CN102617748B - 一种普鲁兰多糖的纯化方法 - Google Patents
一种普鲁兰多糖的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102617748B CN102617748B CN201210098732.XA CN201210098732A CN102617748B CN 102617748 B CN102617748 B CN 102617748B CN 201210098732 A CN201210098732 A CN 201210098732A CN 102617748 B CN102617748 B CN 102617748B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pulullan polysaccharide
- ethanol
- polysaccharide
- chloroform
- alcohol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明公开了一种普鲁兰多糖的纯化方法。其中主要包括以下步骤:用Savage法除去蛋白质,反复4~20次,再用95%或98%的乙醇配制成不同浓度梯度的溶液,进行醇沉,除去小分子物质,最后用蒸馏水为洗脱溶剂,进行凝胶层析,最终得到纯化普鲁兰多糖,纯度在99%以上,收率在58%以上(以多糖含量计算)。本发明用时间短、收率高、方法简单,所得的普鲁兰多糖的多糖纯度高等优点,适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用Savage法、分级醇沉和凝胶层析纯化普鲁兰多糖的方法,属于生物技术领域。
技术背景
普鲁兰多糖是短梗霉多糖(pullulan)的中文译名,是通过黑酵母菌的一种出芽短梗霉发酵所产生的胞外多糖,是无味无嗅的白色粉末。其化学组成主要是由α-1.4葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖,分子结构中含1/3的α-1.6葡萄糖苷键,2/3的α-1.4葡萄糖苷键,受不同发酵培养条件的影响,分子量一般在5.0×104-5.0×106道尔顿之间。该多糖易溶于水,安全无毒、可食用、低热值、耐酸碱、可塑性好、成膜性好、簿膜隔气性佳。因其在自然界可被微生物降解利用,不会引起环境污染,故被誉为无公害塑料。
1938年R.Bauer从微生物的培养物中发现普鲁兰多糖的产生菌,而普鲁兰多糖的研究工作则起始于西德,英国人在理论方面也作了不少工作,日本进行了比较系统尤其是生产工艺和产品应用的研究,并取得了大量专利。1976年至1980年是普鲁兰多糖的第一个研究高峰,主要是对其性质和发酵方法的研究,1984年至1996年是第二个研究高峰,主要集中在对其产生机理和应用方面的研究。我国在80年代初期开始进行相关研究,虽然在菌种和工艺方面取得了一定成绩,但生产厂商较少。普鲁兰多糖的纯化工艺一般采用氯仿/丁醇混合溶液除去蛋白质后透析,后用溶液洗涤、干燥,经DEAE-纤维素柱层析,收集多糖峰,减压浓缩、透析、冷冻干燥。反应时间较长,多次用到透析,对溶剂消耗量较大,且所得到的普鲁兰多糖纯度多在90%-95%之间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不同于传统的普鲁兰多糖的纯化方法,采用发明所述的工艺方法,制得普鲁兰多糖的含糖量在99%以上,产品得率高。
本发明提供的普鲁兰多糖的纯化工艺是以普鲁兰多糖粗品为原料(含糖量20%左右——硫酸苯酚法测定(中国药学杂质,1996,31(9):550),分子量为5000-15000道尔顿),对其进行纯化,使之达到多糖纯度在99%以上,其具体包括以下步骤:
(a)将粗品普鲁兰多糖加蒸馏水稀释成普鲁兰多糖水溶液,加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液,充分震荡,离心,除去沉淀,将上清液再用此方法重复处理,最后得到脱去蛋白的上清液,减压蒸馏除去有机溶液,冻干,得到粗普鲁兰多糖。
(b)将一定量的粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中,加入乙醇,醇析,离心,沉淀为普鲁兰多糖,然后继续向上清液中加入乙醇,至不同梯度的乙醇浓度,每次操作如上所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离,分部收集器分管收集减压旋蒸含有活性物质的洗脱液,得到普鲁兰多糖,再用冷冻乙酸乙酯冲洗,冻干,既得普鲁兰多糖纯品。
本发明所提供的方法,相对于现有普鲁兰多糖纯化方法,具有以下优势:
(1)传统方法在除去普鲁兰多糖粗品的小分子时采用的是透析方法,所用时间较长,一般一次透析在8小时以上,且整个纯化工艺中至少要使用3次透析;本发明所采用方法采用分级醇沉方法除去小分子,只需一次分级醇沉,所用时间在2-8小时,大大节省了纯化时间;
(2)传统方法制得的普鲁兰多糖的多糖纯度在90%-95%,而采用本发明所提供方法,普鲁兰多糖的多糖纯度能达到99%以上,收率(以多糖含量计算,下同)在58%以上。
具体实施案例
下面通过实施例对本发明做进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,所用术语从事生物技术行业的技术人员均能读懂。
实施例1
(a)将粗品普鲁兰多糖100g加蒸馏水稀释成1.5%的普鲁兰多糖水溶液,加入氯仿/正丁醇(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)混合液,充分震荡,以2000r/min离心15min,除去沉淀,将上清液再用此方法重复处理8次,最后得到脱去蛋白的上清液,减压蒸馏除去有机溶液,冻干,得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中,加入95%乙醇至浓度为20%(体积浓度,下同),4℃醇析8小时,以15000r/min离心10min,沉淀为普鲁兰多糖,然后继续向上清液中继续加入乙醇,至终浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%,每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离,用蒸馏水洗脱,流速2.0mL/min,分部收集器分管收集,收集活性片段减压旋蒸含有活性物质的洗脱液,得到普鲁兰多糖,再用冷冻乙酸乙酯冲洗,冻干,既得普鲁兰多糖纯品16.2g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.2%,收率81%。
实施例2
