CN112409506A - 一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法。该方法首先通过发酵生产出高分子量的普鲁兰多糖，然后通过复合酶酶解菌体和杂蛋白，超滤膜除菌体和杂蛋白且浓缩，向浓缩液中加入无机盐，然后通过逐级加入10％，20％，30％，40％，50％的沉淀剂沉淀，再置于低温下分级沉淀，将不同浓度沉淀剂沉淀物溶于纯化水中，冷冻干燥得产品。本发明工艺简单，成本低廉，通过发酵可以生产出分子量大于80万的普鲁兰多糖，通过沉淀剂在低温下沉淀，可以实现普鲁兰多糖的分级，分子量分布范围窄，沉淀剂用量减少了75％以上。

Description

一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，属于生物分离工程技术领域。
背景技术
近年来，普鲁兰多糖在药物载体、药物控释、生物材料等方面被广泛研究并应用。这些领域的开发将直接提升普鲁兰多糖的价值，但同时对普鲁兰多糖的生产也提出了新的要求，特别是分子量分布。分子量分布是聚合物特性非常重要的参数，它决定了聚合物的应用范围及医用价值，例如，作为生物材料及组织工程而言，要求高分子量普鲁兰多糖且分布相对均一；作为血浆代用品则需要分子量低的普鲁兰多糖，因为高分子量的普鲁兰多糖可能产生高的静脉压；作为一般的食品添加剂，中等分子量的普鲁兰多糖就能满足需求。
为了测定普鲁兰多糖的分子量及其分布，迫切需要一种分子量分布均一的普鲁兰多糖作为标准。由于不同均一分子量普鲁兰多糖制备工艺复杂，生产成本高，且国内众多研发机构及企业在这方面研发经验不足，研发投入不够，目前主要依靠国外进口。
发明内容
本发明提供了一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法。该方法首先通过发酵生产出高分子量的普鲁兰多糖，然后通过复合酶酶解菌体和杂蛋白，超滤膜除菌体和杂蛋白且浓缩，向浓缩液中加入无机盐，然后通过逐级加入10％，20％，30％，40％，50％的沉淀剂沉淀，再置于低温下分级沉淀，将不同浓度沉淀剂沉淀物溶于纯化水中，冷冻干燥得产品。本发明工艺简单，成本低廉，通过发酵可以生产出分子量大于80万的普鲁兰多糖，通过沉淀剂在低温下沉淀，可以实现普鲁兰多糖的分级，分子量分布范围窄，沉淀剂用量减少了75％以上。
本发明的技术方案是：一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，
1)复合酶酶解：将普鲁兰多糖发酵液中加入1-10‰脂肪酶和1-10‰纤维素酶酶解后，再加入1-10‰蛋白酶酶解裂解出芽短梗霉菌体和杂蛋白，利用1-2万的超滤膜除裂解后的菌体和杂蛋白，并通过超滤膜浓缩，得到普鲁兰多糖浓缩液；
2)制备不同均一分子量普鲁兰多糖：向普鲁兰多糖浓缩液中加入0.1-1.0wt％的无机盐，然后逐级加入10％，20％，30％，40％，50％的沉淀剂，每次加入沉淀剂后，充分搅拌使其在室温下溶解变成均一透明的溶液，再置于1-10℃条件下，分级沉淀，将不同浓度沉淀剂沉淀物溶于纯化水中，冷冻干燥，粉碎，即得不同均一分子量的普鲁兰多糖产品。
所述无机盐为氯化钠、硫酸铵、氯化铵、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾中的一种或其混合物。
所述沉淀剂为无水乙醇。
所述普鲁兰多糖发酵液，由下述方法制备而成：出芽短梗霉孢子经二级种子培养后得到种子液；然后将种子液按3％-10％接种量接种到发酵培养基中培养，培养温度25-30℃，培养时间50-55h。
所述发酵培养基的组成为：蔗糖80-120g/L、酵母浸出物1.0-3.0g/L、硫酸铵1.0-2.0g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、复合氨基酸1.5-2.5g/L、消泡剂0.05-0.15g/L，其中复合氨基酸为蛋氨酸、络氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸中的一种或几种，初始pH 6.5，121℃灭菌20min。
进一步的，所述步骤2)具体为：
①室温下，向普鲁兰多糖浓缩液中加入质量分数为0.1％的氯化钠，充分搅拌溶解后，加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌，待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降，得到沉淀物和上清；
②取步骤①的沉淀物，加入纯化水稀释至1-10％，冷冻干燥、粉碎即得产品1；
③取步骤①的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇(共使用了20％的无水乙醇)，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降，得到沉淀物和上清；
④取步骤③的沉淀物重复步骤②的操作(加入纯化水稀释至1-10％，冷冻干燥、粉碎)，得到产品2；取步骤③的上清重复步骤③的操作(继续室温加入质量分数10％的无水乙醇(共使用了30％的无水乙醇)，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降)，得到沉淀物和上清；
