CN113355315B - 普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种普鲁兰多糖‑动物酯酶复合纳米纤维的制备方法。所述方法通过动物肝脏提取和纯化，制得动物酯酶溶液，然后与普鲁兰多糖溶液混合均匀，得到普鲁兰多糖‑动物酯酶静电纺丝溶液，最后静电纺丝制得普鲁兰多糖‑动物酯酶复合纳米纤维。本发明的普鲁兰多糖‑动物酯酶复合纳米纤维的平均直径在70.39‑108.79nm，动物酯酶在纳米纤维表面分布均匀，对农药西维因的检测下限为0.81‑1.10mg/L。本发明实现了动物酯酶的纳米材料固定化，具有工艺简单、成本低和环境友好等优点。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，涉及一种普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法。
背景技术
农药的大量使用有很大概率会进入生态环境，不仅对土壤和空气造成污染，进入水体的农药还会危害渔业和水产养殖，严重影响了农业的可持续发展。而农产品中的农药残留也会对人畜造成多器官损伤，诱发多种疾病，如癌症和内分泌系统紊乱等。因此，农残检测一直是农产品安全中的研究热点之一。
根据国标对农残快速检测方法的规定，速测卡法和酶抑制法已成为农残现场快检的主要方法。大部分酶抑制法采用酯酶纯品作为主要农药靶向对象，但一般都需要从国外进口且价格昂贵。而动物肝脏、血液和组织中含有丰富的酯酶且成本较低，更能满足市场化的要求。动物体内的羧酸酯酶和胆碱酯酶等，可作为有机磷类和氨基甲酸酯类农药的有效作用靶标，应用于酶抑制法的农残检测中。但使用动物酯酶存在重新收集难度大，且易受到环境因素(光、热、氧和pH等)或化学反应的影响，导致酶的催化活力下降，限制了其在实际应用中的适用范围。目前固定动物酯酶用于农残检测的方法主要有，以聚氯乙烯和聚苯乙烯材料的96微孔板作为载体物理吸附法固定鸡肝酯酶(Tu等,安徽农业科学,39(24):14534-14536)和基于NCM9924微量热芯片的微机电加工法(于劲松等,理化检验(化学分册).2014,50(11):1338-1341)，但依然存在稳定性差和农药响应不敏感等问题。
静电纺丝是一种可工业化连续制备纳米纤维且操作方式温和的方法，所得纤维直径在数十到数百纳米范围，较大的比表面积赋予了其优良的吸附能力、过滤性和粘合性等特性，常被用于吸附和过滤材料。利用静电纺丝将酶固定化，可增加酶反应的比表面积和促进多孔结构的形成，从而大大提高酶的使用效率和稳定性，可连续进行酶体系反应。因此，静电纺丝法在酶抑制法的农残检测方面具有潜在的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种工艺简单、成本低和固定效果好的环境友好型的检测农药西维因的普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法。
实现本发明目的的技术方案如下：
普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法，首先从动物肝脏中从提取和纯化得到动物酯酶，再将其与普鲁兰多糖纺丝溶液进行充分混合，利用静电纺丝技术制备出具有比表面积大、孔隙率高和活性位点多等优点的普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维，实现动物酯酶的纳米材料固定化，具体步骤如下：
(1)动物酯酶的提取和纯化：将新鲜动物肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液混合，加入苯甲基磺酰氟和2,6-二叔丁基对甲酚，分别保持浓度为100-130μmol/L和30-60μmol/L，匀浆离心后取上清液，加入硫酸铵至30-70％的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后于0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析6-12h，静置离心后得到上清液，得到纯化后的动物酯酶溶液；
(2)普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液的制备：按照0.15～0.25g/mL的质量浓度将普鲁兰多糖分散于pH为4-10的磷酸缓冲盐溶液，沸水浴糊化1-3h，冷却至室温，得到普鲁兰多糖溶液，按照体积比4:1-4:4将普鲁兰多糖溶液与纯化后的动物酯酶溶液磁力搅拌混合1-3h后，得到普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液；