(a)将粗品普鲁兰多糖500g加蒸馏水稀释成2%的普鲁兰多糖水溶液,加入氯仿/戊醇(V氯仿∶V戊醇=4∶1)混合液,充分震荡,以3000r/min离心30min,除去沉淀,将上清液再用此方法重复处理5次,最后得到脱去蛋白的上清液,减压蒸馏除去有机溶液,冻干,得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中,加入98%乙醇至浓度为15%(体积浓度,下同),4℃醇析5小时,以25000r/min离心10min,沉淀为普鲁兰多糖,然后继续向上清液中继续加入乙醇,至终浓度分别为30%、45%、60%、75%,每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离,用蒸馏水洗脱,流速3.0mL/min,分部收集器分管收集,收集活性片段,减压旋蒸含有活性物质的洗脱液,得到普鲁兰多糖,再用冷冻乙酸乙酯冲洗,冻干,既得普鲁兰多糖纯品76g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.4%,收率76%。
实施例3
(a)将粗品普鲁兰多糖200g加蒸馏水稀释成10%的普鲁兰多糖水溶液,加入氯仿/戊醇(V氯仿∶V戊醇=6∶1)混合液,充分震荡,以4000r/min离心30min,除去沉淀,将上清液再用此方法重复处理6次,最后得到脱去蛋白的上清液,减压蒸馏除去有机溶液,冻干,得到粗普鲁兰多糖。
(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中,加入98%乙醇至浓度为15%(体积浓度,下同),4℃醇析10小时,以20000r/min离心20min,沉淀为普鲁兰多糖,然后继续向上清液中继续加入乙醇,至终浓度分别为30%、45%、60%、75%,每次操作同前所述。
(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离,用蒸馏水洗脱,流速5.0mL/min,分部收集器分管收集,收集活性片段,减压旋蒸含有活性物质的洗脱液,得到普鲁兰多糖,再用冷冻乙酸乙酯冲洗,冻干,既得普鲁兰多糖纯品24g。用硫酸苯酚法测定多糖纯度为99.5%,收率为60%。
Claims (4)
1.一种普鲁兰多糖的纯化方法,其特征在于,包括:
采用Savage法、分级醇沉和凝胶层析的方法纯化粗品普鲁兰多糖,得到99%以上的普鲁兰多糖;
所述的Savage法指的是:用蒸馏水稀释粗品普鲁兰多糖,加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液,离心,将上清液再用此方法重复处理,最后得到脱去蛋白的上清液,减压蒸馏除去有机溶液,冻干,得到粗普鲁兰多糖;
所述的分级醇沉指的是:将所得的粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中,加入乙醇,醇析,离心,沉淀为普鲁兰多糖,然后继续向上清液中加入乙醇,至不同梯度的乙醇浓度,每次操作同上述;
所述的凝胶层析指的是:将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析柱分离,分部收集器分管收集,减压旋蒸含有活性物质的洗脱液,得到普鲁兰多糖,再用冷冻乙酸乙酯冲洗,冻干,既得普鲁兰多糖纯品,纯度在99%以上。
2.如权利要求1所述的普鲁兰多糖的纯化方法,其特征在于,所述的普鲁兰多糖水溶液的浓度为0.5%~10%;氯仿/正丁醇和氯仿/戊醇的比例为V氯仿∶V戊醇或正丁醇=6~1∶1;离心的速率在1500r/min~4000r/min,离心时间为10min~30min;Savage法重复次数为4~20次。
3.如权利要求1所述的普鲁兰多糖的纯化方法,其特征在于,所述的乙醇选用95%或98%乙醇,乙醇浓度梯度为5%~20%,乙醇的始浓度为10%~20%,终浓度为70%~80%;醇析时间为4~20小时,醇析温度为0℃~6℃;离心速率为10000r/min~40000r/min,时间为10~60min。
4.如权利要求1所述的普鲁兰多糖的纯化方法,其特征在于,所述的凝胶柱层析洗脱液为蒸馏水,流速为1.0mL/min~5.0mL/min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210098732.XA CN102617748B (zh) | 2012-04-06 | 2012-04-06 | 一种普鲁兰多糖的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210098732.XA CN102617748B (zh) | 2012-04-06 | 2012-04-06 | 一种普鲁兰多糖的纯化方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102617748A CN102617748A (zh) | 2012-08-01 |
CN102617748B true CN102617748B (zh) | 2016-12-14 |
Family
ID=46557993
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210098732.XA Active CN102617748B (zh) | 2012-04-06 | 2012-04-06 | 一种普鲁兰多糖的纯化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102617748B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105037570B (zh) * | 2015-06-05 | 2017-09-05 | 天津商业大学 | 滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法 |
CN107951858A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-24 | 江苏力凡胶囊有限公司 | 一种基于普鲁兰多糖的胶囊封口胶 |
CN112409506A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-02-26 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种制备不同均一分子量普鲁兰多糖的方法 |
CN113355315B (zh) * | 2021-05-31 | 2023-11-03 | 扬州大学 | 普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1651468A (zh) * | 2005-01-11 | 2005-08-10 | 苏理 | 普鲁兰糖的后提取生产工艺 |
CN101760490A (zh) * | 2008-11-07 | 2010-06-30 | 南通芯迎设计服务有限公司 | 砂海星粘多糖的提取分离方法 |
