DE1945680A1 - Enzymatisch aktives Addukt und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

8. September I969 Gzy/Ra.

Enzymatisch aktives Addukt und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein enzymatisch aktives, wasserlösliches Addukt eines Enzyms, das durch Valenzbindungen mit einem Polymer verbunden ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Adduktes. Die neuen Addukte haben wertvolle und nicht vorhergesehene Eigenschaften.

Die Erfindung beruht auf der neuen Erkenntnis, daß man lösliche Addukte von Enzymen und Polymeren hersteilen kann, die wesentlich andere enzymatische Eigenschaften haben als die unlöslichen Addukte. Die löslichen Addukte von Chymotrypsin und Trypsin haben ein pH-Profil der Aktivität, das sich deutlich von dem der ursprünglichen Enzyme unterscheidet. Diese Tatsache war vollständig überraschend und unerwartet.

Gegenüber den ursprünglichen Enzymen ist die Stabilität dieser löslichen Addukte erhöht. Diese Tatsache kann auf verschiedene Umstände zurückgeführt werden, die sich zur Zeit noch nicht erklären lassen. In jedem Falle sind die löslichen erfindungsgemäßen Addukte bemerkenswert stabil gegen Autolyse und Abbau, selbst in Lösung.

Wie schon erwähnt, haben die löslichen Addukte gemäß der Erfindung die wünschenswerte Eigenschaft der Löslichkeit von nativen Enzymen, was den Kontakt mit dem Substrat erleichtert. Dar-

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über hinaus haben sie die erwünschte Eigenschaft einer erhöhten Stabilität und eines geänderten biologischen Verhaltens gegenüber den unlöslichen Addukten.

Die erfindungsgemaßen löslichen Addukte von Enzymen und einem Polymer bringen Vorteile mit sich gegenüber den nativen Enzymen oder ihren unlöslichen Addukten mit einem Polymer. So können beispielsweise solche löslichen Addukte verwendet werden, um auf biologische und synthetische Substrate einzuwirken. Diese charakteristische biologische Einwirkung des Enzyms findet innerhalb eines optimalen pH-Bereiches statt. Anschließend können solche löslichen Addukte von dem behandelten Substrat getrennt werden, z.B. durch Chromatographie mit Sephadex. Dann kann das lösliche Addukt abgetrennt und wieder verwendet werden.

Das lösliche erfindungsgemäße Addukt kann aber auch in einem Behälter enthalten sein, dessen eine Wand eine poröse Membrane" ist. Durch diese Membrane können Stoffe mit einem niederen Molekulargewicht hindurchtreten, nicht aber Stoffe mit einem hohen Molekulargewicht wie die löslichen Addukte von Enzymen und Polymeren. Das lösliche Addukt reagiert also mit den Substraten so, daß die Abbauprodukte des Substrats von dem löslichen Addukt durch Hindurchführung durch die poröse Membrane getrennt werden, wobei das lösliche Addukt zurückbleibt und isoliert oder wiederverwendet werden kann. '

Ein anderes Beispiel der sehr vorteilhaften Verwendung eines erfindungsgemäßen löslichen Adduktes sseigt die einfache Anwendung in Form von stabilen Lösungen*, So kann beispielsweise ein lösliches Addukt aus- EMA. und Gellulase in Form einer Lösung

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auf Cellulose oder ein Cellulose enthaltendes Material aufgesprüht werden. Hiernach wird die Cellulose abgebaut und es entsteht Glukose. Eine Wiedergewinnung und Wiederverwendung ist möglich.

Mit dem Ausdruck "EMA." wird nachstehend ein Polymer aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid bezeichnet, das erfindungsgemäß von großem Wert ist.

Polymere des "EMI-Typs¹⁹ werden weiter unten gekennzeichnet.

"EMA-Enzym" oder "EMA/Enzym" bezeichnet nachstehend ein 1'..0Iymer von Äthylen und Maleinsäureanhydrid, mit welchem durch Valenzbindungen das Enzym verbunden ist. Das Addukt ist in Jedem Falle dasselbe, gleichgültig,, pb das Enzym direkt mit einer Anhydridgruppe dee Copolymers reagiert hat oder mit einer Carboxylgruppe, und ob «ine Aktivierung der Carboxylgruppe des Polyuers durchgeführt wurde oder nicht. Anhydridgruppen, die an der Umsetzung im wässrigen Medium nicht teilgenommen haben, sind in dem Addukt als Carboxyl- oder Carboxylat-Gruppen vorhanden. Solche nicht umgesetzten Gruppen können in Amide, Iaide, Ester und dergleichen übergeführt werden und im Addukt enthalten sein.

"Wasserunlöslich¹¹ bedeutet, daß der Stoff sich nicht in Wasser oder wässrigen Lösungen löst, obwohl er unter Umständen durch Solvatation ait Wasser schwellen kann und gegebenenfalls in Gelform übergeführt wird.

"Wasserlöslich" bedeutet nicht, daß der Stoff in Wasser unlöslich ist. Eine genauere Definition wird weiter unten gegeben.

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Die erfindungsgemäßen Addukte können hergestellt werden durch Umsetzen von kristallinen oder rohen Enzymen oder Enzymgemischen in !lösung mit dem Polymer. Es entsteht ein Addukt, in welchem die Enzyme durch Valenzbindungen gebunden sind.

Wenn in dem Polymer ein Anhydridrest oder ein Carboxylrest vorhanden ist, z.B. in einem EMA-Polymer, so wird die Valenzbindung des Enzyms an das Polymer entweder durch direkte Umsetzung mit der Anhydridgruppe oder unter Verwendung eines Aktivierungsmittels mit der Carboxylgruppe erreicht. Das Endprodukt ist in beiden Fällen dasselbe. Der pH-Bereich für die Umsetzung ist abhängig von dem verwendeten Enzym und dessen Stabilitätsbereich. In der Regel liegt der pH-Wert zwischen etwa 5 und 9j5» vorzugsweise zwischen 6 und 8, In einzelnen Fällen kann er auch eingestellt werden. Die Isolierung und Reinigung ge-S3eiil©M aaeh. üblichen biochemischen Verfahren, und ist auch in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Da eine Valenzbindung des Ensjms mit dem Polymer erwünscht ist, führt man die Umsetzung in der Regel bei niedrigeren Temperaturen und bei einem etwa neutralen pH-Wert in Wasser oder in einer verdünnten wässrigen Pufferlösung durch.

Bei diesem Verfahren erhält man enzymatisch aktive Addukte. Der Aktivitätsgrad ist aber mitunter geringer als erwünscht, waiirseliQinliels. wegen der teilweisen Inaktivierung der Enzyme während des ¥erfaiirene. BeehaTb ist es häufig vorteilhaft, ein gemischt©^ Lösungsmittel anzuwenden, wobei man ein Lösungsmittel nimmt„ in welchem das Enzym wenigstens teilweise, in der Regel in einer Metige "bis au $0 Vol.-$, löslich ist. Dimethyl- sulfQxjü ist besonders geeignet als Lösungsmittel zusammen mit

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Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung. Bei Verwendung eines solchen gemischten Systems von Lösungsmittel zur Herstellung eines enzymatisch hochaktiven Addukte sind die Ausbeuten in der Regel höher, und es können höhere Mengen aktiver Enzyme in das Polymer eingeführt werden.

Das zur Umsetzung verwendete Polymer enthält vorzugsweise Carboxyl- oder Anhydridbindungen, insbesondere wenn die Enzyme Amino-, Hydroxyl-, phenolische Hydroxyl- oder Sulfhydryl-Gruppen enthalten, die nicht wesentlich für die enzymatische Aktivität sind. Das Polymer ist vorzugsweise ein EMA oder ein Polymer' vom EMA-Typ. Es können aber auch andere Polymere verwendet werden, die mit Enzymen umsetzbar sind. In allen Fällen ist es wichtig, daß eine Valenzbindung mit dem Enzym erreicht wird, damit das Addukt direkt oder indirekt verwendet werden kann. Wenn die enzymatische Aktivität der Ausgangs-Enzyme im Addukt erhalten bleiben soll, so ist es natürlich notwendig, daß die Bindung des Enzyms zu dem Polymer durch eine Gruppe geschieht, die für die Aktivität des Enzym-Moleküls nicht wesentlich ist. Zu solchen reaktiven Gruppen der Enzym-Moleküle gehören beispielsweise Amino-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-, phenolische Hydroxyl-, Carboxyl- und Imidazolyl-Gruppen. Solche Gruppen sind in freier ungebundener Form in inaktiven !Teilen der Enzym-Moleküle enthalten, z.B. in Lysin, Cystein, Serin, Threonin, Histidin oder Tyrosin. Diese Teile der Moleküle sind nicht wesentlich für die enzymatische Aktivität. Die Umsetzung der Enzyme mit dem Polymer unter Vermittlung dieser Gruppen vermeidet also eine Inaktivierung der Enzyme während der Umsetzung. In der Regel geschieht die Bindung über eine Amido-, Imido-, Ester-, Thioester- oder Disulfid-Gruppe, unter Anknüpfung an eine Carboxyl- oder Anhydrid-Gruppe des Polymers«.

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Amide entstehen durch. Umsetzung von Aminogruppen des Enzyms mit Carboxyl-Anhydridgruppen des Polymers in Wasser, in wässrigen Pufferlösungen oder in gemischten Lösungsmitteln. Amide, Imide und Ester werden leicht gebildet durch Aktivierung der Carboxylgruppen des Polymers oder der Carboxylgruppen des Enzyms, und reagieren mit Hydroxyl-, Amino- oder Mercaptan-Gruppen des anderen Reaktionsteilnehmers. Die Aktivierung kann erzielt werden durch Verwendung verschiedener Carbodiimide, Carbodiimidazole, dem Reagenz nach Woodward, dem Reagenz nach Sheehan, oder dergleichen. Hierbei entstehen hochaktive Zwischenprodukte, die mit den anderen oben erwähnten Gruppen auch unter milden Verfahrensbedingungen sich umsetzen können, und damit die enzymatische Aktivität erhalten lassen.

Das für die Umsetzung verwendete Polymer ist also fähig, das Enzym zu kuppeln oder mit ihm zu reagieren, und zwar entweder direkt oder indirekt unter Verwendung eines Aktivierungsmittels, wie schon oben ausgeführt wurde. In jedem Falle entsteht eine Valenzbindung zwischen dem Enzym und dem Polymer, Die Umsetzung kann so durchgeführt werden, daß das Enzym geschützt wird. Hierbei kann man eine oder mehrere aktive Gruppen des Enzyms reversibel blockieren, wie z.B. durch die Überführung von Papain in Quecksilberpapain oder Zinkpapain. Nach der Verbindung des Enzyms mit dem Polymer können die schützenden oder blockierenden Atome wieder entfernt werden.

Um eine hohe Ausbeute an wasserlöslichen Addukten zu erhalten, soll eine Vernetzung, die zu einer Unlöslichsiachung führt, vermieden werden.

