CN104877035B - 一种具有降糖作用的黑木耳多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑木耳多糖的提取方法：取干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎后，与去离子水混合并充分溶胀，冷冻干燥后先机械粗分，再使用高压均质机均质，所得黑木耳超细粉碎酱与新鲜的唾液充分振荡混合，加入去离子水，调pH至1.7～1.9，加入人工胃液，搅拌，水浴保温，维持体系pH为6.6～7.0，再加入胰酶溶液，搅拌，水浴保温，升温灭酶，所得混合液离心，取上清液加入硅藻土与活性炭的混合物，充分搅拌后过滤，取滤液，用聚砜膜进行膜过滤，收集小分子溶液进行干燥得到黑木耳多糖；本发明采用超低温均质技术结合唾液与人工胃液协同作用，在促使多糖充分溶出时确保多糖的降糖活性，得到的多糖纯度高、活性破坏小。

Description

一种具有降糖作用的黑木耳多糖的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种具有降糖作用的黑木耳多糖的制备方法。

(二)背景技术

黑木耳[Auricularia auricular(Hook.)Underw，简称AA]属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、木耳目(Auriculariales)、木耳科(Auriculariaceae)、木耳属(Auricularia)。我国是世界上黑木耳生产的主要国家之一，占世界黑木耳总产量的90％。

黑木耳中的糖类物质占其干重的70％左右，除含有甘露聚糖、葡聚糖、酸性多糖、几丁质、纤维素等物质外，还含有一些微量成分，如黑色素、酚类化合物等。黑木耳多糖作为具有多种生物活性的天然糖类物质，近年来关于其降血糖方面的报道不断增加，如薛惟建等(中国药科大学学报,1989,20(3):181-183)报道黑木耳多糖可明显增加小鼠Ins分泌，且口服4-7h降血糖作用最显著。Yuan ZM等(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1998,62:1898-1903)报道黑木耳多糖能显著降低小鼠血糖、尿糖水平，增强Ins分泌及肝糖原含量。Takeuchi H等(Journal of Nutritional Science and Vitaminology(Tokyo),2004,50(4):300-304)报道中性黑木耳多糖能剂量依赖地降低小鼠血糖、胰岛素、HbA1c和尿糖水平，而酸性多糖无明显降糖效果。武卓(哈尔滨工业大学硕士学位论文,2007.7)从黑木耳中分离获得一种黑木耳多糖AAP3-1(重均分子量11.9kDa)并硫酸酰化(SAAP)，发现AAP3-1和SAAP均可降低小鼠的血糖并升高肝糖原含量，且SAAP的效果优于AAP3-1。于伟(东北林业大学学报，2010,38(6):101-103)将黑木耳多糖与鹿茸提取物复配后，能极显著降低小鼠血糖、血脂(TC、TG、LDL-C)水平，提高HDL-C含量，并可调节糖尿病小鼠的饮食水平。

临床上α-葡萄糖苷酶抑制剂是治疗糖尿病的主要手段之一，其能够与小肠中α-葡萄糖苷酶的活性部位结合，通过竞争抑制α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20，α-glucosidase)，抑制酶的催化作用，阻止可消化低聚糖水解为单糖，使单糖的吸收时间延后，抑制餐后血糖水平的快速升高，降低餐后血糖。因此，可以采用多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率反应多糖的降血糖效果。

目前，多糖粗制品的制备方法大致可分为以下几类(见表1)。

表1多糖制备方法及优缺点

与其它来源的材料相比，制备黑木耳多糖具有其特殊性，这是因为黑木耳细胞壁关键组分几丁质和β-葡聚糖，质地坚韧，不易被人体所消化，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁，被人体所吸收，因而破壁处理是开展黑木耳深加工首要考虑的问题，是提取细胞内有效成分的关键步骤，破壁可使黑木耳细胞内富含的功能性成分溶出于水中，提高黑木耳的消化吸收率。同时，黑木耳是一种特殊的胶质体真菌，有别于一般常见的食用真菌(如菇类)，且其碳水化合物含量很高，随着黑木耳吸水溶胀后，可溶性部分从组织中流出，增加了提取体系的粘度，给黑木耳多糖的提取制备过程增加了难度，尤其是对于制备过程中需要利用酶催化作用的制备方法十分不利，高粘度不利于酶分子的流动性和扩散。