(3)静电纺丝制备普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维：将普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液进行静电纺丝，静电纺丝电压为10-20kV，纺丝距离为8-20cm，流速为0.1-0.4mL/h，滚筒转速为5-30rpm，得到普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维。
优选地，步骤(1)中，所述的动物为猪、鸡和鹅中的一种或多种；所述的动物肝脏与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液的混合比例为20-40:50-200，g:mL。
优选地，步骤(1)中，研磨成粉与磷酸缓冲盐溶液的比例为0.5-1.5:5-25，g:mL。
优选地，步骤(2)中，所述的普鲁兰多糖的分子量为100-200g/mol。
优选地，步骤(3)中，所述的静电纺丝的时间为4-12h。
优选地，步骤(3)中，纺丝针头规格为18-23G。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1)实现了动物酯酶的纳米材料固定化，具有工艺简单、成本低和环境友好等特点，并适用于农药西维因的检测。
2)本发明得到的普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维，其平均直径在70.39-108.79nm，动物酯酶在纳米纤维表面分布均匀，对农药西维因的检测下限为0.81-1.10mg/L。
3)本发明技术与现有固定化方法(96微孔板物理吸附法和微量热芯片的微机电加工法)相比，所需设备和制备工艺简便，成本较低，且固定化酶效果好，农药响应敏感，具有工业化生产的潜力。
附图说明
图1为实施例1普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维的扫描电镜和能谱成像图。
图2为实施例1普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维的直径分布图。
图3为实施例1普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维在不同西维因浓度下的酶活抑制率曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不仅仅局限于实施例表述的范围。
动物酯酶的提取和纯化参考文献【徐斐等，食品科学,2007,028(005):237-240；于晓航等，现代食品科技,2015,031(006):230-235】。
实施例中有关的测试方法说明如下：
1)样品的扫描电镜观察
用导电胶将样品固定在金属载物台上，真空喷金90s后，通过扫描电子显微镜(S-4800Ⅱ，日本Hitachi公司)观察样品形貌并于10000倍下进行拍摄，并通过能谱成像仪对其元素组成进行分析。
2)样品的直径分析
通过ImageJ软件对上述获得的样品扫描电镜图进行分析，每个样品取5-10张图片，每张图片取点50-100次，得到直径数据后进行平均直径计算。
3)样品在不同西维因浓度下的酶活抑制率及其检测下限测试
取1×5cm的纳米纤维膜，用1mL的磷酸盐(PBS)缓冲液将其溶解，加入1mL不同浓度的西维因PBS缓冲液(0.5-10mg/L，0.1mol/L)和25uL底物(100mmol/Lα-乙酸萘酯丙酮溶液)后混合均匀，于30℃恒温振荡水浴孵育5min，然后加入0.25mL显色剂溶液(0.8％固兰B盐的3.6％SDS溶液)后继续30℃恒温振荡水浴孵育5min。以不加底物的样品溶液作为空白对照，在595nm处测定上述反应溶液的吸光度，比较不同西维因浓度对样品酶活抑制率的影响。
样品的酶活计算公式如下：
E＝D×(K×A)/T×10-3，
式中，E为样品的酶活力(U/mL)，D为样品的稀释倍数，K为α-萘酚在pH 6.4条件下标准曲线斜率(10-6mol/L)，T为反应时间，A为反应液的吸光度(OD)。
样品的酶活抑制率计算公式如下：
I＝(E2-E1)/E1，
式中，I为酶活抑制率(％)，E2为无农药抑制时样品的酶活力(U/mL)，E1为一定西维因浓度下样品的酶活力(U/mL)。
农药西维因检测下限定义为与3倍抑制率标准差平均值相对应的农药浓度。
实施例1
普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)鸡肝酯酶的提取和纯化：将鸡肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液以30：100的比例混合，加入苯甲基磺酰氟和2,6-二叔丁基对甲酚分别保持浓度115μmol/L和45μmol/L的浓度，匀浆离心后取30mL上清液，加入硫酸铵至70％的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后以1：10的比例于0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析6h，静置离心后得到上清液，即为纯化后的鸡肝酯酶溶液。
