CN100545163C - 一种防治老年痴呆的中药活性成分化合物及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从中药仁茹中提取得到的新的活性成分的结构、提取方法以及其用途，它是通过用8～10倍重量比的含水醇溶剂，在室温或加热回流下提取粉碎的仁茹根块，然后浓缩得到浸膏，将浸膏按极性梯度用萃取的方法分段，采用反复柱层析的方法得到一全新的化合物；本发明的活性成分可与药学上适用载体混合，制成各种制剂，用于治疗老年痴呆症。

Description

一种防治老年痴呆的中药活性成分化合物及其制备和用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种从中药仁茹中提取得到的新的活性成分的化合物，其制备方法，以及该化合物在制备治疗老年痴呆症药物中的用途。

背景技术

老年痴呆症即阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是发生于老年和老年前期以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，是患者在潜意识清醒的状态下出现的全面持久的智能减退，表现为记忆力、计算力、判断力、抽象思维能力和语言功能的减退，出现情感和行为异常，丧失独立生活能力和工作能力。其病理变化主要表现为脑内胆碱神经元的原发性变性和减少、β一淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉积脑内所形成的老年斑(senile plaque，SP)以及神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)。1907年，德国医生阿尔茨海默(Alois Alzheimer)首先报道了1例51岁发病的女性患者，表现为进行性痴呆和妄想，发病4年后死亡，病理检查发现其脑部全面萎缩，在大脑皮质出现老年斑和神经原纤维缠结，后来人们便将这类在老年前期发病的痴呆以其名字命名为阿尔茨海默病。

随着人类寿命的延长，许多国家已经或即将进入老龄社会，目前老年痴呆症已成为继心血管疾病、癌症和中风之后威胁老年人健康的又一大疾病。由于当前老年痴呆症的发病机制仍不十分清楚，因此迄今为止还缺乏明确有效的根治手段，尤其是中、晚期痴呆患者，疗效更不理想。

仁茹(Fordia cauliflora Hemsl.)属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科，鸡血藤属(Milletlia)植物。该植物系中国特有树种。幼枝密生锈色短毛。羽状复叶长可达50cm，有17-25小叶：小叶披针形，椭圆形或矩形，长4-14cm，宽1.5-5cm，先端尾状，基部圆形，幼时上面有疏毛，下面疏毛白色柔毛；托叶锥状，常约2cm，宿存。总状花序自干上发出，长15-20cm；总花梗、序轴密生锈色端柔毛；花萼浅杯状，长约3mm，有短柔毛；花冠淡紫色，旗瓣外面疏生柔毛；子房有淡黄色柔毛。荚果扁，革质，棕褐色，上部较宽，成熟后开裂，长6-10cm，宽2-2.5cm，无毛；种子圆形，扁、褐色，有光泽。主要分布于广西、广东省，地理分布系经度104°～108°，纬度23°～25°的瑶族地区。生长于山地页岩上、山坡流林中或水旁。资源较丰富，野生植物，生长周期为4～5年。根及叶入药。分布在广东、广西。生长于山地页岩上、山坡疏林中或水旁。根及叶入药。

在民间，仁茹作为滋补品已有数年的历史，或取根煎服，或取枝、根煮熟后食用。具有“补肾强身，益髓壮脑”的功效，用于治疗体质虚弱、脑外伤和妇女产后康复。近年来发现，仁茹对治疗小儿智力发育迟缓及老年痴呆具有独特的疗效。

发明内容

本发明的目的就是提供一种从中药中提取的新活性成分的结构和制备方法及其在治疗老年痴呆症中的应用。这将为迄今为止还缺乏明确有效的根治手段的老年痴呆症的治疗提供一个治疗药物，也为即将步入老年期的中年人预防或减少老年痴呆的发病率提供良好预防用药。

本发明的技术方案为：

本发明公开了一种防治老年痴呆的中药活性成分的化合物，其结构式为：

化合物的分子式为：C₂₀H₁₆O₃，分子量为：304，熔点为：181～183℃，分子的不饱和度为13。

化学名为2”，2”-二甲基-[7，8：5”，6”]吡喃并黄酮(4H，8H-Benzo[1，2-b：3，4-b’]-dipyran-4-one，8，8-dimethoxyl-2-phenyl)。

