CN104435314A - 一种治疗骨关节病的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种用于治疗骨关节病的药物组合物。本发明所述药物组合物的原料药组成为：狗脊、淫羊藿、独活、骨碎补、续断、桑寄生、鸡血藤、熟地黄、木香、以及乳香挥发油、没药挥发油和补骨脂炮制品。所述药物组合物不仅有效治疗肝肾不足、气滞血瘀、脉络痹阻所致的骨性关节炎和腰肌劳损，并且有效减少了原产品的肝毒性副作用，具有更好的临床治疗效果。

Description

一种治疗骨关节病的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种用于治疗骨关节病的药物组合物及其应用。

背景技术

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性关节疾病，其主要病变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生。退行性骨关节病是指人体出现的一系列退行性病变，如关节疼痛、僵硬及活动受限等，是一种综合性疾病。其在50岁以上的人群中，发病率仅次于心脏病，在65岁以上人群中的发病率高达60-90％，特别是给中老年人的生活带来了极大的痛苦及不便。

腰肌劳损也是腰疼病中最常见的一种疼痛，常被用作没有器质性改变的慢性腰背疼痛的总称。腰肌劳损是由很多原因引起的，其疼痛长期反复发作，腰部酸痛或胀痛。临床表现为，活动过度、弯腰过久则疼痛加重，直腰困难，阴冷、潮湿的天气会加重病症。

对于上述骨性关节炎及腰肌劳损症状，中国专利CN1931277A公开了一种治疗骨关节病的药物组合物。所述药物组合物由狗脊、淫羊藿、独活、骨碎补、续断、补骨脂、桑寄生、鸡血藤、熟地黄、木香、乳香、没药十二味中药组成，具有补益肝肾，养血活血，舒筋活络，理气止痛等功能，主要用于肝肾不足，血瘀气滞，经络痹阻所致的骨性关节炎、腰肌劳损等症。且动物及临床试验显示，该药物对骨性关节炎、腰肌劳损具有确切的疗效，并获得广大患者的青睐。

然而，上述药物在临床使用过程中发现存在一定的肝损伤不良反应，为此，在保证药效的前提下，通过工艺改进对其进行降低肝损伤研究是迫切需要解决的问题。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中治疗骨关节病的药物存在一定的肝损伤不良反应的问题，进而开发一种肝损伤较低的、可有效治疗骨关节病的药物组合物。

为解决上述技术问题，本发明所述的治疗骨关节病的药物组合物的原料药组成为：

狗脊290-864重量份、淫羊藿154-520重量份、独活154-520重量份、骨碎补224-692重量份、续断290-864重量份、桑寄生290-864重量份、鸡血藤154-520重量份、熟地黄692-2076重量份、木香154-520重量份、以及乳香挥发油、没药挥发油和补骨脂炮制品；

其中，所述乳香挥发油由154-520重量份乳香提取得到；所述没药挥发油由154-520重量份没药提取得到；所述补骨脂炮制品为水提154-520重量份补骨脂弃去水提液后的药渣。

优选的，所述药物组合物的原料药组成为：

狗脊576.8重量份、淫羊藿346.1重量份、独活346.1重量份、骨碎补462.0重量份、续断576.8重量份、桑寄生576.8重量份、鸡血藤346.1重量份、熟地黄1384.2重量份、木香346.1重量份、以及乳香挥发油、没药挥发油和补骨脂炮制品；

其中，所述乳香挥发油由346.1重量份乳香加水进行水蒸气蒸馏提取得到；所述没药挥发油由346.1重量份没药加水进行水蒸气蒸馏提取得到；所述补骨脂炮制品为水提346.1重量份补骨脂弃去水提液后的药渣。

所述乳香和/或没药为醋炙。

进一步的，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加水进行水蒸气蒸馏提取，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加水提取，弃去水提液后收集药渣，得到补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

优选的，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加8-12倍量水进行水蒸气蒸馏提取8-15小时，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加6-10倍量水提取1-3次，每次0.5-2小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

更优的，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加10倍量水进行水蒸气蒸馏提取12小时，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加8倍量水提取2次，每次1小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

所述步骤(1)中，制备所述挥发油包合物的常规辅料包括但不限于β-环糊精、水和乙醇。

所述步骤(1)中，所述挥发油、β-环糊精、水和乙醇的质量比为1：8-12：16-24:1-2。

本发明还提供了一种由所述药物组合物添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受的口服制剂。

本发明还提供了一种所述药物组合物在制备治疗骨关节病药物中的用途。

本发明所述治疗骨关节病的药物组合物由补骨脂、骨碎补、续断、淫羊藿、独活、木香、鸡血藤和狗脊等药材组成，主要用于肝肾不足、气滞血瘀、脉络痹阻所致的骨性关节炎和腰肌劳损等症。本发明所述药物组合物以乳香和没药的挥发油、以及补骨脂炮制品入药，在保持原有产品药效的基础上，进一步大大降低了原产品的肝毒性副作用，使得产品具有更好的药用价值及市场前景。