常见的黑木耳破壁技术：水提法、碱提法、酶解法、超声波法、微波辅助法、超微粉碎法以及复合法等。提取黑木耳多糖时要兼顾得率与活性，超低温均质技术和唾液与人工胃肠液仿生技术是保证低温有效破壁、提高得率与活性的重要手段之一。

超低温均质技术是将冷冻与粉碎均质2种单元操作相结合，使物料在冻结状态下，利用超低温的脆性实现粉碎。它可以粉碎在常温下难以粉碎的物料，使物料颗粒流动性更好、粒度分布更理想，不会因粉碎使物料发热而出现氧化、分解、变色等现象，特别适合诸如功效成分之类物料的粉碎。唾液与人工胃肠液仿生技术是模拟人体的整个消化过程，从唾液充分混合到人工胃液与人工肠液作用使多糖充分溶出。人体消化液很独特，不同于体外水溶液的特性，表现为生物活性特性、pH值特性及胃肠液分泌物质特性。如唾液中含有13种消化酶、11种矿物质、9种维生素、多种有机酸和激素等。因此，本发明采用超低温均质技术结合唾液与人工胃肠液协同作用于黑木耳，并以得率与降血糖活性为指标，使提取率和活性大为提高，对于进一步发掘黑木耳多糖的营养价值与药用价值具有实际意义。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种以黑木耳为原料，利用超低温均质技术结合唾液与人工胃肠液协同仿生提取工艺，所得黑木耳多糖得率高，降血糖活性高，工艺条件温和。

本发明采用的技术方案是：

一种黑木耳多糖的提取方法，所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)取干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过40～60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉与去离子水按1：10～12的料液质量比混合，充分溶胀后，于-80～-85℃冷冻干燥12～24h，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力10～12MPa条件下，均质5～8min，获得黑木耳超细粉碎酱；

(2)取步骤(1)所得黑木耳超细粉碎酱预热至35～40℃，再与新鲜的唾液混合，充分振荡混合10～30min得黑木耳超细粉碎酱和唾液的混合物；其中，所述黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为1～5：1；

(3)将步骤(2)黑木耳超细粉碎酱和唾液的混合物与去离子水按质量比1：3～5混合，用HCl水溶液调pH至1.7～1.9，加入人工胃液，开始磁力搅拌，速度130～180r/s，在35～40℃水浴中保温30～180min后，加入NaHCO₃溶液和或磷酸缓冲液维持体系pH为6.6～7.0，再加入终浓度为2.0wt％～3.0wt％胰酶溶液，磁力搅拌，速度130～180r/s，在35～40℃水浴中保温30～60min后，升温至85～90℃灭酶5～6min得到混合液；其中，所述人工胃液的体积用量以所述黑木耳超细粉碎酱的质量计为2～3mL/g；所述胰酶溶液的体积用量以所述黑木耳超细粉碎酱的质量计为1～2mL/g；

(4)取步骤(3)所得混合液离心，得到上清液与沉淀物，弃去沉淀物，取上清液加入硅藻土与活性炭的混合物，充分搅拌后过滤，取滤液，先用10～20kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，再进一步用50～60kD的聚砜膜进行膜过滤，收集滤过膜的小分子溶液，将收集的小分子溶液进行干燥得到黑木耳多糖。

本发明黑木耳多糖的提取方法，步骤(1)中，优选所述冷冻干燥的时间为15h。

步骤(2)中，所述新鲜的唾液按如下方法获得：健康志愿者于餐后2～2.5h首先用200～250mL蒸馏水漱口，咽下口腔内全部唾液后，口腔微张、头低位，8～10min后将下切牙与下唇之间的唾液收集于无菌试管内，收集后即刻使用。