本发明中药组合物的活性成分和医药学上可接受的载体，包括赋性剂，如淀粉、水；润滑剂，如硬脂酸镁；崩解剂，如微晶纤维素；填充剂，如乳糖；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等，采用本领域公知的方法制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂、输液等，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射)等给药途径进行老年痴呆症的治疗。

本发明的化合物可由以下方法制备，其工艺步骤如下：首先取属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科，鸡血藤属(Milletlia)植物仁茹(Fordia cauliflora Hemsl.)药材的根部即原药，经过粉碎后，用含醇类的溶剂，室温或加热回流提取；然后过滤去药渣，滤液在常压或减压状态下浓缩至膏状，得浸膏；再将浸膏按极性梯度用萃取的方法分段，采用多种分离纯化方法，直至分离到纯的化合物，即得该化合物。

其中优选的制备方法为：含醇类的溶剂为浓度75％～99％的乙醇，提取温度为25～60℃，溶剂的用量8～10ml/g原药，重复提取1～3次。

其中所述的滤液在常压或减压状态下浓缩，其中的减压状态为0.09～0.1Mpa；过滤方法为在常压或减压下微滤或超滤。

其中所述的浸膏按极性梯度用萃取是指依次使用分析纯的石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行分段。优选的柱层析为采用硅胶柱层析。

其中所述的分离纯化方法包括硅胶色谱、薄层色谱、重结晶的方法。一般至少重复2次以上。

经大量深入研究后证明，本发明提取自仁茹的新活性成分具有促进学习记忆的功能，含有该活性成分的药物可用来作为老年痴呆症的治疗。

一般地，本发明的化合物用于治疗时，药剂用量为每天300～600mg，每天2～3次。

所述的药理学模型为正常小鼠学习记忆、小鼠东莨菪碱所致的学习记忆获得、亚硝酸钠所致的学习记忆巩固障碍、酒精所致的学习记忆再现障碍模型。

有益效果：

本发明克服了传统中药复方制剂成分不清、机理不明、质量难控、疗效不稳的缺点。本发明的中药组合物有效成分明确，质量容易控制，疗效可靠。

附图说明

图1：化合物的氢谱图

图2：化合物的氢谱放大图

图3：化合物的碳谱图

图4：化合物的质谱图

图5：化合物的HMQC图

图6：化合物的HMBC图

具体实施方式

下面将结合具体实施例及实验，对本发明作进一步说明。

实施例1：

将80g的仁茹干药材(根)粗粉加入到1000ml的圆底烧瓶中，加入700ml 75％的乙醇，60℃水浴回流3h，滤出液体，重复以上操作3次，乙醇提取液过滤后，减压浓缩至膏状，得深褐色浸膏。将所得的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次以上，并在减压状态下进行浓缩。上述的石油醚萃取液进行硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯的不同比例进行梯度洗脱，并用薄层色谱进行检测，合并相同成分的液体，进行反复柱层析。上述的乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯和甲醇的不同比例进行梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，合并相同成分的液体，进行反复柱层析。上述的正丁醇萃取液进行硅胶柱层析，用氯仿和甲醇的不同比例进行梯度洗脱，用薄层色谱进行检测，合并相同成分的液体，进行反复柱层析。经过重结晶，得到一白色结晶，经波谱学鉴定为一新化合物2”，2”-二甲基-[7，8：5”，6”]吡喃骈黄酮。

2”，2”-二甲基-[7，8：5”，6”]吡喃骈黄酮的结构鉴定

该化合物为白色结晶，易溶于氯仿；mp181℃～183℃；盐酸镁粉和铁氰化钾反应均呈阳性。

高分辨质谱给出分子式为C₂₀H₁₆O₃，m/z 304.1096M⁺，根据分子式推算出该分子的不饱和度为13。

¹H-NMR(400MHz，C₃D₆O，δppm)显示有16个氢：δ7.91(1H，d，J＝8.8Hz)，δ7.09(1H，d，J＝8.8Hz)为苯环5，6位质子信号；δ6.92(1H，d，J＝10Hz)，δ5.98(1H，d，J＝10Hz)归属为吡喃环3″，4″质子信号，同时存在δ1.67(6H，s)，表明了2个甲基的存在，可以推测是吡喃环2″被2个甲基取代；δ8.21(2H)归属B环2′，6′质子信号，δ7.65～7.61(3H，m)归属B环3′，4′，5′质子信号，因为均为单峰氢；δ6.806是黄酮类化合物的特征信号，因此归属黄酮3位质子信号。

