作为优选，步骤(6)中所述的膜处理方法为微滤和/或超滤；所述的浓缩方法为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述的干燥方法为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
本发明还提供了一种瓜蒌蛋白粉，由采用上述的方法制得的蛋白沉淀物制成。
上述瓜蒌蛋白粉的制备方法，包括如下步骤：
A)采用上述方法用瓜蒌籽制备蛋白沉淀物；
B)将蛋白沉淀物干燥，得到所述瓜蒌蛋白粉。
同时，本发明还提供了一种组合物，包括上述的瓜蒌蛋白粉和/或瓜蒌多肽粉。
上述组合物可以用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品。其剂型可以为素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
本发明先提取出瓜蒌籽中的蛋白质，再对蛋白质进行酶解获得具有生物活性的短肽，得到瓜蒌多肽粉，结合对各工艺参数及酶种类的选择，大大提升了多肽粉中的多肽含量，并使多肽具有较小的分子量和较窄的分子量分布范围。本发明瓜蒌蛋白的收率在60wt％以上，含量大于85wt％；瓜蒌多肽的收率在40wt％以上，肽含量不少于90wt％，75％以上肽分子量分布在500Dalton以下。因此，本发明中制备出的瓜蒌多肽粉具有良好功能性及生物活性，且制备工艺简单、经济、绿色环保，适用于大规模生产。
本发明中制得的瓜蒌蛋白粉及多肽粉具有良好的抗氧化活性，用于食品、药品或保健品中可以治疗或预防自由基过多引起的症状，并具有防止人体中细胞老化、改善记忆力、延缓衰老、保护心血管、防止老年痴呆等作用。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)通过碱提酸沉法提取瓜蒌籽中的蛋白质，制成瓜蒌蛋白质粉，制备过程中瓜蒌蛋白的收率高，制得的蛋白粉中瓜蒌蛋白含量高；
(2)在对瓜蒌籽中的蛋白质进行提取的基础上，又进一步对提取的蛋白质进行酶解和膜处理，得到瓜蒌多肽粉，大大提升了多肽粉中的多肽含量，并使多肽具有较小的分子量和较窄的分子量分布范围，从而使制备出的瓜蒌多肽粉具有良好的功能性及生物活性；
(3)瓜蒌蛋白粉及多肽粉的制备工艺简单、经济、绿色环保，适用于大规模生产；
(4)制得的瓜蒌蛋白粉及多肽粉具有良好的抗氧化活性，用于食品、药品或保健品中可以治疗或预防自由基过多引起的症状。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
本发明实施例中用到的所有原料和溶剂均购自Sigma Biochemical and OrganicCompounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents公司；
蛋白粉的检测方法为国家标准GB 5009.5-2010中的凯氏定氮法；
多肽含量检测方法为国家标准GB/T 22492-2008附录B中的多肽测定法；
多肽相对分子量分布的检测方法为国家标准GB/T 22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法。
实施例1：
一种瓜蒌蛋白粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)将瓜蒌籽风干后，冷压榨脱油，获得脱脂瓜蒌籽粕；
(2)将100kg瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:10混合，调节pH至9，恒温40℃提取2h，提取完成后离心过滤；滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为3.5，静置1h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(4)不断搅拌蛋白沉淀物并加入纯化水以调节固含至7wt％，进行喷雾干燥，进口温度为150℃，出口温度为50℃，得到瓜蒌蛋白粉。
本实施例中瓜蒌蛋白产率为64.4％，使用凯氏定氮法测得蛋白含量为88.9％。
实施例2：
一种瓜蒌多肽粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)将瓜蒌籽风干后，冷压榨脱油，获得脱脂瓜蒌籽粕；
(2)将100kg瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:10混合，调节pH至9，恒温40℃提取2h，提取完成后离心过滤；滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为3.5，静置1h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(4)向蛋白沉淀物中加入体积比为1:10的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液；
(5)将蛋白复溶液加热至45℃，加入瓜蒌籽粕质量的0.1％的中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，恒定pH为7，搅拌酶解4h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液在50℃下浓缩至固含量为6.6wt％时，进行喷雾干燥，进口温度为160℃，出口温度为65℃，得到瓜蒌多肽粉。
本实施例中瓜蒌多肽粉产率为42％，测得肽含量为92.5wt％，77.0％的肽分子量分布在500Dalton以下。
实施例3：
一种瓜蒌多肽粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)将瓜蒌籽风干后，冷压榨脱油，获得脱脂瓜蒌籽粕；
(2)将100kg瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:5混合，调节pH至10，恒温30℃提取1h，提取完成后离心过滤；滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为5，静置1h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(4)向蛋白沉淀物中加入体积比为1:15的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液；
(5)将蛋白复溶液加热至50℃，加入瓜蒌籽粕质量的0.1％的木瓜蛋白酶(酶活力为50万u/g)，恒定pH为7，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再过20000Dalton超滤膜处理，透过液在40℃下浓缩至固含量为6wt％时，进行冷冻干燥，得到瓜蒌多肽粉。
本实施例中瓜蒌多肽粉产率为46％，测得肽含量为91.5wt％，78.3％的肽分子量分布在500Dalton以下。
实施例4：
一种瓜蒌多肽粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)将瓜蒌籽风干后，经超临界CO2脱脂后，获得脱脂瓜蒌籽粕；
(2)将100kg脱脂后的瓜蒌籽粕(记录为A)，与水按重量比为1:20混合，调节pH至10于室温提取1.5h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的瓜蒌籽粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取1.5h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的瓜蒌籽粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取1.5h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1.5h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；
(3)合并以上待用滤液，调节pH为4.5，静置1.5h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(4)向蛋白沉淀物中加入体积比为1:15的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液；