实验例

实验例1药效学实验

1材料

1.1动物

Hartley豚鼠，普通级，SD大鼠、KM小鼠，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK(京)2009-0004；饲养于天津中医药大学实验动物中心，保持动物房安静，通风，干燥，室温18～25℃，湿度40％～70％，自由摄食、饮水。

1.2受试药

实施例1所制备新工艺丸剂；

壮骨关节丸，华润三九医药股份有限公司。

实验给药剂量参考壮骨关节丸的临床人用剂量：12g/d，实验中的各给药剂量都按照不同种属动物折合成相应的给药剂量。

1.3试剂

盐酸氨基葡萄糖胶囊(浙江诚意药业有限公司)；

木瓜蛋白酶，泊洛沙姆P407(Sigma公司)；

0.5％伊红染色液，苏木素染色液(武藤化学株式会社)；

基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-1抑制剂(TIMP-1)Elisa试剂盒(Cusabio)；TIMP-1和MMP-3ELISA试剂盒(武汉优尔生公司)；UNIQ-10column Trizol总RNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；mProm Ⅱ Reverse Transcription System逆转录试剂盒(Promega)；FastStart Universal CYBR Green试剂盒(Roche)；BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)；

碱性磷酸酶(AKP)，南京建成生物工程研究所；

苯扎溴铵溶液，江西京东药业有限公司；

注射用青霉素钠，中诺药业(石家庄)有限公司；

冰醋酸，天津市化学试剂一厂；

甲醛，天津市风船化学试剂科技有限公司；

二甲苯，天津市津被精细化工有限公司。

1.4仪器

JJ3000电子天平、JJ2000精密电子天平(常熟双杰测试仪器厂)；

YLS-Q4耳肿打孔器(济南益延科技发展有限公司)；

HSS-1(B)恒温浴槽(成都仪器厂)；

MEK-6318K型血细胞分析仪(日本光电工业株式会社)；

核酸蛋白分析仪-DU800，Allegra 64R High-Speed Centrifuge(BeckmanCoulter)；Real-time RT-PCR System，Prism7500(Applied Biosystem)；PCR-C1000型PCR仪，C1000Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)；FlexStation3多功能酶标仪(Molecular Devices)；MODEL 1012型杂交箱(SHEL LAB)；ASP300S全自动封闭脱水机，RM2135切片机(Leica)；BMJ-1生物组织包埋机(天津航空机电公司)；照相显微镜(OLYMPUS)；超声破碎仪(UIBRA)；MEK-7222K全自动血细胞分析仪(日本光电工业株式公社)；

IKA/T18匀浆机(1KA)；KJ-201A型振荡器(江苏康健医疗用品有限公司)；

QL-901型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；

MilliQ纯水系统(Millipore公司)。

2方法

2.1骨关节炎治疗作用研究

2.1.1对hareley豚鼠自发性骨关节炎的治疗作用

取hartley豚鼠，雌性，随机分为模型组(对照组)，壮骨关节丸组(0.96g/kg)及本发明组合物高剂量(1.92g/kg)、中剂量(0.96g/kg)、低剂量(0.48g/kg)5个剂量组，每组10只。待5月龄豚鼠自发骨性关节炎模型形成后，开始给药，模型组给予相应体积蒸馏水，连续给药4周。每天观察动物一般状态，每周一称动物体重及食量，末次给药后腹主动脉取血，检测血清中MMP-1、TIMP-1的含量。动物处死后切取胫骨到股骨之间的关节软骨进行组织病理学检查。

2.1.2对木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎慢性期的治疗

选健康雄性SD大鼠，按0.3g/kg体重腹腔注射10％的水合氯醛麻醉，以35％泊洛沙姆载药体加载4％木瓜蛋白酶制成温敏型原位凝胶控释剂(pH5.7)，按照0.05mL(1.6U)/关节剂量，双侧膝关节注射，将造模动物膝关节及以下肢体置于特制的保温箱中，50℃环境下保温作用2小时，即可造成软骨的损伤。随机抽取3/10只大鼠进行病理组织学检查，复核模型的可靠性及成功率。

选择造模成功的骨关节炎模型大鼠40只，随机分为模型组、壮骨关节丸组、本发明组合物2.20g/kg、1.10g/kg和0.55g/kg剂量组，每组8只。另选健康雄性SD大鼠8只，作为对照组。壮骨关节丸和本发明组合物按照设定剂量灌胃给药，连续治疗4周，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水。

治疗结束后，按0.3mL/100g体重腹腔注射10％的水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血。打开左膝关节腔，用1mL生理盐水反复冲洗3次，收集关节液，3000r/min离心10分钟，取上清液，-20℃保存备用。用小刀刮取大鼠股骨关节面和胫骨关节面的表面软骨，称重，放入400μl Trizol中，-80℃存放备用，采用实时定量RT-PCR法测定大鼠关节软骨iNOS、Aggrecan和Collegan Ⅱ mRNA表达。取完整右膝关节10％福尔马林固定。用ELISA法测定关节液MMP-3和TIMP-1的含量，引物设计见表1。

常规Trizol法提取总RNA，根据OD260/OD280的值估计核酸的纯度。采用Real-time RT-PCR法测定大鼠关节软骨Aggrecan和Collegan-Ⅱ mRNA表达。取2-△△CT值进行数据统计。