¹³C-NMR(400MHz，C₃D₆O，δppm)：δ176.77是羰基的质子信号，归属碳4位，也是黄酮类化合物的特征信号；δ27.72是甲基质子信号；δ126.69，δ115.17为吡喃环上质子的特征信号，分别归属于吡喃环3″，4″质子，与氢谱相对应可以证明吡喃环2″位被2个甲基取代；δ131.83～125.9(6C)分别归属为B环的C质子信号，说明存在着一个苯环。见表1。

表1新化合物¹H-NMR和¹³C-NMR化学位移

结合HMQC和HMBC中的数据，推测其为2”，2”-二甲基-[7，8：5”，6”]吡喃并黄酮(4H，8H-Benzo[1，2-b：3，4-b’]-dipyran-4-one，8，8-dimethoxyl-2-phenyl)。

实施例2：毒性实验

1动物SD

大鼠，体重80±10g，雌雄兼用；昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄兼用(由中国药科大学动物中心提供，动质号：970004)。

2.实验

2.1小鼠急性毒性试验

取40只小鼠，动物禁食16h后，分雌雄按体重随机分入200mg·kg^-1、160mg·kg^-1、125mg·kg^-1、100mg·kg^-14个剂量组，每组10只，受检各剂量用生理盐水配制，以20ml·kg^-1体重的灌胃容量经口一次投予，受试后观察一周。

2.2大鼠的长期毒性试验

参照文献方法，取SD大鼠80只，4周龄，依性别和体重均衡随机分为4组，一个空白对照组(给水)，高、中、低组给150mg·kg^-1、100mg·kg^-1、50mg·kg^-1，雌雄分笼饲养，投药前观察两周，各组动物活动、进食、粪便情况均无异常。然后开始灌胃给药，连续给药90d。并每周按体重变化调整给药量。自由摄食饮水，每天观察一次动物的活动、毛发、粪便情况。每周称体重和饲料消耗量。最后一次给药24h后，每组各取12只动物采血，检查血常规，肝肾功能，尔后放血处死，对脏器进行全面肉眼尸检，并对心、肝、脾、肺、肾5个实质性脏器称重，计算脏器系数。

3实验结果

3.1小鼠急性经口毒性试验

各剂量组小鼠均未出现明显异常及死亡，未测出LD₅₀，小鼠急性经口试验最大耐受量为200mg·kg^-1。

3.2灌服90d的长期毒性试验中，未发现毒性作用，一般检查血液学、血液生化学检查，显示无明显毒性和副作用。

实验例3对正常小鼠学习和记忆的影响

1实验材料

1.1药品

上述分离得到的新化合物

东莨菪碱(北京通县育才精细化工厂，分析纯)

亚硝酸钠(河南省焦作市化工厂，分析纯)

无水乙醇(南京化学试剂一厂，分析纯)

吡拉西坦(上海第一生化药业公司)

1.2动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g。由中国药科大学动物中心提供。

1.2实验器材

跳台仪(为一正方形反射箱，大小为4cm×10cm×～60cm，用黑色塑料板分隔成2间，底面铺以铜栅，间距为0.5cm，可以通电，电压强度由一变压器控制，每间右角置一高和直径均为4.5cm的平台)。

2实验方法和步骤

2.1方法

雌雄各半昆明种小鼠50只，随机分组，每组10只，编号，称重。三个不同剂量给药组灌服新化合物，体积均为0.2ml·10g^-1，正常组灌服相同体积的自来水，对照组灌服脑复康200mg·kg^-1，体积为0.2ml·10g^-1。连续给药7天，于末次给药1小时后进行跳台法测试。

2.2分组如下

空白对照组igNS；脑复康200mg·kg^-1组(Piracetam)；高剂量组150mg·kg^-1(High)；中剂量组100mg·kg^-1(Middle)；低剂量组50mg·kg^-1(Low)。

2.3跳台法进行行为测试

将小鼠放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36v交流电。小鼠受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又跳回平台，如此训练3min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数(number of errors)，以此作为学习成绩。24h后重作测验，此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和5min内的错误次数。

3实验结果

学习过程：各给药组与空白组相比均无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

记忆测试过程中空白组错误次数明显多于给药组及阳性对照组。与空白组小鼠相比，High组、Middele组以及脑复康组小鼠的错误次数有显著性差异(P＜0.01)，LRR组小鼠有差异，但差异不显著(P＜0.05)。实验说明该化合物及脑复康可以改善小鼠的学习记忆能力。