(5)将蛋白复溶液加热至45℃，加入总质量为瓜蒌籽粕质量的2％的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶(两种蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g)，恒定pH为7，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再过5000Dalton超滤膜处理，透过液在40℃下浓缩至固含量为6.4wt％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为60℃，得到瓜蒌多肽粉。
本实施例中瓜蒌多肽粉产率为47％，测得肽含量为93.3wt％，75.5％的肽分子量分布在500Dalton以下。
实施例5：
一种瓜蒌多肽粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)将瓜蒌籽风干后，热压榨脱油，获得脱脂瓜蒌籽粕；
(2)将100kg瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:10混合，调节pH至8，恒温50℃提取2h，提取完成后离心过滤；滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为3，静置2h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(4)向蛋白沉淀物中加入体积比为1:5的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液；
(5)将蛋白复溶液加热至55℃，加入瓜蒌籽粕质量的0.1％的菠萝蛋白酶(酶活力为50万u/g)，恒定pH为7，搅拌酶解6h后，煮沸灭活50min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液在50℃下真空浓缩至固含量为6.2wt％时，进行真空干燥，得到瓜蒌多肽粉。
本实施例中瓜蒌多肽粉产率为44.9％，测得肽含量为90.7wt％，77.1％的肽分子量分布在500Dalton以下。
分别采用自由基清除法和超氧阴离子自由基清除法测试实施例2～5中制得的瓜蒌多肽粉的抗氧化活性。
测试方法为：
1.ABTS+自由基清除实验
1.1 PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用；
1.2 ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜；
1.3 ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀；
1.4供试品溶液的配制：配制合适浓度的瓜蒌多肽粉溶液；
1.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS+工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS+工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS+混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS+和溶剂混合后溶液的吸光度。
2.SRSA超氧阴离子自由基清除实验
2.1 0.1moL/L PBS缓冲液(pH 7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅拌使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用；
2.2 150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.3 60μmoL/L PMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.4 468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得；
2.5供试品溶液的配制：配制合适浓度的瓜蒌多肽溶液；
2.6工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值；
2.7操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
分别使用实施例2～5中制备出的瓜蒌多肽粉配制浓度为0.5和1mg/mL的瓜蒌多肽溶液，以没食子酸为阳性对照，测试结果如表1所示。
表1：瓜蒌多肽粉抗氧化活性测试结果
从表1中可以看出，采用本发明中的方法制备出的瓜蒌多肽粉具有较好的抗氧化活性，可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品，有可能防止人体中细胞老化、改善记忆力、延缓衰老、保护心血管、防止老年痴呆等作用。
Claims (9)
1.一种瓜蒌多肽粉，其特征是，采用GB/T 22492-2008附录B中的多肽含量检测方法和GB/T 22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法，测得肽含量在90wt％以上，其中75％以上分布在500Dalton分子量以下，其分子量分布如下所示：
分子量Dalton分布
2.一种如权利要求1所述的瓜蒌多肽粉的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
S1：使用碱提酸沉法从瓜蒌籽中得到蛋白沉淀物；
S2：将蛋白沉淀物酶解，分离纯化得到所述瓜蒌多肽粉。
3.根据权利要求2所述的一种瓜蒌多肽粉的制备方法，其特征是，
S1中制备蛋白沉淀物的方法为：
(1)将瓜蒌籽干燥、脱脂，获得瓜蒌籽粕；
(2)将瓜蒌籽粕与纯化水按质量比为1:5～1:20混合，调节pH至8～10，恒温30～50℃提取1～2h，提取完成后离心过滤，滤渣进行第二次提取，第二次完成后，离心过滤，合并两次滤液待用；
(3)将步骤(2)中的滤液pH调节为3～5，静置沉淀1～2h后弃去上清液，得到蛋白沉淀物；S2中蛋白沉淀物的酶解方法为：
(4)向蛋白沉淀物中加入纯化水，搅拌均匀形成蛋白复溶液，蛋白沉淀物和纯化水的体积比为1:5～1:15；
(5)将蛋白复溶液加热至40～55℃，加入制备蛋白沉淀物时使用的瓜蒌籽粕质量的0.1～2％的蛋白酶，搅拌酶解4～6h后，煮沸灭活10～30min，离心，取上清液得到蛋白酶解液；
(6)将蛋白酶解液经膜处理、浓缩、干燥后得到所述瓜蒌多肽粉。
4.根据权利要求3所述的一种瓜蒌多肽粉的制备方法，其特征是，步骤(5)所述的蛋白酶选自食品级的酶活力≥20万u/g的中性蛋白酶、酶活力≥40万u/g的木瓜蛋白酶、酶活力≥30万u/g的菠萝蛋白酶、酶活力≥20万u/g的碱性蛋白酶、酶活力≥50万u/g的胃蛋白酶、酶活力≥3000u/g的胰酶中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的一种瓜蒌多肽粉的制备方法，其特征是，步骤(6)中所述的膜处理方法为微滤和/或超滤；所述的浓缩方法为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述的干燥方法为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
6.一种瓜蒌蛋白粉，其特征是，由采用如权利要求2～5任意一项的方法制得的蛋白沉淀物制成。
7.根据权利要求6所述的一种瓜蒌蛋白粉的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
A)用瓜蒌籽制备蛋白沉淀物；
B)将蛋白沉淀物干燥，得到所述瓜蒌蛋白粉。
8.一种组合物，其特征是，包括如权利要求1所述的瓜蒌多肽粉和/或如权利要求6所述的瓜蒌蛋白粉。
9.一种如权利要求8所述的组合物的应用，其特征是，用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品。
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