CN101961355A - 联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,该中药提取方法主要包括以下的步骤:在不同消化阶段按照不同消化器官在一定时间内分泌出的消化液的成份和量,加入相应的仿生消化液(模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液和模拟胆汁),再根据中药不同剂型在人体消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间,获得全仿生消化液;而后以单层脂质体-水分配体系模拟全仿生消化液在人体胃肠中的分配、吸收情况,得到负载有中药有效成分群的单层脂质体。本发明联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术,反应条件温和,具有保持天然产物构象及有效成分原有药效的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取方法,具体地涉及一种联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法。
背景技术
中药的成分异常复杂,且多种有效成分在进入人体后相互配合、协同作用,而后起到疾病的治疗作用。传统的提纯分离技术(如煎煮法、回流、浸渍、渗漉等)和现代中药提纯分离技术(如超微粉碎技术、超临界萃取技术、逆流动态提取技术、吸附分离纯化技术、膜分离技术、多效薄膜浓缩干燥技术、真空带式干燥技术、计算机控制技术等)均沿用“纯粹”、“传统”的物理及化学手段,与吸收入人体的中药有效成分的协同作用无关,因此易破坏中药有效成分的结构或组成,难以将中药中含有的有效成分完全提取出来。
仿生提取法(Bionic Extration method)则与上述提纯方式不同,它是从生物药剂学的角度将整体药物研究法与分子药物研究法相结合仿生提取法,它特别适用于中药复方中有效成分的提取,中药复方是中医临床用药的一大特点,其化学成分非常复杂,很难用现代提纯分离技术提纯的某一成分的药效和药代参数来代表整个中药复方。基于中药复方中部分有效成分已知,部分有效成分未知的现实,SBE法坚持“有成分论,不唯成分论,重在基体的药效学反应”的基本原则(郁威,中药提取分离技术原理与应用,中医药出版社:2005,364-369),由于中药大多使用口服吸收,因此,仿生提取法主要模仿口服药物在口腔、胃肠道中的吸收环境,以得到有效成分含量高的活性中药提取液。
但是,现有的仿生提取技术仅仅停留在将中药中的有效成分萃取到胃、肠等仿生液中,而上述仿生提取液存在溶液量大、口感差、易发生胃肠不适等的问题,无法像水煎剂一样直接口服使用;当然,也可以将其浓缩、或将其烘干,但是,由于上述仿生液中带有大量的生物酶及一系列成分复杂的化合物,在加热的过程中,其中所含有的有效成分易发生副反应(如水解反应等),导致有效成分的含量降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,以解决现有技术中存在的上述问题。本发明联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术,反应条件温和,可保持天然产物构象及有效成分原有药效。
本发明提供的技术方案如下:
联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于,它包括以下的步骤:
1)在一容器中加入中药,而后加入模拟唾液,在36~38℃下振荡3~6分钟;
2)而后向上述容器中加入模拟胃液,在36~38℃下继续振荡1~4小时,获得中药的体外胃仿生消化液;
3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁,在36~38℃下继续振荡5~10小时,而后使用孔径为0.45μm的滤膜抽滤,获得体外胃肠全仿生消化液;
4)取蛋黄卵磷脂,将其溶于氯仿中,获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液;将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中,在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发,使之形成均匀的多层脂质膜,而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化;向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消化液,将其加入水浴恒温振荡器中,在36~38℃下振荡,使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中,而后在-80~-71℃冷冻1h,在36~38℃下融化,反复冻融3次后,得到含单层脂质体的冻融液,该单层脂质体中负载有中药有效成分群;
5)依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤冻融液,从溶液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体(单层脂质体粒径为0.3~0.35μm)。