CN101851297A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-10-06 | 安徽天品堂生态农业有限公司 | 一种黄精多糖高效提取工艺 |
CN102002109A (zh) * | 2010-11-25 | 2011-04-06 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种山茱萸多糖的制备方法 |
CN102304191A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-01-04 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法 |
-
2012
- 2012-04-06 CN CN201210098732.XA patent/CN102617748B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1651468A (zh) * | 2005-01-11 | 2005-08-10 | 苏理 | 普鲁兰糖的后提取生产工艺 |
CN101760490A (zh) * | 2008-11-07 | 2010-06-30 | 南通芯迎设计服务有限公司 | 砂海星粘多糖的提取分离方法 |
CN101851297A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-10-06 | 安徽天品堂生态农业有限公司 | 一种黄精多糖高效提取工艺 |
CN102002109A (zh) * | 2010-11-25 | 2011-04-06 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种山茱萸多糖的制备方法 |
CN102304191A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-01-04 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定;曹海石等;《高等学校化学学报》;19991130;第20卷(第11期);第1729-1732页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102617748A (zh) | 2012-08-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Three-phase partitioning for the direct extraction and separation of bioactive exopolysaccharides from the cultured broth of Phellinus baumii | |
CN102617748B (zh) | 一种普鲁兰多糖的纯化方法 | |
WO2020192496A1 (zh) | 一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法 | |
US10835552B2 (en) | Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide | |
CN111978421B (zh) | 一种桑树桑黄多糖及其制备和用途 | |
CN106636288B (zh) | 一种发酵提取剑麻皂素的方法 | |
CN107226871A (zh) | 一种青稞β‑葡聚糖的制备方法 | |
CN104846031B (zh) | 一种利用发酵法提取燕麦β-葡聚糖的方法 | |
CN103467618A (zh) | 一种虫草菌丝体多糖分离纯化的方法 | |
CN108265092B (zh) | 一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法 | |
CN102965414A (zh) | 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 | |
CN105153321A (zh) | 一种具有益生元效应的莲子低聚糖单体的快速分离方法 | |
CN107880149A (zh) | 一种铁皮石斛多糖的提取工艺 | |
CN102174613A (zh) | 一种乳杆菌多糖分离纯化的方法 | |
CN105685766B (zh) | 微藻发酵液胞外多糖、其制备方法及用途 | |
CN111607010A (zh) | 一种具有免疫调节活性的浒苔多糖及其制备方法 | |
CN107236054B (zh) | 一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用 | |
CN105542030A (zh) | 一种从桑黄子实体中提取水溶性β葡聚糖的方法 | |
CN109762855B (zh) | 一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法 | |
CN101117641B (zh) | 开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法 | |
CN113735802A (zh) | 一种采用低共熔溶剂制备岩藻黄质提取物的制备方法 | |
CN111718428A (zh) | 一种利用铁皮石斛发酵液制备水溶性多糖的方法 | |
CN106608908B (zh) | 一种从含铬酵母中提取葡萄糖耐量因子的方法 | |
CN1844156A (zh) | 真菌多糖精化提纯工艺 | |
CN108623701B (zh) | 一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200424 Address after: 256800 Central Road, Zhanhua District, Binzhou, Shandong Province, No. 1145 Patentee after: SHANDONG LUBEI PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 102600 Beijing City, Daxing District Zhongguancun Science Park Daxing biomedical industry base Tianhua Street No. 21 Building No. 7 hospital room 212 Patentee before: HUAYUAN MEDICAL RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. |