CN105949290B - 一种鹰嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹰嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制备方法和用途。所述鹰嘴豆蛋白粉的含量大于90wt％；鹰嘴豆低聚肽粉的肽含量不低于80wt％，其中85％以上肽分子量小于1500Dalton。所述方法包括将带皮的鹰嘴豆粉碎并与有机溶剂混合处理；碱提酸沉法提取蛋白质；分离纯化等步骤。所述蛋白粉和低聚肽粉可用于治疗或预防自由基过多引起的症状。本发明的制备方操作简便，高收率低成本，产品质量稳定，工艺绿色环保，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明提供种高纯度鹰嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制备工艺，属于生物工程植物蛋白深加工领域。
背景技术
鹰嘴豆(Cicer arietinum L)，为蝶形花科草本植物，别名桃尔豆、鸡豆、鸡心豆等，是印度和巴基斯坦的重要的蔬菜之一，在欧洲食用鹰嘴豆也十分普遍，也是维吾尔医常用药材。维吾尔族用它治疗支气管炎、黏膜炎、霍乱、便秘痢疾、消化不良、肠胃气胀、毒蛇咬伤、糖尿病、性欲降低、皮肤瘙痒、高脂血症、中暑等疾病。在中医上，鹰嘴豆可以调节湿度，有止泻、解毒、壮身等作用。鹰嘴豆所含的营养成分非常丰富，无论是从种类，还是数量上，都大大超过其他豆类。它含有18以上的氨基酸(含人体必须但自身不能合成的全部8种氨基酸)，多种营养元素和微量元素，如：钙、罗、锌、镁、磷等。特别是每百克鹰嘴豆所含的钙高达350毫克，磷320毫克，高于大部分豆类，铁的含量达47毫克，比其它豆类高出90％，维生素C、B1、B2含量高达12毫克，膳食纤维含量更高于其它。据报道，鹰嘴豆含有丰富的蛋白质，高达20％，其中球蛋白和清蛋白分别占总蛋白的42.16％和39.76％。球蛋白和清蛋白是人体非常重要的营养物质，可以起到提升免疫力的作用。
鹰嘴豆蛋白因其氨基酸组成均衡、生物利用率高和抗营养因子低而被作为植物蛋白的重要来源。目前对于鹰嘴豆蛋白的分离纯化、营养价值、功能性质以及其被水解后制成具有抑制血管紧缩素-I转移酶(ACE)、抗氧化、抗肿瘤以及抗过敏活力的鹰嘴豆肽方面均有报道。张涛等人将鹰嘴豆粉碎去皮并使用石油醚脱脂制备得到纯度为90％以上的鹰嘴豆蛋白，石油醚的使用在工业大规模生产中不易实现，残留在产品中的石油醚影响人体健康；我们实验中发现使用冷榨或者热榨方法将去皮后的鹰嘴豆脱脂后，再使用碱提酸沉法制备蛋白质的纯度(60％左右)很不理想。专利CN 104789629A公开了将鹰嘴豆浸泡去皮烘干粉碎，使用碱提酸沉法获得蛋白质，再使用两步酶解获得的蛋白酶解液，最后经两次陶瓷膜纯化获得低聚肽粉，获得的蛋白质和低聚肽的最高含量均不超过80％；将鹰嘴豆浸泡后种皮由于非常坚韧很难去除，因此在大型生产中去皮也很难实现；由于陶瓷膜膜表面积较小，造成纯化时膜通量下降较快，延长了膜纯化时间，增加了生产成本。专利CN 104761617A中发明人使用C18反相柱层析制备鹰嘴豆多肽，反相柱层析的成本高，在实际生产中不易实现。专利CN 103525891B中将鹰嘴豆蛋白酶解液灭活离心后未将酶解液中的杂质彻底清除，直接使用6kDa和2kDa的超滤膜进行纯化，这样容易造成超滤膜阻塞引起膜效率下降，同时发明人没有测定肽的分子量和纯度。专利CN 103168913B和CN 103194517B使用多种复合酶多步酶解获得鹰嘴豆多肽，未进行纯化步骤，可见制备的只是粗肽。专利CN 103172706B和CN102391361B公开了鹰嘴豆多肽的制备方法，工艺包括脱脂、蛋白酶水解、凝胶层析分离，凝胶层析色谱的使用由于高成本，不能用于大规模生产。专利CN 102028036A将鹰嘴豆自然发酵，再进行酶解获得多肽，自然发酵容易造成其它菌种的影响，不够稳定。专利CN101962399A和CN101602799A公开的蛋白和多肽的制备工艺均用磷酸盐缓冲液提取、硫酸铵沉淀，但存在蛋白利用率低、制备多肽的效率偏低的缺点。综上所述，以上专利大多存在原料利用率低，工艺复杂，难以应用于大规模生产的缺点。
为解决上述技术问题，本专利提供了适合大规模生产的高纯度鹰嘴豆蛋白粉的制备工艺，同时也提供了获得比原蛋白在营养、功能性及生物活性上更加优良、纯度较高的鹰嘴豆低聚肽粉的制备方法。本专利弥补了高纯度鹰嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉在制备工艺上的欠缺。
发明内容
本发明公开了一种高纯度鹰嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制备工艺，将鹰嘴豆粉碎后，使用特殊技术获得高纯度鹰嘴豆蛋白粉，并且通过一定工艺酶解后，获得纯度较高的低聚肽粉。该生产方法是经过长期的生产实践和科学研究而总结出来的，该工艺的特点在于工艺简单、经济、绿色环保，尤其适用于大规模生产。
本发明的目的在于提供了一种鹰嘴豆低聚肽粉，其采用GB/T22492-2008附录B中的多肽测定法和GB/T 22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法，肽含量不低于80wt％，其中85％以上肽分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下所示：
分子量Dalton分布
本发明的目的在于提供所述鹰嘴豆低聚肽粉的制备方法，包括下述步骤：将带皮的鹰嘴豆粉碎并与有机溶剂混合处理；使用碱提酸沉法得到蛋白沉淀物；蛋白沉淀物酶解；分离纯化得到低聚肽粉；优选地，所述的碱提酸沉法可以为逆流提取法或者普通提取法。
