CN112094752B - 一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法 - Google Patents

一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及到一种利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ‑6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法。该方法以出芽短梗霉为生产菌种，利用葡萄糖或蔗糖为底物，30℃条件下，采用分批发酵方式生产普鲁兰多糖，生产得到的普鲁兰多糖的产量可达110~120 g/L，底物转化率达78~85%，分子量低至2.5×103~9.0×103，具有发酵液粘度低、普鲁兰多糖产量和底物转化率高、以及普鲁兰多糖分子量低的优点，极具工业生产潜力。

Description

一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及到一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法。
背景技术
普鲁兰多糖（Pullulan）是一种由麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键连接而成的微生物胞外多糖。由于其具有诸多优良特性如水溶性、生物降解性、生物兼容性、成膜性以及化学可塑性等，普鲁兰多糖及其衍生物可广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。在日本，普鲁兰多糖作为食品添加剂无使用限制。我们国家于2006年也将普鲁兰多糖批准为食品添加剂新品种。普鲁兰多糖的大规模工业化生产是实现其广泛应用的前提。尽管普鲁兰多糖在1959年被发现可由出芽短梗霉发酵生产，但直到70年代才由日本林原生化公司实现规模化生产，并一直垄断国际市场。国内在90年代才开始相关研究，经过20多年的发展，虽然取得了较大进展，但在普鲁兰多糖产量、底物转化率、发酵周期、以及分子量控制等方面还存在诸多问题。
作为一种高分子聚合物，分子量是影响普鲁兰多糖物理化学性质和应用领域的一个重要因素。普鲁兰多糖分子量主要受到菌种差异、培养基组分、以及发酵条件的影响。在不同分子量的普鲁兰多糖的生产方面，检索到相关的文献如下：1、申请号为97121608.8的中国专利公开的一种发酵生产普鲁兰的新方法，得到的普鲁兰多糖分子量为1×105；2、申请号为200810052070.6的中国专利公开的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，普鲁兰多糖的分子量为2×105~6×105；3、申请号为200910148764.4的中国专利公开的一种生产不同分子量普鲁兰糖的方法，通过调节发酵培养基中酵母膏和硫酸铵的含量得到分子量为8×104~4×105的普鲁兰多糖；4、申请号为专利201210555219.9的中国专利公开了一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，通过调节培养基中磷酸盐浓度和初始pH，可以得到分子量为5×105~2×106的普鲁兰多糖；5、申请号为201310370435.0的中国专利公开了一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，同样通过调节培养基中磷酸盐浓度和发酵过程中pH，得到分子量为2×105~5×105的普鲁兰多糖；6、申请号为201610827587.2的中国专利公开了一种半连续法生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，采用半连续发酵模式并调节发酵过程中的pH，可以得到分子量为2×105~6.7×105的普鲁兰多糖；7、申请号为201610030180.7的中国专利公开了一种高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法，得到普鲁兰多糖分子量大于2×106；8、申请号为201710426466.1的中国专利公开了一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用，得到普鲁兰多糖分子量为8.1×105；9、申请号为201710426406.X的中国专利公开了一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用，得到普鲁兰多糖分子量大于2×105。
通过上述公开的专利可以得知，众多研究人员利用自然选育或诱变选育获得了多株能够合成不同分子量普鲁兰多糖的出芽短梗霉，结合发酵条件控制，普鲁兰多糖分子量最低可到8×104，最高可大于2×106。研究表明不同分子量普鲁兰多糖的应用领域不同，例如用于胶囊制备的普鲁兰多糖分子量要求大于3×105，用于食品保鲜成膜的普鲁兰多糖分子量为2×105，而用作化妆品添加剂和低热值食品添加剂的普鲁兰多糖分子量则越低越好。此外，在发酵过程中高分子量普鲁兰多糖引起发酵液粘度大，尤其在发酵后期，底物、溶氧和热量的传递受到严重限制，从而影响普鲁兰多糖产量，并增加了发酵工艺能耗。因此，开发低分子量普鲁兰多糖生产工艺，对于提高普鲁兰多糖的产量、降低生产成本、拓宽普鲁兰多糖应用领域、提高产品附加值具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法，本发明是以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517为生产菌种，利用葡萄糖或蔗糖为底物，30℃条件下，采用分批发酵方式生产普鲁兰多糖，生产得到的普鲁兰多糖的产量可达110~120 g/L，底物转化率达78~85%，分子量低至2.5×103~9.0×103，具有发酵液粘度低、普鲁兰多糖产量和底物转化率高、以及分子量低的优点，极具工业生产潜力。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化
将出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6接种于PDA固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH），25~30℃培养36~48h；所述出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6的保藏编号为CCTCC M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；
（2）种子液制备
将整个PDA固体斜面培养基上的菌落接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50mL一级种子液接入装有250mL液体种子培养基的3L三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖80~100g/L，NH4Cl 2~4g/L，KCl 0.5~1g/L，KH2PO4 0.1~0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.05~0.1g/L，CaCO3 20~40g/L，自然pH，蒸馏水配制；
（3）液体发酵
将二级种子液按接种量5~15%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5L发酵罐中，发酵罐装液量为3.5~4L，转速200~400rpm，通气量0.5~1vvm，25~30℃发酵5~7天；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源140~160g/L，NH4Cl 3~6g/L，KCl 0.5~1g/L，KH2PO4 0.1~0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2~0.4g/L，CaCO3 20~40g/L，琥珀酸 5~10g/L，自然pH，蒸馏水配制；所述液体发酵培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖中的任意一种或其组合；
