SU1022988A1

SU1022988A1 - Стабилизированна урокиназа,обладающа тромболитической активностью,и способ ее получени

Info

Publication number: SU1022988A1
Application number: SU792821712A
Authority: SU
Inventors: Александр Васильевич Максименко; Владимир Петрович Торчилин; Владимир Николаевич Смирнов; Евгений Иванович Чазов
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР
Priority date: 1979-09-28
Filing date: 1979-09-28
Publication date: 1983-06-15
Also published as: US4349630A; DE3033030A1; DE3033030C2

Abstract

1. Стабилизированна урокиназа . рбыей формулы тЛ-то1-То где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекул рным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20% NH-T урокиназа, обладающа тромболитйческой активностью . 2. Способ получени стабили.зи« рованной урокиназы по п. 1, о т л ич .аюцийс тем, что урокиназу при, температуре 0-25 С и рН В,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акрило-вой кислой с молекул рным весом 10-200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварите тьно обработанным карбодиимидом.

Description

to

IVD

СО

сх оо

Изобретение относитс к химикофармацевтической промышленности, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, про вл ющих тромболитическую активность , в частности стабилизированной урокиназе .и способу ее получени . Описываемое соединение представл ет собой продукт св зывани урокиназы с синтетическим сополийером акриламида и акриловой кислоты .

Урокиназу используют в медицине как активатор плазминогена, поскольку она обладает хорошо выраженными тромболитическими свойствами . Урокиназу примен ют при лечении таких заболеваний как легочна тромбоэмболи , тромбозы глубоких вен, заболевани сосудов головного мозга, инфаркт миокарда. .;сццнако терапи нативной урокиназой осложн етс в св зи с ее инактивацией под действием ингибиторов кровки и эндогенных протеаз, а также из-за невозможности создани высокого локального содержани препарата в пораженном органе. При лечении урокиназой необходимо неоднократно вводить высокие дозы препарата . Преодолеть указанные выше трудности позвол ет св зывание ферментов с высокомолекул рными носител ми .

Известно производное урокиназн, которое получают следующим путем.; Урокиназу вшивают в полиакриламидный гель после обработки его (нитритом натри в кислой среде. Диазотированный таким способом носитель взаимодействует азосочетаНием с ферментом.

При этом образуетс водонерастворимое производное урокиназы, которое не может быть использовано в медицине tl3.

Известен способ получени ферментного препарата на основе пуллуланазы (КФ 3.2.1.40) путем ковалентного св зывани фермента с био-гелем ICM-100 (сополимер акрилами да и акриловой кислоты) с помощью карбодиимида. Дл получени иммобилизованного ферментного препарата частицы носител (размер 100200 меш) обрабатывают 30 мин Е кислой среде ( 4) раствором фермента дл .протекани адсорбции фермента на носитель, после чего в реакционную смесь добавл етс карбодиимид . Полученный продукт фильтруют и промывают дистиллированной водой и буферными растворами 2.

Одйако данный способ не дает возможности получить стабилизированную Урокиназу, которую можно было бы использовать дл медицинских целей, поскольку дл лечебных ферментных

препаратов наиболее благопри тной формой практического использовани вл етс растворима .Таким образом; использование в качестве носител водорастворимого сополимера акриламида и акриловой кислоты (мол.вес. 10-200 тыс. ед.) с содержанием последней 1-20%, а также Изменение условий процесса -привод т к получению нового соединени , обладаю.пего ценными свойствами.

Цель изобретени - получение нового препарата - стабилизированной урокиназы, обладаквдей пролонгированной тромболитической активностью,

повьаиенной термостабильностью, т.е. расширение ассортимента и№лобилизованных и стабилизированных ферментов медицинского назначени .

Поставленна .цель достигаетс

свойствами стабилизированной урокимазы обшей формулы

б

т-с- тда-тр

где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекул рным весом 10200 тыс. ед. и содержан1|ем акриловой кислоты 1-20%; урокиназа, обладающа тром болитической активностью. Способ получени стабилизированной урокиназы за-ключаетс в том, что Урокиназу при температуре и рН 8,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акрилалвида и акриловой кислоты с молекул рным ве- ; сом 10-200 тыс.ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварительно обработанным карбодиимидом.