本发明建立体外全仿生消化技术并应用于中药提取的前处理,即一句化学仿生(人工胃、人工肠)与医学仿生(酶的作用)原理,建立人体仿生消化体系:在不同消化阶段按照不同消化器官在一定时间内分泌出的消化液的成份和量,加入相应的仿生消化液,再根据中药不同剂型在人体消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间,并模拟消化器官有规律的蠕动,建立中药材和中药水煎液的模拟消化过程,以此来获得全仿生消化液,该全仿生消化液更接近药物在体内达到平衡后的有效成分群,合乎中医药理论的系统观、整体观;另外,鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜,因此,本发明建立细胞膜仿生萃取技术,提取可与模拟细胞膜(即单层脂质体)结合的有效成分群,达到中药成份的活性化、浓缩化,并具有可直接吸收的特点。模拟唾液、模拟胃液,模拟十二指肠液和模拟胆汁的组成成分及制备方法可如表1中所示:
表1 模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液及模拟胆汁的组成成份及制备方法
需要说明的是,人体在患病时,特别是患有消化系统疾病时,消化、吸收能力下降,影响药物的吸收,而本方法中获得的负载有中药有效成分群的单层脂质体具有高度活性化、浓缩化、可直接吸收的特点,有助于保证药效,并减轻消化系统负荷。
在推荐的实施例中,还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为0.45μm的滤膜过滤的步骤。
本发明中涉及的中药可以是中药材或中药复方的粉剂或水煎液等,且每日/每次给药量的粉剂或水煎液中均含有有效剂量的药物有效成分,在使用粉剂时,每克粉剂中依次加入模拟唾液2.0~3.0mL,模拟胃液90~110mL,模拟十二指肠液110~135mL和模拟胆汁40~60mL;在使用水煎液时,每mL水煎液中依次加入模拟唾液0.01~0.03mL,模拟胃液0.5~0.7mL,模拟十二直肠液0.7~0.9mL和模拟胆汁0.28~0.35mL。另外,相对于粉剂而言,水煎剂在模拟胃液、模拟十二直肠液和模拟胆汁中的消化时间均有所下降。
本发明中使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比是0.01g/1000mL。
本发明中所述的超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除,又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水,电阻率大于18MΩ*cm,或接近18.3MΩ*cm极限值。
与现有技术相比,本发明以单层脂质体为细胞生物膜模型,以单层脂质体-水分配体系模拟中药粉剂及水煎液在胃、肠中的全仿生消化液分别在人体胃肠中的分配、吸收情况,以单层脂质体为固相萃取剂,提取负载有中药有效成分群的单层脂质体,更合乎中医药理论的系统观、整体观。本发明联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术,反应条件温和,具有保持天然产物构象及有效成分原有药效的有益效果。
具体实施方式
实施例1
按传统煎煮方法获得中药水煎液,称取黄芪粉末300g,放入600mL的烧杯中,每次加超纯水400mL,加热至沸腾并保持微沸约1h,煎煮三次,合并三次煎煮液并加热浓缩,用0.45μm滤膜过滤定容至1000mL,获得黄芪的水煎液1000mL;
取黄芪的水煎液250mL加入容量瓶中,而后向其中加入模拟唾液5mL,在37℃下恒温下振荡5min;而后加150mL模拟胃液,继续在37℃下振荡2h,获得405mL体外胃仿生消化液;
在所获得的405mL黄芪水煎液体外胃仿生消化液中,加入195mL十二指肠模拟液和75mL模拟胆汁,在37℃下继续振荡7h,取消化液用0.45μm滤膜抽滤,获得675mL体外胃肠全仿生消化液;将体外胃肠全仿生消化液在4℃下恒温保存。
取0.250mg蛋黄卵磷脂,将其溶于5mL氯仿中,获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液;将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中,在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发10min,使之形成均匀的多层脂质膜,而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化;向其中加入上述步骤中获得的全仿生消化液25mL,将其加入水浴恒温振荡器中,在37℃下振荡0.5h,使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中,而后在-71℃冷冻1h,在37℃下融化,反复冻融3次后,得到含单层脂质体的冻融液,该单层脂质体中负载有中药有效成分群;依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤所获得的全部冻融液,从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体(固体,粒径为0.3~0.35μm),冷冻干燥后得到1.25mg负载有黄芪水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂质体;而后重复上述步骤,每次加全仿生消化液25mL,直到675mL的胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体。
取黄芪水煎液25mL浓缩成5mL的黄芪浓缩液,作为对照例备用。
实施例2