步骤(2)中，优选所述黑木耳超细粉碎酱和唾液的质量比为4：1，振荡混合8min。

步骤(3)中，所述的人工胃液按照《中国药典》2010年版第二部中记载的标准方法配制：取稀盐酸16.4ml，加水约800ml，与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000ml即得。

步骤(3)中，加入人工胃液后，优选在所述水浴中保温120min。

步骤(3)中，优选用于调pH的HCl水溶液为1mol/L。

步骤(3)中，优选所述NaHCO₃溶液为1mol/L，优选所述磷酸缓冲液为0.1mol/L。

步骤(4)中，所述聚砜膜进行膜过滤时，优选采用切向流过滤技术，即液体流动方向与过滤方向呈垂直的过滤形式。相对于常规的垂直流过滤有着能保持稳定的过滤速度、能连续循环进行过滤和在膜表面不形成凝胶层的特点。

步骤(4)中，优选所述小分子溶液进行干燥的方法为：在-80℃冷冻4～6h后，转移到冷冻干燥机，在机器运作温度-60℃～-40℃下，冷冻干燥2～3d。

本发明采用超低温均质技术结合唾液与人工胃肠液协同作用，在促使多糖充分溶出时确保多糖的降糖活性，得到的多糖纯度高、活性破坏小。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

1)本发明所得产品纯度高，其中多糖含量可高达60％以上。

2)针对黑木耳细胞壁质地坚韧，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁的特点，筛选适用于此的超低温冷冻结合高压均质的预处理技术，以及唾液与人工胃肠液协同仿生的提取工艺，在有效破壁的基础上，可获得高生物活性的多糖，使多糖溶出量达16.41％，比传统的热水浸提机械式粉碎粗分得到的多糖提高了10.13倍，对α-葡萄糖苷酶的抑制率提高了3.17倍；比超低温冷冻结合高压均质的预处理后去离子水提取得到的多糖提高了5.16倍，对α-葡萄糖苷酶的抑制率提高了3.17倍。降糖活性与传统工艺相比有显著性差异，且工艺条件温和，不易损坏多糖的“活性中心”。

3)所采用的超低温冷冻预处理技术可以使物料颗粒流动性更好、粒度分布更理想，不会因后期粉碎使物料发热而出现氧化、分解、变色等现象，对热敏性多糖活性的保持非常适合；同时，黑木耳属胶质菌，具有韧性大，不易粉碎，粘性大的特点，而超低温冷冻处理过程中，吸附水冰点被认为是-78℃，较小直径的毛细孔隙水和吸附水在超低温度下才有可能结冰从而产生更大的静水压力和膨胀力，结合高压均质处理所产生的协同效应可以保证黑木耳壁内多糖充分溶出。

4)采用优选的唾液与人工胃液仿生提取工艺，可以真实地反映多糖在消化道内的实际情况，消化液所表现出的生物活性特性、pH值特性及分泌物质特性使破壁处理后的黑木耳多糖具有独特的溶出特性与生物活性。如正常唾液中除水分之外还含有蛋白质(黏蛋白、球蛋白)、有机物、氨基酸、碱性离子和钠、钾、镁、钙，以及淀粉酶、麦芽糖酶、磷酸酯酶、溶菌酶、过氧化物酶等，且人唾液来源丰富，易于获取。唾液结合人工胃液的仿生工艺可使获得多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率明显提高。

(四)附图说明

图1是标准葡聚糖分子量与保留时间的测定曲线；

图2是黑木耳多糖经人工胃肠液作用不同时间分子量的变化趋势；

图3是人工胃液作用黑木耳多糖不同时间分子量的变化趋势。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、材料与试剂

黑木耳(由杭州华丹农产品有限公司提供)；pNPG，购自sigma；α-葡萄糖苷酶，购自江苏锐阳生物有限公司；唾液；胃蛋白酶；胰酶；盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。

2、实验仪器

UV-2000紫外分光光度计；DFY-400粉碎机；SANYO超低温冰箱；RE-52A旋转蒸发器；JJ系列高压均质机；JP-250A-I型高速多功能粉碎机；L04型电子天平；DELTA-320型pH计；85-Z磁力搅拌器；HH-2型水浴锅；DHG-9240A型鼓风干燥箱；DL-5M离心机；拜安捷TM21455血糖仪，拜安捷TM2血糖检测试碟(葡萄糖氧化酶法)。

