CN103409480A - 一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法 - Google Patents

一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法 Download PDF

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本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种出芽短梗霉发酵生产不同分子量普鲁兰多糖的方法。包括如下步骤：（1）制备出芽短梗霉种子液；（2）将上述种子液接种到发酵培养基，发酵生产普鲁兰多糖；通过改变发酵培养基中K2HPO4的含量，并且在发酵过程中调控发酵液pH，生产不同分子量的普鲁兰多糖。K2HPO4含量的调控范围是1～7g/L，pH的调控范围是3.0～4.0。本发明采用改变发酵培养基中磷酸氢二钾的含量，结合发酵过程中对pH的调控，影响普鲁兰多糖合成及降解过程中酶的活性，进而获得不同分子量的普鲁兰多糖，使其在食品、医药、化工和石油领域得到更广泛合理的应用，进一步满足人们的需求。

Description

一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种出芽短梗霉发酵生产不同分子量普鲁兰多糖的方法。
背景技术
普鲁兰多糖是一种类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质微生物胞外多糖，以α-1，6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子聚合物。
因菌种的差异、培养基成分、发酵条件的不同，普鲁兰多糖的聚合度也有很大的变化；研究发现不同分子量的普鲁兰多糖应用也不尽相同，随着普鲁兰多糖在食品、医药、化工和石油领域的广泛应用，人们对普鲁兰多糖的聚合度要求也越来越精。
Catley和McDowell提出了普鲁兰生物合成的反应过程：最初阶段是在UDPG的参与下，葡萄糖和脂质分子(LPh)通过磷酸酷键结合，然后另一个UDPG的葡萄糖基通过葡萄糖转移酶，形成与脂质体连接的异麦芽糖，异麦芽糖与和脂质体连接的葡萄糖形成异潘糖残基，接下来，异潘糖残基通过普鲁兰聚合酶形成普鲁兰链。
江南大学童群义讲授等研究发现，在普鲁兰多糖发酵后期，普鲁兰多糖降解酶的出现，高分子量的普鲁兰多糖得到降解。
目前文献中只有山东省生物药物研究院通过控制发酵培养基中的氮源组成及搅拌转速，获得不同分子量的普鲁兰多糖，专利申请号：200910148764.4；但其得到的普鲁兰多糖具体的分子量范围不明确；本发明采用改变发酵培养基中磷酸氢二钾的含量，结合发酵过程的pH调节葡萄糖转移酶以及普鲁兰多糖降解酶的活性，从而获得不同聚合度的普鲁兰多糖。
发明内容
本发明的目的是通过对发酵过程的调控，提供了一种生产不同分子量的普鲁兰多糖的方法，以满足人们对不同聚合度的普鲁兰多糖的需求。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤：（1）制备出芽短梗霉种子液；(2）将上述种子液接种到发酵培养基，发酵生产普鲁兰多糖；其特征在于，通过改变发酵培养基中K2HPO4的含量，并且在发酵过程中调控发酵液pH，生产不同分子量的普鲁兰多糖。
所述K2HPO4的含量的调控范围是1～7g/L。
所述发酵过程中pH的调控范围是3.0～4.0。
所述发酵方法可以如下：以1%～10%的体积比将出芽短梗霉种子液接种到5L的发酵罐中，培养基装液量3L，通风量1.0V/V，转速300r/min，30℃培养88h，在40～88h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH分别稳定在3.0或3.5或4.0，发酵结束后离心除去菌体。
优选的发酵培养基组成为：蔗糖150g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO41～7g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，初始pH5.5～6.5。
所述种子液的制备方法可以如下：将出芽短梗霉菌株进行活化，转接到500ml的挡板瓶中，培养基装液量80ml，恒温28℃，180r/min培养29～32h制得种子液。
优选的种子培养基组成为：蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO41～3g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
K2HPO4的调节作用：变化范围1～4g/L，K2HPO4含量越高普鲁兰多糖分子量越小，变化范围5～7g/L，K2HPO4含量越高普鲁兰多糖分子量越大，普鲁兰糖分子量均在20～50万道尔顿之间。
K2HPO4与pH协同作用：K2HPO41～2g/L，发酵中后期调控pH稳定在3.0，可控制普鲁兰多糖分子量在29万-32万道尔顿；K2HPO43～4g/L，发酵中后期调控pH稳定在3.5，可控制普鲁兰多糖分子量在21万-24万道尔顿；K2HPO45～7g/L，发酵中后期调控pH稳定在4.0，可控制普鲁兰多糖分子量在45万-47万道尔顿。
有益效果：
本发明采用改变发酵培养基中磷酸氢二钾的含量，结合发酵过程中对pH的调控，影响普鲁兰多糖合成及降解过程中酶的活性，进而获得不同分子量的普鲁兰多糖，从而根据普鲁兰多糖聚合度的不同，使其在食品、医药、化工和石油领域得到更广泛合理的应用，进一步满足人们的需求。
不同的pH条件下，葡糖基转移酶、普鲁兰多糖聚合酶以及普鲁兰多糖降解酶的活性不同，从而影响普鲁兰多糖的聚合度，进而改变普鲁兰多糖的分子量。K2HPO4作为缓冲盐与pH协同作用，能够进一步调控生产普鲁兰糖的分子量。通过对发酵培养基的进一步优化，生产的普鲁兰糖分子量能够更准确地定向在一个较小的范围。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种生产不同分子量普鲁兰多糖的发酵方法，步骤如下：
1、发酵培养基成分：蔗糖150g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO41～2g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，初始pH6.5。
2、将出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC NO.7055菌株进行活化6～8h，即将其从蔗糖斜面培养基转接到500ml的挡板瓶中，装液量为80ml，恒温28℃，180r/min培养29～32h制得种子液；种子培养基组成为：蔗糖80g/L、酵母浸粉2g/L、氯化钠2g/L、硫酸铵2g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、K2HPO43g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以5%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V)，300r/min，30℃培养88h，在40～52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至普鲁兰多糖浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在29万～32万道尔顿。
实施例2
1、制备发酵培养基：发酵培养基成分：蔗糖150g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO43～4g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，初始pH5.5。
2、种子液的制备和所用菌种基本同实施例1；种子培养基组成为：蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO42g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以5%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V)，300r/min，30℃培养88h，在40～52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.5，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至普鲁兰多糖浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在21万～24万道尔顿。
实施例3
1、制备发酵培养基：发酵培养基成分：蔗糖150g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO45～7g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，初始pH6.0。
2、种子液的制备和所用菌种及种子培养基组成基本同实施例2。
3、以5%的体积比将（1）所得的种子菌液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V)，300r/min，30℃培养88h，在40～52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定在4.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至普鲁兰多糖浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在45万～47万道尔顿。
实施例4
1、制备发酵培养基：发酵培养基成分：蔗糖100g/L、酵母膏3g/L、氯化钠1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、K2HPO43～4g/L、FeSO4·7H2O1g/L，初始pH6.5。
2、种子液的制备和所用菌种及种子培养基组成基本同实施例1。
3、以5%的体积比将（1）所得的种子菌液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V)，300r/min，30℃培养88h，在40～52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定在3.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至普鲁兰多糖浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在25万～45万道尔顿。