（4）普鲁兰多糖提取纯化及产量测定
将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入2倍体积无水乙醇，轻微搅动后于4℃静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。利用称重法测定普鲁兰多糖产量。
（5）普鲁兰多糖分子量测定
将提取纯化的普鲁兰多糖溶解于蒸馏水中至浓度为10mg/mL，利用凝胶渗透色谱测定普鲁兰多糖分子量，色谱条件：流动相为水，流速1mL/min，进样量20μL，检测温度25℃。采用不同分子量的商品化普鲁兰多糖作为标准对照品。
上述利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法，发酵生产得到的普鲁兰多糖的分子量为2.5×103~9.0×103。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6为生产菌种，利用葡萄糖或蔗糖为底物，采用分批发酵方式生产普鲁兰多糖，生产得到的普鲁兰多糖的产量可达110~120 g/L，底物转化率达78~85%，分子量低至2.5×103~9.0×103，具有发酵液粘度低、普鲁兰多糖产量和底物转化率高、以及分子量低的优点。相较于已公开的普鲁兰多糖生产技术而言，本发明的普鲁兰多糖产量和底物转化率高，有利于降低原料成本，发酵液粘度低，有利于降低发酵能耗，而超低分子量的普鲁兰多糖特别适用于化妆品添加剂和低热值食品添加剂，能够拓宽普鲁兰多糖应用领域。上述有益效果表明本发明技术极具工业生产潜力，并具备显著的经济效益。
2、本发明采用的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6可在30℃条件下分批发酵生产普鲁兰多糖，相较于大多数出芽短梗霉25℃发酵生产普鲁兰多糖而言，能够大大减少发酵过程中冷却水的消耗，这个优良特性为工业化生产提供了有利条件。
附图说明
图1为本发明实施例3步骤（3）中液体发酵过程图；
图2为采用本发明一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法生产得到的普鲁兰多糖产品图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1-2
一种利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法，具体步骤为：
（1）菌种活化：将出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6接种于PDA固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH）上，30℃下培养48h。所述出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6的保藏编号为CCTCC M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
（2）种子液制备：将整个PDA固体斜面培养基上的菌落接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180rpm， 30℃下培养36h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50mL一级种子液接入装有250mL液体种子培养基的3L三角瓶中，摇床转速180rpm，30℃下培养36h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖80g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，CaCO3 20g/L，自然pH，蒸馏水配制。
（3）液体发酵：将二级种子液按接种量15%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5L发酵罐中，发酵罐装液量为3.5L，转速400rpm，通气量1vvm， 30℃下发酵7天；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源140g/L，NH4Cl 3g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CaCO3 20g/L，琥珀酸 5g/L，自然pH，蒸馏水配制。
（4）普鲁兰多糖提取纯化及产量测定：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入2倍体积无水乙醇，轻微搅动后于4℃静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。利用称重法测定普鲁兰多糖产量。
（5）普鲁兰多糖分子量测定：将提取纯化的普鲁兰多糖溶解于蒸馏水中至浓度为10mg/mL，利用凝胶渗透色谱测定普鲁兰多糖分子量，色谱条件：流动相为水，流速1mL/min，进样量20μL，检测温度25℃。采用不同分子量的商品化普鲁兰多糖作为标准对照品。
实施例1和实施例2的区别在于，上述步骤（3）中所述液体发酵培养基中的碳源分别为葡萄糖、蔗糖，按上述方法发酵后，分析所得发酵液中普鲁兰多糖产量和分子量如下表1所示。
Figure 125790DEST_PATH_IMAGE001
实施例3-4
一种利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法，具体步骤为：
（1）菌种活化：将出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6接种于PDA固体斜面培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH）中，25℃下培养36h。
（2）种子液制备：将整个PDA固体斜面培养基上的菌落接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速220rpm，25℃下培养48h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50mL一级种子液接入装有250mL液体种子培养基的3L三角瓶中，摇床转速220rpm，25℃下培养48h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖100g/L，NH4Cl 4g/L，KCl 1g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 40g/L，自然pH，蒸馏水配制。
（3）液体发酵：将二级种子液按接种量5%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5L发酵罐中，发酵罐装液量为4L，转速200rpm，通气量0.5vvm，25℃下发酵5天；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源160g/L，NH4Cl 6g/L，KCl 1g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，CaCO3 40g/L，琥珀酸 10g/L，自然pH，蒸馏水配制。
（4）普鲁兰多糖提取纯化及产量测定：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入2倍体积无水乙醇，轻微搅动后于4℃静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。利用称重法测定普鲁兰多糖产量。
（5）普鲁兰多糖分子量测定：同实施例1-2。
实施例3和实施例4的区别在于，上述步骤（3）中所述液体发酵培养基中的碳源分别为葡萄糖、蔗糖，按上述方法发酵后，分析所得发酵液中普鲁兰多糖产量和分子量如下表2所示。
Figure 143424DEST_PATH_IMAGE002