优选地，包括下述步骤：
(1)将带皮的鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉，将鹰嘴豆粉与有机溶剂按质量比为1∶3～1∶10混合，室温搅拌20～60min，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理1～2次，最后离心过滤后得到豆渣；
(2)将步骤(1)中的豆渣与其质量比为1∶5～1∶20的纯化水混合，调节pH至8～10，室温提取1～2h，提取完成后离心过滤，得到滤液；
(3)调节(2)中滤液的pH为3～5，离心弃去上清液，再使用pH为3～5纯化水清洗沉淀物1～2次，得到蛋白沉淀物；
(4)将步骤(3)中的蛋白沉淀物中加入体积比为1∶5～1∶15的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至40～55℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.1～1％蛋白酶，搅拌酶解4～6h后，煮沸灭活10～30min，离心，上清液即为蛋白酶解液；
(5)将步骤(4)中的蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，将超滤膜透过液浓缩、干燥后，得到乳白色鹰嘴豆低聚肽粉，所述微滤膜和超滤膜均为卷式膜。
优选地，本发明将鹰嘴豆粉碎、过筛，使用碱提酸沉法提取蛋白质，离心过滤，得到蛋白沉淀物；将蛋白沉淀物加水复溶、酶解，依次经过微滤膜与超滤膜高效分离纯化、浓缩，最后将蛋白复溶液和酶解浓缩液干燥，得到白色鹰嘴豆蛋白粉和乳白色鹰嘴豆低聚肽粉。鹰嘴豆蛋白的收率不少于8％，含量大于90wt％；鹰嘴豆低聚肽粉的收率在5～7％，肽含量不低于80wt％，其中85％以上肽分子量小于1500Dalton。
优选地，所述的浓缩方法可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述的干燥方法可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
本发明还提供了一种鹰嘴豆蛋白粉，其是通过下述方法制备得到：
(1)将带皮的鹰嘴豆粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉，将鹰嘴豆粉与有机溶剂按质量比为1∶3～1∶10混合，室温搅拌20～60min，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理1～2次，最后离心过滤后得到豆渣；
(2)将步骤(1)中的豆渣与其质量比为1∶5～1∶20的纯化水混合，调节pH至8～10，室温提取1～2h，提取完成后离心过滤，得到滤液；
(3)调节(2)中滤液的pH为3～5，离心弃去上清液，再使用pH为3～5纯化水清洗沉淀物1～2次，得到蛋白沉淀物；干燥，得到白色鹰嘴豆蛋白粉。
优选地，得到高纯度白色鹰嘴豆蛋白粉，产率可达8％以上，含量为90wt％以上；
优选地，得到乳白色鹰嘴豆低聚肽粉，产率可达5～7％，并测得肽含量在80wt％以上，90％以上分子量分布在1500Dalton以下，其分子量分布如下所示：
分子量Dalton分布
所述步骤(1)中的有机溶剂可以为醇类、脂类、醚类、烷烃类的一种或者它们的混合物，优选地使用乙醇溶液。
所述乙醇溶液配制使用的乙醇为食品级乙醇，乙醇溶液体积浓度为50％以上，优选地使用体积浓度为90％以上的乙醇溶液。
优选地，所述蛋白酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
所述的蛋白粉的检测方法为国家标准GB 5009.5-2010中的凯氏定氮法。
所述的多肽含量检测方法为国家标准GB/T 22492-2008附录B中的多肽测定法。
所述的多肽相对分子量分布的检测方法为国家标准GB/T22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法。
本发明还提供了一种组合物，其含有本发明所述的鹰嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉，药物或食品上可接受的助剂。
所述的组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
所述的鹰嘴豆低聚粉可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。
所述的鹰嘴豆低聚肽粉的抗氧化活性使用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、超氧阴离子自由基清除法(SRSA)以及Fe3+还原能力法(FRAP)四种方法得以验证，测试结果表明鹰嘴豆低聚肽粉具有较好的抗氧化活性。
本发明的优势在于：
1、鹰嘴豆浸泡后种皮由于非常坚韧很难去除，难以进行工业化生产。本发明所述制备方法中，将粉碎的鹰嘴豆与有机溶剂混合处理，使得鹰嘴豆不需提起去皮，适合于工业化生产。
2、现有技术中的方法一般需要经过多次酶解，且生产一个产品需要3种以上的酶才能实现，由于生产前需要对酶活力逐一测定，因此增加了成本。本发明的制备工艺中仅使用一种酶，通过一次酶解即可完成；另外，本发明也没有使用现有技术中经常使用的凝胶色谱柱，降低了成本，有利于工业化生产。
3、现有技术进行纯化时，一般采用的膜材质为陶瓷管式膜，比表面积小，单位时间内膜的流速下降快，造成过膜时间长，生产成本高。本发明所述方法使用了卷式膜，膜面积大，单位时间内流速下降比管式膜慢很多，从而节约了过膜时间，降低了成本。