Die Herstellung von wasserlöslichen Addukten von Enzymen und einem Polymer wird daher voraugsweise unter nicht vernetzenden

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Bedingungen durchgeführt. Die unerwünschte Vernetzung kann vermindert werden, wenn man die Umsetzung in hoher Verdünnung durchführt, so daß weniger Reaktionen zwischen mehreren Molekülen des Polymers und einem einzigen Enzym-Molekül stattfinden. Ein hohes Mengenverhältnis von Enzym zu Polymer fördert die Umletzung mehrerer Enzym-Moleküle mit einem einzigen Molekül des Polymers. Es entsteht also ein Addukt, in welchem die gewünschte Löslichkeit der einzelnen Enzym-Moleküle ei malten ist. Ein anderer Weg zur Bildung löslicher Addukte besteht darin, daß man die Umsetzung bei einer hohen lonenkonzentration durchführt, um die Aggregation von natürlichem Protein herabzusetzen. Solche Verfahren sind zwar oft erwünscht, aber es ist nicht imnr < notwendig, verdünnte Lösungen oder hohe Mengenverhältnisse von Enzym zu Polymer zu verwenden, tut lösliche Addukte zu erhalten.

Der Ausdruck "wasserlöslich* bedeutet * laß das Produkt sich in Wasser oder wässrigen Lösungen löst, Bas betteltet aber nicht, daß der Stoff sich vollständig 1&ei alles Eonse;:*Nationen und allen pH-Werten löst. Trotzdem sind diese wasserlöslichen Addukte bei verschiedenen Konzentrationen und pH-Werten löslich. In der Regel sind sie löslich bei pH-Werten von 7 oder darüber.

In ihrer löslichen Form haben die erfindungsgemäßen Addukte im wesentlichen dieselbe enzymatisch« Aktivität wie das natürliche als Ausgangsmaterial verwendete Enzym. Alls haben aber den Vorteil der Verwendungsmöglichkeit in Lösung oder Suspension susammen mit der erhöhten Stabilität und der verlängerten Aktivität. Weil sie polymere Stoffe enthalten, auch in löslicher Form, so können die erfindungsgemäßen . Addukte von den nativen Enzymen oder Substraten abge-

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trennt werden, ebenso wie von Verunreinigungen oder unerwünschten Färbungen, und zwar durch übliche Verfahren, z.B. durch Abschleudern, Elektrophorese oder Chromatographie.

Die erfindungsgemäßen Polymere enthalten Carboxyl- oder Anhydridgruppen, an welche die Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen der Enzyme gebunden werden, die nicht wesentlich für die enzymatisch^ Aktivität sind. Wenn ein Enzym eine für die enzymatische Aktivität nicht wesentliche Carboxylgruppe enthält, so kann das Polymer Hydroxyl- oder Aminogruppen enthalten, die mit dem Enzym reagieren können. Das Polymer kann ein EMA-Polymer oder eines vom EMA-Typ sein, oder ein solches Polymer, das mit einem Enzym umgesetzt werden kann. In allen Fällen muß das Polymer in der Lage sein, das Enzym d.urch eine Valenzbindung zu binden, um die erfindungsgemäßen, mehrere Enzyme enthaltenden Addukte zu erhalten.

Da eine Valenzbindung gewünscht ist, muß das Polymer so gestaltet sein, daß es wenigstens eine reaktive Gruppe innerhalb jeden Moleküls gibt, die mit den Enzymen reagieren kann, entweder direkt oder indirekt, um eine Valenzbindung zu erhalten. Diese reaktiven Gruppen sind vorzugsweise Carboxyl- oder Carboxylanhydridgruppen.

Der erfindungsgemäße polymere Ausgangsstoff ist ein Polymer, das Ketten von Carboxylsäuren oder Anhydriden solcher Carboxylsäureeinheiten enthält, und entsteht durch Polymerisation von polymerisierbaren Säuren oder Anhydriden. Das Polymer kann auch Einheiten von Carboxylsäuren oder ihren Anhydriden enthalten, die durch Kohlenstoffketten mit einem bis vier Kohlenstoffatomen getrennt sind. Diese Kohlenstoffketten bilden einen Teil

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einer Einheit, die höchstens 18 Kohlenstoffatome enthält. Das Polymer entsteht durch Copolymerisieren einer polymerisierbaren Säure oder eines Anhydrids mit einem anderen copolymerisierbaren Monomer. Vorzugsweise sind die Säure, das Anhydrid und weitere, copolymerisierbare Monomere ungesättigt. Die Polymerisation oder die Copolymerisation geschieht durch Addition dieser ungesättigten Verbindungen.

Zu den erfindungsgemäß verwendbaren Polymeren gehören auch Polyelektrolyte mit Einheiten der nachstehenden Formel

Z-GR.

I ⁱ
0-0

C=O

I Y

In dieser Formel sind R. und R^ gleich oder verschieden und bedeuten Wasserstoff, ein Halogen, vorzugsweise Chlor, einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen Methylrest, einen Cyanorest, einen Phenylrest oder ein Gemisch dieser Reste. Hierbei soll nicht mehr als einer der Reste R. und R-g ein Phenylrest sein. Z ist ein zweiwertiger Rest, vorzugsweise ein Alkylen-, Phenylalkylen-, niederer Alkoxyalkylen- oder niederer aliphatischer Acyloxyalkylenrest, der eine Kohlenstoffkette mit einem bis vier Kohlenstoffatomen enthält. Diese Kohlenstoffkette bildet einen Teil einer Einheit, die 1 bis18 Kohlenstoffatome enthält, q ist UuIl oder Eins. X und Y sind gleich"oder verschieden und bedeuten Hydroxy-, Oxyalkalimetall-, OR-, -OH-NH₅, -OH-R₅N, -OH-R₂NH,

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-OH-RNH₉, -MR«, -(Q)-W-(M¹R¹) . und -(Q) -W-(OH),.-Reste.

£— P A* J) Λ

Hierbei ist χ 1 bis 4 und ρ 0 oder 1. R ist ein Alkyl-, Phenylalkyl- oder Phenylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen. R¹ bedeutet Wasserstoff oder R. Q bedeutet Sauerstoff oder den Rest -NR¹-. W ist ein zweiwertiger Rest, vorzugsweise ein niederer Alkylen-, Phenyl-, Phenylalkyl-, Phenylalkyl- ^ phenyl- oder Alkylphenylalkylrest mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen. X und Υ können zusammen ein Sauerstoffatom bedeuten. Bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen X und Y ein Hydroxylrest sind oder bei denen X und Y zusammen ein Sauerstoffatom sind. Viele dieser Polymere sind im Handel erhältlich, und andere sind einfache Derivate von handelsüblichen Produkten, die entweder vorher oder gleichzeitig mit der Herstellung der Addukte hergestellt werden können, oder durch eine kleine Änderung des fertigen Addukts gewonnen werden können. Diese genannten Polymere werden nachstehend als Polymere vom "EMA-Typ" bezeichnet.

Die Enzyme haben ein sehr hohes Molekulargewicht. Selbst wenn ψ von den Einheiten des Polymers nur eines von mehreren Hunderten mit dem Enzym sich umsetzt, so entsteht ein Addukt, das eine beträchtliche enzymatische Aktivität hat, und bei welchem der Enzym-Anteil einen wesentlichen Teil des Molekulargewichts des Addukts ausmacht. Wenn mehrere der genannten Einheiten zugegen sind, so kann eine Mehrfachbindung mit erhöhter enzymatischer Aktivität im Addukt erhalten werden» Wie schon ge- / sagt, wiederholen sich die Einheiten in der oben gegebenen Formel, wobei η wenigstens 8 sein soll .Wenn die Einheiten sich wiederholen, so brauchen die Symbole in den einseinen sich wiederholenden Einheiten nicht unbedingt immer dasselbe zu bedeuten. Wenn die Einheiten sich wiederholen, so können

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einige der Gruppen X und Y auch anderes als eine Hydroxygruppe oder Sauerstoff bedeuten. So können einige dieser Gruppen Imidogruppen eein, d.h. solche Gruppen, in welchen X und Y zusammen den Rest -NR- oder -N-W-(NR¹R¹) bilden, wobei R, W und R« die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Eine bevorzugte Art von Polymeren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind solche mit olefinisch ungesättigten Polycarbonsäuren oder Derivaten davon, in etwa äquimolarer Menge mit wenigstens einem der anderen copolymerisierbaren Stoffe. Diese Polycarboxylsäurederivate können beispielsweise Einheiten von Acrylsäure, Acrylsäureanhydrid, Methacrylsäure, Crotonsäure oder ihre Derivate enthalten, einschließlich der Teilsalze, Amide und Ester, wozu auch Maleinsäure, Itaconsäure, Citraconsäure ,o(,o( -Dimethy !maleinsäure, O^ -Butylmal eins äure, </ -Phenylmaleineäure, Fumarsäure, Aconitsäure,O^-Chlormaleinsäure, o(.-Brommaleinsäure, oC-Cyanomaleinsäure und ihre Teilsalze, Amide und Ester gehören. Vorzugsweise verwendet man Anhydride der oben genannten Säuren.

Zu den Monomeren, die mit diesen Verbindungen copolymerisiert werden können, gehören^-Olefine wie Äthylen, Propylen, Isobutylen, 1- oder 2-Buten, 1-Hexan, 1-Octan, 1-Decen, 1-Dodecen, 1-Octadecen und andere monomere Vinylverbindungen wie Styrol,C<-Methylstyrol, Vinyltoluol, Vinylpropionat, Vinylamin, Vinylchlorid, Vinylformiat, Vinylacetat, Vinylalkyläther, beispielsweise Methylvinyläther, Alkylacrylate, Alky!methacrylate, Acrylamide und Alkylacrylamide, oder Mischungen dieser Monomeren. Die Reaktivität einiger Gruppen in diesen Copolymeren erlaubt die Bildung anderer brauchbarer funktlonelier Gruppen in dem fertigen Copolymer, z.B. von Hydroxy-, Lacton-, Amino- und Lactam-Gruppen.