(2)普鲁兰多糖-鸡肝酯酶静电纺丝溶液的制备：按照0.15g/mL的质量浓度将分子量为150g/mol的普鲁兰多糖分散于pH为6的磷酸缓冲盐溶液，沸水浴糊化1h，冷却至室温，得到普鲁兰多糖溶液；按照体积比4:1将普鲁兰多糖溶液与上述步骤(1)纯化后的鸡肝酯酶溶液磁力搅拌混合1h后，即可得到普鲁兰多糖-鸡肝酯酶静电纺丝溶液。
(3)静电纺丝制备普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维：将步骤(2)得到的普鲁兰多糖-鸡肝酯酶静电纺丝溶液，装入10mL的针管注射器，连接18G的纺丝针头；静电纺丝电压为12kV，纺丝距离为15cm，注射器流速为0.2mL/h，滚筒转速为30rpm，静电纺丝12h后，即可得到普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维。
经测试，鸡肝酯酶的特征硫元素均匀地分布在复合纳米纤维的内外表面(图1)，表明鸡肝酯酶被均匀复合在普鲁兰多糖纳米纤维中；普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维的平均粒径为70.39nm(图2)，其对农药西维因的检测下限为0.81mg/L(图3)。
实施例2
普鲁兰多糖-猪肝酯酶复合纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)猪肝酯酶的提取和纯化：将猪肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液以20：200的比例混合，加入苯甲基磺酰氟和2,6-二叔丁基对甲酚分别保持浓度100μmol/L和30μmol/L的浓度，匀浆离心后取50mL上清液，加入硫酸铵至70％的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后以0.5：25的比例于0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析12h，静置离心后得到上清液，即为纯化后的猪肝酯酶溶液。
(2)普鲁兰多糖-猪肝酯酶静电纺丝溶液的制备：按照0.25g/mL的质量浓度将分子量为200g/mol的普鲁兰多糖分散于pH为4的磷酸缓冲盐溶液，沸水浴糊化2h，冷却至室温，得到普鲁兰多糖溶液；按照体积比4:3将普鲁兰多糖溶液与上述步骤(1)纯化后的猪肝酯酶溶液磁力搅拌混合3h后，即可得到普鲁兰多糖-猪肝酯酶静电纺丝溶液。
(3)静电纺丝制备普鲁兰多糖-猪肝酯酶复合纳米纤维：将步骤(2)得到的普鲁兰多糖-猪肝酯酶静电纺丝溶液，装入20mL的针管注射器，连接23G的纺丝针头；静电纺丝电压为20kV，纺丝距离为10cm，注射器流速为0.4mL/h，滚筒转速为5rpm，静电纺丝4h后，即可得到普鲁兰多糖-猪肝酯酶复合纳米纤维。
经测试，普鲁兰多糖-猪肝酯酶复合纳米纤维的平均粒径为108.79nm，对农药西维因的检测下限为1.10mg/L。
实施例3
普鲁兰多糖-鹅肝酯酶复合纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)鹅肝酯酶的提取和纯化：将鹅肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液以30：150的比例混合，加入苯甲基磺酰氟和2,6-二叔丁基对甲酚分别保持浓度130μmol/L和60μmol/L的浓度，匀浆离心后取40mL上清液，加入硫酸铵至70％的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后以1.5：20的比例于0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析8h，静置离心后得到上清液，即为纯化后的鹅肝酯酶溶液。
(2)普鲁兰多糖-鹅肝酯酶静电纺丝溶液的制备：按照0.20g/mL的质量浓度将分子量为100g/mol的普鲁兰多糖分散于pH为10的磷酸缓冲盐溶液，沸水浴糊化3h，冷却至室温，得到普鲁兰多糖溶液；按照体积比4:4将普鲁兰多糖溶液与上述步骤(1)纯化后的鹅肝酯酶溶液磁力搅拌混合2h后，即可得到普鲁兰多糖-鹅肝酯酶静电纺丝溶液。
(3)静电纺丝制备普鲁兰多糖-鹅肝酯酶复合纳米纤维：将步骤(2)得到的普鲁兰多糖-鹅肝酯酶静电纺丝溶液，装入5mL的针管注射器，连接20G的纺丝针头；静电纺丝电压为10kV，纺丝距离为20cm，注射器流速为0.1mL/h，滚筒转速为20rpm，静电纺丝8h后，即可得到普鲁兰多糖-鹅肝酯酶复合纳米纤维。
经测试，普鲁兰多糖-鹅肝酯酶复合纳米纤维的平均粒径为75.62nm，对农药西维因的检测下限为0.95mg/L。
对比例1
本对比例采用无纳米纤维固定化，以提取和纯化后的动物酯酶作为对比例，包括如下步骤：