表1Real-time RT-PCR引物序列

取固定的右膝关节，将甲醛溶液移去，替换成5％硝酸溶液进行脱钙。常规石蜡包埋、HE染色，光镜下进行病理组织学检查。

所得数据均用SPSS 17.0软件进行统计，数据用表示，实验测定结果各组间比较均采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2镇痛作用

2.2.1小鼠热板实验

选用KM小鼠，雌性，将其逐只置于55℃金属热板槽上，恒温变化在±0.5℃内，从小鼠放入热板槽开始计时，以舔后足为痛反应指标。试验前进行动物筛选，将反应潜伏期小于5s或大于30s的动物剔除，选取符合条件的KM小鼠60只，随机分为对照组；壮骨关节丸高剂量组(3.08g/kg)；本发明组合物高剂量组(3.08g/kg)、中剂量组(1.54g/kg)、低剂量组(0.77g/kg)5个剂量组。每天给药1次，对照组给予相应剂量蒸馏水，给药14天，用热板法(55℃±0.5℃)测定小鼠的痛阈值，比较实验组与对照组之间的差异。

2.2.2小鼠醋酸扭体实验

选取KM小鼠60只，雌雄各半，分组、给药同2.2.1小鼠热板实验，末次给药30min后，按0.2mL/只，腹腔注射0.7％冰酸，观察并记录注射后5-10min、11-15min和16-20min时间段内小鼠的扭体次数及15min内的扭体总数，比较实验组与对照组之间的差异。

2.3抗炎作用

2.3.1小鼠二甲苯耳肿实验

选取KM小鼠60只，雌性，分组、给药同2.2.1小鼠热板实验，末次给药后30min，于小鼠右耳正反两面均匀涂布100％二甲苯致炎剂0.03mL/只，用二甲苯耳肿法计算肿胀度(mg)，比较实验组与对照组之间的差异。

2.3.2大鼠棉球肉芽肿实验

选取大鼠60只，雄性，随机分为对照组；壮骨关节丸高剂量组(2.20g/kg)；本发明组合物高剂量组(2.20g/kg)、中剂量组(1.10g/kg)；低剂量组(0.55g/kg)5个剂量组。采取大鼠棉球肉芽肿模型方法大鼠体内植入棉球，24h后，按剂量设定连续灌胃14d，对照组给予相应体积蒸馏水，每天给药1次，末次给药后，处死动物，将棉球与肉芽组织一并摘出，称重，记录湿重。60℃干燥24h后称重，即为干重，减去原有棉球重量，即为肉芽净重，比较给药组与对照组之间的差异。

3结果

3.1骨关节炎治疗作用

3.1.1对hareley豚鼠自发性骨关节炎的治疗作用

形成自发性骨关节炎的豚鼠，连续给药4周后，各给药组动物的体重与模型组相比无显著性差异，MMP-1和TIMP-1值均高于模型组。组织病理学检查显示，模型组动物膝关节发生明显的软骨组织退行性病变，如软骨四层结构不明显，表层细胞脱落，少量炎细胞浸润及软骨细胞坏死等现象；各给药组与模型组比较，膝关节软骨退变均被抑制或延缓(见表2、图1)。

表2壮骨关节丸及本发明组合物对豚鼠血清MMP-1、TIMP-1的影响

3.1.2对木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎慢性期的治疗

如表3-1所示结果，对木瓜蛋白酶诱导的骨关节炎慢性期大鼠关节液MMP-3含量高于正常对照组(P＜0.01)，TIMP的含量变化不明显(P＞0.05)，而MMP-3/TIMP-1的比值增大，MMP-3的含量相对增加(P＜0.01)，用壮骨关节丸1.10g/kg和新工艺2.20g/kg、1.10g/kg治疗4周，MMP-3含量明显降低(P＜0.01)，MMP-3/TIMP-1的浓度比趋向于平衡。

表3-1壮骨关节丸及本发明组合物对关节液MMP-3和TIMP-1的影响

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

如表3-2所示结果，OA慢性期大鼠关节软骨Collagen II mRNA和Aggrecan mRNA明显减弱(P＜0.05或P＜0.01)，用壮骨关节丸和本发明组合物治疗4周，本发明组合物2.20g/kg剂量组大鼠软骨Collagen II mRNA表达明显增强(P＜0.01)，壮骨关节丸1.10g/kg和本发明组合物2.20g/kg、1.10g/kg剂量组Aggrecan mRNA表达均明显增强，其中本发明组合物1.10g/kg剂量组与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)。结果表明壮骨关节丸及本发明组合物可促进Collagen II与Aggrecan的合成，具有一定抗软骨损伤作用，可以延缓软骨退行性变的进程。

表3-2壮骨关节丸及本发明组合物对软骨CollagenII、AggrecanmRNA的影响

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##p＜0.01

OA大鼠关节病理组织学检查发现，大体观察：壮骨关节丸和本发明组合物治疗组：大鼠关节病变稍轻于模型组。病理形态学观察：壮骨关节丸和本发明组合物2.20g/kg、1.10g/kg剂量治疗组：与模型组相比较，软骨组织坏死减少，坏死区残留较多软骨细胞，大小不一，排列紊乱，有的簇状排列。

