CN114349806A

CN114349806A - 一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法

Info

Publication number: CN114349806A
Application number: CN202210054809.7A
Authority: CN
Inventors: 牟海津; 任昕淼; 付晓丹; 肖梦诗; 郁东兴; 刘永健; 刘永文
Original assignee: Brilliance Bio Tech Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Brilliance Bio Tech Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-18
Also published as: CN114349806B

Abstract

本发明提供一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法，将纳豆芽孢杆菌接种含有单糖的岩藻寡糖混合物，获得含有岩藻寡糖，纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶的发酵液，离心分离上清液和菌体，上清液超滤获得寡糖滤出液和纳豆激酶截留液，滤出液通过浓缩干燥，获得纯度大于85%的岩藻寡糖，离心菌体重悬后循环使用，纳豆激酶截留液浓缩冻干成粉。本发明纳豆芽孢杆菌发酵法能够脱除岩藻寡糖混合物中的杂单糖，大大提高岩藻寡糖的纯度。工艺设计巧妙合理，发酵获得高值副产物纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶，可作为功能性食品的低成本原料，或开发低聚糖—益生菌—活性代谢产物复合的多功能活性产品。

Description

一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体为一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法。

背景技术

岩藻寡糖分子量小、水溶性和吸收性好、生物利用度高，具有益生、抗炎、抗凝血、免疫调节、促进认知发育等多种潜在生理功能。岩藻寡糖的来源包括母乳、陆地和海洋的动植物多糖和各种细菌，真菌和微藻的胞外多糖等。目前岩藻寡糖主要通过岩藻多糖的降解获得，岩藻多糖包括海参、海藻多糖和含有岩藻糖的细菌胞外多糖等。多糖降解的方法主要包括生物酶解、化学降解和物理降解法，但岩藻多糖降解酶还处于筛选开发阶段，成本昂贵，酶解法适用性不高，化学和物理水解的优势更明显，成本低，实操性强，但微波降解，酸水解等物化降解法在制备岩藻寡糖的同时产生大量游离单糖副产物，葡萄糖、半乳糖等杂糖组分不仅降低了岩藻寡糖的纯度，也破坏了岩藻寡糖的功能性，制约其进一步的研究和应用。

寡糖的分离纯化技术主要有色谱柱法、膜法和微生物发酵法等，由于单糖与寡糖的分子量接近，化学性质相似，因此分离难度大，分离条件比较苛刻。色谱柱法利用各组分与色谱柱填料间的结合力强度的差异进行分离纯化，膜法依靠滤膜孔径来筛分不同分子量的物质，两种技术虽然已经工业化，但设备昂贵，分离效率低，成本相对较高。微生物发酵法是利用某些细菌对单糖的优先选择性利用，通过糖液发酵去除寡糖中杂糖的方法，最常用的是酵母细胞，酵母利用单糖，产生乙醇和二氧化碳，最后脱除乙醇得到纯化寡糖。微生物发酵法操作工艺简单、设备投入成本较低且分离效果好，具有广阔的应用前景。

纳豆芽孢杆菌是发酵食品用菌种和益生菌，广泛应用于食品生产和农业养殖领域，其产生的纳豆激酶具有预防血栓形成，降血压、降血脂、抗炎、抗肿瘤等心血管系统保健功能。纳豆芽孢杆菌是微生物发酵法纯化寡糖的潜在菌种，可以利用葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖等多种单糖作为碳源，能够有效脱除寡糖混合物中的多种杂单糖，发酵后的副产物是高值的益生菌及其活性代谢产物，分离方法简单且具有多种生理功能，开发应用价值很高。目前，尚未见将纳豆芽孢杆菌应用于岩藻寡糖纯化的报道，研究和开发新型菌株在岩藻寡糖制备纯化中的应用，降低岩藻寡糖分离纯化成本，可为从岩藻多糖中开发岩藻寡糖提供更多元化，更便捷的手段和方式。