按传统煎煮方法获得双黄连水煎液,称取金银花375g、黄芩375g和连翘750g,放入600mL的烧杯中,每次加超纯水400mL,加热至沸腾并保持微沸约1h,煎煮三次,合并三次煎煮液并加热浓缩,用0.45μm滤膜过滤定容至1000mL,获得双黄连水煎液1000mL;
取双黄连水煎液250mL加入容量瓶中,向其中加入模拟唾液2.5mL,在36℃下恒温下振荡6min;而后加125mL模拟胃液,继续在36℃下振荡4h,获得377mL体外胃仿生消化液;
向上述获得377mL体外仿生胃消化液中,加入178mL十二指肠模拟液和70mL模拟胆汁,在36℃下继续振荡10h,取消化液用0.45μm滤膜抽滤,获得625mL体外胃肠全仿生消化液;将全仿生消化液在4℃下恒温保存。
取0.250mg蛋黄卵磷脂,将其溶于5.00mL氯仿中,获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液;将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中,在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发10min,使之形成均匀的多层脂质膜,而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化;向其中加入上述步骤中获得的全仿生消化液25mL,将其加入水浴恒温振荡器中,在36℃下振荡0.8h,使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中,而后在-80℃冷冻1h,在36℃下融化,反复冻融3次后,得到含单层脂质体的冻融液,该单层脂质体中负载有中药有效成分群;依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤所得的全部冻融液,从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体(固体,粒径为0.3~0.35μm),冷冻干燥后得到1.65mg负载有双黄连水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂质体。而后重复上述步骤,每次加体外胃肠全仿生消化液25mL,直到625mL的胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体。
取25mL双黄连水煎液浓缩成5mL双黄连浓缩液,作为对照例备用。
实施例3
准确称取2.50g桃仁粉末于1000mL容量瓶,加7.5mL唾液,在38℃水浴恒温下振荡3min后,加270mL胃液,继续在38℃下振荡1h,获得桃仁粉末的胃仿生消化液,往其中加332.5mL十二指肠液和140mL胆汁,继续在38℃下振荡5h,用0.45μm滤膜抽滤,获得桃仁粉末的胃肠全仿生消化液750mL,于4℃下保存待用。
取0.250mg蛋黄卵磷脂,将其溶于5.00mL氯仿中,获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液;将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中,在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发10min,使之形成均匀的多层脂质膜,而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化;向其中加入上述步骤中获得的全仿生消化液25.00mL,将其加入水浴恒温振荡器中,在38℃下振荡0.8h,使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中,而后在-75℃冷冻1h,在38℃下融化,反复冻融3次后,得到含单层脂质体的冻融液,该单层脂质体中负载有中药有效成分群,依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤所得的全部冻融液,从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体(固体,粒径为0.3~0.35μm),冷冻干燥后得到0.75mg负载有桃仁粉末仿生消化液中有效成分群的单层脂质体。而后重复上述步骤,每次加全仿生消化液25mL,直到750mL的胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体约22.5mg。
试验例1
本试验例探讨实施例1中负载有黄芪水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂质体对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用,并使用实施例1中浓缩的黄芪水煎液为对照进行试验。
本试验例采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤为模型,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,HE染色法对肝脏作病理检查。结果负载有黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体喂食小鼠后能显著降低小鼠血清ALT、AST、肝匀浆MDA水平,升高SOD和GSH-Px酶活性,减轻肝细胞损伤。比单纯黄芪水煎液喂食小鼠,作用时间短,疗效更显著。
实验方法