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Jedes der Derivate dieser mehrbasischen Säuren kann copolymerisiert werden mit jedem der oben bezeichneten Monomeren, oder mit einem anderen Monomer, das ein Copolymer mit einer zweibasischen Säure oder ihrem Derivat bildet. Die mehrbasischen Säurederivate können Copolymere nLt verschiedenen Comonomeren sein, in welchem Falle die Gesamtmenge der Comonomeren vorzugsweise etwa äquimolekular ist mit dem Derivat der mehrbasischen Säure, Diese Copolymere können durch direkte Polymerisation der Monomeren hergestellt werden, sie werden aber in der Regel leichter hergestellt durch eine nach der Umsetzung vorgenommene Modifikation eines entstandenen Copolymers·

Copolymer® von Anhydriden und anderen Monomeren können in

uppen. enthaltende Copolymere übergeführt werden durch mit Wasser« Ihre Sal^® ait Ammonium,, Alkalimetallen

siliaütallen und ihre Alkylaminsalze können gewonnen lasetzung mit Alkalimetall^©^indungen, Erdalkali™

metallverbindungen, Aminen, Ammoniak usw_{e 9} entweder vor, währemä oder nach-der Bindung der Enzyme„

Zu den foratachbsren Derivaten der oben genanntes Polyaere gehören Teil-Allylester eier andere Tell@ste? und fQÜamiäe, Alkylamide_s Diallsylamit©, MiGBjlalkylamid© ©eier Tfaenjlemi&e, die durch Umeetzirag der OasOosylgnipp-sa der Folymerlcette mit den "betreffen-. üoii AmiiiQn oööe¹ Ällcyl- oö@r Phenylallcyl-Alkoholen, ebenso mit äca /i.miiioestes?a, AaiaoasiäeE^ EjüToiijmmlden und Hydroxy estern a Ιγ9?κι®ε₅ uo'ögI &±q tmsktioiiellen Gruppen durch

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ebenfalls zugegen sein. Besonders wertvoll sind solche Derivate, in welchen die negativ geladenen Carboxylgruppen teilweise ersetzt sind durch Amino- oder Amino-Salz-G-ruppen. Diese werden gebildet durch Reaktion der Carboxylgruppen mit Polyaminen wie Dimethylaminopropylamin oder Dialkylaminoalkoholen wie Dimethylaminoäthanol, wobei die ersteren eine Amidbindung mit dem Polymer und die letzteren eine Esterbindung mit dem Polymer eingehen. Durch geeignete Auswahl dieser Derivate kann man verschiedene Verhaltensparameter für die erfindungsgemäßen Addukte regeln.

Repräsentative Copolymere aus zweibasischen Säuren oder ihren Anhydriden mit Olefinen, insbesondere von Maleinsäure "oder ihrem Anhydrid, sind bekannt. Die verwendeten Copolymere enthalten vorzugsweise etwa äquimolekulare Mengen des Olefinrestes und des Anhydridrestes. Der Polymerisationsgrad liegt in der Regel zwischen 8 und 10 000, vorzugsweise zwischen 100 und 5 000, und die Copolymere haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1 000 bis 1 000.000, vorzugsweise von 10 000 bis 500 000. Zahlreiche dieser Polymere sind im Handel erhältlich. Besonders wertvoll sind solche Copolymere, die Äthylen und Maleinsäure in etwa äquimolekularen Mengen enthalten. Das Produkt ist im Handel erhältlich.

Die Copolymere mit Maleinsäureanhydrid enthalten sich wiederholende Anhydridbindungen in dem Molekül, die durch Wasser leicht zu der Säure hydrolysiert werden. Die Hydrolysengeschwindigkeit ist proportional der Temperatur. Da die erfindungsgemäßen Umsetzungen in wässrigen Lösungen oder Suspensionen durchgeführt werden, oder unter Verwendung von Wasser enthaltenden Gemischen von Lösungsmitteln, so sind die Enzyme über

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Carboxyl- oder Carboxylat-Gruppen mit dem Polymer verbunden, da die Anhydridgruppen, die nicht mit den Enzymen reagieren, während der Umsetzung hydrolysiert werden. Sasselbe trifft auch zu auf nicht reagierende Anhydridgruppen in anderen Polymeren, z.B. in den oben erwähnten, wo ebenfalls die Carboxyl- oder Carboxylat-Gruppen während der Umsetzung hydrolysiert werden.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Enzym kann einer geeigneten Quelle entstammen. Es kann eine oder mehrere neutrale oder alkalische Proteasen, Papain, Asclepain, Bromelin, Bromelain, Trypsin, Chymotrypsin oder dergleichen enthalten. Es kann ferner eine Amylase und/oder eine Lipase enthalten. Auch eine Carbohydrase, Esterase, Fuclease oder eine andere Hydrolase kann als Ausgangsenzym verwendet werden. Ebenso kann man eine Hydrase, Oxydoreduktase oder eine Demolase, eine Transferase oder eine Isomerase verwenden," was von der gewünschten Aktivität und dem Anwendungsbereich abhängt. In jedem Falle werden das oder die Enzyme erfindungsgemäß durch Valenzbindungen mit dem Polymer unter Bildung wasserlöslicher Addukte gebunden.

Zahlreiche Enzyme sind bekannt und können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Viele dieser Enzyme sind im Handel erhältlich und tierischen, pflanzlichen oder mikrobischen Ursprungs. Viele Enzyme werden durch mikrobische Fermentation erhalten, z.B. von Bakterien, hierbei können die gut bekannten Permentationsverfahren verwendet werden, wie sie "beispielsweise im Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Si echo ©logy 8, 173-204 beschrieben werden.

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Sie genaue Aktivität der als Ausgangsmaterial verwendeten Enzyme hängt ab von dem Gewinnungsverfahren und ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Wichtig ist lediglich, daß das Addukt die gewünschte mehrfache enzymatisch^ Aktivität hat. Es gibt verschiedene Analysenverfahren, um die Aktivität von enzymatisch aktivem Material zu bestimmen, z.B. kann die Froteaseaktivität von proteolytischen Enzymen mittels der bekannten Verfahren zum Abbau von Kasein bestimmt werden. Bei isaein Verfahren katalysiert die Protease die Hydrolyse von Kasein während einer bestimmten Zeitdauer, einer bestimmten Temperatur und bei einem bestimmten pH-Wert. Die Umsetzung wird gestoppt durch"Zusatz von Triohloressigsäure, worauf man die Lösung abfiltert* * Farbe des filtrate wird durch ein phenolisches Reagenz nach Polin entwickelt, und der Grad der enzymatischen Aktivität wird spektroskopisch in Einheiten von Kasein-Tyrosin gern ssn* Dieses Verfahren ist beschrieben in* Journal of General Physiology 30, 291 C 947) im«! in iifrfö-.j of Sasymology 2, 33 bsi Academic Preee Μ.Ϊ. (1955)- S;^:«s 4Jc¹;!?^:** vm laiylase wird in der Regel nach dem Ysrfahr^ ■■··■<·:<& '■■■ i^.il.*lü £'-■'■ Dinitrosalicylsäure bestimmt. Es sind auch noch anatas fevirsn bekannt, und einige davon werden weiter unten beschrieben.

Eine besonders'gute Quelle für Enzyisgämische_s die erf £il rrn gemäfl als Ausgangsmaterial verwendet werden s'uwamn_t ist e Ln mutierter Bazillus subtilis. Das Verfahren sir Herstellung dieses Organismus und zur Gewinnung von Enzymes Smraus ist in der USA-Patentschrift 3 031 380 beschrieben, Sin© Kteltur des Stammes AM von Bazillus subtilis ist niedergelegt te Suited States Department of Agriculture, Agricultural leseastr?: Service, Northern Utilization Research and Development- 3ivia£.r::_: 1815 Horth University Street* Pec:.ia.- lllino-ls 61604 τ:::.' :.:vz

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die Nr. NRlL B-3411 erhalten. Die aus diesem Material gewonnenen Enzyme bestehen in der Regel aus zwei Proteasen, nämlich etwa 65 bis 75 # einer neutralen Protease mit einer Aktivität bei einem pH-Bereich von 7,0 bis 7,5 und etwa 25 bis 35 # einer alkalischen Protease mit einer Aktivität innerhalb eines pH-Bereiches von 9 bis 10. Bedeutende Mengen von Amylase sind ebenso vorhanden. Die neutrale Protease hat in der Regel eine Aktivität von etwa 700 000 bis etwa 1,2 Millionen Einheiten je Gramm isolierter Pe st stoffe, und die alkalische Protease hat eine Aktivität von etwa 250 000 bis etwa 400 000 Einheiten je Gramm. Beide Aktivitäten können durch das Verfahren von Kunitz mit der Variante von Anson bestimmt werden. Die vorhandene Amylase hat in der Regel eine Aktivität von etwa 300 000 bis 350 000 Einheiten je Gramm, bestimmt nach dem Verfaliren von Bernfeld. Wie auch die erwähnte Patentschrift ausflüirts schwanken die Mengenverhältnisse der Protease zu der Amylase in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen des Mikroorganismus. In jedem Falle werden aber neutrale und alkalische Protease und Amylase in gewissen Mengen erzeugt, fast unabhängig von Änderungen des Kulturmediums und den anderen Wachstumsbedingungen des Mikroorganismus. Das Aktivitätβverhältnis der alkalischen Protease zu der neutralen Protease in den Ausgangsstoffen und in &®m Addukt liegt vorzugsweise zwischen 0,25 s 1 bis 1,2 s 1.

Eine andere Quelle für gemischte Enzyme, die erfindungsgemäß als Äusgangsmatsrial verwendet werden können, ist B. subtilis, Stamm HRRL 644, B. subtilis Stamm NRRL 941 und B. subtilis Stamm IAM 1523, japanische Kultur. Es gibt auch noch andere Stämme des B. subtilis, die Protease, eine Mischung von Proteasen, oder Protease und Amylase, wenigstens teilweis©

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wenn auch nicht in optimaler Menge, erzeugen. Die neutrale Protease aus dem sog. Streptomyces griseus hat eine Aktivität innerhalb eines weiten pH-Bereiches und kann als Ausgangsmaterial für die Erfindung verwendet werden.

. Versuchsbedingungen

In der Regel läßt man kalte Lösungen von Enzymen in geeigneten Pufferlösungen über Nacht bei 4 C mit einer kalten homogenisierten Suspension des Polymers, z.B. von EMA, reagieren. Vorzugsweise wurde EMA-21 verwendet, das ein Molekulargewicht von etwa 20 000 bis 30 000 hat. Es können aber auch Polymere mit anderen Molekulargewichten gebraucht werden. So hat beispielsweise EMA-11 ein Molekulargewicht von etwa 2 000 bis 3 000 und EMA-31 ein Molekulargewicht von etwa 60 000. Die Abtrennung von löslichen und unlöslichen Addukten nach der Umsetzung geschieht durch Schleudern in der Kälte in einer Zentrifuge (Sorval SS-3 (!EM) mit etwa 10 000 U/Min, während etwa 10 Minuten. Die löslichen Addukte wurden in der Kälte sorgfältig gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Unlösliche Addukte wurden ausgewaschen und abgeschleudert, in der Regel zehnmal mit einer kalten Pufferlösung und fünfmal mit kaltem destillierten Wasser, worauf sie lyophilisiert wurden.

Die Umsetzung des Polymers mit den Enzymen kann entweder schrittweise, unter Verwendung eines Enzyms nach dem anderen, mit oder ohne zwischenzeitliche Isolierung durchgeführt werden, oder aber man kann alle Enzyme gleichzeitig einwirken lassen. Aus zeitlichen, wirtschaftlichen und arbeitstechnischen Gründen wird das letzte Verfahren bevorzugt.

Beispiele 1 bis 3. Lösliche Addukte von EMA mit Trypsin

Trypsin (Worthington Biochemical Co.) wurde kalt gelagert und in erhaltenem Zustande verwendet. EMA-21 wurde in die Anhydridform übergeführt durch 15-stündiges Erhitzen bei 105⁰G im Vakuum, bis eine Gewichtskonstanz erreicht war. Dann wurde es bis zum Gebrauch in dichten Behältern bewahrt. BAEE (Benzoylargininäthylester) wurde von der Firma Mann Laboratories bezogen und in der erhaltenen Form verwendet. RNase (Ribonuclease vom Rinde) wurde von der Firma Worthington Biochemical Go. bezogen und in dieser Form verwendet.