3.2镇痛作用

3.2.1热板实验显示

药后30min，与对照组相比，本发明组合物三个剂量组均能显著延长小鼠的痛反应时间(p<0.01)，具有较好的镇痛作用；药后60min，只有本发明组合物的中剂量组表现出较好的镇痛效果(p<0.05)；药后120min，各给药组无镇痛效果(结果见表4)。

表4.壮骨关节丸及本发明组合物对小鼠热板痛反应时间的影响

注：与对照组比较，经t检验，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001

3.2.2醋酸扭体实验

结果显示，在给小鼠注入致痛剂醋酸后，本发明组合物三个剂量组均对小鼠扭体次数有一定的抑制作用，尤以高、中剂量镇痛效果显著(见表5)。

表5.壮骨关节丸及本发明组合物对小鼠醋酸扭体次数的影响

注：与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001

3.3抗炎作用

小鼠二甲苯耳肿实验和大鼠棉球肉芽肿实验显示，本发明组合物能抑制二甲苯所引起的小鼠耳廓局部急性炎症和大鼠棉球肉芽肿增生，有效降低小鼠和大鼠的急性炎症和慢性炎症的发生(见表6、7)。

表6.壮骨关节丸及本发明组合物对小鼠二甲苯致耳肿的影响

注：与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

表7.壮骨关节丸及本发明组合物对大鼠棉球肉芽肿的影响

注：与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001

实验例2毒性试验

1、材料与方法

1.1供试品

实施例1制备的本发明组合物，华润三九医药股份有限公司，黑色水丸，气芳香，味微苦；

1.2对照品

壮骨关节丸，华润三九医药股份有限公司，黑色水丸，气芳香，味微苦。

1.3配制方法

本发明组合物及对照品无需配制，根据每只动物药前最近一次测定的体重，确定每只动物的给药量(保留至小数点1位)，本发明组合物的称取量应控制在理论给药量±0.2g。给药剂量按生药量计算，1克新工艺(实施例1制备)相当于1.13克生药，1克壮骨关节丸相当于1克生药。

2、实验系统

Beagle犬，普通级，60只，雌雄各半；动物月龄：给药开始时动物为6～7月龄；动物体重：给药开始时动物体重：5.33-6.67kg(♂)，5.44-7.84kg(♂)；实验动物来源：北京玛斯生物技术有限公司；实验动物生产许可证号：SCXK(京)2011-0003；实验动物质量合格证编号：0234473；生产许可证签发单位：北京市科学技术委员会。

3、试验设计

3.1试验分组与给药剂量

根据给药前(D-2)测定的动物体重，选择检疫合格、健康、体重相近的动物，使用计算机系统的随机数，将动物按照性别进行区段随机分组。各组动物给药剂量和分组后的动物号见下表8：

表8各受试组动物给药剂量设计

注：^a:人体重按60kg计算，临床拟用剂量为0.2g/kg/天(按生药量计算)

给药途径为口服给药，给药频率与周期为，每周给药6天，每天给药一次，连续给药39周，共给药234次。

4、动物活体检测指标

4.1一般临床观察

每天上午和下午各进行1次一般临床观察，包括：笼旁观察动物死亡或濒死情况、精神状态、行为活动、粪便性状等。

4.2详细临床观察

每周一次进行详细临床观察，包括：精神状态、行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、口、足和呼吸等。

4.3其他参数观察

包括不定期对动物体重、体温、心电图观察。

4.4临床病理监测

包括对血细胞计数、凝血功能(凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB))、血液生化指标、尿液检查、眼科检查、动物安乐死后检测指标进行检测，同时对安乐死后的动物的尸体进行观察、监测脏器重量并对所有动物的器官和组织进行常规石蜡包埋、切片、HE染色及显微镜观察。

5、数据采集和统计分析

数据采集：方案要求测定的和观察的数据结果需要手记到适当的表格上或计算机直接采集数据。

统计分析：所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在5％或P≤0.05。各组动物的体重、体温、心电图参数、血细胞计数、凝血功能、血液生化、脏器重量和脏器系数等指标均计算不同组别动物(雌雄动物合并在一起)的平均数和标准偏差。上述数据将按下列过程分析：首先用Levene Test对数据进行均一性检验。如果数据均一(P﹥0.05)，则进行单因素方差分析；如果方差分析显著(P≤0.05)，则进行Dunnett’s进行统计分析。如果LeveneTest的结果显著(P≤0.05)，则进行Kruskal-wallis非参数检验；如果Kruskal-wallis非参数检验结果显著(P≤0.05)，则进一步采用Mann-WhitneyU检验进行统计分析。样本数(n)小于3时，不进行统计分析。

6、结果

6.1动物死亡和濒死

试验期间，各组动物未出现死亡或濒死现象。

6.2临床观察

试验期间，各给药组的异常反应主要为药后的胃肠道反应，具体情况如下：

壮骨关节丸3g/kg剂量组：2只动物首次药后出现呕吐，之后陆续可见其它动物出现呕吐，给药期间7/10的动物药后可见呕吐，其中W1动物出现呕吐的频率为9犬次，W13动物出现呕吐的频率为1犬次，W27动物均未出现呕吐，W39动物出现呕吐的频率为4犬次；1只动物于第2次药后(D2)出现稀便，之后陆续可见其它动物出现软便或稀便，给药期间9/10的动物药后可见软便或稀便，其中W1和W13动物出现稀便或软便的频率均为2犬次，W27和W39动物均未出现软便或稀便。