发明内容

本发明目的在于提供一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法，通过纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物的简单发酵，有效脱除岩藻寡糖混合物中除了岩藻糖以外的杂单糖，包括葡萄糖和半乳糖等，最终通过离心超滤即可获得纯度约为85%的岩藻寡糖，工艺简单，成本低，适用性好。分离的副产物中，纳豆芽孢杆菌用于循环发酵，纳豆激酶作为开发其他功能性食品的低成本原料。同时，发酵液整体也可以开发岩藻寡糖，纳豆芽孢杆菌，纳豆激酶复合的多功能活性产品。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，包括如下步骤：将纳豆芽孢杆菌进行菌种活化，向岩藻寡糖混合物中接种活化后的纳豆芽孢杆菌进行发酵，获得脱除杂单糖后的岩藻寡糖发酵液。

一种应用纳豆芽孢杆菌获得纯化寡糖产物的方法，采用如权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，并获得脱除杂单糖后的岩藻寡糖发酵液，将发酵液进行离心，获得菌体沉淀和上清液，上清液进行超滤分离得到岩藻寡糖滤出液和纳豆激酶截留液，滤出液通过浓缩干燥获得纯化寡糖产物，截留液经冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉。

进一步的，在本发明中，菌种活化的过程如下，将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，挑取单菌落接种至增菌培养基中培养，传代活化二次。

进一步的，在本发明中，岩藻寡糖发酵液由岩藻寡糖、纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶组成，可经复配冻干成粉，获得多功能活性产品。

进一步的，在本发明中，所述岩藻寡糖混合物是由岩藻多糖降解获得的含有岩藻寡糖、杂单糖和岩藻糖的混合物。

进一步的，在本发明中，所述平板培养基和增菌培养基分别为LB固体和液体培养基，活化条件为：接种量0.5-5%（V/V），活化温度35-37 ℃，转速100-300 rpm，活化时间3-24h。

进一步的，在本发明中，发酵过程如下：将岩藻寡糖混合物旋蒸浓缩0-4倍，调pH至中性，按照0.1-1%的质量比接种纳豆芽孢杆菌菌体，发酵条件为：发酵温度35-37 ℃，转速100-300 rpm，发酵时间6-24 h。

进一步的，在本发明中，超滤分离时使用的超滤膜截留分子量为5000-10000 Da。

进一步的，在本发明中，菌体沉淀中获得菌体，所述菌体可再用于岩藻寡糖混合物的发酵，菌体沉淀循环使用的次数为1-5次。

进一步的，在本发明中，所述纳豆激酶冻干粉的酶活为500-1000 FU/g。

有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：

1、本发明利用微生物优先消耗单糖的特性，在脱除杂单糖的情况下，基本不损失岩藻糖和岩藻寡糖组分，从而大幅提高岩藻寡糖的纯度，在普遍以物化法降解岩藻多糖的工艺背景下，相比层析，膜分离等纯化工艺，能够节约时间和设备成本，实操性强，效率高，同时适用于实验室和工业化的制备应用。

2、本发明选取纳豆芽孢杆菌作为发酵菌种，无需增加去除乙醇，离子酸等单糖发酵副产物的工艺步骤，反而能够分离得到高值的代谢产物纳豆激酶，同时，发酵后的纳豆芽孢杆菌菌体可以在工艺中循环使用，也可以附加复配冻干等其他工艺获得纳豆芽孢杆菌益生菌产品，而从而降低工艺成本，提高经济效益，同时减少废液废固的产生，环境友好。

3、本发明发酵获得的低聚糖，益生菌，益生菌代谢产物的混合发酵液可以作为一种复合的多功能活性产品，应用于功能性食品领域。为从多糖中开发功能性寡糖提供更加简单高效的手段。拓展了活性寡糖和益生菌的应用领域和应用形式，是二者除合生元之外一种新的组合方式。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