Claims (2)

1.一种利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化
将出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6接种于PDA固体斜面培养基中，所述的PDA固体斜面培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH；25~30℃下培养36~48h；所述出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）GXZ-6的保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；
（2）种子液制备
将整个PDA固体斜面培养基上的菌落接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为一级种子液；将50mL一级种子液接入装有250mL液体种子培养基的3L三角瓶中，摇床转速180~220rpm，25~30℃培养36~48h至菌株对数生长中期，以此作为二级种子液；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖80~100g/L，NH4Cl 2~4g/L，KCl 0.5~1g/L，KH2PO4 0.1~0.2g/L，MgSO4·7H2O0.1~0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.05~0.1g/L，CaCO3 20~40g/L，自然pH，蒸馏水配制；
（3）液体发酵
将二级种子液按接种量5~15%（v/v）接入装有液体发酵培养基的5L发酵罐中，发酵罐装液量为3.5~4L，转速200~400rpm，通气量0.5~1vvm，25~30℃发酵5~7天；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源140~160g/L，NH4Cl 3~6g/L，KCl 0.5~1g/L，KH2PO4 0.1~0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1~0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2~0.4g/L，CaCO3 20~40g/L，琥珀酸 5~10g/L，自然pH，蒸馏水配制；所述液体发酵培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖中的任意一种或其组合；
（4）普鲁兰多糖提取纯化
将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入2倍体积无水乙醇，轻微搅动后于4℃静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。
2.根据权利要求1所述的利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于：发酵生产得到的普鲁兰多糖的分子量为2.5×103~9.0×103。
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