壮骨关节丸10g/kg剂量组：9只动物首次药后出现呕吐，之后陆续可见其它动物出现呕吐，给药期间10/10的动物药后可见呕吐，其中W1、W13、W27和W39动物出现呕吐的频率分别为54、25、17和12犬次；1只动物于第2次药后(D2)出现稀便，之后陆续可见其它动物出现软便或稀便，给药期间10/10的动物药后可见软便或稀便，其中W1、W13和W27动物出现软便或稀便的频率分别为10、13和1犬次，W39动物未出现软便或稀便。

本发明组合物1g/kg剂量组：给药期间动物未出现呕吐，1只动物D5药后出现软便，之后陆续可见其它动物出现软便或稀便，给药期间5/10的动物药后可见软便或稀便，其中W1动物出现软便或稀便的频率为1犬次，W13、W27和W39动物均未出现软便或稀便。

本发明组合物3g/kg剂量组：1只动物于首次药后出现呕吐，之后陆续可见其它动物出现呕吐，给药期间4/10的动物药后可见呕吐，其中W1动物出现呕吐的频率为1犬次，W13、W27和W39动物未出现呕吐；2只动物第2次药后出现软便，之后陆续可见其它动物出现软便或稀便，给药期间5/10的动物药后可见软便或稀便，其中W1动物出现软便或稀便的频率为2犬次，W13、W27和W39动物均未出现软便或稀便。

本发明组合物10g/kg剂量组：1只动物于首次药后出现呕吐，之后陆续可见其它动物出现呕吐，给药期间10/10的动物药后可见呕吐，其中W1、W13、W27和W39动物出现呕吐的频率分别为7、2、8和2犬次；2只动物于第2次药后出现软便，之后陆续可见其它动物出现软便或稀便，给药期间10/10的动物药后可见软便或稀便，其中W1和W13动物出现软便或稀便的频率分别为9和6犬次，W27和W39动物均未出现软便或稀便。

此外，包括阴性对照组在内的部分动物给药期间可见唾液分泌过多表现，可能与应激有关；部分动物可见皮肤红斑、皮肤潮红、结膜异常、眼分泌物、创口、皮肤破溃、运动失调等表现，考虑为动物自发性改变或活动时出现的外伤等改变，认为与给药不相关。

6.3体重

试验期间，与同期阴性对照组相比，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D49、D56、D63、D70、D77、D84、D91和D210的体重降低(P≤0.05)，其余各组动物的体重未见有毒理学意义的改变；与同期本发明组合物10g/kg剂量组相比，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D49、D56、D63、D70、D77、D84、D91和D210的体重降低(P≤0.05)。

不同时间点各组动物体重变化趋势见图2。

6.4体温

试验期间，所有动物的体温未见具有毒理学意义的改变。

6.5心电图

试验期间，与同期阴性对照组相比，壮骨关节丸10g/kg剂量组和本发明组合物10g/kg剂量组动物D272的QRS时限缩短。壮骨关节丸10g/kg剂量组和新工艺10g/kg剂量组动物D272的QRS时限相比未见差异(P>0.05)。

由于壮骨关节丸10g/kg剂量组和本发明组合物10g/kg剂量组动物D272的QRS时限在参考值范围内，且与药前相比也未见明显变化，因此认为该变化不具有毒理学意义。

6.6临床病理

6.6.1血细胞计数

红细胞相关指标

试验期间，与同期阴性对照组相比，本发明组合物10g/kg剂量组D273的Retic(绝对值)升高，MCH降低；本发明组合物3g/kg剂量组D273的MCH降低，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

与同期等剂量壮骨关节丸对照组相比，本发明组合物3g/kg剂量组动物D273的MCH降低(P≤0.05)；本发明组合物10g/kg剂量组动物D273的Retic(绝对值)及MCH未见明显变化(P>0.05)。

由于本发明组合物10g/kg剂量组动物D273的Retic(绝对值)和MCH以及本发明组合物3g/kg剂量组动物D273的MCH均在参考值范围内，且未见明确的时间-反应关系，因此认为该变化不具有毒理学意义。

白细胞及分类计数

试验期间，与同期阴性对照组相比，本发明组合物10g/kg剂量组动物D184的WBC和Neut(绝对值)升高，D273的Lymph(绝对值)升高；壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D273的Mono(相对值和绝对值)升高，Eos(相对值)降低，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

与同期等剂量壮骨关节丸对照组相比，本发明组合物10g/kg剂量组动物D184的WBC和Neut(绝对值)升高，D273的Mono(相对值和绝对值)降低，EOS(相对值)升高，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

由于本发明组合物10g/kg剂量组动物D184的WBC、Neut(绝对值)，D273的Lymph(绝对值)以及壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D273的Mono(相对值和绝对值)和Eos(相对值)均在参考值范围内，且未见明确的时间-反应关系，因此认为该变化不具有毒理学意义。