Bei einem typischen Versuch löste man 500 mg Trypsin in 15 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5. 1,00 g EMA wurde in einem Mischer etwa 1 Minute lang mit 100 ml einer kalten Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7»5 homogenisiert. Man gab die Lösungen zusammen und rührte das Gemisch bei 4°C 12 bis 15 Stunden. Dann zentrifugierte man das Gemisch in der Kälte 10 Minuten lang bei etwa 10 000 U/Min, in einer Sorvall SS-1-Zentrifuge.

Die überstehende Flüssigkeit wurde dann von dem sedimentierten vernetzten Addukt von Trypsin und EMA (IMET) getrennt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde erschöpfend dialysiert gegen entionisiertes Wasser bei 4°C, um Phosphationen zu entfernen. Bei dem Lyophilisieren des dialysierten Materials entstand das rohe Endprodukt. Das Verhältnis von löslichem zu unlöslichem Addukt und der Proteingehalt des Addukts ändert sich mit dem Verhältnis von Trypsin zu EMA, wie die Tabelle 1 zeigt.

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Zum Reinigen werden etwa 100 mg rohes SEMAT In einer kleinen Menge einer 10 jiigen Zuckerlösung, die hinsichtlich Phosphat 0,2-molar ist, und einen pH-Wert von 7,5 hat, gelöst. Man bringt die Lüftung in eine 5 x 40 cm große Kolonne mit Sephadex G-100 und bringt zum Gleichgewicht mit einer phosphatisehen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5. Das Bluieren wurde in üblicher Art durchgeführt und die Fraktionen wurden gesammelt. Das Sluant wurde gesammelt, dialysiert und lyophilisiirt und ergab SEMAT als Endprodukt.

Die Vollständigkeit des SEMAT ergab sich durch Chromatographie von physikalischen Gemischen aus Trypsin und HEMA. (hydrc*⁵⁵ "^rtes BMl), hierbei entstand eine verworfene Fraktion mit einem sehr niedrigen Proteingehalt, was durch UV-Absorption bei 280 mu bzw. 215 mu gezeigt werden konnte, und mit einem niedrigen Stickstoffgehalt von weniger als 0,2 96. Die Elektrophorese von scheibenförmigem Gel sowohl gegen sinen positiven wie auch gegen einen negativen Pol ergab ein® Wandeimag und keine färbbaren Banden mit gereinigtem SEMAT. Dagegen ©rgeb eia Gemisch von Trypsin und HEMA eine Bande mit einem R«, öl® etwa identisch war der Bande aus nativem Trypsin. SEMAT gab eine Färbung nit Amido-Schwäre, wenn dieses dem unteren Gel zugesetzt wurde, das man dann polymerisierte und färbte.

Muster von SEMAlT wurden in einer 0,2-molaren Phosphat-Pufferlösung oder in einer 0,1-molaren Lösung von KCl gelöst. Man ließ diese Lösungen entweder bei Raumtemperatur oder bei etwa 4⁰C stehen. Lösungen von Trypsin wurden in ähnlicher Weise hergestellt und ähnlich behandelt, wie die Lösungen von SEMAT.

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Die Aktivität der Muster von SEMAT und Trypsin wurde so geprüft, daß man ihre Aktivitäten gegen die Hydrolyse von BAEE bestimmte und feststellte, ob es sich um eine Reaktion nullter Ordnung handelte. Die Lösungen wurden anfänglich so eingestellt, daß sie etwa die gleichen Aktivitäten hatten oder Aktivitäten, die auf äquivalenten Gehalten an Protein beruhten. Die Aktivität wurde als Punktion der Zeit (Tage) gemessen. Bei gereinigtem SEMAT waren 65 $> der ursprünglichen BAEE-Aktivität noch nach 17 Tagen in Lösungen von Raumtemperatur erhalten geblieben. Demgegenüber hatte eine Lösung von Trypsin weniger als 10 # der ursprünglichen Aktivität nach 8 Tagen bei Raumtemperatur. Bei einem anderen Versuch hatte ein Präparat aus ungereinigtem SEMAT etwa 60 # der ursprünglichen BAEE-Aktivität nach 28 Tagen in Lösung bei Raumtemperatur.

Die kinetischen Parameter, K_ und V__Q„, für SEMAT und Trypsin mit BAEE als Substrat, sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Die Aktivitäten der Muster von SEMAT und Trypsin wurden gemessen durch Bestimmung der Hydrolysengeschwindigkeit von BAEE, gemessen durch die Änderung der Absorption bei 255 mp (Tabelle 3)

Tabelle 3

Maximale Aktivität von löslichem Addukt aus Trypsin und EMA. gegen BAEE bei verschiedenen pH-Werten (Tris Puffer auf einen pH-Wert von 9, Carbonate und Bicarbonate Puffer auf einen pH-Wert über 9)

pH Trypsin SEMAT

6,9 83 30

7,2 90 45

7,6 95 65

8,0 — 80

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⁴Lf

- 21 -

pH	Trypsin	SEMA.T
8,3	100	95
8,9	—	100
9,5	90	96
10,9	73	97

Unerwarteterweise erstreckt sich, der optimale pH-Wert von SEMA.T in höhere pH-Bereiche, im Gegensatz zu nativem Trypsin.

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Tabelle 1

SEMAT (mg)

Präparate von SEMAT

Trypsin EMA-21 Rohaus- Menge des chro- , (mg), beute % N^a matographierten Ausbeute (mg) Rohproduktes*⁵ (mg)

(mg)

Phosphat
N^a Puffer, pH
7,5 M

Aktivität
Einheiten/Sek,/

mg^c χ

102

254 509 509

500 TOOO 291 2,83 250 501 203 8,36

105

101

102

3,50

3,86

0,2
0,2

0,02
0,02

0,2
0,2

3,14

3,95

aktiv
aktiv

3,16

a — bezogen auf Trockengewicht

b - Das rohe Endprodukt wurde auf Sephadex G-IOO chromatographxert (vernetztes Dextran; eine phosphatische Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5); das Endprodukt wurde Fraktionen aus dem Leer-Volum (void volume) entnommen.

c - £ur Bestimmung der Aktivität wurde ein BAEE-Sübstrat (etwa 1,3 bis 2,7 x 10 jM) verwendet. Die Aktivität von Trypsin unter vergleichbaren Bedingungen entspricht 1,6 χ 1"δ""~ Einheiten/ Sek./mg. Die Versuche wurden bei einem pH-Wert von 9>5 unter Verwendung von Carbonat ,und Bicaröonat durchgeführt.

cn cn co ο

Tabelle 2

Hydrolyse von BAEE, katalysiert von Trypsin und SEMAT pH 9,5 (0,1 M Carbonat/Bicarbonat)

	Enzym M x 10'	Sn (BAEE) M0X 104	M x To5	Mol/8t$. χ 105
öTrypsin	0,655	9,284	1,84	1,06
cogereinigt ο» WSEMAT ^ungereinigt	2,70 Jo	9,284 9,284	2,0 1,80	0,96 . 0,69
!^Trypsin, SpH 8,OC	-	7,0	8	-

a - Unter Verwendung von 2,6 χ ΙΟ""⁴" g SEMAT, in welchem 24 i° Protein als Trypsin enthalten sind -t> (3,89 * N); . cn

wirksame Enzymmenge = 0,625 x 10 g Protein

b - Unter Verwendung von 2,6 χ 10 g SEMAi¹ ungereinigt
c-H. Neurath und G.W. Schwert, Ghem. Rev. 46, 69 (1950)

g Aue der Gleichung von Michaelis und Menten (siehe Fußnote c) .gibt S die ursprüngliche Konzen-

,L tration des Substrats (BAEE) an, K bedeutet die Konstante nach Micnaelis-Menten, und V bedeutet

g die maximale Geschwindigkeit. ^{m max}

Beispiel 4» Addukt aus Chymotrypsin und EMA.

Zu 240 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatisehen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,3 gab man 1,050 g EMA.-21 zu und homogenisierte während einer Minute. Während dieser Zeit löste man 210 mg kristallines Chymotrypsin in 60 ml kalten destillierten Wassers. Die beiden Lösungen gab man zusammen und rührte magnetisch über Nacht in einem kalten Raum. "Dann schleuderte man das Gemisch ab, um die löslichen und unlöslichen Bestandteile zu trennen. Beide wurden über Nacht lyophilisiert. Die lyophiJLisierten löslichen und unlöslichen Systeme wurden erschöpfend gegen kaltes Wasser dialysiert. Man erhielt 1 441,82 mg eines löslichen Adduktes von Chymotrypsin an EMA (SEMAC) und 792,11 mg eines unlöslichen .Addukte (IEMAC).

Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden 100 mg rohes SEMAC nach Einstellung des Gleichgewichtes mit einer 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH von 7,5 in einer Kolonne über Sephadex (TM) G-100 chromatographiert. Bei der Elution wurden im wesentlichen zwei Spitzen festgestellt, die eine in der Nähe des verworfenen Volums (206 ml) und die andere sich über ein weiteres Volum (etwa 250 bis 350 ml) erstreckend. Die beiden Spitzeneluate wurden gesondert gesammelt, gegen kaltes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Aus der ersten Fraktion erhielt man 17,60 mg, aus der zweiten Fraktion 22,75 mg.

Die ATEE-Aktivitäten von Chymotrypsin und SEMAC (Fraktion I) wurden unter Verwendung eines 0,1-molaren phosphatischen Puffers mit einem pH von 7,4 bestimmt. Für den Versuch wurden 100 Gamma ATEE (25 mg in 1,25 ml destilliertes Acetonitril) zu 3 ml einer phosphatischen Pufferlösung zugegeben. Bei der Zeit Null wurden 100 Gamma der Lösung von Chymotrypsin (0,398 mg Chymotrypsin

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in 1 ml einer phosphatischen Pufferlösung) oder 100 Gamma einer Lösung von SEMAC (12,750 mg SEMA.C in 1 ml einer phosphatischen Pufferlösung) zugegeben. Es wurde die Änderung der optischen Dichte bei 237 mp als eine Punktion der Zeit in einem S>pektrophotometer nach Cary Modell 14 aufgezeichnet. Die Aktivität von Chymotrypsin betrug 0,186 Einheiten/Sek./iOO Gamma» die von SEMAC 0,422 Einheiten/Sek./iOO Gamma. Die Einheiten sind willkürlich und beruhen auf der Änderung der optischen Dichte in der Zeiteinheit. Diese und andere Versuche zeigten, daß das Muster von SEMAC etwa 1-30-Sekunden der Aktivität von natürlichem Chymotrypsin bei diesem pH-Wert und bei dieser Ionenkonzentration hat.