4、本发明的方法同时制备得到了蛋白粉和低聚肽粉，肽含量在80wt％以上，与现有技术中的肽粉相比具有更强的自由基清楚能力。
5、本发明所得低聚肽粉未经活性碳脱色，即可直接得到乳白色肽粉。
附图说明
图1：中性蛋白酶制得肽粉液相色谱图；
图2：木瓜蛋白酶制得肽粉液相色谱图。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均购自Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic ClinicalReagents公司。
实施例1：
将带皮鹰嘴豆直接粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将100kg鹰嘴豆粉与体积浓度为95％乙醇溶液按质量比为1∶3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1∶8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；沉淀物经冷冻干燥后，得到白色鹰嘴豆蛋白粉，产率为8.4％，含量为91.6wt％。
实施例2：
将带皮鹰嘴豆直接粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将100kg鹰嘴豆粉与体积浓度为90％乙醇溶液按质量比为1∶5混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1∶10的纯化水混合，调节pH至9，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3.5，离心弃去上清液，再使用pH为3.5纯化水清洗蛋白沉淀物两遍；沉淀物经冷冻干燥后，得到白色鹰嘴豆蛋白粉，产率为8.2％，含量为92.7wt％。
实施例3：
将带皮鹰嘴豆直接粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将100kg鹰嘴豆粉与体积浓度为95％乙醇溶液按质量比为1∶3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1∶8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；在清洗后的蛋白沉淀物中加入体积比为1∶5的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至45℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.2％中性蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解4h后，煮沸灭活10min，离心，上清液即为蛋白酶解液；将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，其透过液浓缩、干燥后，得到乳白色鹰嘴豆低聚肽粉，产率可达6.3％，并测得肽含量为81.4％，至少97.33％以上分布在1500Dalton分子量以下，如表1所示。
表1中性蛋白酶所制备得鹰嘴豆肽粉的分子量分布
| 保留时间(min) | 峰面积(％) | 重均分子量Mw | 数均分子量Mn |
| 16.39 | 2.67 | 1170 | 1060 |
| 17.49 | 6.58 | 527 | 517 |
| 18.86 | 7.07 | 267 | 264 |
| 19.21 | 10.08 | 208 | 207 |
| 19.83 | 28.72 | 151 | 149 |
| 21.25 | 27.49 | 73 | 72 |
| 21.99 | 3.80 | 48 | 48 |
| 22.68 | 13.02 | 32 | 31 |
| 24.47 | 0.57 | 13 | 13 |
实施例4：
将带皮鹰嘴豆直接粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉。将100kg鹰嘴豆粉与体积浓度为95％乙醇溶液按质量比为1∶3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1∶8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；在清洗后的蛋白沉淀物中加入体积比为1∶5的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至50℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.5％木瓜蛋白酶(酶活力为50万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活10min，离心，上清液即为蛋白酶解液；将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，其透过液浓缩、干燥后，得到乳白色鹰嘴豆低聚肽粉，产率可达5.2％，并测得肽含量为83.0％，至少89.57％以上分布在1500Dalton分子量以下，如表2所示。
表2木瓜蛋白酶所制备得鹰嘴豆肽粉的分子量分布
对比实施例(专利CN104789629A所提供的方法)：