血小板

试验期间，与同期阴性对照组相比，壮骨关节丸3g/kg剂量组动物D91、D184和D273的PLT升高，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D29、D91、D184和D273的PLT升高；本发明组合物3g/kg和10g/kg剂量组动物D29、D91、D184和D273的PLT升高，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

与同期等剂量本发明组合物组相比，壮骨关节丸0g/kg组动物D273的PLT升高(P≤0.05)。

恢复期结束时，各给药组血小板未见明显异常的规律性变化。

给药期间各组动物PLT变化情况见下表9：

表9给药期间各组动物PLT变化情况

注：1.“*”表示与溶媒对照组相比，P≤0.05；2.“↑”表示升高

上述PLT的变化情况提示：给药后，壮骨关节丸和本发明组合物3、10g/kg剂量组动物PLT均呈现明显升高现象，以上现象认为与给药相关。

6.6.2凝血功能

试验期间，各给药组动物凝血功能指标未见有毒理学意义的改变。

6.6.3血液生化

试验期间，与同期阴性对照最相比，壮骨关节丸3g/kg剂量组动物D91的ALT和ALB降低，ALP升高，D184的ALP升高，D273的ALP和TCH升高；

壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D29的ALT、ALB和A/G下降，TG升高，D91的ALT、AST、ALB、A/G和Cl^-降低，ALP和TG升高，D184的A/G、BUN、CREA和Cl^-降低，ALP、GLB和K⁺升高，D273的AST、ALB、A/G、BUN、CREA、Na⁺和Cl^-降低，ALP、GGT和TG升高；

本发明组合物(实施例1制备)1g/kg剂量组动物D91和D184的ALB和A/G降低；

本发明组合物3g/kg剂量组动物D29的A/G降低，D91的ALB降低，D184和D273的TCH升高；

本发明组合物10g/kg剂量组动物D29的ALT和A/G降低，GLB升高，D91的ALT、ALB和A/G降低，D184的ALB和A/G降低，GLB和TCH升高，D273的ALB和A/G降低，TCH升高，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。其余血液生化指标未见明显差异。

与同期等剂量本发明组合物(实施例1制备)组相比，壮骨关节丸3g/kg剂量组动物D91、D184和D273的ALP升高，D91和D184的TCH降低；壮骨关节丸10g/kg剂量组动物D29的TG升高，D91、D184和D273的CREA和TCH降低，D91和D273的Cl^-降低，D184和D273的ALP升高，D273的AST、BUN、A/G和Na⁺降低，GGT升高，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

上述出现变化的血液生化指标中，由于ALT、AST、BUN、CREA、Na⁺、K⁺和Cl^-均在参考值范围内波动，未见明显规律性变化，因此认为与给药不相关。其余血液生化指标变化情况如下表10。

表10血液生化指标变化情况

注：“↓”表示降低；“↑”表示升高；且与同期阴性对照组比较，差异有统计学意义(P≤0.05)

上述变化的数据中，各组动物与药前值相比如下表11：

表11各组动物与药前值对比

注：“↓”表示降低；“↑”表示升高

上表中血液生化指标变化情况提示：给药期间，壮骨关节丸3g/kg和10g/kg剂量组动物ALP明显升高，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物给药结束时可见GGT显著升高，认为ALP和GGT的升高与壮骨关节丸的肝毒性有关，本发明组合物10g/kg剂量组动物D184虽可见ALP升高，但与药前相比未见明显变化；壮骨关节丸3g/kg和10g/kg及本发明组合物3g/kg和10g/kg剂量组动物可见TCH升高，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物可见TG升高，认为该变化与给药相关；各给药组可见ALB略有降低，壮骨关节丸10g/kg和本发明组合物各剂量组可见A/G降低，壮骨关节丸和本发明组合物10g/kg组可见GLB升高，结合组合病理学检查结果，认为该变化可能与给药相关，但本发明组合物各剂量组ALB与给药前相比未见明显变化，A/G的轻微降低可能与药后GLP的轻微升高有关。

6.7尿液分析

试验期间，各给药组动物尿液检查未见有毒理学意义的改变。

6.8眼科检查

试验期间，各给药组动物眼科检查未见有毒理学意义的改变。

6.9病理检查

与同期阴性对照组相比，给药期结束时，壮骨关节丸组3g/kg剂量组动物肝脏重量升高，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物肝脏重量和脏体比升高，附睾重量降低，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

与同期等剂量本发明组合物(实施例1制备)组相比，壮骨关节丸3g/kg剂量组动物肝脏重量升高，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物肝脏脏体比升高，附睾重量降低，以上差异具有统计学意义(P≤0.05)。

组织学检查结果显示，壮骨关节丸10g/kg剂量组动物可见肝脏的毒性病理改变，故本试验中壮骨关节丸对照组肝脏的重量改变可能与给药相关。

6.10大体观察

所有动物大体观察均未见与药物相关的明显异常。

6.11组织学检查

组织学检查显示，肝脏可见与壮骨关节丸相关的组织学改变。连续给药39周，壮骨关节丸10g/kg组有2/6动物肝脏可见双核肝细胞增多，1/6动物可见胆管增生，1/6动物可见肝细胞变性，恢复4周后完全恢复；壮骨关节丸3g/kg组，恢复4周结束时有1/4动物可见胆管增生。