Tabelle 4

Lösliches Addukt aus Chymotrypsin und EMA. Abhängigkeit der maximalen Aktivität gegen ATEE von dem pH-Wert (Pufferlösungen aus Tris und Salzsäure mit pH-Werten von 6,8 bis 9»4 und Pufferlösungen mit Tris mit pH-Werten von 9,4)

fo maximale Aktivität (willkürliche Einheiten der Aktivität)

7,6 8,4 9,0 9,6 10,2

Chymotrypsin	SEMA.C
11	12
100	44
—	95
93	100
89	98

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Unvorhergeselienerweise erstreckt sich der optimale pH-Wert von SEMAC in höhere pH-Bereiche als bei natürlichem Chymotrypsin.

Prüfung der Stabilität von Chymotrypsin, löslichen und unlöslichen Addukten von Chymotrypsin an EMA.

2,00 mg Chymotrypsin, 60,02 mg eines löslichen Addukts von Chymotrypsin und EMA und 30,08 mg eines unlöslichen Adduktes von Chymotrypsin und EMA wurden gesondert in je 2 ml einer 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst, worauf man bei Raumtemperatur stehen ließ. Die Esterase-Aktivitäten wurden während mehrerer Tage gemessen. Diese Aktivitäten wurden gemessen durch Bestimmung der Hydrolysengeschwindigkeit von N-Acetyl-L-tyrosin-äthyl-ester (ATEE) anhand der Änderung der Absorption bei 237 ^mp bXb Punktion der Zeit. Pur die Versuche wurden 100 Gamma einer Lösung von ATEE (40,06 mg in 2 ml Acetonitril) zu 3 ml einer phosphatischen Pufferlösung zugegeben. Die Hydrolyse wurde in Gang gesetzt durch Zugabe von 10 Gamma Chymotrypsin ader des löslichen Addukts von Chymotrypsin an EMA bzw. durch Zugabe von 25 Gamma des unlöslichen Addukts. Nach 2 Tagen bei Raumtemperatur hatte das Chymotrypsin 60 $ der ursprünglichen Aktivität, das unlösliche Addukt von Chymotrypsin und EMA 97 $ der ursprünglichen Aktivität und das lösliche Addukt von Chymotrypsin und EMA 99 i° der ursprünglichen Aktivität. Nach 7 Tagen bei Raumtemperatur hatte das lösliche Addukt 93 $> der ursprünglichen Esterasen-Aktivität.

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Beispiel 5· Addukte von Lipase und Amy läse an EKA.

251,52 mg Lipase (MY-20, TM-Meito-Sangyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) wurden in 25 ml einer 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung gelöst und zu einer homogenisierten Dispersion von 500,61 mg EMA.-21 in 50 ml einer phosphatischen Pufferlösung zugegeben. Man ließ die Mischung über Nacht stehen. Nach Dialyse, Lyophilisieren und Abtrennung erhielt man 506,87 mg eines löslichen Addukte und 111,18 mg eines unlöslichen Addukte.

Pur die Prüfung wurde Olivenöl verwendet. Eine Emulsion wurde wie folgt hergestellt. 20 g Polyvinylalkohol (98 $> hydrolysiert, bezogen von Matheson, Coleman und Bell) wurden in 1 Liter destillierten Wassers bei 75°G bis zum Lösen gerührt. Dann kühlte man und neutralisierte mit NaOH bis auf einen pH-Wert von 7,0. 10 ml Olivenöl und 90 ml dieser Lösung wurden fünf Minuten lang in einem Mischer (Waring Blendor (TM)) homogenisiert, worauf der pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt wurde. Täglich wurde eine frische Suspension hergestellt. Zur Prüfung wurde ein Radiometer pH-stat verwendet. Diese Vorrichtung enthält einen pH-Messer No. 25, einen Titrator No. 11, eine ABUIb (TM) Autobürette, und einen SBR2c (TM) Titigraph. Die Bürette hatte ein Volum von 0,25 ml. 3 ml der Emulsion des Olivenöls wurden bei Raumtemperatur in das Titriergefäß gebracht. Die Umsetzung wurde in Gang gesetzt durch Zugabe von

einer Lösung von
0,25 ml/Lipase oder einer Lösung von 2 bis 4 mg des Addukts je ml, und es wurde die Geschwindigkeit der Aufnahme von 0,01-normaler NaOH-Lösung bestimmt, die notwendig war, um den pH-Wert bei einem konstanten Volum aufrecht zu erhalten. Ein Strom von kohlendioxydfreiem Stickstoff spülte das COp aus der

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- 28. -

Reaktionskammer. Es wurde magnetisch gerührt. Die Hydrolysengeschwindigkeit wurde von dem linearen Teil der Titrieraufzeichnung abgelesen und ausgedrückt in u Mol Fettsäure, die je Minute von einem mg Enzym freigesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle enthalten.

Muster pH 7 pH 6

Lipase^a 0,48 0,20/0,22

Lösliche EMA/Lipase^a 0,003

Unlösliche EMA/Lipase^a 2,0-4,0^b 2,2/2,7

Eine Reinigung des rohen Enzyms, die während der Bindung an das Polymer stattfindet, trägt bei zur hohen Aktivität der unlöslichen Bestandteile.

a - Das Gewicht beruht auf Protein und Lipase; das Muster hatte ein Gesamtgewicht für Lipase und EMA..

b - Die Versuchswerte lagen bei 2 bis 4 Mol/Min./mg bei verschiedenen Mustern. Die Werte waren aber innerhalb jedes einzelnen Musters reproduzierbar. Pur diese Anomalie kann keine Erklärung gegeben werden.

Die Lipase-Aktivitäten wurden für Lipase und unlösliche Addukte aus Lipase und EMA. bestimmt unter Verwendung der Emulsion von Olivenöl. Kurz vor der Prüfung wurde der pH-Wert der Emulsion eingestellt durch Zugabe von 0,1- oder 0,01-molarem Natriumhydroxyd. Bei entsprechenden pH-Werten wurde die gleiche Emulsion für die Prüfung der Lipase und des Addukte verwendet. Bei höheren pH-Werten wurde eine Korrektur vorgenommen, um eine durch Basen katalysierte Hydrolyse zu berücksichtigen. Man nahm die ursprünglichen Neigungen und zog diese Werte von der

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Nullordnung der Reaktion ab. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 enthalten.

Ebenso wie bei dem vorhergehenden Beispiel wurde ein Addukt von Amylase aus B. subtilis AM und EMA-21 hergestellt. Bei verschiedenen Versuchen schwankte die amylolytische Aktivität der löslichen und unlöslichen Addukte von Amylase und EMA zwischen 44 und 72 $ des ursprünglichen nativen Enzyms.

Tabelle 5

Lipase-Aktivität gegen pH
(Aktivität in Mol/Min./mg χ 1O⁵)

Unlösliche pH Iiipase Lipase-EMA

0,23* 2,7*

0,21 2,2

1,5 5,3

1,9 5,3

2,9 5,6

2,9 5,5

2,9 5,4

2,9 5,3

2,2 3,8

2,0 3,9

*) Der Versuch wurde wiederholt.

Beispiel 6. Addukt von Gellulase und EMA

4,001 g Cellulase (Cellosin AP, TM-Nomoto Go., Japan) wurden zu 60 ml kaltem Wasser gegeben, worin sie sich unvollständig lösten. Dieses Gemisch wurde zu einer Suspension von 1,001 g

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EMA-21 in 240 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,48, das eine Minute lang homogenisiert war, zugegeben, worauf man die Mischung über Nacht bei 4°C rührte. Man schleuderte das Gemisch ab, dialysierte die überstehende Flüssigkeit und das Unlösliche erschöpfend gegen Wasser und lyophilisierte. Erhalten wurden 0,9997 g eines löslichen Addukts von Cellulase und EMA. und 1,8786 g P eines unlöslichen Addukts.

Die Versuche wurden nach dem Verfahren von Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, durchgeführt. Es wurde die Menge freigesetzter Glucose in der Zeiteinheit bestimmt, wobei ein Glucostat der oben erwähnten Firma verwendet wurde.

Für die Versuche wurde eine abgewogene Menge von Cellulase oder des Addukts von Cellulase und EMA zu einer 0,05-molaren Lösung von Natriumacetat gegeben und gegebenenfalls gerührt und verdünnt.

Als Substrat wurde eine Lösung von 1,200 g Carboxymethyl-" cellulose, !Typ 70 Premium von der Hercules Powder Co. in 80 ml einer heißen 0,05-molaren Citrat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 gelöst. Nach dem Lösen kühlte man die Lösung und ergänzte das Volum auf 100 ml. Hiernach lag der pH-Wert bei etwa 4.

Es wurden wässrige Lösungen hergestellt, die D-Glucose in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 0,3 mg je ml enthielten.

Zur Herstellung von glucOstatischen Lösungen wurde Chromagen (TM) als Farbentwickler in destilliertem Wasser gelöst, worauf

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- 31 -

das Volum auf 60 ml eingestellt wurde. Das Glucostat (TM) wurde in dieser Lösung gelöst, worauf das Volum auf 90 ml eingestellt wurde.

Testlösungen wurden hergestellt durch Zugabe von 1 ml der Enzymlösung zu 10 ml des Substrats. Von jedem Gemisch wurde 1 ml verwendet. Die Standardlösungen waren aliquote Mengen von 1 ml der Grlucoselösungen. Zu dem Umsetzungsgemisch gab man 9 ml des glucostatlachen Reagenz hinzu· Man ließ die Umsetzung während einer Stunde bei Raumtemperatur fortschreiten, worauf man sie dann durch Zugabe eines Tropfens von 4-normaler Salzsäure stoppte. Nach 10 Minuten wurde die optische Dichte der Lösungen bei 400 mu gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle enthalten.

Aktivität g Glucose/St./mg Enzym-System

Cellulase in AP (TM)

(handeleübliche Cellulase) 0,048

Unlösliche Oellulase/EMA 0,014

Lösliche Cellulase/EMA 0,157

Die hohe Aktivität des löslichen Addukte beruht auch darauf, daß das rohe Enzym bei der Bindung an das Polymer gereinigt wird.

Beispiel 7. Unlösliche und lösliche Addukte von neutraler und alkalischer Protease aus B. subtilis und EMA

200 mg alkalischer und neutraler Protease von B. subtilis wurden in 50 ml einer kalten Lösung gelöst, die hinsichtlich Phosphat 0,01-molar und hinsichtlich Calciumacetat 0,01-molar war, und einen pH-Wert von 7,5 hatte. Diese Lösung gab man zu einem kalten homogenisierten Gemisch von 100 mg EMA-21 in 50 ml einer

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0,1-molaren Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7 »5. Man rührte die Mischung über Nacht "bei 4⁰C und trennte durch Abschleudern das unlösliche Material von der überstehenden Flüssigkeit. Die Feststoffe wurden fünfmal mit einer kalten 0,1-molaren Lösung von Natriumchlorid und zweimal mit Wasser gewaschen. Dann wurde lyophilisiert. Man erhielt einen Feststoff, der 38 # der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease und 52 <$> der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease hatte.

Die überstehende Lösung wurde gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Man erhielt einen löslichen Feststoff mit 47 $ der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease und 59 % der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease.