图1为本发明岩藻寡糖混合物中游离单糖组成色谱图。

图2为本发明三个菌株发酵过程中OD₆₀₀值和pH值的变化图，从左至右依次为纳豆芽孢杆菌，干酪乳杆菌和大肠杆菌。

图3为本发明三个菌株发酵前后岩藻寡糖、杂单糖和岩藻糖的含量色谱图。

图4为本发明三个菌株发酵过程中岩藻寡糖、杂单糖和岩藻糖的含量变化图。

图5为本发明不同发酵条件下纳豆芽孢杆菌生长增殖情况，图5中A为纳豆芽孢杆菌OD₆₀₀值变化图；图5中B为纳豆芽孢杆菌pH值变化图。

图6为本发明纳豆芽孢杆菌不同发酵条件下岩藻寡糖，杂单糖和岩藻糖的含量变化图。

图7为本发明单糖脱除后岩藻寡糖中游离单糖组成色谱图。

图8为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定义在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。

如图8所示，本发明给出一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法，包括菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，挑取单菌落接种至增菌培养基中培养，传代活化二次。

岩藻寡糖混合物的发酵：向岩藻寡糖混合物中接种纳豆芽孢杆菌进行发酵，获得脱除杂单糖后的岩藻寡糖发酵液。

岩藻寡糖的分离：将发酵液离心，上清液进行超滤分离得到岩藻寡糖滤出液和纳豆激酶截留液，滤出液通过浓缩干燥获得纯化寡糖产物。

其他发酵产物的处理：发酵液离心获得的菌体沉淀，经适当比例重悬后，循环使用于发酵过程中，超滤截留的纳豆激酶粗酶液，经冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉。

根据上述方法具体的实施例如下：

一、岩藻寡糖的制备和游离单糖的测定

配制1%的岩藻多糖溶液，加入盐酸调节pH为2，70 ℃酸解2 h后，冷却至室温，酸解液4000 rpm离心20 min，获得含有单糖的岩藻寡糖粗糖液。

使用PMP柱前衍生化法测定岩藻寡糖粗糖液中游离单糖的种类和含量。

检测操作条件如下：

PMP柱前衍生化法具体为：称取冻干后的岩藻寡糖配制为10 g/L岩藻寡糖溶液，调岩藻寡糖溶液pH为中性。岩藻寡糖溶液和各单糖标准品溶液（1 g/L）与两倍体积NaOH（0.3mol/L）和PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液（0.5 mol/L）混合，70 ℃反应60 min后，冷却至室温，用HCl（0.3 mol/L）中和NaOH，二氯甲烷反复萃取除去PMP试剂，过0.22 µm微孔滤膜后进行HPLC分析。HPLC分析使用Agilent 1260高效液相色谱仪，紫外检测器和Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6mm×150mm,5μm）分析单糖组成。系统温度设置为30 ℃；流动相为0.05 mol/L KH₂PO₄（pH 6.7）：CH₃CN=83:17（V:V）；流速为1 mL/min；进样量为10 µL；检测波长245 nm。

结果如图1所示，岩藻寡糖混合物中的游离单糖为岩藻糖1.14 g/L、葡萄糖1.58g/L、半乳糖1.56 g/L，甘露糖0.26 g/L，共计4.54 g，占寡糖混合物的45.4%，得岩藻寡糖的纯度约为54.6%。其中除岩藻糖外的杂单糖共3.40 g/L，占寡糖混合物的34%，表明岩藻寡糖酸解产物中含有1/3的杂单糖，对寡糖的纯度有极大影响。

二、脱单糖发酵菌株筛选

选取大肠杆菌，干酪乳杆菌和纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，大肠杆菌和纳豆芽孢杆菌用LB固体和液体培养基培养，干酪乳杆菌用MRS固体和液体培养基培养。

活化方法为：菌株先划线于固体培养基中，37 ℃培养24 h后，再用无菌接种环挑取单菌落于液体培养基中培养24 h后，按照1%（V/V）的接菌量二次活化至对数生长期，4 ℃低速离心2 min获得菌体沉淀待用。