将鹰嘴豆用温水浸泡16小时，去皮，37℃烘干20h，打碎成粉状，过60目筛，得到鹰嘴豆粉，将1kg鹰嘴豆粉与10L水混合均匀，30℃保温搅拌30min，用10％氢氧化钠溶液调pH为10，离心收集上清液；调节所述上清液用1∶1的盐酸将pH调至4，30℃搅拌30min，离心收集沉淀，搅拌、离心，将沉淀与水按质量比为1∶4混合后，再次在30℃搅拌30min，离心，收集沉淀，得到鹰嘴豆蛋白沉淀物；将鹰嘴豆蛋白按质量体积比为1∶10，加水2L搅拌均匀，用10％氢氧化钠调pH值为10，加入碱性蛋白酶进行第一次酶解，碱性蛋白酶的用量为200u/g，酶解时间为60min，得到第一酶解液；调节所述第一酶解液的pH为7，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶进行第二次酶解，中性蛋白酶用量为200u/g，风味蛋白酶用量为100u/g，酶解时间为300min；将酶解液温度升至95℃，维持15min，然后冷却至室温，离心分离，收取上清液，制得酶解液；酶解液经5000rpm转速进行离心，将上清液用500nm陶瓷膜进行粗滤，收集透过液，再用50nm陶瓷膜进行精滤，透过液浓缩后，加入3g活性炭，脱色30min，过滤除去活性炭，最后经喷雾干燥制成肽粉，产率为4.6％，并测得肽含量为74.3％。通过本对比实验可知，鹰嘴豆经浸泡后，豆皮坚韧很难去除，使用此方法进行大规模生产较难实现；酶解时至少需要3种蛋白酶，酶活力需逐一测定，因而大规模生产时增加了成本；陶瓷膜为管式膜，比表面积小，单位时间内膜的流速下降快，造成过膜时间长，因而大规模生产时成本高；使用活性炭脱色时，活性炭会吸附一部分肽，造成产率不高；此方法的产品的低聚肽含量较低，仍有提高的空间。
生物活性实施例1：
FRAP Fe3+还原能力测定实验
1、FeCl3溶液(20mmol/L)：准确称取FeCl3·6H2O固体108mg于20mL的棕色容量瓶中，加15mL蒸馏水超声溶解后，蒸馏水定容。
2、三吡啶三吖嗪(TPTZ，10mmol/L)：准确称取三吡啶三吖嗪固体62.47mg于20mL的棕色容量瓶中，加40mmol/L的HCl 15mL超声溶解后，用40mmol/L的HCl定容。
3、乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.3mol/L)：准确称取无水乙酸钠24.6g于1000mL的容量瓶中，加蒸馏水700mL超声溶解后，加入冰乙酸80mL，震荡混匀后，蒸馏水定容。
4、FRAP工作液：0.3mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液、10mmol/L的三吡啶三吖嗪溶液和20mmol/L的FeCl3溶液以10∶1∶1的比例混合即得。
5、供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声溶解后，用蒸馏水定容，摇匀，即得。
6、FeSO4标准曲线的绘制：精密称取FeSO4·7H2O 27.8mg于50mL棕色容量瓶中，加30mL蒸馏水，超声5min，蒸馏水定容，摇匀，即得2mmol/L的FeSO4溶液。精密移取0.5mL、2mL、4mL、6mL、8mL于10mL棕色容量瓶中，蒸馏水定容，得1mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、12mmol/L和16mmol/L的FeSO4溶液。分别准确吸取200μL上述FeSO4溶液至25mL比色管中，加入6mL FRAP工作液，600μL的蒸馏水，混匀，37℃水浴中反应10min，于593nm处测定其吸光度并绘制标准曲线。
7、样品的测定：精密移取供试品溶液200μL于25mL比色管中，加入600μLFRAP工作液，600μL蒸馏水，混匀后，37℃水浴中反应10min，于593nm处测定其吸光度。根据标准曲线计算其还原能力，测定结果如表3所示：
表3鹰嘴豆低聚粉还原能力的测定结果
由表3可知，两种酶制备所得的鹰嘴豆低聚肽粉均具有较强的还原能力，中性蛋白酶酶解产品活性略高。
生物活性实施例2：
1、DPPH自由基清除实验
1.1DPPH乙醇溶液的配制：精密称取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL乙醇，超声30s，用乙醇定容至刻度，摇匀，待用。本品须现配现用。
1.2供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽粉，置于50mL棕色容量瓶中，加入30mL乙醇，超声5min，用乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
1.3操作步骤：准确吸取2mL供试品溶液和2mL DPPH溶液混合均匀；准确吸取2mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀；准确吸取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均匀，室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示DPPH和溶剂混合后溶液的吸光度。
2、SRSA超氧阴离子自由基清除实验
2.10.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)的配制：称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸二氢钾2.4g，三水合磷酸氢二钾23.1g，置于1000mL烧杯中，加入600mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.2，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