Beispiel 8. Unlösliche und lösliche Addukte von neutraler und alkalischer Protease und Lipase von B. subtilis und EMA

4-00 mg neutraler und alkalischer Protease von B. subtilis und 400 mg Lipase (Lipase-MY (TM) Meito-Sangyo Co., Japan) wurden in 300 ml einer kalten Lösung gelöst, die hinsichtlich Phosphat 0,2-molar und hinsichtlich Calciumacetat 0,01-molar war, und einen pH-Wert von 7,5 hatte. Zu dieser Lösung gab man ein kaltes homogenisiertes Gemisch von 200 mg EMA-21 in 100 ml einer 0,1-molaren Phosphatlösung mit einem pH von 7,5. Man rührte das Gemisch über Nacht bei 4 C. Dann trennte man die überstehende Flüssigkeit von dem Unlöslichen durch Abschleudern. Die Feststoffe wurden mit 0,1-molarer Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Man erhielt einen Feststoff mit 35 # der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease, 47 i» der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease und 72 $> der ursprünglichen Aktivität der Lipase.

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Bei der Dialyse der ü"berstehenden Flüssigkeit gegen kaltes destilliertes Wasser und bei der nachfolgenden Lyophilisierung erhielt man einen löslichen Peststoff, der 43 f» der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease, 56 $ der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease und 17 $ der ursprünglichen Aktivität der Lipase hatte.

Beispiel 9. Addukt aus Oxynitrilase und EMA.

Oxynitrilase wurde aus bitteren Mandeln nach dem Verfahren Von Pfeil und Becker, J. Am. Chem. Soc. 88, 4299 (1966) gewonnen. Das rohe durch Ausfällen mit Äthanol erhaltene Enzym wurde vor der Verwendung aus Sephadex rechromatographiert. 307»60 mg Oxynitrilase wurden in 150 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst. 613,12 mg EMA-21 wurden in einem Mischer eine Minute lang mit 60 ml einer kalten phosphatischen Pufferlösung homogenisiert. Zu diesem Homogenisat gab man 10 ml einer 1 $igen Lösung von Hexamethylendiamin in Wasser zu und rührte das Gemisch 2 Minuten lang. Hierauf gab man die Lösung der Oxynitrilase zu und rührte über Nacht bei 4°0. Dann schleuderte man das Gemisch ab, um die überstehende flüssigkeit von den Feststoffen zu trennen. Die Peststoffe wurden fünfmal mit einer kalten phosphatischen Pufferlösung und anschließend achtmal mit kaltem Wasser gewaschen. Die Feststoffe und die überstehende Flüssigkeit wurden dann dialysiert und lyophilisiert. Man erhielt 428 mg eines löslichen Addukte von Oxynitrilase und EMA und 838,07 mg eines unlöslichen Addukte von Oxynitrilase und EMA.

Das unlösliche Addukt enthielt 3,60 bzw. 3,68 # N.

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Die Aktivitäten wurden bestimmt durch Messung der optischen Rotation als Funktion der Zeit unter Verwendung eines Perkin-Elmer Modell'141 Polarimeter mit einer Zelle von 1 Dezimeter, und zwar "bei der D-Linie von Natrium.

Crotonaldehyd und Natriumcyanid

Zu 5 ml einer Lösung von 7,6g Natriumcyanid in 250 ml destilliertem Wasser gab man 6-normale Essigsäure zu, um den pH-Wert auf 5,4 einzustellen. Dann fügte man 1 ml einer Aufschlämmung von 10 mg des Addukte aus Oxynitrilase und EMA in 2 ml Wasser zu. Bei der Zeit Null fügte man 5 ml einer Lösung von 7 g Crotonaldehyd in 250 ml destilliertem Wasser zu, und rührte die Mischung einige Minuten lang vor dem Aufzeichnen der optischen Rotation.

Nach 5 Minuten betrug die optische Rotation cK^ -0,048, was anzeigt, daß das Addukt aus Oxynitrilase und EMA die Bildung von optisch aktivem Cyanhydrin des Crotonaldehyds katalysiert.

\ Versuche mit löslichen Addukten aus Oxynitrilase und EMA

10 mg eines löslichen Addukts aus Oxynitrilase und EMA wurden in 2ml destilliertem Wasser gelöst. Man löste 3,5g Crotonaldehyd in 125 ml Wasser. Ferner wurden 3,8 g Natriumcyanid in 125 ml kaltem Wasser gelöst, worauf der pH-Wert mit 6-normaler Essigsäure auf 5,4 eingestellt wurde. Zu 5 ml der Oyanidlösung gab man 1 ml der Lösung des löslichen Addukts aus Oxynitrilase und EMA. Bei der Zeit Null gab man 5 ml der Lösung von Crotonaldehyd zu der Mischung. Die Rotation in negativen Milligrad als Funktion der Zeit in Minuten wurde in einer Vorrichtung nach Perkin-Elmer Modell I4I gemessen,

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die eine Quarzzelle von 1 Dezimeter hatte. Nach 2 Minuten betrug die Rotation <AJ₃₎-O,272, nach 5 Minuten oOjj-0,317 und nach 10 Minuten oQjj-0,371. Diese Werte zeigen, daß das lösliche Addukt von Oxynitrilase und EMA die enzymatische Aktivität des ursprünglichen Enzyms zur Umwandlung von HCN und Crotonaldehyd in ein optisch aktives Crotonaldehydcyanhydrin hat.

Beispiel 10. Addukt aua Asparaginase und EMA

13,55 mg einer Asparaginase von Worthington mit 20 Einheiten/mg wurden in 10 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst. 50,28 mg EMA-21 wurden 45 Sekunden lang mit 50 ml einer phosphatisehen Pufferlösung homogenisiert. Dann gab man zusammen mit 15 ml einer kalten Pufferlösung 0,5 ml einer 1 #igen Lösung von Hexamethylendiamin zu und rührte 45 Sekunden. Hiernach gab man die kalte Lösung der Asparaginase zu und rührte das ganze gemisch über Nacht bei 4°C. Beim Aufarbeiten in üblicher Weise durch Abschleudern, Dialyse und Lyophilisieren erhielt man 25,29 mg eines löslichen Addukts von Asparaginase und EMA und 57,55 mg eines unlöslichen Addukte von Asparaginase und EMA.

Zur Prüfung würde das Verfahren der Worthington Biochemical Corp. verwendet. Die Enzyme und die löslichen und unlöslichen Addukte wurden in einer Konzentration von 1 mg in 1 ml einer physiologischen Salzlösung verwendet. Als Substrat wurde eine 0,01-molare Lösung von L-Asparagin in einer 0,05-molaren Lösung von Tris-HCl/l;ris(hydroxymethylaminomethan)hydrochloridj mit einem pH-Wert von 8j6 verwendet. Eine Lösung mit 1,7 ml des Substrats und 0,2 ml des Puffers wurde bei 37⁰C inkubiert. Bei der Zeit Null gab man 0,1 ml des Enzyms oder

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der Lösung des Addukte zu und inkubierte 10 Minuten lang bei 37°C. Danach gab man 0,1 ml einer 1,5-molaren Lösung von Trichloressigsäure zu, schleuderte das Gemisch ab und gab 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit in 7,0 ml Wasser, darauf 1,0 ml Nessler's Reagenz. Nach 10 Minuten wurde die Absorption bei 480 mp abgelesen. Zum Vergleich-wurde einem Muster des Substrats vor der Zugabe des Enzyms die Trichloressigsäure zugesetzt. Standardlösungen waren Lösungen von Ammoniumsulfat, die 0,5 bis 0,1 ρ Mol Stickstoff je 0,5 ml enthielten.

Bei einem pH-Wert von 8,6 hatte die Asparaginase eine Aktivität von 71 Einheiten/mg Protein, das unlösliche Addukt von Asparaginase und EMA eine Aktivität von 1,5 Einheiten/mg Gesamtgewicht und das lösliche Addukt von Asparaginase und EMA eine Aktivität von 27 Einheiten/mg Gesamtgewicht.

Das lösliche Addukt von Asparaginase und EMA enthielt 5,48 $ N, bezogen auf das Trockengewicht.

Beispiele 11 und 12. Addukte von Pepsin und EMA

(A) Pepsin und EMA im Verhältnis von 1:1. 201,03 mg Pepsin (Sigma Chemicals; 1:60 000) wurden in 150 ml einer kalten, 0,2-molaren Acetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,0 gelöst. Diese Lösung gab man zu einem Gemisch von 203,41 mg EMA-21 in 50 ml einer kalten Pufferlösung, das 1 Minute lang homogenisiert worden war. Man rührte das kombinierte Gemisch über Nacht bei 4°C. Die überstehende Flüssigkeit und die Feststoffe wurden durch Abschleudern getrennt. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert. Die Feststoffe wurden zweimal mit kaltem Wasser gewaschen und dann über Nacht dialysiert. Anschließend lyophilisierte man

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die überstehende Flüssigkeit und die Feststoffe. Es wurden 129,35 mg eines löslichen Addukts von Pepsin und EMA. mit einem Stickstoffgehalt von 7,25 $, "bezogen auf Trockengewicht, und 32,20 mg eines unlöslichen Addukts von Pepsin und EMA. mit einem Stickstoffgehalt von 1,16 $, bezogen auf Trockengewicht, erhalten. Beim Waschen der Feststoffe mit puffernden Lösungen von Natriumchlorid entstanden anscheinend disperse Gele.

(B) Pepsin:EMA im Verhältnis von 4:1. Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens ließ man eine Lösung von 403,38 mg Pepsin in 100 ml einer kalten 0,05-molaren acetatischen Pufferlösung reagieren mit 101,21 mg EM, das in 125 ml einer kalten acetatischen Pufferlösung homogenisiert war. Die abgetrennten Feststoffe wurden nach dem Abschleudern zweimal mit Wasser gewaschen und dann dialysiert, ebenso wie die überstehende Flüssigkeit. Nach dem Lyophilisieren der beiden Fraktionen erhielt man 226,39 mg eines löslichen Addukts von Pepsin und EMA mit einem Gehalt von 12,2 $ Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht, und 68,11 mg eines unlöslichen Addukts von Pepsin und EMA. mit einem Gehalt von 0,32 ^ Stickstoff, bezogen auf Trockengewicht.

Die Prüfung wurde wie folgt durchgeführt. 2,5g Hämoglobin wurden zu 100 ml destilliertem Wasser gegeben. Man homogenisierte 30 Sekunden lang und filterte dann durch Glaswolle. Der pH-Wert wurde durch Zugabe einer geeigneten Pufferlösung eingestellt. Die Prüfung des Pepsins und der Addukte von Pepsin und EMA. wurden nach dem Verfahren der Worthington Biochemical Corp. durchgeführt. Hierbei wird die Hydrolyse des Hämoglobins in der Zeiteinheit bei 37°C gemessen durch die optische Dichte bei 280 mu des in Trichloressigsäure löslichen Materials. Die Aktivitäten werden ausgedrückt in Einheiten je mg Pepsin oder

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mg des Adduktes von Pepsin und EMA.. Eine Einheit entspricht einer Absorption bei 280 mu eines in Trichloressigsäure löslichen Hydrolysenprodukts von 0,001 je Minute bei 37⁰G.