3、实验方法

(1)黑木耳预处理

取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻15h，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。

(2)黑木耳多糖的提取工艺

人唾液收集：健康志愿者于餐后2h首先用200mL蒸馏水漱口，咽下口腔内全部唾液后，口腔微张、头低位，10min后将下切牙与下唇之间的唾液收集于无菌试管内，收集后即刻使用。

取步骤(1)所得黑木耳超细粉碎酱300g预热至37℃，再与新鲜制备的唾液75g混合，充分振荡混合25min。将黑木耳超细粉碎酱和唾液的混合物加入去离子水1000ml中，用1M HCl调pH至1.8±0.1，加入人工胃液800ml，开始磁力搅拌，速度150r/s，在37℃水浴中保温120min后，加入100ml 1M NaHCO₃溶液和300ml 0.1M磷酸缓冲液，体系pH维持6.8，再加入300ml 2.5wt％胰酶溶液，磁力搅拌，速度150r/s，在37℃水浴中保温30min后，升温至85℃灭酶5min得到混合液。

(3)黑木耳多糖的制备

取步骤(2)所得混合液离心，得到上清液1730ml(1730g，密度以水的密度计算)，加入上清液质量5％(86.5g)的硅藻土活性炭的混合物(硅藻土与活性炭按质量比1：3混合)，充分搅拌后过滤，取滤液，用聚砜膜材料进行膜过滤，采用切向流超滤技术，先用10kD聚砜膜材料(北京特里高膜技术有限公司)进行膜过滤，压力不超过0.4MPa，收集未滤过膜的大分子浓缩溶液，再进一步用50kD的聚砜膜进行膜过滤，收集滤过膜的小分子溶液，将收集的小分子溶液进行冷冻干燥，得到黑木耳多糖4.428g。

(4)黑木耳多糖溶出量与分子量测定

黑木耳多糖采用改良的苯酚-硫酸法对其进行含量测定：

①标准曲线：取葡萄糖20mg于500mL容量瓶用蒸馏水定容，即为葡萄糖标准溶液，取2mL蒸馏水作为空白对照，依次取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL葡萄糖标准溶液，再用蒸馏水补足2mL，在9个标准样品中加入5％的苯酚1mL，95％浓硫酸5mL，摇匀，室温静置30min，然后在490nm下测量标准样品的吸光值，获得葡萄糖标准曲线回归方程为：Y＝0.0095X-0.018，R²＝0.9975，Y为吸光度，X为多糖含量(μg/mL)。

②多糖含量测定：取0.6mg步骤(3)制备的黑木耳多糖用蒸馏水配溶液1mL，定容至100mL，吸取定容后的多糖溶液0.5mL，按①中方法进行反应，然后以蒸馏水为空白对照，测试490nm处吸光值，根据葡萄糖标准曲线回归方程计算多糖含量，按公式(1)计算黑木耳多糖溶出量：

公式(1)

公式(1)中，C为经过稀释后，测定的多糖含量(μg)，V为提取后得到的上清体积(mL)，N为稀释倍数，v为用于测定的上清体积(mL)，M为供试黑木耳叶的重量(mg)。

③分子量的测定：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)，选用TSKgel Super MultiPW-M色谱柱，示差折光检测器检测，流动相为纯水，柱温40℃，流速为0.6ml/min，标准品浓度10mg/ml进样量20μ。六种标准Dextran分子量依次为M_w＝158100，M_w＝91100，M_w＝31200，M_w＝20100，M_w＝4300，M_w＝1200，M_w＝505，M_w＝180。以保留时间为横坐标，LogM为纵坐标，绘制标准曲线。待测样品按上述条件进样，求得V_R，通过标准曲线的回归方程计算多糖的分子量。