酸解后的岩藻寡糖粗糖液用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，菌体由无菌PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，使发酵0 h的OD₆₀₀值为0.1±10%。发酵温度为37 ℃，转速为200 rpm，时间为24 h。测定发酵过程中0 h、6 h、12 h、18 h、24 h发酵糖液的OD₆₀₀值和pH值，评价三株菌的生长增殖情况。

利用高效液相色谱法测定几个发酵时间点岩藻寡糖混合物中岩藻糖、杂单糖和岩藻寡糖的含量变化，计算发酵终点的岩藻寡糖纯度，评价三株菌脱除杂单糖的效果，检测操作条件如下：

取1 mL岩藻寡糖粗糖液，过0.22 µm微孔滤膜后上机分析。使用Agilent 1260高效液相色谱仪，示差折光检测器和OHpak SB-802.5色谱柱，系统温度设置为30 ℃；流动相为100% H₂O；流速1 mL/min；上样量为10 µL。使用不同分子量的寡糖标品（岩藻糖（164 Da）、甘露糖（180 Da），甘露二糖（342 Da），甘露三糖（504 Da），甘露四糖（666 Da），甘露五糖（828 Da），1000 Da，3650 Da，5000 Da）绘制标准曲线。

三个菌株在发酵过程中的生长增殖情况如图2所示，相比于干酪乳杆菌和大肠杆菌，纳豆芽孢杆菌菌体增殖迅速，但pH仅下降了0.5左右，而另两株菌大量产酸，产生细胞毒性抑制自身生长。结果表明纳豆芽孢杆菌生长快，产酸少，对无氮源寡糖环境适应性好，是发酵的潜力菌株。

三个菌株发酵液中岩藻糖、杂单糖和岩藻寡糖的含量变化如图3和图4所示，三个菌株0 h和24 h的发酵液色谱图显示，纳豆芽孢杆菌组发酵24 h后，岩藻寡糖混合物中杂单糖对应的峰消失，表明杂单糖被利用完全，而干酪乳杆菌组和大肠杆菌组发酵24h后，杂单糖峰未消失，表明杂单糖仍有残余。测定5个发酵时间点（0 h、6 h、12 h、18 h、24 h）岩藻寡糖、杂单糖和岩藻糖的含量变化，发现纳豆芽孢杆菌组中岩藻糖含量基本无变化，其余杂单糖于18 h被利用完全，而干酪乳杆菌组和大肠杆菌组发酵24h后仍有杂单糖残余，利用杂单糖的能力较差。

综合菌株生长情况和单糖脱除结果，纳豆芽孢杆菌能够完全脱除岩藻寡糖混合物中的杂单糖，从而提高岩藻寡糖的纯度，是纯化岩藻寡糖的优势菌株。

三、纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除的工艺（实施例）

实施例A：

菌种活化：纳豆芽孢杆菌划线于LB固体培养基中，37 ℃培养6 h后，用无菌接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养6 h后，按照1%（V/V）的接菌量二次活化至对数生长期，4℃低速离心2 min获得菌体沉淀待用。

寡糖混合物的发酵：酸解后的岩藻寡糖粗糖液用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，按质量比设置接菌量为0.1%，0.1%菌体由无菌PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，发酵温度为35 ℃，转速为100 rpm，时间为24 h。

寡糖混合物的分离：发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集上清液和菌体，使用截留分子量为5000 Da的超滤膜对上清液进行分离（超滤压力为0.5 MPa）。滤出液为岩藻寡糖溶液，截留液为纳豆芽孢杆菌粗酶浓缩液。岩藻寡糖溶液于50 ℃旋蒸浓缩至1/4体积，冷冻干燥。

实施例B：

菌种活化：纳豆芽孢杆菌划线于LB固体培养基中，37 ℃培养12 h后，用无菌接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养12 h后，按照1%（V/V）的接菌量二次活化至对数生长期，4 ℃低速离心2 min获得菌体沉淀待用。