Die Aktivität bei verschiedenen pH-Werten. Die Versuche wurden durchgeführt zur Bestimmung der Aktivitäten in Abhängigkeit vom pH-Wert. Als Puffer wurden verwendet Lösungen von HGl und KCl mit einem pH-Wert von 1,0 bis 3,11 (I = 0,10) und von Natriuinacetat mit pH-Werten von 3,60 bis 5,8 (I = 0,05).

Tabelle 6

Pepsin-EMA-Derivate /pH-Profile 4> Maximum Aktivität

	Pepsin	Lösl. EMA-Pepsin (7,25 # N)	Unlösl. EMA-Pepsin (0,35 % N)
1,0	15	16
1,4	54	29	—
1,8	77	84	—
2,2	84	87	38
2,4	100	100	92
3,1	48	16	100
3,6	9	2	25
4,0	3	2	1
4,6	1	1	—
5,0	—	—^
5,8	—	—	—
Beispiel 13. Wasserlösliche Addukte	von Papain, Quecksilber-
papain und Zinkpapain und EMA

A - Lösliche Addukte von Quecksilberpapain oder Zinkpapain

und EMA
In 50 ml einer kalten 0,01-molaren phosphatischen Pufferlösung

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mit einem pH-Wert von 7,0, die hinsichtlich Cystein 0,002-molar war, wurden 250 mg handelsübliches Quecksilberpapain gelöst, Zu dieser Lösung gab man ein homogenisiertes Gemisch von 200 mg EMA. in 100 ml einer kalten, 0,01-molaren Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die hinsichtlich Cystein 0,002-molar war. Man rührte das Gemisch über Nacht bei 4⁰C und schleuderte dann 10 Minuten bei 8 000 U/Min, ab. Die überstehende Flüssigkeit wurde erschöpfend gegen kaltes Wasser, das Cystein in 0,002-molarer Konzentration enthielt, dialysiert. Beim Lyophilisieren des dialysierten Materials erhielt man ein wasserlösliches Produkt, das nach dem Entfernen des Quecksilbers eine Proteasenaktivität von 65 i» der ursprünglichen hatte. Hierbei wurde das Verfahren von Anson und Kunitz (J. Gen. Phyeiol. 30, 291 (1947)) verwendet, wobei man mit Äthylendiamin-Tetraeseigsäure (EDTA) in Gegenwart von Cystein arbeitete.

In gleicher Art wurde ein wasserlösliches Addukt von Zinkpapain und EMA nach dem Verfahren der USA-Patentschrift Nr. 3 284 316 hergestellt. Dieses hatte nach dem Abtrennen des Zinke 40 ^ der ursprünglichen Aktivität, vor dem Abtrennen des Zinks 10 ^.

B - Lösliche Addukte von Papain und EMA

100 mg rohea Papain wurden in 25 ml einer kalten 0,01-molaren phoephatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7.0 gelöst, die hinsichtlich Cystein 0,002-molar war. Zu dieser kalten Lösung gab man ein homogenisiertes Gemisch von 100 mg EMA-21 in 100 ml einer kalten 0,01-molaren Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die hinsichtlich Cystein 0,002-molar war. Man

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rührte die Mischung über Nacht bei 4°C, schleuderte ab und dialysierte die überstehende Flüssigkeit erschöpfend gegen eine kalte 0,002-molare Lösung von Cystein. Nach dem Lyophilisieren erhielt man ein wasserlösliches Addukt von Papain und EMA, das 15 # der ursprünglichen Proteasenaktivität hatte.

Beispiel 14« Addukt aus Lipase und einem Copolymer von Styrol und Maleinsäureanhydrid

Bakterielle Lipase wurde mit einem Copolymer aus einem Teil Styrol und einem Teil Maleinsäureanhydrid gekuppelt, wobei man in einem wässrigen Puffermedium nach den Verfahren der Beispiele 1 bis 12 arbeitete. Das Verhältnis des Polymers zum Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1. Die erhaltenen löslichen Addukte von Lipase hatten bis zu 20 $ der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

Beispiel 15'. Addukte von Cellulase und Protease mit Copolymeren von Vinylmethyläther und Maleinsäureanhydrid

Bakterielle Cellulase und neutrale und alkalische Proteasen von B. subtilis AM wurden gekuppelt mit einem Copolymer aus einem Teil Vinylmethyläther und einem Teil Maleinsäureanhydrid, wobei man in einem wässrigen Puffermedium nach den Beispielen 1 bis 12 arbeitete. Das Verhältnis des Polymers zum Enzym lag zwischen 1s15 und 3s 1» Es wurden lösliche Addukte erhalten, die bis zu etwa 50 fo der ursprünglichen enzymatischen Aktivität hatten.

Beispiel 16. Addukte von Cellulase und Copolymeren aus Vinyl*- acetat und Maleinsäureanhydrid

Bakterielle Cellulase wurde mit einem Copolymer aus einem Teil Vinylacetat und einem Teil Maleinsäureanhydrid gekuppelt. Man

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arbeitete in einem wässrigen Puffermedium nach den Beispielen 1 bis 12. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1· Erhalten wurden lösliche Addukte mit bis zu 60 io der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

Beispiel 17. Addukte von Cellulase, Lipase und Protease und Cyclopolymeren von Divinyläther und Maleinsäureanhydrid

Bakterielle Cellulase, Lipase und alkalische Protease wurden gekuppelt mit dem oben erwähnten Polymer, das sich wiederholende Einheiten aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid enthielt, die miteinander durch Ätherbindungen verbunden waren. Man arbeitete in einem wässrigen Puffermedium nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 12. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1. Erhalten wurden lösliche Addukte mit bis zu etwa 50 io der ursprünglichen enzymatischen Aktivitäten.

Beispiel 18. Addukte von Chymotrypsin und Polymaleinsäureanhydrid

Chymotrypsin wurde mit Polymaleinsäureanhydrid gekuppelt, wobei man in einem wässrigen Puffermedium nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 12 arbeitete. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1· Erhalten wurden lösliche Addukte mit bis zu etwa 70 $> der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

Beispiel 19. Addukte von !Trypsin und Polymaleinsäureanhydrid

Trypsin wurde mit Polymaleinsäureanhydrid in einem wässrigen Puffermedium nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 12 gekuppelt. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1· Erhalten wurden lösliche Addukte mit bis zu 70 io der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

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Beispiel 20. Addukte von Protease und Polymaleinsäureanhydrid

Ein Gemisch, von alkalischen und neutralen Proteasen von B. subtilis wurde mit Polymaleinsäureanhydrid in einem wässrigen Puffermedium nach dem Verfahren der Beispiele 1 "bis 12 gekuppelt. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3:1. Erhalten wurde ein lösliches Addukt von alkalischer und neutraler Protease mit bis zu etwa 70 $ der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

Beispiel 21. Addukte von saurer Protease und Polyacrylsäureanhydrid und EMA

Saure Protease von Aspergillus oryzae wurde mit Polyacrylsäureanhydrid in einem wässrigen Puffermedium nach dem Verfahren der Beispiele 1 his 12 gekuppelt. Das Verhältnis von Polymer zu Enzym lag zwischen 1:15 und 3ί1. Erhalten wurde ein lösliches Addukt mit "bis zu etwa 50 $ der ursprünglichen enzymatischen Aktivität.

In gleicher Weise konnte das Enzym gekuppelt werden mit Polyacrylsäure, wenn man das Reagenz von Woodward, N-AthyI-S-phenylisooxazolium-3'-sulfonat, als Aktivator für die Carboxylgruppen der Polyacrylsäure verwendete.

Die direkte Umsetzung von saurer Protease von A.-oryzae mit EMA.-21 nach den Beispielen 1 "bis 12 ergibt ein lösliches Addukt, das bei sauren pH-Werten eine außergewöhnlich hohe Aktivität hat* Die saure proteolytische Aktivität, bezogen auf die Aktivität der ursprünglichen Protease, liegt zwischen 23 und

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Beispiel 22« Addukte von neutraler und alkalischer Protease von B. subtilis und Amylase mit EMA in unlöslicher und löslicher Form

Ein Gemisch von 250 mg neutraler und alkalischer Proteasen von B. subtilis und von Amylase wurden in 100 ml einer kalten 0,1-molaren Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,5» die hinsichtlich Oalciumacetat 0,01-molar war, gelöst. Hierzu gab man ein homogenisiertes Gemisch von 200 mg EMA-21, die in 50 ml einer kalten 0,1-molaren Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,5 suspendiert waren. Man rührte das Gemisch über Nacht bei 4°G. Dann trennte man die überstehende Flüssigkeit von den unlöslichen Stoffen durch Abschleudern. Die Peststoffe wurden fünfmal mit einer kalten 0,1-molaren Lösung von Natriumchlorid und zweimal mit Wasser gewaschen. Das Material wurde dann lyophilisiert· Man erhielt einen Peststoff mit 32 "fa der ursprünglichen Aktivität ds-r neutralen Protease, 48 io der ursprünglichen Aktivität der a'lkali seilen Protease und 62 i* der ursprünglichen Aktivität der Amylase·

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Man erhielt einen löslichen Feststoff mit 42 £ der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease, 57 # der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease und 69 $ der ursprünglichen Aktivität der Amylase.

Beispiel 23. Addukte von neutraler Protease von B. subtilis und Dextranase mit EMA in löslicher und unlöslicher Form

100 mg neutraler Protease von B. subtilis und 100 mg Dextranase wurden in 75 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst, die hinsichtlich

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Calciumacetat O,01-molar war. Zu dieser Lösung gab man ein homogenisiertes Gemisch von 250 mg EMA-21 in 100 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatisehen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5. Das Gesamtgemisch wurde über Nacht bei 4⁰C gerührt. Dann trennte man die Feststoffe von der überstehenden Flüssigkeit durch Abschleudern. Nach Dialyse und Lyophilisieren hatte das unlösliche Addukt eine Aktivität von 43 $ der ursprünglichen Protease und 27 <fo der ursprünglichen Dextranase.

Die überstehende Flüssigkeit wurde dialysiert und iyophilisiert. Man erhielt ein lösliches Addukt mit 64 # der ursprünglichen Proteasenaktivität und 62 $> der ursprünglichen Dextranasenaktivität.

Beispiel 24. Lösliche und unlösliche Addukte von Dextranase und EMA

Aus einem mit Penicillium funiculosum (Stamm NRRL 1132) fermentiertem Bier wurde Dextranase durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen^ 100 mg dieser Dextranase wurden in 50 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst, die hinsichtlich Calciumacetat 0,01-molar war. Zu dieser Lösung gab man ein homogenisiertes Gemisch von 100 mg EMA-21 in 50 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung. Das Gesamtgemisch wurde bei 4°C über Nacht gerührt. Dann trennte man die Feststoffe von der überstehenden Flüssigkeit durch Abschleudern. Nach Dialyse und Lyophilisierung erhielt man ein unlösliches Addukt mit 35 $ der ursprünglichen Aktivität.