(5)黑木耳多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

①α-葡萄糖苷酶的活性测定方法

Ⅰ、反应体系：100μL酶液、0.2mL pNPG、1.7mL磷酸缓冲液(PH 5.7)、1.5mL 1M碳酸钠。

Ⅱ、酶反应条件优化

A)最佳底物浓度：设6个底物浓度梯度，即7、8、9、10、11、12mM，将100μL酶液、0.2mL各浓度的pNPG、1.7mL磷酸缓冲液加入试管，分别在49℃反应120min，加入碳酸钠1.5mL终止反应并显色，以不加酶液的空白管调零，于400nm处比色测定。

B)最佳反应时间：设10个时间梯度，即10、15、30、45、60、90、120、150、180、210min，将酶液、10mM pNPG、磷酸缓冲液加入试管，分别在49℃下反应不同时间，加入碳酸钠终止反应并显色，以不加酶液的空白管调零，于400nm比色测定。

C)最佳反应温度：设9个温度梯度，即37、40、43、46、49、52、55、58、61℃，将酶液、10mM pNPG、磷酸缓冲液加入到试管里，分别在各温度下反应120min，加入碳酸钠终止反应并显色，以不加酶液的空白管调零，于400nm比色测定。

D)最佳缓冲液pH：设9个缓冲液pH值梯度，即4、4.3、4.6、4.9、5.2、5.5、5.8、6.1、6.4，将酶液、10mM pNPG、磷酸缓冲液加入试管，分别在49℃下反应120min，加入碳酸钠终止反应并显色，以不加酶液的空白管调零，于400nm比色测定。

E)不同条件的组合试验：根据单因素实验结果，将反应时间、反应温度、底物浓度及缓冲液pH四个因素进行组合，优化反应条件。

②黑木耳多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

根据①优化的最佳反应体系，在400nm波长处测定反应中形成的硝基苯酚，硝基苯酚的形成速率与酶的活性成正比。试验设置空白组、背景组与样品组，样品组取磷酸缓冲液(pH 4.3)，多糖溶液(多糖质量为8mg)和0.1mL 50U/mLα-葡萄糖苷酶于试管中，在52℃水浴锅中预热10min，再加入已在52℃预热10min的0.2mL 10mmol/L pNPG底物，于55℃反应180min，加入1.5mL 1mol/L碳酸钠以结束反应，在400nm出测定吸光度。以蒸馏水调零，以不加酶的反应体系为背景组，以不加多糖的反应体系为空白组，计算黑木耳多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制百分率。计算公式：

抑制率(％)＝[1-(A_样-A_背景)/A_空白]×100％

4实验结果

(1)α-葡萄糖苷酶的测定体系

分别以底物浓度、反应时间、孵育温度与缓冲液pH值为单因素，考察α-葡萄糖苷酶的最佳反应体系。底物浓度增加时，酶活出现先增加后下降的趋势，底物浓度为10mmol/L时，酶活达到峰值；反应时间在90min以内时随着反应时间的延长，酶活不断缓慢上升，从90min到150min酶活增加幅度变大，150min以后酶活趋于平缓，不再增加，达到了饱和；孵育温度增加时，酶活出现先增加后下降的趋势，温度为52℃时，酶活达到峰值；缓冲液pH值增加时，酶活出现先增加后下降的趋势，pH为4.6，酶活达到峰值。根据各单因素试验结果，设计3⁴的正交试验表，不同反应条件的组合试验设计及结果见下表2。

表2酶反应不同条件的组合实验

表2结果表明，反应时间对酶活的影响最大，其次是反应温度、底物浓度、缓冲液pH，即B>A>D>C。酶反应的最佳条件为A3B3C1D2，即确定α-葡萄糖苷酶最佳酶活测定条件为：反应温度55℃、反应时间180min、缓冲液pH 4.3、底物浓度10mmol/L，以下在此条件下，测定黑木耳多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(2)分子量的测定

标准葡聚糖分子量与保留时间的测定曲线如图1所示。

由标准葡聚糖分子量与保留时间的关系拟合方程：V_T＝-2.976LogM+25.75(R²＝0.9975)，其中V_T为保留时间，M为分子量。

黑木耳多糖经超低温冷冻与高压均质预处理后，模拟人体消化的过程，首先与唾液充分混合，再在人工胃液中作用30min，然后在人工肠液中作用至180min(每30min检测多糖的变化)，通过HPLC检测峰位相对分子量的变化情况，如图2所示。