分组与给药 KM清洁剂小鼠90只,雄性,体重(18~22)g,按体重随机分成4组,分别为正常组、CCl4模型组、25mL黄芪浓缩液组、负载25mL黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体。造模前灌胃给药,负载25mL黄芪水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂质体冷冻干燥后称重后以每次1.25mg/kg灌胃,25mL黄芪水煎液组浓缩成5mL后,以5mL/kg灌胃,每天给药1次,连续7d,正常对照组和模型组给予等量溶媒。
末次给药后1h,除正常组外,其它各组小鼠按10ml/kg体重腹腔注射0.1%CCl4精制花生油溶液,正常组注射相应体积的生理盐水,禁食18h后,自小鼠后眼眶静脉丛采血,取肝脏、脾脏、胸腺称重作相关指标检测。
观察指标 (1)收集血液,分离血清检测ALT、AST水平;(2)取肝脏、脾脏、胸腺称重,计算肝脏、脾脏、胸腺指数。
(3)取肝右叶制备10%肝匀浆,分别采用相关试剂盒测MDA、SOD、GSH-Px。(4)取肝左叶经10%甲醛固定,进行组织病理学检查。
1、黄芪提取物对小鼠血清转氨酶的影响
表2结果显示,模型组小鼠血清ALT、AS水平显著升高。与模型组比较,黄芪水煎液和负载有黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体均均能降低CCl4升高的ALT、AST水平。
注:与正常组比较,##P<0.05;与模型组比较,* *P<0.01。
2、黄芪提取物对小鼠肝、脾、胸腺指数的影响
表3的结果表明,与正常组相比较,模型组小鼠的肝脏、脾脏和胸腺指数均显著升高。与模型组比较,负载有黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体能显著降低CCl4升高的肝指数,升高胸、腺、脾指数。
注:与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,* *P<0.01。
3、黄芪提取物对肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px的影响
表4的结果表明,CCl4使小鼠肝匀浆中SOD和GSH-Px酶活性显著下降,同时MDA含量显著升高,给予负载有黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体可显著升高肝脏GSH-Px酶活性,降低MDA水平还可显著升高SOD酶活性。
表4 黄芪水煎液及有效成分群的单层脂质体对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆MDA,SOD和GSH-Px水平的影响
注:与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,* *P<0.01。
4、黄芪提取物对小鼠肝脏病理的影响
表5显示,正常肝组织未见明显病理改变,模型组肝内出现弥漫性分布的肝细胞变性坏死,炎细胞呈弥漫性浸润。黄芪水煎液及负载黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体组均可降低肝脏组织病理评分、减轻组织病变范围与程度,使炎细胞浸润减少。负载黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体减轻组织病变能力与程度都加强。
注:与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05。
结论:黄芪提取物能显著降低CCl4诱导的急性化学性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平;降低肝匀浆CCl4升高的MDA水平,并且升高SOD和GSH-Px酶活性;病理组织学结果表明,黄芪水煎液及负载黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体能使CCl4诱导的肝细胞损伤减轻,且负载黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体对肝损伤的保护作用更显著,提示在人体及动物病理状态下,对负载药物有效成分群的单层脂质体吸收更好,药效增强。在较小的剂量范围使用,减轻了药物的毒性。
试验例2
本试验例考察了实施例3中桃仁粉末及负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液单层脂质体的抗大鼠心肌缺血作用。
桃仁粉末以生药2.5g/Kg/天给大鼠灌胃,负载2.5g桃仁粉末有效成分群体外胃肠全仿生消化液单层脂质体干燥粉末以22.5mg/Kg/天给大鼠灌胃,连续5d,末次给药1h后,结扎冠状动脉造成大鼠急性心肌梗塞。观察结扎冠脉后48h内的ECG(II)、血清CPK、LDH和心梗面积的变化,比较桃仁粉末及负载桃仁有效成分群体外胃、肠全仿生消化液单层脂质体对抗心肌缺血损伤的作用。
结果:负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液单层脂质体能降低急性心肌梗塞大鼠心电图ST段的抬高,抑制血清中CPK、LDH的升高,降低冠状动脉结扎造成的急性心肌梗塞大鼠的梗塞面积(P<0.05)。桃仁粉末对这些心肌缺血性指标效果不明显。提示负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液单层脂质体对心肌缺血损伤具有良好的改善作用。
数据分析
1、对心肌梗塞大鼠ECG(II)的影响