寡糖混合物的发酵：将酸解后的岩藻寡糖粗糖液浓缩2倍后，用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，按质量比设置接菌量为0.25%，0.25%菌体由无菌PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，发酵温度为35 ℃，转速为150 rpm，时间为24 h。

寡糖混合物的分离：发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集上清液和菌体，使用截留分子量为6000 Da的超滤膜对上清液进行分离（超滤压力为0.5 MPa）。滤出液为岩藻寡糖溶液，截留液为纳豆芽孢杆菌粗酶浓缩液。岩藻寡糖溶液于50 ℃旋蒸浓缩至1/4体积，冷冻干燥。

实施例C：

菌种活化：纳豆芽孢杆菌划线于LB固体培养基中，37 ℃培养24 h后，用无菌接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养24 h后，按照1%（V/V）的接菌量二次活化至对数生长期，4 ℃低速离心2 min获得菌体沉淀待用。

寡糖混合物的发酵：将酸解后的岩藻寡糖粗糖液浓缩3倍后，用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，按质量比设置接菌量为0.5%，0.5%菌体由无菌PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，发酵温度为37 ℃，转速为200 rpm，时间为24 h。

寡糖混合物的分离：发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集上清液和菌体，使用截留分子量为8000 Da的超滤膜对上清液进行分离（超滤压力为0.5 MPa）。滤出液为岩藻寡糖溶液，截留液为纳豆芽孢杆菌粗酶浓缩液。岩藻寡糖溶液于50 ℃旋蒸浓缩至1/4体积，冷冻干燥。

实施例D：

寡糖混合物的发酵：将酸解后的岩藻寡糖粗糖液浓缩4倍后，用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，按质量比设置接菌量为1%，1%菌体由无菌PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，发酵温度为37 ℃，转速为250 rpm，时间为24 h。

寡糖混合物的分离；发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集上清液和菌体，使用截留分子量为10000 Da的超滤膜对上清液进行分离（超滤压力为0.5 MPa）。滤出液为岩藻寡糖溶液，截留液为纳豆芽孢杆菌粗酶浓缩液。岩藻寡糖溶液于50 ℃旋蒸浓缩至1/4体积，冷冻干燥。

四、检测纳豆芽孢杆菌的生长增殖情况

按照将实施例A-D的工艺条件进行操作，并定义为发酵组1-4，未接种纳豆芽孢杆菌的岩藻寡糖粗糖液作为空白组，测定每组发酵过程中0 h、6 h、12 h、18 h和24 h发酵糖液的OD₆₀₀值和pH值，评价纳豆芽孢杆菌的生长增殖情况。OD₆₀₀值和pH值的测定分别使用酶标仪和pH计，结果如图5所示，纳豆芽孢杆菌在0-12 h间OD₆₀₀值迅速增加，表明菌株在此期间快速生长，12-24 h进入平稳期，菌体停止增殖。pH值于0-12 h降低，表明菌株利用碳水化合物产生丙酮酸等初级代谢产物，12-24 h间pH值回升，表明蛋白等次级代谢产物的积累，发酵组3的pH迅速降低后回升，且生物量积累较高，生长情况最佳。

五、检测纳豆芽孢杆菌发酵法脱除单糖的效果

利用高效液相色谱法测定每组中5个发酵时间点（0 h，6 h，12 h，18 h和24 h）岩藻寡糖混合物中岩藻糖、杂单糖和岩藻寡糖的含量变化，计算发酵终点的岩藻寡糖纯度，评价各发酵组杂单糖脱除的效果，检测操作如前所述。

测定各发酵组中岩藻糖、杂单糖和岩藻寡糖岩藻寡糖的含量，结果如图6所示，四个发酵组均可在24 h内完全脱除寡糖混合物中杂单糖。与发酵组1和发酵组2相比，发酵组3和发酵组4于18 h时可完全脱除杂单糖，单糖脱除的效率更高。