Claims (8)

1.一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤：（1）制备出芽短梗霉种子液；（2）将上述种子液接种到发酵培养基，发酵生产普鲁兰多糖；其特征在于，通过改变发酵培养基中K2HPO4的含量，并且在发酵过程中调控发酵液pH，生产不同分子量的普鲁兰多糖。
2.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其步骤（1）含有K2HPO41～3g/L的种子培养基的pH为7.0，其步骤（2）含有K2HPO41～7g/L的发酵培养基初始pH为5.5～6.5，发酵中后期K2HPO41～7g/L，调控pH稳定在3.0～4.0。
3.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其特征在于，步骤（1）所述种子培养基组成为：蔗糖100g/L、酵母浸粉3g/L、氯化钠2.5g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO42g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0；将出芽短梗霉菌株进行活化，转接到500ml的挡板瓶中，培养基装液量80ml，恒温28℃，180r/min培养29～32h制得种子液。
4.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其特征在于步骤（2）所述发酵培养基组成为：蔗糖150g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、K2HPO41～7g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，初始pH6.0。
5.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其中发酵过程中调控发酵液K2HPO41～2g/L，发酵中后期调控pH稳定在3.0，普鲁兰多糖分子量在29万-32万道尔顿。
6.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其中发酵过程中调控发酵液K2HPO43～4g/L，发酵中后期调控pH稳定在3.5，普鲁兰多糖分子量在21万-24万道尔顿。
7.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其中发酵过程中调控发酵液K2HPO45～7g/L，发酵中后期调控pH稳定在4.0，普鲁兰多糖分子量在45万-47万道尔顿。
8.如权利要求1所述的一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，其特征在于，所述发酵方法如下：以1%～10%的体积比将出芽短梗霉种子液接种到5L的发酵罐中，培养基装液量3L，通风量1.0V/V，转速300r/min，30℃培养88h，在40～88h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH分别稳定在3.0或3.5或4.0，发酵结束后离心除去菌体。
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Patentee before: Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co., Ltd.