结扎冠状动脉左前降支(LAD)后2、24、48h时记录ECG(II),然后测量心电图纸上ST段上移的幅度,以1mV=20mm计算ST段升高的平均值ST(mV)数作为评价指标。结果显示负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液单层脂质体心肌梗塞大鼠ECG(II)的ST段有降低作用(P<0.05)。桃仁粉末效果不明显(表6)。
与模型组比较,*P<0.05,* *P<0.01
2、对血清CPK,LDH及心肌梗塞面积的影响
结果表明负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液冻融液固体组与硝苯地平组可降低血清CPK、LDH和减少心肌梗死面积(P<0.05或P<0.01),桃仁水提取物组虽可使心梗面积减少(P<0.05),但对血清CPK和LDH的升高未见有明显的降低作用,其他组与模型组比较未见对血清CPK、LDH和心肌梗死面积有明显的影响。提示负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液冻融液固体对大鼠急性心肌梗塞有较好的防治作用(表7)。
表7 桃仁及负载桃仁有效成分群体外胃肠全仿生消化液冻融液固体对大鼠急性心肌梗塞的作用效果
与模型组比较,*P<0.05,* *P<0.01
由于桃仁的化学成分较复杂,其活血化瘀具体作用部位及有效成分仍不太清楚,为了更好地发挥桃仁在临床治疗的应用,充分发挥其疗效,本研究采用了结扎大鼠冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死模型,把桃仁粉末制成负载桃仁有效成分群的单层脂质体药物,观察了桃仁粉末与负载桃仁有效成分群的单层脂质体对实验性心肌缺血损伤的保护作用。实验中以大鼠的心电图ST段变化的幅度作为指标,结果发现负载桃仁有效成分群的单层脂质体对结扎大鼠冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死引起心电图ST段的升高有明显的降低作用,且可降低血清CPK、LDH和减少心肌梗死面积。而桃仁粉末效果不显著。这提示负载桃仁有效成分群的单层脂质体能更好被活体胃肠吸收,药效加强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于,
它包括以下的步骤:
1)在一容器中加入中药,而后加入模拟唾液,在36~38℃下振荡3~6分钟;
2)而后向上述容器中加入模拟胃液,在36~38℃下继续振荡1~4小时,获得中药的体外胃仿生消化液;
3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁,在36~38℃下继续振荡5~10小时,而后使用孔径为0.45μm的滤膜抽滤,获得体外胃肠全仿生消化液;
4)取蛋黄卵磷脂,将其溶于氯仿中,获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液;将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中,在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发,使之形成均匀的多层脂质膜,而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化;向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消化液,将其加入水浴恒温振荡器中,在36~38℃下振荡,使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中,而后在-80~-71℃冷冻1h,在36~38℃下融化,反复冻融3次后,得到含单层脂质体的冻融液,该单层脂质体中负载有中药有效成分群;
5)依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤冻融液,从溶液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体。
2.根据权利要求1中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于:还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为0.45μm的滤膜过滤的步骤。
3.根据权利要求2中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于:所述的中药为粉剂,每克粉剂中所依次加入的模拟唾液为2.0~3.0mL,模拟胃液为90~110mL,模拟十二指肠液为110~135mL,模拟胆汁为40~60mL。
4.根据权利要求2中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于:所述的中药为水煎液,每mL水煎液中所依次加入的模拟唾液为0.01~0.03mL,模拟胃液为0.5~0.7mL,模拟十二直肠液为0.7~0.9mL和模拟胆汁为0.28~0.35mL。
5.根据权利要求3或4中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法,其特征在于:所使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比是0.01g/1000mL。
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