CN110590968B

CN110590968B - 一种银耳低聚糖的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110590968B
Application number: CN201910835216.2A
Authority: CN
Inventors: 何荣军; 刘高丹; 孙培龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110590968A

Abstract

本发明公开了一种银耳低聚糖的制备方法及其应用，称取银耳多糖，加入去离子水中，混合均匀后倒入高速剪切、超声提取容器中备用，向其中加入纳米石英砂颗粒，将容器中的混合液体升温后，再开启超声进行高速剪切；离心分离后，留取上清液，喷雾干燥，即可得到银耳低聚糖，银耳低聚糖可以作为肠道益生菌碳源。本发明通过机械力和机械波联合并加入纳米级材料辅助，运用物理的方法直接将多糖降解，避免了生物试剂和化学试剂的残留的对糖活性的影响，整个过程不需要加入反应试剂，绿色环保，不给环境带来污染。

Description

一种银耳低聚糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种银耳低聚糖的制备方法及其应用，具体涉及一种联合物理法降解银耳多糖制备低聚糖的方法以及其对肠道益生菌的益生作用。

背景技术

银耳又称白木耳、雪耳、银耳子等，是担子菌纲银耳科植物的子实体。银耳子实体纯白至乳白色，银耳不但能增强机体抗肿瘤的免疫能力，还具有滋补生津；润肺养胃，补肺益气等功效。其中含有丰富的碳水化合物、蛋白质和多种氨基酸等成分。银耳作为一种营养丰富，产量高的食用菌，含有碳水化合物65％-71.2％左右，是一种很好的低聚糖来源。

低聚糖又称寡糖，是由2～10个单糖经脱水缩合由糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖类的合称。由于功能性低聚糖具有提高免疫力，降血糖和调节胃肠道的菌群等作用而备受关注。其来源极丰富，种类繁多且功能广泛。目前，其获取方法主要有以下几种，即从天然原料中直接提取，化学降解、酶降解和物理降解法等，而现有的这些方法均存在着诸多不足之处，比如消耗大量的化学试剂和生物试剂，降低糖的活性，糖的得率低等问题。

高速剪切技术是近年来新兴起的一种技术，因其具有绿色环保，操作简单，缩短生产周期，降低生产成本等优点，应用广泛与传统方法相比具有耗时短、节能、提取率高的特点。在高速剪切的过程中，样品在剪切容器中不断的旋转搅拌，再通过高速旋转的转子与定子之间所产生的强力的剪断、分散、冲击、乱流等过程使物料在剪切缝中被切割，迅速破碎成细小的微粒。高速剪切作用一方面可能使大分子化合物分子间缔合结构破坏，另一方面也可能使部分大分子物质链断裂，从而造成分子降解，高速剪切时带来的剧烈流体扰动，也能促进溶液的混匀程度。

超声波是一种频率高于20000赫兹的声波，可用于辅助溶剂提取，其特点为超声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞，提高目标产物的溶出率。同时，超声波的高速剪切作用也会造成一些蛋白质、多糖的部分降解。但因其能量较为集中，能量的强弱和距离有直接关系，因此容易造成处理不均匀。

由于单一的高速剪切作用或者超声作用的强度都只能使部分大分子的键断裂，仅能形成分子量较大的降解产物，要获得分子量较小的片段还需要组合其他方法。

纳米级石英砂是纳米材料中的一种，具有的在纳米级尺寸上的纳米棱角，这种棱角像＂刀刃＂一样，在高速运行下，可将大分子化合物间的化学键＂切断＂。在本发明中，主要利用高速剪切和超声波的空化剪切作用，以及流体的强扰动，带动纳米刀对银耳多糖大分子等进行高速切割作用，从而高效的得到降解后的银耳低聚糖，属于一种物理降解法。

戴其强(戴其强.草菇水溶性糖的制备及其体外益生元效应的研究[D].江西农业大学,2012.)确定了草菇水溶性糖提取的最佳工艺条件为固液比1:30，浸提温度50℃，浸提时间2h，连续浸提2次。醇沉多糖，离心分离的上清液减压浓缩至无乙醇，得草菇低聚糖浓缩液。但此方法用时长，程序复杂，消耗大量有机试剂。

王玢(王玢.银耳制品的制备及其生理功效研究[D].首都师范大学,2009.)采用法碱提取银耳多糖,在最优条件为：温度100℃,时间h,酸浓度5mol/L,此条件下盐酸水解,银耳还原糖得率为73.87％,但此方法耗时长，消耗大量化学制剂，容易污染环境。

