CN101760490A

CN101760490A - 砂海星粘多糖的提取分离方法

Info

Publication number: CN101760490A
Application number: CN200810175767A
Authority: CN
Inventors: 张炎
Original assignee: Nantong Xinying Design Service Co Ltd
Current assignee: Nantong Xinying Design Service Co Ltd
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2010-06-30

Abstract

本发明用碱提法结合酶解法有效地从砂海星中提取酸性粘多糖，样品粉末可溶性良好。双氧水可有效将其脱色；二次酶解可有效去除结合蛋白，乙醇分级沉淀后可得到砂海星酸性粘多糖I、II，总糖含量可达到为75％和82％，蛋白质含量分别为1.57％和1.46％，并对粘多糖II进行进一步研究后，发现其为酸性粘多糖，含有硫酸根，含有醛糖残基，不含酮糖，由一个主要组分构成，平均分子量约为12kD，且电荷分布较为均一。

Description

砂海星粘多糖的提取分离方法

技术领域：

本发明涉及一种砂海星粘多糖的提取分离方法及应用，特别是涉及用碱提法结合酶解法分离砂海星粘多糖的方法。

背景技术：

酸性粘多糖(Acidic mucopolysaccharides)又称氨基多糖(Glycosaminoglycan)，有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、降血脂、抗放射及增强机体免疫功能等多种作用，目前已得到了广泛的重视和研究，并已应用于医药、化妆品等行业。国内自20世纪80年代开始对动物来源的酸性粘多糖进行研究，但主要集中在海洋可食用动物上，其他动物的研究则很少有报道。砂海星属棘皮动物门(Echinodermata)海星纲(Asteroidea)，在山东沿海特别是胶东半岛有大量分布，资源丰富，其酸性粘多糖的研究未见报道。本发明就砂海星的酸性粘多糖进行了初步分离纯化及性质鉴定，以期为砂海星的开发利用提供基础。

酸性粘多糖提取要解决的主要难题为：在多糖不被显著降解的情况下除去结合蛋白。此过程中，不仅要破坏多糖聚集体间的次级键，更主要的是要破坏糖链与蛋白质间的糖肽键，从而释放出多糖。本实验采用碱提法和酶解法相结合以及二次酶解，可以提取到纯度较高的酸性粘多糖，二次酶解后精制酸性粘多糖中的总糖含量分别为75％和82％，蛋白质含量分别为1.57％和1.46％(一次酶解后，粘多糖的蛋白质平均含量约为12％)，二次酶解可显著减少粘多糖中的蛋白质含量.每次进行的糖及蛋白质含量测定实验，均平行做了3个样品，重复性好。

本发明利用反相高效液相色谱法分离芫花得到高纯度芫花总黄酮并确定了该提取物在免疫调节中的应用。

发明内容：

本发明用碱提法结合酶解法能有效地从砂海星中提取酸性粘多糖，样品粉末可溶性良好。双氧水可有效将其脱色；二次酶解可有效去除结合蛋白，乙醇分级沉淀后可得到砂海星酸性粘多糖I、II，总糖含量可达到为75％和82％，蛋白质含量分别为1.57％和1.46％。并对粘多糖II进行进一步研究后，发现其为酸性粘多糖，含有硫酸根，含有醛糖残基，不含酮糖，由一个主要组分构成，平均分子量约为12kD，且电荷分布较为均一。

本发明的具体实施方式为，海星新鲜时用水冲洗净泥沙，自然风干，用粉碎机粉碎至40目。称取1000g海星样品，加入5000mL 0.15mol/LNaOH与0.15mol/L的硼氢化钠溶液，60℃搅拌过夜，冷却后用三氯乙酸调pH至4.00，5000r/min离心15min；取上清液，将pH调至7.200，加入10g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，4000r/min离心15min；取上清液，加入5％的双氧水脱色，加入量约为样品液体积的1/8，55℃保温至溶液变为浅黄色，将脱色后的溶液浓缩至合适体积，按1∶5加入90％的乙醇，5000r/min，30min，取沉淀溶于适量蒸馏水中，水浴60℃，使其充分溶解.将pH调至7.0，加入3g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，酶解完毕后，三氯乙酸调pH至4.50，9000r/min离心30min，取上清液加入乙醇使乙醇体积分数为42％，8000r/min离心30min；取沉淀用乙醇和丙酮洗涤，摊于平皿上，60℃真空干燥，得到精制砂海星粘多糖I，上清中再次加入乙醇，使乙醇体积分数为82％，操作同上，得到精制砂海星粘多糖II。

具体实施例

实施例1

1材料与方法

1.1材料

实验用材料砂海星(Luidia quinaria von Mar2tens)于2007年4-5月采集自山东烟台牟平区附近海域潮下带。样品新鲜时用水冲洗净泥沙，自然风干，用粉碎机粉碎(约40目左右)，置阴凉通风处备用。