潜伏期：空白组小鼠的潜伏期明显短于其它各组。与空白组相比，Middle组和脑复康组小鼠具有显著性差异(P＜0.01)，High和Low组小鼠表现出差异，但差异不显著(P＜0.05)。试验说明，该化合物和脑复康均可延长潜伏期，但High和Low的作用不如Middle和脑复康。

表2对正常小鼠学习和记忆的影响

^***p＜0.01 ^**p＜0.05 ^*p＜0.1vs control group

实验例4对东莨菪碱致小鼠学习获得障碍模型的作用

1实验方法和步骤

1.1方法

将小鼠随机分6组，每组10只，编号，称重。各给药组训练前三天开始灌胃给药。以后每天训练前1h灌胃给药，训练前30min腹腔注射东莨菪碱2mg·kg^-1。空白对照组同时灌胃生理盐水。

1.2分组

空白对照组igNS；东莨菪碱模型组；脑复康200mg·kg^-1组(Piracetam)；高剂量组150mg·kg^-1(High)；中剂量组100mg·kg^-1(Middle)；低剂量组50mg·kg^-1(Low)。

1.3Morris水迷宫进行行为测试

历时5天，每天4次。测试方法如下：在水池壁表明四个入水点，由此将水池分为四个象限，任选取一个象限，正中放置一个直径6cm的平台，没于水下1cm，用淡牛奶使水池变为半透明，以掩盖平台位置。将小鼠分别从四个不同象限放入水池，记录2min内寻找平台的时间，即逃避潜伏期，2min内找不到平台者，将其放到平台上休息10s，再进行下一次训练，记录每次寻找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)，计算平均潜伏期。以小鼠平均潜伏期为正常对照。以确定药物对此模型的作用。

2实验结果

行为学测试结果见表3。脑复康和各剂量组对于此模型均有不同程度的改善作用，以脑复康、middle组为明显，且middle组与脑复康相当(P＞0.05)。其余各组均不及脑复康。

空白组训练第二天平均潜伏期与自身第一天比较即出现显著性差异，而东莨菪碱模型组第五天才出现。与自身相比，脑复康组于第三天才出现差异(P＜0.01)。middle组于训练第二天出现差异(P＜0.05)。

middle组与模型组比较第二天即出现差异(P＜0.05)，作用略早于脑复康组，但第五天平均潜伏期长于脑复康组(P＜0.05)。middle组第二、三、四天平均潜伏期与空白组同时相无差异，但训练第五天平均潜伏期长于空白组(P＜0.05)。仁茹三个剂量组间比较可见high组与模型组相当，无明显促进学习记忆作用，low作用较弱，与模型组比较差异无显著性，而与空白、脑复康、middle组比较差异显著(P＜0.01)。

表3对东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠的影响

^*P＜0.05 ^**P＜0.01 ^***P＜0.001 vs model group；△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001 vs itself

▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 ▲▲▲P＜0.001 vs control group※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001 vs piracetam

实验例5对NaNO₂致小鼠学习记忆巩固不良模型的作用

1实验方法和步骤

1.1方法

将小鼠随机分6组，每组11只，编号，称重。各给药组训练前三天看是灌胃给药。以后每天训练前1小时给药。各给药组与模型组每次训练后立即皮下注射亚硝酸钠120mg·kg^-1。空白对照组同时灌胃生理盐水。

1.2分组

空白对照组(igNS)；亚硝酸钠模型组(120mg·kg^-1·d^-1，sc，5d)；脑复康200mg·kg^-1组(Piracetam)；高剂量组150mg·kg^-1(High)；中剂量组100mg·kg^-1(Middle)；低剂量组50mg·kg^-1(Low)。

1.3Morris水迷宫进行行为测试

历时5天，每天4次。方法见实验例3中1.3项下。

2实验结果

Morris水迷宫行为测试结果见表4。亚硝酸钠所致的记忆巩固不良模型第四天平均潜伏期与自身第一天相比，才出现差异(P＜0.05)，而空白组第二天的平均潜伏期与自身第一天比即可出现差异(P＜0.05)。脑复康、high组及middle组第二天与自身第一天比较，差异即显著，与空白组同时相比较无差异。low组作用略慢，于训练第三天与自身第一天比较差异显著(P＜0.05)，与模型组比较差异显著(P＜0.05)。