⑤取步骤④的沉淀物重复步骤②的操作，得到产品3；取步骤④的上清重复步骤③的操作(共使用了40％的无水乙醇)，得到沉淀物和上清；
⑥取步骤⑤的沉淀物重复步骤②的操作，得到产品4；取步骤④的上清重复步骤③的操作(共使用了50％的无水乙醇)，得到沉淀物和上清；沉淀物加入纯化水稀释至1％-10％，冷冻干燥、粉碎即得产品5。
所述产品1-产品5的分子量范围分别为：750-850KD、500-600KD、200-300KD、100-200KD和30-80KD。
本发明的有益效果是：
1、本发明制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，工艺简单，成本低廉，反应条件温和，所制备的普鲁兰多糖产品分子量分布范围窄，分子量与出峰时间之间线性关系好，可以作为标准测定不同普鲁兰多糖的分子量。
2、本发明采用复合酶裂解出芽短梗霉菌体和杂蛋白，使其变成小分子物质，使用超滤膜，既达到了除菌体和杂蛋白的目的，又使普鲁兰多糖溶液得到了浓缩，减少沉淀剂的用量。
3、本发明通过控制加入适量的沉淀剂(无水乙醇)使其在常温下为均一透明的溶液，再置于1℃-10℃环境中，使混合液自然沉降：在常温下使普鲁兰多糖分子分散均匀，在低温下分子间作用力减弱，较大分子普鲁兰多糖首先沉降下来，较低分子量的普鲁兰多糖不会因为分子间的作用力而沉降，从而可以实现不同分子量普鲁兰多糖的有效分离。低温下使用沉淀剂沉淀普鲁兰多糖，可以使沉淀剂的用量减少了75％。
附图说明
图1为普鲁兰多糖产品1-1的色谱图；
图2为普鲁兰多糖产品1-2的色谱图；
图3为普鲁兰多糖产品1-3的色谱图；
图4为普鲁兰多糖产品1-4的色谱图；
图5为普鲁兰多糖产品1-5的色谱图；
图6为普鲁兰多糖样品分子量与出峰时间的关系图；
图7为对比例1的普鲁兰多糖的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述。应当理解，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例1：
1.高分子量普鲁兰多糖发酵液的制备：
(1)种子培养：挑取一环出芽短梗霉孢子到液体种子培养基中，经一级种子罐28℃培养24h后，然后按体积比10％接种量接入二级种子罐，28℃培养24h后作为液体种子；
种子培养基组成为：蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L，调节pH至6.5，121℃灭菌20min；
(2)发酵培养：按体积比5％接种量将培养好的种子液接种到发酵培养基中培养，培养温度28℃，培养时间55h；
发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵1.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、复合氨基酸2g/L、消泡剂(GPE20)0.1g/L，其中复合氨基酸为蛋氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和谷氨酸，其质量比为1：1：1：1，初始pH 6.5，121℃灭菌20min。
2.发酵液后处理：
向步骤1所制备的普鲁兰多糖发酵液中加入1‰的纤维素酶(10万u/g)和1‰脂肪酶(10万u/g)1‰，35℃，酶解60min，维持温度再加入1‰蛋白酶酶解(10万u/g)60min，35℃，酶解60min，裂解出芽短梗霉菌体和杂蛋白，利用1万的超滤膜除裂解后的菌体和杂蛋白，同时将普鲁兰多糖发酵液浓缩2倍(体积是原来的1/2)，得到普鲁兰多糖浓缩液。
3.不同均一分子量普鲁兰多糖的制备：
(1)室温下，向步骤2所得到的普鲁兰多糖浓缩液中加入质量分数为0.1％的氯化钠，充分搅拌溶解后，加入质量份数10％的无水乙醇，充分搅拌，待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降；
(2)取步骤(1)混合液的沉淀物，加入纯化水稀释至3％，冷冻干燥、粉碎即得产品1-1；
取步骤(1)混合液的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降；
(3)取步骤(2)混合液的沉淀物，加入纯化水稀释至3％，冷冻干燥、粉碎即得产品1-2；
取步骤(2)混合液的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降；
(4)取步骤(3)混合液的沉淀物，加入纯化水稀释至3％，冷冻干燥、粉碎即得产品1-3；
取步骤(3)混合液的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降；
(5)取步骤(4)混合液的沉淀物，加入纯化水稀释至3％，冷冻干燥、粉碎即得产品1-4；
取步骤(4)混合液的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降；
(6)取步骤(5)混合液的沉淀物，加入纯化水稀释至3％，冷冻干燥、粉碎即得产品1-5。
4.所制备产品分子量的测定：