图2结果表明，黑木耳多糖在模拟人工胃液中作用15min时出现降解，持续至30min时，HPLC检测出峰时间不断延迟，至30min时分子量已由659KDa下降到273KDa，而在人工肠液中则未发生进一步降解，说明黑木耳多糖在胃酸胃酶条件下会发生降解，而在人工肠液中比较稳定，未发生变化。进一步，检测黑木耳多糖在人工胃液与肠液作用不同时间的溶出量与对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果见表3。

表3不同时间多糖的溶出量及α-葡萄糖苷酶抑制率

表3的实验结果与图2的实验结果趋势相同，即黑木耳多糖在人工胃液中随着时间延长，溶出量与对α-葡萄糖苷酶的抑制率不断增加，但在人工肠液中多糖的溶出量与对α-葡萄糖苷酶的抑制率变化很小，说明人工胃液对黑木耳多糖的溶出量与α-葡萄糖苷酶的抑制率贡献很大，而人工肠液对多糖的溶出量与α-葡萄糖苷酶的抑制率影响不大。故以下进一步增加黑木耳多糖在人工胃液中的作用时间，考察黑木耳多糖分子量，溶出量与酶抑制率的变化。黑木耳多糖经人工胃液作用不同时间分子量的变化趋势见图3。

由图3可知，当黑木耳多糖在人工胃中的作用时间延长至180min(每30min检测多糖的变化)，发现黑木耳多糖在人工胃液中作用120min后不再进一步降解，此时分子量由659KDa下降到32.9KDa，说明胃液对黑木耳多糖具有明显的降解作用。同样，检测黑木耳多糖在人工胃液作用下不同时间的溶出量与对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果见表4。

表4不同时间多糖的溶出量及α-葡萄糖苷酶抑制率

表4的实验结果与图3的实验结果趋势相同，即黑木耳多糖在人工胃液中随着时间延长，溶出量与对α-葡萄糖苷酶的抑制率不断增加，但黑木耳多糖在人工胃液中作用120min后，多糖的溶出量与α-葡萄糖苷酶的抑制率趋于平缓，增加幅度不大。故实验选择黑木耳多糖经超低温冷冻与高压均质预处理后，模拟人体消化的过程，首先与唾液按4：1充分混匀，再在人工胃液中作用120min，此时黑木耳多糖的分子量为32.9KDa，溶出量为16.41％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为44.05％。进一步对人工胃液作用的黑木耳多糖采用聚砜膜超滤技术进行纯化制备，获得的黑木耳多糖的纯度达63.87％。

比较例1

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后，取300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合，将混合物充分振荡混合25min；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量62.96％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表5。

表5不同预处理工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表5可知，黑木耳的破壁处理工艺对黑木耳内多糖的溶出量影响很大。机械粉碎时，黑木耳壁内多糖的溶出量较低。与机械粉碎相比，黑木耳超低温冷冻结合高压均质的处理工艺可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加2.29倍。由表5可知，机械粉碎时获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率低于超低温冷冻结合高压均质的处理工艺。

比较例2

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后于-80℃超低温环境下冷冻15h，取出经机械粗粉碎后，取300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合，将混合物充分振荡混合25min；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量63.14％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表6。

表6不同预处理工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表6可知，黑木耳的破壁处理工艺对黑木耳内多糖的溶出量影响较大，黑木耳单纯经超低温冷冻处理时壁内多糖的溶出量不高。与单纯超低温冷冻处理相比，黑木耳超低温冷冻结合高压均质的处理工艺可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加1.46倍。由表6可知，单纯超低温冷冻处理获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率略低于超低温冷冻结合高压均质的处理工艺。

比较例3

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后，使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，取300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合，将混合物充分振荡混合25min；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量63.02％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表7。