而本发明组合物(实施例1制备)各剂量组未见明显与新工艺相关的组织学改变。

7、讨论

7.1毒性反应分析

给药期间，本发明组合物组和壮骨关节炎对照组主要可见呕吐、软便或稀便等胃肠道反应，且壮骨关节炎10g/kg组可见胃肠道反应继发的体重降低。

壮骨关节炎对照组3g/kg和10g/kg剂量组动物ALP明显升高，壮骨关节炎对照组10g/kg剂量组动物给药结束时可见GGT显著升高，认为ALP和GGT的升高与壮骨关节炎的肝毒性有关。

壮骨关节炎对照组3g/kg和10g/kg及本发明组合物(实施例1制备)3g/kg和10g/kg剂量组动物可见TCH升高，壮骨关节炎对照组10g/kg剂量组动物可见TG升高；壮骨关节炎对照组各剂量组可见ALB略有降低，壮骨关节炎对照组10g/kg和本发明组合物(实施例1制备)各剂量组可见A/G降低，壮骨关节炎和本发明组合物10g/kg组可见GLB升高，认为该变化可能与给药相关，但本发明组合物各剂量组A/G的轻微降低可能与GLB的轻微升高有关。

7.2毒性反应比较

给药期间，本发明组合物和壮骨关节炎对照组均可见呕吐、软便或稀便等胃肠道刺激反应，但在同等剂量下，出现胃肠道刺激反应的频率和反应程度上，壮骨关节炎的胃肠道反应略重，且壮骨关节炎出现继发的体重降低表现；而本发明组合物3和10g/kg及壮骨关节炎对照3和10g/kg剂量组均可见PLT升高，但在同等剂量下，本发明组合物PLT升高的幅度略低于壮骨关节炎。壮骨关节炎对照3和10g/kg组可见ALP明显升高，且壮骨关节炎对照10g/kg组给药结束时的GGT升高；本发明组合物10g/kg组D184的ALP升高，但变化幅度较同期等剂量壮骨关节炎对照小；壮骨关节炎3g/kg和10g/kg剂量组可见肝脏重量升高，肝脏可见双核肝细胞增多、胆管增生和肝细胞变性等反应，本发明组合物各剂量组肝脏未见明显改变。

等剂量壮骨关节丸和本发明组合物的毒性对比列表如下表12-14。

表12等剂量壮骨关节丸和本发明组合物的胃肠道毒性对比

表13等剂量壮骨关节丸和本发明组合物的肝毒性对比

表14等剂量壮骨关节丸和本发明组合物的指标变化

注：“↑”表示升高；且与同期阴性对照组比较，差异有统计学意义(P≤0.05)

8结论

在本试验条件下，采用壮骨关节丸对照和本发明实施例1制备的丸剂重复口服给予Beagle犬，每周给药6天，每天给药一次，连续给药39周，壮骨关节丸剂量分别是3和10g/kg，主要毒性反应为胃肠道反应(主要为呕吐、软便或稀便)和肝损伤；本发明实施例1制备的丸剂分别是1、3和10g/kg，主要毒性反应为胃肠道反应，胃肠道反应较等剂量壮骨关节丸(原工艺)轻，肝毒性损伤较低。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为各试验组对木瓜蛋白酶诱导的骨关节炎大鼠膝关节软骨组织作用的H.E染色图片(×200)；其中，A为对照组、B为模型组、C为壮骨关节丸组、D-F分别为实施例1受试药物2.20、1.10、0.55g/kg组、G为氨基葡萄糖对照组；

图2为毒性试验中不同时间点各组动物体重变化趋势。

具体实施方式

实施例1

【处方】狗脊576.8克、淫羊藿346.1克、独活346.1克、骨碎补462.0克、续断576.8克、桑寄生576.8克、鸡血藤346.1克、熟地黄1384.2克、木香346.1克、乳香346.1克、没药346.1克、补骨脂346.1克。

【制备方法】按照选定的重量取所述乳香和没药混合，加10倍量水进行水蒸气蒸馏提取12小时，收集挥发油；按照挥发油：β-环糊精：水：乙醇的质量比为1：10：20:1的比例加入辅料，研磨20min进行包合，50℃以内干燥、粉碎，过120目筛，制成挥发油包合物，备用；

按照选定的重量取所述补骨脂，加8倍量水提取2次，每次1小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

按照选定的重量取其余药材，与补骨脂炮制品混合，粉碎、过筛，加入挥发油包合物和适量的粘合剂，混匀，用水制丸，干燥，薄膜包衣，即得。

实施例2

【处方】狗脊290克、淫羊藿520克、独活154克、骨碎补692克、续断290克、桑寄生864克、鸡血藤154克、熟地黄2076克、木香154克、乳香520克、没药154克和补骨脂520克。