六、单糖脱除后岩藻寡糖中游离单糖种类和含量

使用PMP柱前衍生化法测定通过纳豆芽孢杆菌发酵法纯化后，岩藻寡糖中游离单糖的种类和含量。检测操作条件如前所述。

测得结果如图7所示，岩藻寡糖中的游离单糖为岩藻糖1.34 g/L，表明通过纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖粗糖液的发酵，脱除了岩藻寡糖混合物中的除岩藻糖之外的杂单糖，岩藻寡糖的纯度约为86%，纯度提高30%，表明纳豆芽孢杆菌发酵法是纯化岩藻寡糖的有效手段，能够脱除岩藻寡糖混合物中的杂单糖，大大提高岩藻寡糖的纯度。

七、寡糖得率和发酵副产物纳豆激酶酶活的测定

发酵组1-4获得的岩藻寡糖冻干粉称重测定岩藻寡糖得率，评价几组发酵参数对岩藻寡糖纯化得率的影响，如表1。四个发酵组的寡糖得率依次增加，发酵组3和发酵组4的寡糖得率相差不大。同时，图4高效液相色谱法测得岩藻寡糖的分子量小于5000 Da，使用截留量大于5000 Da超滤膜可以用来分离发酵副产物。得率结果表明，寡糖分离时，超滤膜截留量的分子量应适当大于寡糖分子量，避免岩藻寡糖的损失

得率（%）	发酵组1	发酵组2	发酵组3	发酵组4
					岩藻寡糖	59.37%	61.76%	64.22%	64.49%

表1 不同发酵工艺对岩藻寡糖纯化得率的影响。

使用吸光值法检测四个发酵组获得的纳豆激酶冻干粉的酶活，评价四种发酵工艺对发酵副产物纳豆激酶酶活的影响。检测操作条件如下：

向试管中加入0.7 mL硼酸盐缓冲液，于37±0.5 ℃金属浴中静置10 min。分别加入0.2 mL 0.72%纤维蛋白原溶液，手动颠倒混匀5 s，并于37±0.5 ℃金属浴中静置10min。加入50 μL 20 U/mL凝血酶溶液制作人工血栓，手动颠倒混匀5 s，37±0.5 ℃金属浴中静置10 min。每一个实施例制备的纳豆激酶均设置3个平行实验组和1个空白组。

实验组：精确加入50 μL用样品稀释液稀释5倍的纳豆激酶粗酶液，涡旋振荡混合5s后于37±0.5 ℃下恒温振荡反应60 min。立即加入1 mL 20 mmol/L三氯乙酸溶液终止反应，于37±0.5 ℃下恒温振荡反应20 min，常温下10000 rpm离心1 min，用注射器小心吸取上清液，过0.22 μm水相滤膜后于275 nm处测定吸光值。

空白组：加入1mL 20 mmol/L三氯乙酸溶液终止反应，于37± 0.5 ℃下恒温振荡反应20 min。精确加入50 μL实验组对应的纳豆激酶粗酶液涡旋振荡混合5 s后于37±0.5℃下恒温振荡反应60 min。常温下10000 rpm离心1 min，用注射器小心吸取上清液，过0.22μm水相滤膜后于275 nm处测定吸光值。

取实验组的吸光值平均值带入以下公式求得纳豆激酶酶活。

纳豆激酶酶活（FU/g）＝A*100*20*N/t/M；

A为实验组吸光值平均值与空白组吸光值差值，需控制在0.075～0.09之间；N为样品稀释倍数；100即1/0.01，酶活单位定义为吸光值每上升0.01的变化；20即1000/50，反应中添加样品量为50 μL；t为纳豆激酶纤溶反应时间（min）；M为1 mL纳豆激酶粗酶液冻干后的质量（g）。

酶活单位定义：FU/g，1 FU等于1 min内导致吸光值每上升0.01的酶量。

四个发酵组的纳豆激酶酶活依次增加，发酵组3和发酵组4的纳豆激酶酶活相差不大，表明发酵副产物纳豆激酶被高效收集浓缩，酶活力较高，可以作为优质原料应用于其他领域。

四种发酵工艺所得纳豆激酶的酶活结果如表2。

酶活（FU/g）	发酵组1	发酵组2	发酵组3	发酵组4
					纳豆激酶	648.92±0.28	739.81±0.14	916.71±015	956.77±0.18