表7不同预处理工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表7可知，黑木耳的破壁处理工艺对黑木耳内多糖的溶出量影响较大，黑木耳单纯经高压均质处理时壁内多糖的溶出量不高。与单纯高压均质处理相比，黑木耳超低温冷冻结合高压均质的处理工艺可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加1.65倍。由表7可知，单纯超高压均质处理获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率略低于超低温冷冻结合高压均质的处理工艺。

比较例4

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后于-80℃超低温环境下冷冻15h，取出机械粗分后，进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，取300g预热至37℃，加入去离子水1000ml；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量63.62％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表8。

表8不同提取工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表8可知，黑木耳的提取工艺对黑木耳内多糖的溶出量有一定影响，黑木耳单纯经人工胃液提取时壁内多糖的溶出量较高。与单纯人工胃液提取相比，黑木耳经唾液与人工胃液连续提取可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加1.33倍。由表8可知，单纯人工胃液提取获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率略低于唾液与人工胃液的连续提取工艺。

比较例5

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后于-80℃超低温环境下冷冻15h，取出机械粗分后，进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，取300g预热至37℃，加入去离子水1800ml，开始磁力搅拌，速度150r/s，在37℃水浴条件下提取120min，离心，加入上清液质量5％的硅藻土活性炭的混合物；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量62.42％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表9。

表9不同提取工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表9可知，黑木耳的提取工艺对黑木耳内多糖的溶出量有很大影响，黑木耳经去离子水提取时壁内多糖的溶出量较低。与去离子水提取相比，黑木耳经唾液与人工胃液连续提取可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加5.16倍。由表9可知，唾液与人工胃液的连续提取获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率比去离子水提取高2.23倍。

比较例6

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤(1)中，取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉；将黑木耳粉加入1000mL去离子水中充分溶胀后，取300g加入去离子水1800ml，开始磁力搅拌，速度150r/s，在80℃水浴条件下提取120min，离心，加入上清液质量5％的硅藻土活性炭的混合物；后续的步骤与操作都同实施例1。采用该工艺得到黑木耳多糖含量58.43％，黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率见下表10。

表10不同提取工艺黑木耳多糖的溶出量与酶抑制率

由表10可知，黑木耳的提取工艺对黑木耳内多糖的溶出量有很大影响，黑木耳单纯经去离子水提取时壁内多糖的溶出量很低。与单纯去离子水提取相比，黑木耳经唾液与人工胃液连续提取可使黑木耳壁内多糖的溶出量增加10.13倍。由表10可知，唾液与人工胃液的连续提取获得的黑木耳多糖，其α-葡萄糖苷酶的抑制率比单纯去离子水提取高3.17倍。

实施例2

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻12h，其他操作和条件仍同实施例1，得到产物14.76g，其中黑木耳多糖含量62.84％，黑木耳多糖的溶出量为14.76％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为43.77％。

实施例3

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻24h，其他操作和条件仍同实施例1，得到产物16.31g，其中黑木耳多糖含量63.75％，黑木耳多糖的溶出量为16.31％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为44.02％。

实施例4

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻15h，取出机械粗分后，使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min。取经预处理后的黑木耳超细粉碎酱300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合(预处理后的黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为1:1)，将混合物充分振荡混合10min。其他操作和条件同实施例1，得到产物15.72g，其中黑木耳多糖含量63.32％，黑木耳多糖的溶出量为15.72％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为43.67％。

实施例5

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻15h，取出机械粗分后，使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min。取经预处理后的黑木耳超细粉碎酱300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合(预处理后的黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为5:1)，将混合物充分振荡混合30min。其他操作和条件同实施例1，得到产物16.11g，其中黑木耳多糖含量63.74％，黑木耳多糖的溶出量为16.11％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为43.85％。

实施例6

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻15h，取出机械粗分后，进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min。取经预处理后的黑木耳超细粉碎酱300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合(预处理后的黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为4:1)，将混合物充分振荡混合25min。将黑木耳超细粉碎酱与唾液的混合物加入去离子水1000ml，加入1M HCl调pH1.8±0.1，加入人工胃液600ml，开始磁力搅拌，其他操作和条件同实施例1，得到产物15.86g，其中黑木耳多糖含量63.51％，黑木耳多糖的溶出量为15.86％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为43.58％。