任艳玲等(任艳玲,郭益冰,赵亚红,et al.过氧化氢在中性条件下氧化降解壳聚糖的研究[J].南通大学学报(医学版),2007,27(4):254-256.)壳聚糖的水溶液加人一定量的双氧水,加热搅拌一段时间进行降解。分子量为103万的壳聚糖降解得到分子量5万到94万不等壳聚糖。此方法可以很好的将多糖分子量降低，但不能将多糖降解成低聚糖。

专利200710069897.3将壳聚糖先与EDTA钠盐溶液中搅拌后过滤，加水混匀后加酸溶解、然后经酶解并过滤得壳低聚糖溶液。该方法由于酶的专一性所以只适用于壳聚糖，不适用于大部分多糖降解低聚糖上，且酶解条件繁琐。

专利CN109134676A用醇沉膜分离方法取中药材水提液中的多糖，然后加入纤维素酶进行酶解，再加入果胶酶进行酶解，酶灭活，即得低聚糖溶液，该方法能够获得分子量在2000以下的低聚糖，消耗大量的生物试剂，需要两次酶解反应，繁琐耗时。

张丽芬(张丽芬.果胶多糖超声波定向降解途径及机理研究[D].浙江大学,2013.)用超声波降解果胶的分子量分布变窄且更加均匀；当超声波降解时间为时90min，果胶分子量小于100KDa的片段可达47％。此方法是将多糖分子量降低但并未达到本发明所诉低聚糖的分子量，且时间长。

专利CN105368991A将处理后的落叶松纤维素与72％硫酸溶解混合，在室温条件下,超声波和微波联合辅助水解,制备低聚糖溶液。此方法快速方便，但是强酸易和多糖发生氧化反应，产生副反应产物，超声波和微波对样品的混匀作用不明显，也会影响实验效果。

专利CN102643362A将超声场与超滤分离有机结合起来，建立连续化的功率超声降解与膜分离一体化置，对降解多糖的分子量进行有效控制。但此发明是将多糖降解到1-500kDa分子量之间，不能有效的将其降解到低聚糖的分子量范围内。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型环保、工艺简单、易于操作、加工材料可重复利用的银耳低聚糖制备方法。本发明的另一个目的是提供该银耳低聚糖的一种应用。

本发明的技术方案如下：一种银耳低聚糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)称取银耳多糖，加入去离子水中，料液比为1∶20g/ml，混合均匀后倒入高速剪切\超声提取容器中备用，向其中加入纳米石英砂颗粒，加入量为每250ml混合液中加入1～7g纳米石英砂颗粒；

2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声，功率为500W/L，在转速20000～30000r/min下，高速剪切15～30min；

3)转速8000r/min下离心分离20min，留取上清液，喷雾干燥，即可得到分子量在300-2000之间的银耳低聚糖。

本发明还采用这样的技术方案：前述的银耳低聚糖作为肠道益生菌碳源的应用。

本发明与现有技术相比,有益效果体现在以下几点:低聚糖得率高、制备温度低，在50℃进行，可以避免一些美拉德反应、焦糖化反应产生的不良影响，制备速度快(15-30min)、工艺简单，无需有机溶剂。

(1)本发明通过机械力和机械波联合并加入纳米级材料辅助，运用物理的方法直接将多糖降解，避免了生物试剂和化学试剂的残留的对糖活性的影响，整个过程不需要加入反应试剂，绿色环保，不给环境带来污染。

(2)超声降解多糖是近年来新兴的方法，具有操作方便且无污染等优点，不消耗化学试剂和生物试剂十分的绿色、环保。

(3)纳米石英砂在扫描电子显微镜下观察的具有纳米级的棱角，不仅韧性好而且锋利，可以将分子间的化学键＂切断＂，用其辅助高速剪切，将其机械力转化到纳米石英砂的切割力上，可以有效的将大分子量的多糖切割成低聚糖，使多糖降解率大大提高，且纳米石英砂可反复利用。