Middle组改善作用明显，平均逃避潜伏期与空白组同时相比较无差异，且优于脑复康组(P＜0.05)。Middle组和low组第五天平均逃避潜伏期与空白组比较，差异具显著性(P＜0.05)，但明显短于模型组(P＜0.05)，与脑复康组无差异(P＜0.05)。

表4仁茹醇提液对亚硝酸钠所致学习记忆巩固不良小鼠的影响

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 vs model group △P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001 vs itself ▲P＜0.05▲▲P＜0.01 ▲▲▲P＜0.001 vs control group ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001 vs piracetam group

实验例6对酒精致小鼠学习记忆再现障碍模型的作用

1实验方法和步骤

1.1方法

将小鼠随机分为6组，每组10只，编号，称重。各给药组训练前三天开始灌胃给药。以后每天训练前1h给药。空白对照组同时灌胃生理盐水。

1.2分组

空白对照组(igNS)；20％酒精模型组(120mg·kg^-1·d^-1，sc，5d)；脑复康200mg·kg^-1组(Piracetam)；高剂量组150mg·kg^-1(High)；中剂量组100mg·kg^-1(Middle)；低剂量组50mg·kg^-1(Low)。

1.3Morris水迷宫进行行为测试

历时5天，每天4次。方法见实验例3中1.3项下。一般情况下，正常动物或服用促智药的动物经过5-6个实验日训练后，很快就会以最快的轨迹搜索到平台的确切位置。记录第5、6个训练日各组4次2min内寻找到平台的时间，即逃避潜伏期，计算其平均潜伏期。于第7个训练日，训练前30min灌胃20％乙醇，记录4次2min内寻找到平台的时间，计算其平均潜伏期。

2实验结果

见表5。模型组小鼠灌胃20％乙醇后的平均逃避潜伏期(48.5s)较自身第五、六天略长，但差异无显著性(P＞0.05)。Middle组灌胃20％乙醇后的平均潜逃期(10.13s)比自身第五、六天进一步缩短，差异仍显著(P＜0.05)，表明middle组可完全对抗20％乙醇对记忆再现的影响。High组灌胃20％乙醇后的平均逃避潜伏期变化同正常组，差异无显著性(P＞0.05)；脑复康组、low组和high组灌胃20％乙醇后的平均逃避潜伏期与自身第五、六天比，明显延长，差异具有显著性(P＜0.05)，说明其不能对抗20％乙醇对学习记忆再现的影响，且组间存在差异，差异显著(P＜0.01)。

表5仁茹醇提液对酒精致学习记忆再现障碍小鼠的影响

^*P＜0.05 ^**P＜0.01 ^***P＜0.001 vs model group；△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001 vs itself

▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 ▲▲▲P＜0.001 vs control group ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001 vs piracetam

实施例7

取上述的化合物10g，加入适量的辅料：淀粉4g、10％淀粉浆2.4g、干淀粉(4％左右)2.3g、硬脂酸镁(0.5％左右)0.3g，采用本领域公知的方法，压成片剂10片。按规定剂量服用，每天300～600mg，每天2～3次。

实施例8

取上述的化合物10g，分别加入适量的10％淀粉浆和食用色素后，制粒，采用本领域公知的方法，灌制硬胶囊20粒。按规定剂量服用，每天300～600mg，每天2～3次。

实施例9

取上述的化合物10g，加入适量的丙二醇和氯化钠作为增溶剂和等渗调节剂，加注射用水至100ml，按本领域公知的方法，过滤、精滤、灌封、灭菌、检验，制得规格为1ml:100mg的注射剂100支。按规定剂量使用，每天200～400mg。

Claims (3)

1、一种防治老年痴呆的中药活性成分化合物的制备方法，其工艺步骤如下：首先取干仁茹药材的根部，经过粉碎后，用浓度为75％～99％的乙醇，25～60℃下回流提取；过滤，滤液在常压或减压状态下浓缩至膏状，得浸膏；将所得的浸膏按极性梯度用萃取的方法分段，采用硅胶色谱和重结晶的方法分离纯化，直至分离得到化合物，其结构式为：

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述回流提取时乙醇的用量为8～10ml/g干仁茹药材的根部，重复提取1～3次。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的滤液在常压或减压状态下浓缩，其中的减压状态为0.09～0.1MPa。

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