实施例7

实验操作同实施例1，即取100g干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉加入1000mL去离子水中，充分溶胀后，于-80℃超低温环境下冷冻，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min，获得黑木耳超细粉碎酱967g。所不同的是取黑木耳子实体在-80℃超低温冷冻15h，取出机械粗分后，进一步使用高压均质机，在均质压力12MPa条件下，均质6min。取经预处理后的黑木耳超细粉碎酱300g预热至37℃与新鲜制备的唾液混合(预处理后的黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为4:1)，将混合物充分振荡混合25min。将黑木耳超细粉碎酱与唾液的混合物加入去离子水1000ml，加入1M HCl调pH1.8±0.1，加入人工胃液1000ml，开始磁力搅拌，其他操作和条件同实施例1，得到产物16.23g，其中黑木耳多糖含量63.76％，黑木耳多糖的溶出量为16.23％，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为43.75％。

Claims (8)

1.一种黑木耳多糖的提取方法，其特征在于，所述的提取方法按如下步骤进行：

(1)取干燥黑木耳子实体经机械粗粉碎，过40～60目筛，获得黑木耳粉，将所得黑木耳粉与去离子水按1：10～12的料液质量比混合，充分溶胀后，于-80～-85℃冷冻干燥12～24h，之后先机械粗分，再进一步使用高压均质机，在均质压力10～12MPa条件下，均质5～8min，获得黑木耳超细粉碎酱；

(2)取步骤(1)所得黑木耳超细粉碎酱预热至35～40℃，再与新鲜的唾液混合，充分振荡混合10～30min得黑木耳超细粉碎酱和唾液的混合物；其中，所述黑木耳超细粉碎酱与唾液的质量比为1～5：1；

(3)将步骤(2)黑木耳超细粉碎酱和唾液的混合物与去离子水按质量比1：3～5混合，用HCl水溶液调pH至1.7～1.9，加入人工胃液，开始磁力搅拌，速度130～180r/s，在35～40℃水浴中保温30～180min后，加入NaHCO₃溶液和磷酸缓冲液维持体系pH为6.6～7.0，再加入终浓度为2.0wt％～3.0wt％胰酶溶液，磁力搅拌，速度130～180r/s，在35～40℃水浴中保温30～60min后，升温至85～90℃灭酶5～6min得到混合液；其中，所述人工胃液的体积用量以所述黑木耳超细粉碎酱的质量计为2～3mL/g；所述胰酶溶液的体积用量以所述黑木耳超细粉碎酱的质量计为1～2mL/g；

(4)取步骤(3)所得混合液离心，得到上清液与沉淀物，弃去沉淀物，取上清液加入硅藻土与活性炭的混合物，充分搅拌后过滤，取滤液，先用10～20kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，再进一步用50～60kD的聚砜膜进行膜过滤，收集滤过膜的小分子溶液，将收集的小分子溶液进行干燥得到黑木耳多糖。

2.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(1)中，所述冷冻干燥的时间为15h。

3.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(2)中，所述新鲜的唾液按如下方法获得：健康志愿者于餐后2～2.5h，首先用200～250mL蒸馏水漱口，咽下口腔内全部唾液后，口腔微张、头低位，8～10min后将下切牙与下唇之间的唾液收集于无菌试管内，收集后即刻使用。

4.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(3)中，加入人工胃液后，所述在水浴中保温的时间为120min。

5.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(3)中，用于调pH的HCl水溶液为1mol/L。

6.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(3)中，所述NaHCO₃溶液为1mol/L，所述磷酸缓冲液为0.1mol/L。

7.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(4)中，所述聚砜膜进行膜过滤时，均采用切向流过滤技术，即液体流动方向与过滤方向呈垂直的过滤形式。

8.如权利要求1所述的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于步骤(4)中，所述小分子溶液进行干燥的方法为：在-80℃冷冻4～6h后，转移到冷冻干燥机，在机器运作温度-60℃～-40℃下，冷冻干燥2～3d。