(4)化学降解、酶降解等反应加入的反应试剂不能循环利用，新的多糖需要加入新的反应物，这样就使耗费成本高，并且会产生二次污染。

(5)本发明具有非化学、非生物、完全依靠物理外力分解多糖的优点，同时避免了二次污染。

附图说明

以下结合附图和本发明的实施方式来作进一步详细说明

图1为银耳低聚糖的制备工艺流程图；

图2(a)为单糖混标溶液的单糖组成分析，

(b)为银耳低聚糖的单糖组成分析，

P1为甘露糖、P2为氨基葡萄糖、P3为木糖、P4为葡萄糖、P5为半乳糖、P6为阿拉伯糖；

图3为银耳低聚糖的HPGPC的洗脱曲线图；

曲线S1为纤维二糖，曲线S2为葡萄糖，曲线S3为葡聚糖,曲线S4为银耳低聚糖，其中a1，a2，a3，a4，a5为峰值；

图4为银耳低聚糖对乳双歧杆菌的益生活性；

曲线T1为银耳低聚糖，曲线T2为葡萄糖，曲线T3为低聚半乳糖，曲线T4为菊粉，曲线T5为低聚果糖；

图5为银耳低聚糖对嗜酸乳杆菌的益生活性；

曲线U1为银耳低聚糖，曲线U2为葡萄糖，曲线U3为低聚半乳糖，曲线U4为菊粉，曲线U5为低聚果糖；

图6银耳低聚糖对鼠李糖乳杆菌的益生活性；

曲线V1为银耳低聚糖，曲线V2为葡萄糖，曲线V3为低聚半乳糖，曲线V4为菊粉，曲线V5为低聚果糖。

具体实施方式

1、银耳多糖制备方法

称取适量干的银耳子实体,40-50℃烘干至恒重,在常温下，用粉碎机粉碎，之后过筛孔尺寸0.106mm的筛，之后按照1：30的固液比溶解，在100℃下水提3h，之后离心取上清液，上清液旋转蒸发减压浓缩后按照上清液与乙醇体积比1:3加95％乙醇(乙醇终体积分数约为70％)，放置过夜。离心留取沉淀(7104g，20min)，将粗多糖沉淀稀释之后喷雾干燥。将粗多糖溶于去离子水中，配成50mg/mL溶液，向其中加入木瓜蛋白酶除去蛋白，调节pH为6.0，酶解后放至室温，离心(7104g，20min)，取上清溶液调pH为中性(pH＝7.0),将离心液喷雾干燥，将所得固体配成5mg/ml的粗多糖溶液，经0.45um水系滤膜过滤后上样，过DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换柱层析(XK26mm×100cm)，依次用经0.45um水系滤膜过滤后的蒸馏水、0.1、0.2和0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，每收集100管换一个梯度，收集以0.2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱的液体然后用2mol/L NaCl溶液清洗柱内残留的杂质，最后用蒸馏水除盐平衡。合并收集0.2mol/L NaCl组分的洗脱液，灌装至透析袋透析，用流动的自来水透析8h,蒸馏水透析24h，每2-4h更换一次蒸馏水，透析液喷雾干燥即得纯化多糖固体。

2、银耳低聚糖的分子量分布。

采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法测定银耳低聚糖样品的相对分子质量

(1)标准品及样品处理

称取纤维二糖(M＝342.3Da)、葡萄糖(M＝180.2Da)以及分子量2000的葡聚糖标准品，配置成2mg/mL的标准溶液，过0.45μm微孔滤膜后进行HPGPC分析。

将样品溶于去离子水中，配置成质量浓度为2mg/mL的银耳低聚糖样品溶液，过0.45μm微孔滤膜后进行HPGPC分析，根据峰形判断样品纯度。

(2)HPLC分析条件

设备：Waters 2695；检测器：Wates 2414示差折光检测器；色谱柱：GPC柱子SB802.5(7.8mm×300mm)，柱温：35±0.1℃；流动相0.1mol/L NaNO₃溶液；流速：1mL/min；进样量：20μL，运行时间：30min。

3、银耳低聚糖得率

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量

A(％)＝(V(g))/(W(g))×100％

A：银耳低聚糖得率

V：纯化后银耳低聚糖的质量

W：总糖的质量

4、喷雾干燥方法

将除去纳米石英砂的低聚糖溶液配成合适比例放入喷雾干燥机，进行喷雾干燥

5、银耳低聚糖的单糖组成

PMP衍生化法测定单糖组成分析：

(1)单糖标准品的衍生化

精密称取甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、氨基葡萄糖，阿拉伯糖各2mg置于10mL容量瓶中混匀，以蒸馏水溶解并定容，即得单糖混标溶液。准确移取0.2mL单糖混标溶液于具塞旋蒸瓶中，加入0.2mL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液和0.2mL 0.3mol/L的NaOH溶液，于70℃水浴锅中反应60min，冷却后加入0.2mL0.3mol/L的HCl溶液中和，加入1mL氯仿萃取，离心，取上层水相，再加1mL氯仿萃取，重复操作三次。收集水相，用蒸馏水定容至5mL，过0.22μm滤膜，HPLC分析。