表2 不同发酵工艺对发酵副产物纳豆激酶酶活的影响。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：包括如下步骤：将纳豆芽孢杆菌进行菌种活化，向岩藻寡糖混合物中接种活化后的纳豆芽孢杆菌进行发酵，获得脱除杂单糖后的岩藻寡糖发酵液。

2.一种应用纳豆芽孢杆菌获得纯化寡糖产物的方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，并获得脱除杂单糖后的岩藻寡糖发酵液，将发酵液进行离心，获得菌体沉淀和上清液，上清液进行超滤分离得到岩藻寡糖滤出液和纳豆激酶截留液，岩藻寡糖滤出液通过浓缩干燥获得纯化寡糖产物，纳豆激酶截留液经冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉。

3.根据权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：菌种活化的过程如下，将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，挑取单菌落接种至增菌培养基中培养，传代活化二次。

4.根据权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：岩藻寡糖发酵液由岩藻寡糖、纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶组成，可经复配冻干成粉，获得多功能活性产品。

5.根据权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：所述岩藻寡糖混合物是由岩藻多糖降解获得的含有岩藻寡糖、杂单糖和岩藻糖的混合物。

6.根据权利要求3所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：所述平板培养基和增菌培养基分别为LB固体和液体培养基，活化条件为：接种量0.5-5%（V/V），活化温度35-37 ℃，转速100-300 rpm，活化时间3-24 h。

7.根据权利要求1所述的一种应用纳豆芽孢杆菌进行岩藻寡糖混合物中单糖脱除的方法，其特征在于：发酵过程如下：将岩藻寡糖混合物旋蒸浓缩0-4倍，调pH至中性，按照0.1-1%的质量比接种纳豆芽孢杆菌菌体，发酵条件为：发酵温度35-37 ℃，转速100-300 rpm，发酵时间6-24 h。

8.根据权利要求2所述的一种应用纳豆芽孢杆菌获得纯化寡糖产物的方法，其特征在于：超滤分离时使用的超滤膜截留分子量为5000-10000 Da；

菌体沉淀中获得菌体，所述菌体可再用于岩藻寡糖混合物的发酵，菌体沉淀循环使用的次数为1-5次。

9.根据权利要求2所述的一种应用纳豆芽孢杆菌获得纯化寡糖产物的方法，其特征在于：包括如下过程：

菌种活化：纳豆芽孢杆菌划线于LB固体培养基中，35-37 ℃培养3-24 h后，用无菌接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养3-24h后，按照0.5-5%（V/V）的接菌量二次活化至对数生长期，4 ℃低速离心2 min获得菌体沉淀待用；

寡糖混合物的发酵：酸解后的岩藻寡糖粗糖液用NaHCO₃调pH为7.0，过膜加入灭菌后的反应器中，按质量比设置接菌量为0.1-1%，0.1-1%的菌体由PBS重悬后接种于岩藻寡糖粗糖液中，发酵温度为35-37 ℃，转速为100-300 rpm，时间为6-24 h；

寡糖混合物的分离：发酵液于4 ℃，8000 rpm离心5 min，收集上清液和菌体，使用截留分子量为5000-10000 Da的超滤膜对上清液进行分离，超滤压力为0.5 MPa，流速为1.5 mL，滤出液为岩藻寡糖溶液，截留液为纳豆芽孢杆菌粗酶浓缩液，岩藻寡糖溶液于50 ℃旋蒸浓缩至1/4体积，冷冻干燥。

10.根据权利要求2所述的一种应用纳豆芽孢杆菌获得纯化寡糖产物的方法，其特征在于：所述纳豆激酶冻干粉的酶活为500-1000 FU/g。