利用高效凝胶渗透色谱测定各个产品的分子量分布。普鲁兰多糖标准品购自日本昭和电工株式会社。
高效凝胶渗透色谱条件：
仪器：日本岛津公司高效液相色谱仪，RID-10A示差检测器。色谱柱型号：TSK-gelG-3000PWXL凝胶色谱柱(7.8mm×30.0cm)；流速：0.8mL/min；流动相：0.1mol/L NaNO3；柱温：25℃；进样量：5μL。
产品1-1、1-2、1-3、1-4、1-5的色谱图分别如图1-5所示。普鲁兰多糖样品分子量与出峰时间的关系图如图6所示。普鲁兰多糖产品的分子量分布如表1所示。从图1-6和表1可以看出：普鲁兰多糖分子量分布范围窄(Mw/Mn值小，色谱峰峰形好)，分子量与出峰时间之间线性关系好R2＝98.86％，可以作为标准测定不同普鲁兰多糖的分子量。
表1普鲁兰多糖产品的分子量分布
产品 出峰时间 Mp Mw/Mn
1-1 8.808 785KD 1.25
1-2 9.492 550KD 1.23
1-3 10.437 260KD 1.25
1-4 10.821 155KD 1.21
1-5 11.401 55KD 1.10
对比例1：
取实施例1步骤2所制得的普鲁兰多糖浓缩液，室温下加入2倍体积的无水乙醇沉淀，上层液体依然乳白色，将沉淀用纯化水稀释至3％，冷冻干燥，粉碎，得产品比较1。产品比较1的色谱图，如图7所示，从图7可以看出：对比例1为分子量范围较广的色谱峰。

Claims (6)

1.一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，
1)复合酶酶解：将普鲁兰多糖发酵液中加入1-10‰脂肪酶和1-10‰纤维素酶酶解后，再加入1-10‰蛋白酶酶解，裂解出芽短梗霉菌体和杂蛋白，利用1-2万的超滤膜除裂解后的菌体和杂蛋白，并通过超滤膜浓缩，得到普鲁兰多糖浓缩液；
2)制备不同均一分子量普鲁兰多糖：向普鲁兰多糖浓缩液中加入0.1-1.0wt％的无机盐，然后逐级加入10％，20％，30％，40％，50％的沉淀剂，每次加入沉淀剂后，充分搅拌使其在室温下溶解变成均一透明的溶液，再置于1-10℃条件下，分级沉淀，将不同浓度沉淀剂沉淀物溶于纯化水中，冷冻干燥，粉碎，得到不同均一分子量的普鲁兰多糖产品。
2.如权利要求1所述的制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述无机盐为氯化钠、硫酸铵、氯化铵、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾中的一种或者两种以上的混合物。
3.如权利要求1所述的制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述沉淀剂为无水乙醇。
4.如权利要求1所述的制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述普鲁兰多糖发酵液，由下述方法制备而成：出芽短梗霉孢子经二级种子培养后得到种子液；然后将种子液按3％-10％接种量接种到发酵培养基中培养，培养温度25-30℃，培养时间50-55h。
5.如权利要求4所述的制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，
所述发酵培养基的组成为：蔗糖80-120g/L、酵母浸出物1.0-3.0g/L、硫酸铵1.0-2.0g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾4-6g/L、复合氨基酸1.5-2.5g/L、消泡剂0.05-0.15g/L，其中复合氨基酸为蛋氨酸、络氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸中的一种或者两种以上的混合物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法，其特征是，所述步骤2)具体为：
①室温下，向普鲁兰多糖浓缩液中加入质量分数为0.1％的氯化钠，充分搅拌溶解后，加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌，待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降，得到沉淀物和上清；
②取步骤①的沉淀物，加入纯化水稀释至1-10％，冷冻干燥、粉碎得产品1；
③取步骤①的上清，继续室温加入质量分数10％的无水乙醇，充分搅拌待溶液澄清透明后，置于3℃环境中，待混合液自然沉降，得到沉淀物和上清；
④取步骤③的沉淀物重复步骤②的操作，得到产品2；取步骤③的上清重复步骤③的操作，得到沉淀物和上清；
⑤取步骤④的沉淀物重复步骤②的操作，得到产品3；取步骤④的上清重复步骤③的操作，得到沉淀物和上清；
⑥取步骤⑤的沉淀物重复步骤②的操作，得到产品4；取步骤④的上清重复步骤③的操作，得到沉淀物和上清；沉淀物加入纯化水稀释至1％-10％，冷冻干燥、粉碎即得产品5；所述产品1-产品5的分子量范围分别为：750-850KD、500-600KD、200-300KD、100-200KD和30-80KD。
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