将猪肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液以20：200的比例混合，加入苯甲基磺酰氟和2,6-二叔丁基对甲酚分别保持浓度120μmol/L和60μmol/L的浓度，匀浆离心后取40mL上清液，加入硫酸铵至45％的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后以1：15的比例于0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析6-12h，静置离心后得到上清液，即为纯化后的猪肝酯酶溶液。
经测试，猪肝酯酶对农药西维因的检测下限为2.47mg/L，高于国标(GB/T2763-2019)中西维因浓度在新鲜蔬菜的最大残留量标准(1mg/kg)。
对比例2
本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的时步骤(2)中普鲁兰多糖的质量浓度为0.3g/mL。经测试，无法得到纳米纤维状的普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维，可能由于普鲁兰多糖浓度太高导致溶液粘度太大从而阻碍了静电纺丝的进行。
对比例3
本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的时步骤(2)中普鲁兰多糖的分子量为90g/mol。经测试，无法得到纳米纤维状的普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维，可能由于普鲁兰多糖的分子量太低导致分子间相互纠缠程度不够从而无法静电纺丝。
对比例4
本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的时步骤(2)中普鲁兰多糖溶液与纯化后的鸡肝酯酶溶液的体积比为4:5。经测试，无法得到纳米纤维状的普鲁兰多糖-鸡肝酯酶复合纳米纤维，可能由于鸡肝酯酶在普鲁兰多糖中比例太大阻碍了静电纺丝的进行。
Claims (7)
1.普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）动物酯酶的提取和纯化：将新鲜动物肝脏破碎后与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液混合，加入苯甲基磺酰氟和2, 6-二叔丁基对甲酚，分别保持浓度为100-130 μmol/L和30-60μmol/L，匀浆离心后取上清液，加入硫酸铵至30-70%的饱和度，静置离心后取沉淀冻干，研磨成粉后于0.1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液中透析6-12 h，静置离心后得到上清液，得到纯化后的动物酯酶溶液；
（2）普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液的制备：按照0.15~0.25 g/mL的质量浓度将普鲁兰多糖分散于pH为4-10的磷酸缓冲盐溶液，沸水浴糊化1-3 h，冷却至室温，得到普鲁兰多糖溶液，按照体积比4:1-4:4将普鲁兰多糖溶液与纯化后的动物酯酶溶液磁力搅拌混合1-3 h后，得到普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液，所述的普鲁兰多糖的分子量为100-200g/mol；
（3）静电纺丝制备普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维：将普鲁兰多糖-动物酯酶静电纺丝溶液进行静电纺丝，静电纺丝电压为10-20 kV，纺丝距离为8-20 cm，流速为0.1-0.4mL/h，滚筒转速为5-30 rpm，得到普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的动物为猪、鸡和鹅中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的动物肝脏与氨基丁三醇-乙酸缓冲溶液的混合比例为20-40: 50-200，g:mL。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，研磨成粉与磷酸缓冲盐溶液的比例为0.5-1.5: 5-25，g:mL。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的静电纺丝的时间为4-12 h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，纺丝针头规格为18-23G。
7.根据权利要求1至6任一所述的制备方法制得的普鲁兰多糖-动物酯酶复合纳米纤维。
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