1.2主要仪器与试剂

20PR-520型冰冻离心机，SP-2000UV型紫外可见分光光度计，TH-500梯度混合器，HD-3紫外检测仪，BSZ-100自动部分收集器，LM-17型记录仪，DHL-A电脑恒流泵等。枯草杆菌中性蛋白酶，蒽酮，葡萄糖，DEAE-52，考马斯亮蓝G250，葡聚糖(Sephadex)G-50、G-100，蓝色葡聚糖，对氨基苯磺酸，Dextran T-10，Dextran T-40，Dextran T-70，异戊醇等。以上试剂均为分析纯或生化试剂。

1.3砂海星中酸性粘多糖的提取方法

称取1000g海星样品，加入5000mL 0.15mol/LNaOH与0.15mol/L的硼氢化钠溶液，60℃搅拌过夜，冷却后用三氯乙酸调pH至4.00，5000r/min离心15min；取上清液，将pH调至7.200，加入10g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，4000r/min离心15min；取上清液，加入5％的双氧水脱色，加入量约为样品液体积的1/8，55℃保温至溶液变为浅黄色，将脱色后的溶液浓缩至合适体积，按1∶5加入90％的乙醇，5000r/min，30min，取沉淀溶于适量蒸馏水中，水浴60℃，使其充分溶解.将pH调至7.0，加入3g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，酶解完毕后，三氯乙酸调pH至4.50，9000r/min离心30min，取上清液加入乙醇使乙醇体积分数为42％，8000r/min离心30min；取沉淀用乙醇和丙酮洗涤，摊于平皿上，60℃真空干燥，得到精制砂海星粘多糖I，上清中再次加入乙醇，使乙醇体积分数为82％，操作同上，得到精制砂海星粘多糖II。

1.4总糖含量及蛋白质含量的测定

用蒽酮比色法测定总糖含量，用考马斯亮蓝法(B radford法)测定蛋白质含量，均参照文献陈钧辉等，生物化学实验3版，北京出版社，2003年的方法进行。蒽酮比色法测定总糖含量时，用葡聚糖作标准曲线。测定的总糖含量为75％和82％。蛋白质含量分别为1.57％和1.46％。

1.5硫酸基鉴定及颜色反应。

分别参照文献张惟杰，复合多糖生化研究技术，上海科学技术出版社1987和陈毓荃，生化实验方法与技术，北京出版社，2002的方法进行。

1.6离子交换层析

DEAE-52纤维素柱(2.6cm×25cm)，梯度洗脱：用0-1mol/L氯化钠溶液(以10mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液配制)，以30mL/h的速度洗脱，检测器波长调至220nm处跟踪记录，上样样品为精制砂海星粘多糖II；将峰值管中样品收集备用。

1.7分子筛层析

葡聚糖SephadexG-50的预处理及装柱：将其先用水煮沸约4h，待其冷却至室温，抽气，装柱(1.6cm×50cm)，柱床上方盖一大小合适的滤纸片，以30mL/h的流速平衡过夜。内外水体积测定：用1mg/mL的蓝色葡聚糖与0.1mg/mL对氨基苯磺酸溶液上样，以30mL/h的速度洗脱，在波长为254nm时跟踪记录。上样及洗脱：以10mL/h的速度上样，待样品完全进入柱床后加盖3cm缓冲液，用15mL/h的速度洗脱，检测器波长调至220nm处跟踪记录。

1.8多糖分子量的测定

参照文献镜岩等，生物化学3版，高等教育出版社，2002的方法进行。

Claims

1.一种提取砂海星粘多糖的方法，其特征在于用碱提法结合酶解法进行提取分离。

2.如权利要求1所提取的提取砂海星粘多糖的方法，其特征在于称取1000g海星样品，加入5000mL 0.15mol/LNaOH与0.15mol/L的硼氢化钠溶液，60℃搅拌过夜，冷却后用三氯乙酸调pH至4.00，5000r/min离心15min；取上清液，将pH调至7.200，加入10g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，4000r/min离心15min；取上清液，加入5％的双氧水脱色，加入量约为样品液体积的1/8，55℃保温至溶液变为浅黄色，将脱色后的溶液浓缩至合适体积，按1∶5加入90％的乙醇，5000r/min，30min，取沉淀溶于适量蒸馏水中，水浴60℃，使其充分溶解.将pH调至7.0，加入3g枯草杆菌中性蛋白酶，50℃搅拌过夜，酶解完毕后，三氯乙酸调pH至4.50，9000r/min离心30min，取上清液加入乙醇使乙醇体积分数为42％，8000r/min离心30min；取沉淀用乙醇和丙酮洗涤，摊于平皿上，60℃真空干燥，得到精制砂海星粘多糖I，上清中再次加入乙醇，使乙醇体积分数为82％，操作同上，得到精制砂海星粘多糖II。

3.如权利要求1所提取的提取砂海星粘多糖的方法，其特征在于所述海星样品制备方法为，海星新鲜时用水冲洗净泥沙，自然风干，用粉碎机粉碎至40目。