CN102617748A - 一种普鲁兰多糖的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种普鲁兰多糖的纯化方法。其中主要包括以下步骤：用Savage法除去蛋白质，反复4～20次，再用95％或98％的乙醇配制成不同浓度梯度的溶液，进行醇沉，除去小分子物质，最后用蒸馏水为洗脱溶剂，进行凝胶层析，最终得到纯化普鲁兰多糖，纯度在99％以上，收率在58％以上(以多糖含量计算)。本发明用时间短、收率高、方法简单，所得的普鲁兰多糖的多糖纯度高等优点，适合于工业化生产。

Description

一种普鲁兰多糖的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种利用Savage法、分级醇沉和凝胶层析纯化普鲁兰多糖的方法，属于生物技术领域。
技术背景
普鲁兰多糖是短梗霉多糖(pullulan)的中文译名，是通过黑酵母菌的一种出芽短梗霉发酵所产生的胞外多糖，是无味无嗅的白色粉末。其化学组成主要是由α-1.4葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖，分子结构中含1/3的α-1.6葡萄糖苷键，2/3的α-1.4葡萄糖苷键，受不同发酵培养条件的影响，分子量一般在5.0×104-5.0×106道尔顿之间。该多糖易溶于水，安全无毒、可食用、低热值、耐酸碱、可塑性好、成膜性好、簿膜隔气性佳。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。
1938年R.Bauer从微生物的培养物中发现普鲁兰多糖的产生菌，而普鲁兰多糖的研究工作则起始于西德，英国人在理论方面也作了不少工作，日本进行了比较系统尤其是生产工艺和产品应用的研究，并取得了大量专利。1976年至1980年是普鲁兰多糖的第一个研究高峰，主要是对其性质和发酵方法的研究，1984年至1996年是第二个研究高峰，主要集中在对其产生机理和应用方面的研究。我国在80年代初期开始进行相关研究，虽然在菌种和工艺方面取得了一定成绩，但生产厂商较少。普鲁兰多糖的纯化工艺一般采用氯仿/丁醇混合溶液除去蛋白质后透析，后用溶液洗涤、干燥，经DEAE-纤维素柱层析，收集多糖峰，减压浓缩、透析、冷冻干燥。反应时间较长，多次用到透析，对溶剂消耗量较大，且所得到的普鲁兰多糖纯度多在90％-95％之间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不同于传统的普鲁兰多糖的纯化方法，采用发明所述的工艺方法，制得普鲁兰多糖的含糖量在99％以上，产品得率高。
本发明提供的普鲁兰多糖的纯化工艺是以普鲁兰多糖粗品为原料(含糖量20％左右——硫酸苯酚法测定(中国药学杂质，1996，31(9)：550)，分子量为5000-15000道尔顿)，对其进行纯化，使之达到多糖纯度在99％以上，其具体包括以下步骤：
(a)将粗品普鲁兰多糖加蒸馏水稀释成普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液，充分震荡，离心，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。
(b)将一定量的粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入乙醇，醇析，离心，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中加入乙醇，至不同梯度的乙醇浓度，每次操作如上所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，分部收集器分管收集减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品。
本发明所提供的方法，相对于现有普鲁兰多糖纯化方法，具有以下优势：
(1)传统方法在除去普鲁兰多糖粗品的小分子时采用的是透析方法，所用时间较长，一般一次透析在8小时以上，且整个纯化工艺中至少要使用3次透析；本发明所采用方法采用分级醇沉方法除去小分子，只需一次分级醇沉，所用时间在2-8小时，大大节省了纯化时间；
(2)传统方法制得的普鲁兰多糖的多糖纯度在90％-95％，而采用本发明所提供方法，普鲁兰多糖的多糖纯度能达到99％以上，收率(以多糖含量计算，下同)在58％以上。
具体实施案例
下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，所用术语从事生物技术行业的技术人员均能读懂。
实施例1
(a)将粗品普鲁兰多糖100g加蒸馏水稀释成1.5％的普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)混合液，充分震荡，以2000r/min离心15min，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理8次，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入95％乙醇至浓度为20％(体积浓度，下同)，4℃醇析8小时，以15000r/min离心10min，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中继续加入乙醇，至终浓度分别为30％、40％、50％、60％、70％，每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，用蒸馏水洗脱，流速2.0mL/min，分部收集器分管收集，收集活性片段减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品16.2g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.2％，收率81％。
实施例2
(a)将粗品普鲁兰多糖500g加蒸馏水稀释成2％的普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/戊醇(V氯仿∶V戊醇＝4∶1)混合液，充分震荡，以3000r/min离心30min，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理5次，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入98％乙醇至浓度为15％(体积浓度，下同)，4℃醇析5小时，以25000r/min离心10min，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中继续加入乙醇，至终浓度分别为30％、45％、60％、75％，每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，用蒸馏水洗脱，流速3.0mL/min，分部收集器分管收集，收集活性片段，减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品76g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.4％，收率76％。
实施例3
(a)将粗品普鲁兰多糖200g加蒸馏水稀释成10％的普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/戊醇(V氯仿∶V戊醇＝6∶1)混合液，充分震荡，以4000r/min离心30min，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理6次，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入98％乙醇至浓度为15％(体积浓度，下同)，4℃醇析10小时，以20000r/min离心20min，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中继续加入乙醇，至终浓度分别为30％、45％、60％、75％，每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，用蒸馏水洗脱，流速5.0mL/min，分部收集器分管收集，收集活性片段，减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品24g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.5％，收率为60％。

Claims (7)

1.本发明是采用Savage法、分级醇沉和凝胶层析的方法纯化粗品普鲁兰多糖，得到99％以上的普鲁兰多糖。
2.权利要求1中所述的Savage法指的是：用蒸馏水稀释粗品普鲁兰多糖，加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液，离心，将上清液再用此方法重复处理，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。
3.权利要求1中所述的分级醇沉指的是：将权利要求2所得的粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入乙醇，醇析，离心，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中加入乙醇，至不同梯度的乙醇浓度，每次操作同上述。
4.权利要求1中所述的凝胶层析指的是：将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，分部收集器分管收集，减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品，纯度在99％以上。
5.权利要求2中所述的普鲁兰多糖水溶液的浓度为0.5％～10％；氯仿/正丁醇和氯仿/戊醇的比例为V氯仿∶V戊醇或正丁醇＝6～1∶1；离心的速率在1500r/min～4000r/min，离心时间为10min～30min；Savage法重复次数为4～20次。
6.权利要求3中所述的乙醇选用95％或98％乙醇，乙醇浓度梯度为5％～20％，乙醇的始浓度为10％～20％，终浓度为70％～80％；醇析时间为4～20小时，醇析温度为0℃～6℃；离心速率为10000r/min～40000r/min，时间为10～60min。
7.权利要求4中所述的凝胶柱层析洗脱液为蒸馏水，流速为1.0mL/min～5.0mL/min。
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