2.2150μmoL/L NBT溶液的配制：准确称取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.360μmoL/L PMS溶液的配制：准确称取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.4468μmoL/L NADH溶液的配制：准确称取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中，加入蒸馏水，超声使其溶解，并用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。
2.5供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
2.6工作液的配制：取1mL 0.1moL/L PBS缓冲液(pH7.4)于容量瓶中，加入1mL 150μmoL/L NBT溶液，加入2mL 468μmoL/L NADH溶液，加入1mL 60μmoL/L PMS溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，与560nm波长处测定其吸光度值。
2.7操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL上述工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL蒸馏水混合均匀；准确吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸馏水混合均匀，立即在560nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示SRSA和溶剂混合后溶液的吸光度。
3、ABTS+自由基清除实验
3.1PBS缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
3.2ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
3.3ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
3.4供试品溶液的配制：精密称取适量鹰嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
3.5操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
分别配制不同浓度的中性蛋白酶解产品和木瓜蛋白酶酶解产品、对比实施例酶解产品进行DPPH、SRSA以及ABTS+自由基清除实验，并测定其IC50值，结果如表4所示：
表4鹰嘴豆低聚粉自由基清除实验结果
由表4可知，两种酶制备所得的鹰嘴豆低聚肽粉均有较好的自由基清除活性。在DPPH自由基清除实验中，中性蛋白酶酶解产品自由基清除能力明显强于木瓜蛋白酶酶解产品，而SRSA超氧阴离子实验中，木瓜蛋白酶酶解产品超氧阴离子清除效果显著高于中性蛋白酶酶解产品。两种酶解产品对ABTS自由基清除能力相当。可见酶解时酶的种类影响产品低聚肽的生物活性。此外生物活性结果显示对比实施例的酶解产品比本发明所述方法制备所得的酶解产品活性弱，可见产品中肽的含量影响其生物活性。
Claims (4)
1.一种鹰嘴豆低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录B中的多肽测定法和GB/T 22492-2008附录A中的肽相对分子质量分布的测定法进行测定，测得肽含量为81.4％，至少97.33％以上分布在1500Dalton分子量以下，如下表所示：
所述鹰嘴豆低聚肽粉通过下述方法制备得到：
将带皮鹰嘴豆直接粉碎，过24目以上筛网从而获得鹰嘴豆粉，将100kg鹰嘴豆粉与体积浓度为95％乙醇溶液按质量比为1:3混合，室温搅拌30min，完成后，离心过滤，豆渣按以上步骤再次处理一遍，离心过滤；将豆渣与其质量比为1:8的纯化水混合，调节pH至9.5，室温提取1h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；调节滤液的pH为3，离心弃去上清液，再使用pH为3纯化水清洗蛋白沉淀物一遍；在清洗后的蛋白沉淀物中加入体积比为1:5的纯化水，搅拌均匀复溶，将蛋白复溶液加热至45℃，加入鹰嘴豆粉质量的0.2％中性蛋白酶，酶活力为40万u/g，搅拌酶解4h后，煮沸灭活10min，离心，上清液即为蛋白酶解液；将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，其透过液浓缩、干燥后，得到乳白色鹰嘴豆低聚肽粉，产率可达6.3％。
2.一种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的鹰嘴豆低聚肽粉，以及药物或食品上可接受的助剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：其剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
4.权利要求1所述的鹰嘴豆低聚肽粉可以用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的用途。
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