【制备方法】按照选定的重量取所述乳香和没药混合，加8倍量水进行水蒸气蒸馏提取15小时，收集挥发油；按照挥发油：β-环糊精：水：乙醇的质量比为1：8：24:1的比例加入辅料，研磨20min进行包合，50℃以内干燥、粉碎，制成挥发油包合物，备用；

按照选定的重量取所述补骨脂，加6倍量水提取3次，每次0.5小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

按照选定的重量取其余药材，与补骨脂炮制品混合，粉碎、过筛，加入挥发油包合物和适量的粘合剂，混匀，用水制丸，干燥，薄膜包衣，即得。

实施例3

【处方】狗脊864克、淫羊藿154克、独活520克、骨碎补224克、续断864克、桑寄生290克、鸡血藤520克、熟地黄692克、木香520克、乳香154克、没药520克和补骨脂154克。

【制备方法】按照选定的重量取所述乳香和没药混合，加12倍量水进行水蒸气蒸馏提取8小时，收集挥发油；按照挥发油：β-环糊精：水：乙醇的质量比为1：12：16:2的比例加入辅料，研磨20min进行包合，50℃以内干燥、粉碎，，制成挥发油包合物，备用；

按照选定的重量取所述补骨脂，加10倍量水提取1次，0.5小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

按照选定的重量取其余药材，与补骨脂炮制品混合，粉碎、过筛，加入挥发油包合物和适量的粘合剂，混匀，用水制丸，干燥，薄膜包衣，即得。

实施例4

【处方】狗脊576.8克、淫羊藿346.1克、独活346.1克、骨碎补462.0克、续断576.8克、桑寄生576.8克、鸡血藤346.1克、熟地黄1384.2克、木香346.1克、乳香346.1克、没药346.1克、补骨脂346.1克。

【制备方法】按照选定的重量取所述乳香和没药混合，加10倍量水进行水蒸气蒸馏提取12小时，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

按照选定的重量取所述补骨脂，加8倍量水提取2次，每次1小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

按照选定的重量取其余药材，与所述挥发油包合物和补骨脂炮制品混合，粉碎、过筛，加入适量的常规辅料，制成蜜丸。

实施例5

【处方】狗脊576.8克、淫羊藿346.1克、独活346.1克、骨碎补462.0克、续断576.8克、桑寄生576.8克、鸡血藤346.1克、熟地黄1384.2克、木香346.1克、乳香346.1克、没药346.1克、补骨脂346.1克。

【制备方法】按照选定的重量取所述乳香和没药混合，加水进行水蒸气蒸馏提取，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

按照选定的重量取所述补骨脂，加水提取，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

按照选定的重量取其余药材，与所述补骨脂炮制品混合，粉碎、过筛，加入挥发油包合物和适量的常规辅料，制成片剂。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种治疗骨关节病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的原料药组成为：

狗脊290-864重量份、淫羊藿154-520重量份、独活154-520重量份、骨碎补224-692重量份、续断290-864重量份、桑寄生290-864重量份、鸡血藤154-520重量份、熟地黄692-2076重量份、木香154-520重量份、以及乳香挥发油、没药挥发油和补骨脂炮制品；

其中，所述乳香挥发油由154-520重量份乳香加水进行水蒸气蒸馏提取得到；所述没药挥发油由154-520重量份没药加水进行水蒸气蒸馏提取得到；所述补骨脂炮制品为水提154-520重量份补骨脂弃去水提液后的药渣。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的原料药组成为：

狗脊576.8重量份、淫羊藿346.1重量份、独活346.1重量份、骨碎补462.0重量份、续断576.8重量份、桑寄生576.8重量份、鸡血藤346.1重量份、熟地黄1384.2重量份、木香346.1重量份、以及乳香挥发油、没药挥发油和补骨脂炮制品；

其中，所述乳香挥发油由346.1重量份乳香提取得到；所述没药挥发油由346.1重量份没药提取得到；所述补骨脂炮制品为水提346.1重量份补骨脂弃去水提液后的药渣。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述乳香和/或没药为醋炙。

4.根据权利要求1-3任一所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加水进行水蒸气蒸馏提取，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加水提取，弃去水提液后收集药渣，得到补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加8-12倍量水进行水蒸气蒸馏提取8-15小时，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加6-10倍量水提取1-3次，每次0.5-2小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物按照如下方法制备：

(1)按照选定的重量份取所述乳香和没药混合，加10倍量水进行水蒸气蒸馏提取12小时，收集挥发油，加入常规辅料制成挥发油包合物，备用；

(2)按照选定的重量份取所述补骨脂，加8倍量水提取2次，每次1小时，弃去水提液后收集药渣，干燥即得补骨脂炮制品，备用；

(3)按照选定的重量份取其余药材，与所述备用的补骨脂炮制品混合、粉碎，添加所述备用的挥发油包合物和常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的口服制剂。

7.根据权利要求4-6任一所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(1)中，制备所述挥发油包合物的常规辅料包括β-环糊精、水和乙醇。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(1)中，所述挥发油、β-环糊精、水和乙醇的质量比为1：8-12：16-24:1-2。

9.由权利要求1-8任一所述药物组合物添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受的口服制剂。

10.权利要求1-8任一所述药物组合物在制备治疗骨关节病药物中的用途。