(2)多糖样品的衍生化

精密称取多糖样品6mg置于具塞旋蒸瓶中，加入2mL 2mol/L三氟乙酸，封管后置于110℃油浴锅中水解5h，冷却至室温后离心，取上清液减压蒸干，加1mL甲醇重复洗涤三次，减压蒸干，即得多糖水解产物。将水解产物按(1)中所述方法进行衍生化反应，所得水相以蒸馏水定容至5mL，过0.22μm滤膜，HPLC分析。

(3)HPLC分析条件

检测器：紫外检测器；

色谱柱：Inertsi ODS-3，C18柱(4.6mm×25mm、5μm)

柱温：30±0.1℃

流动相：乙腈：0.05mol/L磷酸盐(pH 6.8)＝18:82，流速：1mL/min；

进样量：20μL，运行时间：65min。

银耳低聚糖的HPGPC的洗脱曲线如图3所示，呈现5个不同的色谱峰，对照纤维二糖S1(M＝342.3Da)、葡萄糖S2(M＝180.2Da)和葡聚糖S3(M＝2000Da)呈现的色谱峰可知，银耳低聚糖中不存在单糖类物质，存在大量二糖类物质。由a3、a4、a5三个峰可推断3、4两峰为分子量相近的寡糖类物质。由分子量为2000的葡聚糖可知a1，a2，a3，a4，a5为分质量小于2000的物质，即为低聚糖。因此，银耳低聚糖为含有二糖和寡糖类物质的糖类混合物。

6、银耳低聚糖益生作用研究

以菌体吸光度值的变化来考察银耳低聚糖作为碳源对肠道益生菌体外增殖的效果，分别接种定量浓缩菌液于分装好的、添加了不同碳源的发酵培养基中，37℃厌氧培养12h后取样测定吸光度值。吸光度测定波长为600nm，无菌培养基做空白对照。

取纯化后的银耳低聚糖，按照0.5％，1％，2％，3％，4％的含量加入5mL去除碳源的MRS液体培养基中，灭菌冷却，加入1mL浓缩菌液。厌氧培养12h后，使益生菌处于对数生长期，此时在600nm处测定吸光度，吸光度值和菌的含量成正比，测定银耳低聚糖对益生菌生长的影响。每组做三次平行实验。

以葡萄糖和常见的益生元——菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖分别作为碳源制成MRS培养基，培养嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌，将其益生效果作为参照，与银耳低聚糖组进行比较。每组做三次平行实验。

实施例1

(1)称取适量银耳多糖，按料液比1∶20加入去离子水中，混合均匀后倒入高速剪切+超声提取容器中备用，按3∶250质量体积比(g/mL)向其中加入纳米石英砂颗粒。

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速20000r/min下，高速剪切15min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为110000Da，得率为10.16％。

(4)以测定其吸光度的方法考察银耳低聚糖作为碳源对肠道益生菌的体外增殖效果。益生效果差。

实施例2

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速22000r/min下，高速剪切20min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为48000Da，得率为21.56％。

实施例3

(1)称取适量银耳多糖，按料液比1∶20加入去离子水中，混合均匀后倒入高速剪切+超声提取容器中备用，按5∶250质量体积比(g/mL)向其中加入纳米石英砂颗粒。

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速24000r/min下，高速剪切23min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为18000Da，得率为28.56％。

实施例4

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速28000r/min下，高速剪切25min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为8000Da，得率为40.17％。

(4)以测定其吸光度的方法考察银耳低聚糖作为碳源对肠道益生菌的体外增殖效果。益生效果较差。

实施例5

(1)称取适量银耳多糖，按料液比1∶20加入去离子水中，混合均匀后倒入高速剪切+超声提取容器中备用，按7∶250质量体积比(g/mL)向其中加入纳米石英砂颗粒。

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速30000r/min下，高速剪切30min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为1500Da，得率为90.18％。

(4)以测定其吸光度的方法考察银耳低聚糖作为碳源对肠道益生菌的体外增殖效果。益生效果好。

实施例6

(2)将容器中的混合液体升温至50℃后，开启超声(功率500W/L)，在转速26000r/min下，高速剪切28min。

(3)离心分离(8000r/min，20min)，留取上清液，喷雾干燥，即可得到低聚糖固体。平均分子量为4700Da，得率为70.18％。

(4)以测定其吸光度的方法考察银耳低聚糖作为碳源对肠道益生菌的体外增殖效果。益生效果较好。

Claims

1.一种银耳低聚糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.权利要求1所述的银耳低聚糖作为肠道益生菌碳源的应用。