Die überstehende Lösung wurde dialysiert und Iyophilisiert. Man erhielt ein lösliches Addukt mit 68 $ der ursprünglichen Aktivität.

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Beispiel 25. Addukt von neutralen und alkalischen Proteasen aus B. subtilis und Amy läse mit DMAPAI und EMA.

Das Teilimid von Dimethylaminopropylamin mit EMA-21 wurde hergestellt durch Erhitzen unter Rückfluß von EMA und 50 Gew.~% Ν,Ν-Dimethylaminopropylamin in Xylol während 5 Stunden. Hierbei wurde das abgespaltene Wasser mittels einer Falle entfernt. Nachdem kein Wasser mehr gebildet wurde, was auf die Beendigung der Umsetzung deutete, fällte man das TJmsetzungsprodukt mit Hexan aus und trocknete es im Vakuum bei 105°C. Das Imid enthielt 8,9 i> N, was einem Imidgehalt von 54 $ entspricht.

500 mg eines Gemisches von neutraler und alkalischer Protease von B. subtilis AM und von Amylase wurden in 50 ml einer kalten 0,1-molaren phospjtiatisehen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7)5 gelöst, die hinsichtlich Oalciumacetat 0,02-molar war. Zu dieser Lösung gab man ein kaltes Gemisch von 500 mg DMAPAI-EMA, das 1 Minute lang mit 50 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 homogenisiert war. Das Gesamtgemisch wurde über Nacht bei 4 C gerührt. Durch Abschleudern trennte man das unlösliche Endprodukt von der überstehenden Flüssigkeit. Die unlöslichen Stoffe wurden achtmal mit 0,1-molarer Natriumchloridlösung und fünfmal mit Wasser gewaschen und anschließend lyophilisiert. Das erhaltene unlösliche Addukt hatte 36 $ der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease, 42 $ der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease und 52 °/> der ursprünglichen Aktivität der Amylase.

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Man erhielt ein lösliches Addukt mit 46 in der ursprünglichen Aktivität der neutralen Protease, 48 fi der ursprünglichen Aktivität der alkalischen Protease

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und 50 io der ursprünglichen Aktivität der Amylase.

Beispiel 26. Addukt von Trypsin und DMAPAI-EMA

Das Copolymer von DMPAI und EMA wurde nach dem Beispiel 25 hergestellt.

250 mg Trypsin wurden in 100 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst. Zu dieser lösung gab man ein homogenisiertes Gemisch von 250 mg des ' Polymers, das eine Minute lang mit 100 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 homogenisiert war. Das Gresamtgemisch wurde ü"ber Nacht bei 4⁰C gerührt. Dann trennte man das unlösliche Addukt von der überstehenden Flüssigkeit durch Abschleudern ab. Die Peststoffe wurden achtmal mit einer 0,1-molaren Lösung von Natriumchlorid und fünfmal mit Wasser gewaschen. Durch Lyophilisieren wurde ein unlösliches Addukt mit 55 $> der ursprünglichen Aktivität bei einem pH-Wert von 7,5 erhalten.

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhielt ein lösliches Addukt mit 65 i° der ursprünglichen Aktivität bei einem pH-Wert von 7,5.

Das lösliche und das unlösliche Addukt haben beide bei geringeren pH-Werten eine größere enzymatisch^ Aktivität, als das ursprüngliche Enzym. >

Beispiel 27,. Addukt von Asparaginase und BMAPAI-EM

Das Polymer wurde nach dsm Verfahren des Beispiels 25 hergestellt.

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34 mg Asparaginase wurden in 30 ml einer kalten 0,2-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst. Zu dieser Lösung gab man ein Gemisch von 45 mg des Polymers mit 30 ml einer kalten 0,1-molaren phosphatischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7»5» das eine Minute lang homogenisiert war. Das Gesamtgemisch wurde über Nacht bei 4⁰G gerührt. Dann trennte man das unlösliche Addukt durch Abschleudern von der überstehenden Flüssigkeit ab. Die Peststoffe wurden achtmal mit einer 0,1-molaren Lösung von Natriumchlorid und fünfmal mit Wasser gewaschen. Nach dem Lyophilisieren hatte das unlösliche Addukt 11 i» der ursprünglichen Aktivität.

Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhielt ein lösliches Addukt mit 36 # der ursprünglichen Aktivität.

Andere Ν,Ν-dialkylaminoalkylamine mit niederen Alkylgruppen ergeben entsprechende Polymere, die mit ürypsin oder neutraler und alkalischer Protease und Amylase oder Asparaginase gekuppelt werden können. Zur Herstellung wasserlöslicher kationischer Addukte können solche Polymere verwendet werden, die im Molekül derartige Gruppen enthalten.

So kann man Teilimide von Polymeren mit Carboxyl oder Carboxy1-anhydrid enthaltenden Gruppen verwenden, um die entsprechenden Aminoalkylamide herzustellen. Diese Teilester werden umgesetzt mit den entsprechenden Enzymen nach dem Verfahren der vorhergehenden Beispiele, um die gewünschten aktiven, wasserlöslichen, kationischen Addukte zu erhalten.

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Zur Gewinnung nicht ionischer Addukte können neutrale G-ruppen dem Polymermolekül angehängt werden nach der Verbindung mit dem Enzym, "beispielsweise Alkylamine, Aminoalkohole und Alkohole, die mit den restlichen Carboxylgruppen oder Gruppen von Carboxyleäureanhydriden reagieren.

Man kann also wasserlösliche Addukte von Enzymen mit den nachstehenden Derivaten von Polymeren mit kationischen Substituenten herstellen: Dialkylaminoalkanolester mit niederen Alkyl- und niederen Alkanolresten, Alkylaminoalkanolester mit niederen Alkyl- und niederen Alkanolresten, Aminoalkanolester mit niederen Alkanolestern. Hierzu gehören beispielsweise die Addukte von alkalischer Protease und dem Dimethylaminopropanolester von EMA, die Addukte von neutraler Protease und Äthylaminobutanolester von EMA, die Addukte von Papain und Aminoäthanolester von Polymaleinsäureanhydrid oder Polyacrylsäureanhydrid oder Polymaleinsäure oder Polyacrylsäure. Zu diesen verwendbaren Polymeren gehören auch Dialkylaminoalkylimide mit niederen Alkylgruppen, Alkylaminoalkylimide mit niederen Alkylgruppen, Aminoalkylimide mit niederen Alkylgruppen, wie beispielsweise das Addukt von alkalischer Protease mit dem Diäthylaminopropylimid von EMA, das Addukt von neutraler Protease mit dem Methylaminobutylimid von EMA, und das Addukt von Papain mit dem Aminopentylimid von Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylsäureanhydrid, Polymaleinsäure oder Polyacrylsäure. Ebenso gehören dazu Dialkylaminoalkylamide der Polymere mit niederen Alkyl- und niederen Alkylamidgruppen, die Alkylaminoalkylamide mit niederen Alkylgruppen, Aminoalkylamide mit niederen Alkylgruppen, wie beispielsweise das Addukt von alkalischer Protease und dem Dimethylaminopropylamid von EMA, das Addukt von neutraler Protease und Äthylaminohexylamid von

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EMA. und das Addukt von Papain mit dem Aminopropylamid von Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylsäureanhydrid, Polymaleinsäure oder Polyacrylsäure.

Aus dem Gesagten geht hervor, daß man zur Gewinnung der erfindungsgemäßen wasserlöslichen Addukte vorzugsweise die folgenden Polymere verwendet: Copolymer von Äthylen und Maleinsäureanhydrid, Copolymer von Styrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymer von Vinylmethyläther und Maleinsäureanhydrid, Copolymer von Vinylacetat und Maleinsäureanhydrid, Cyolocopolymer von Divinyläther und Maleinsäureanhydrid, Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylsäureanhydrid, und kationische Derivate dieser Verbindungen. Vorzugsweise verwendet man zur Gewinnung der Addukte wenigstens eines der nachstehenden Enzyme: Neutrale Protease, saure Protease, alkalische Protease, Trypsin, Chymotrypsin, Lipase, Cellulase, Oxynitrilase, Pepsin, Dextranase, Amylase, Papain. Vorzugsweise sind die Enzyme mikrobiologischen Ursprungs .

Wenn eine Protease namentlich erwähnt wird, z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin oder Papain, so kann diese Protease augenscheinlich entweder allein oder zusammen mit anderen Proteasen vorhanden sein, auch wenn diese nicht namentlich erwähnt werden. Es können auch eine oder mehrere nicht proteolytische Enzyme vorhanden sein.

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Claims (11)

- 50 Patentansprüche

1. Enzymatisch aktives wasserlösliches Addukt eines oder mehrerer Enzyme, die durch Valenzbindungen über Reste, welche für ihre enzymatische Aktivität nicht wesentlich sind, mit einem Polymer verbunden sind, das entweder Ketten von Carboxylsäure-Einheiten oder von Einheiten von Carboxylsäureanhydriden enthält, oder bei welchen diese Einheiten von Carboxylsäuren oder Carboxylsäureanhydriden durch Kohlenstoff ketten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind, wobei die Einheiten aus der Carboxylsäure oder ihrem Anhydrid und der Kohlenstofikette nicht mehr als 18 Kohlenstoff atome enthalten.

2. Addukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Trypsin, Lipase, Amylase, Cellulase, Chymotrypsin, Oxynitrilase, saure Protease, alkalische Protease, neutrale Protease, Pepsin, Papain, Zinkpapain oder Quecksilberpapain enthält.

3« Addukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzyme gleichzeitig alkalische Protease und neutrale Protease enthält.

4. Addukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es außer alkalischer und neutraler Protease noch Amylase und/oder I Lipase enthält.

5. Addukt nach Anspruch 3 oder,4, dadurch gekennzeichnet, daß es alkalische Protease und neutrale Protease in einem Aktivität sverhältnis von 0,25sΓ1 bis 1,2s1 enthält.

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6. Addukt nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Dextranase enthält.

7. Addukt nach Anspruch. 6, dadurch, gekennzeichnet, daß es außer Dextranase noch neutrale Protease enthält.

8. Addukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Enzyme mikrobiologischer Herkunft enthält.

9· Addukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polymer ein Copolymerisat von Äthylen mit Maleinsäureanhydrid, von Styrol mit Maleinsäureanhydrid, von Vinylmethyläther mit Maleinsäureanhydrid, von Vinylacetat mit Maleinsäureanhydrid, ein zyklisches Copolymerisat von Divinyläther mit Maleinsäureanhydrid, Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylsäureanhydrid oder von kationischen Derivaten dieser Verbindungen enthält.

10. Verfahren zur Herstellung eines Addukt3 nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Enzyme mit dem Polymer unter solchen Bedingungen umsetzt, daß keine Vernetzung stattfindet und daß die Aktivität des oder der Enzyme nicht zerstört wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem verdünnten wäßrigen Medium mit einem Überschuß an Enzym durchführt.