Присоединение урокиназы к синтетическому высокомолекул рному носителю проходит через стадию активации карбоксильных групп сополимера карбодиилдадом О

0« ,HHRi

-Ct t R.U«C«im,- T-C-0-Cl. . .

гдеT - указанный вьвие сополимер, a затем активированные карбоксильные группы носител реагируют с аминогруппами урокиназы

«

Т-С-О-С: -Ь H -N-Yp-

,

о

fl н н

- T-C-14H-Yp-f к-C-V

RI и R, 1 О

Способ осуществл етс следующим 6«; образом. Высокомолекул рный носитель - с полимер акриламида и акриловой кис лоты при слабощелочных значени х рН раствор ют в растворе фосфатного буфера, затем на холоду - 5-10 внос т в раствор определенное количество карбодиимида и через 20 м добавл ют раствор урокиназы. Реакц св зывани ведут 16 ч, после чего полученное производное урокиназы отдел ют от других веществ с .помонг гель-хроматографического метода. Полученный продукт представл ет собой урокиназу, хнг- чески св занн с синтетическим полимерным носителем . Продукт полностью сохран ет биологическую активность по высоко молекул рным субстрата1М (например, плазминоген), не тер ет каталитической активности при хранении в холодильнике () в растворимом виде в течение трех мес цев (в отличие от растворов кативного фермента ) , обладает повышенной терио стабильностью и пролонгированной тромболитической активностью. Синтез водорастворимого полимер ного носител осуществл ют известным способом - радикальной сополимеризапией мономеров в присутствии персульфата аммони в водном растворе з). Сополимериэацию ведут при 4 ч,,Обща концентраци Iмономеров в реакционной смеси составл ет 5 вес. %. Сополимер осг1ждают метанолом и .высушивают ацетоном Содержание акриловой кислоты в сополимере составл ет 3 вес.%, что вл етс оптимальным дл процесса получени фepмeнтвыk производных. Следует отметить, что увеличение содержани акриловой кислоты в сополи юре выше 20% не ведет к увеличению количества св занного белка , а низкое содержание акриловой кислоты в сополимере делает его био инертным. Пример 1. В4 мг 0,001 М фосфатного буфера (рН 8,3) раствор ют 20 мг.сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекул рным весом 100000 ед. и содержанием акриловйй кислоты ,3%. Затем на холоду (4С) внос т в этот раствор 2,5 мг Д-этют-З-СЗ-диметиламинопропил )-карбодиимида и через 20 мин после этого приливают 1 мг раствора нативнсхй урокиназы в дистиллированной воде (250000 МЕ/мл). Реакцию св зывани ведут 16 ч, а затем отдел ют полученный препарат урокиназы , св занной с высококюлекул рным носителем, с помсмсью гель-хроматографии на колонне с сефадексом G-150. По кинетическим параметрам гидролиза низко1 4олекул рных субстратов, по- термостабильности по лученный препарат не уступает натиБНому ферменту. С носителем св зываетс до 80% йсходно го количества урокиназы, сохран ема эстеразна и амидоли ичёска активность 78-81%. Препарат не тер ет, каталитической активности по высокомолекул рньв .1 субстратам (плаэминоген), в системе in vitro с той же скоростью лизирует модельный тромб, как и препарат нативной урокиназы. В физиологических услови х при 37 С производное урокиназы с сополимером практически не тер ет своей каталитической активности 2 сут. Нативный фермент в этих услови х тер ет более 50% своей каталитической активности . Пример 2. Процесс проводитс аналогично примеру 1, за исключением того, что реакци сврзывани урокиназы с полимершгм носителем молекул рного .веса 10000 ед. и содержанием акриловой кислоты 1% осуществл етс в 0,1 М растворе фосфатного буфера при 25 С. В этоМ случае количество св занного с носителем фермента составл ет 53%, а сохран вша препаратсж эстеразна и смидолитическа активность 50-51%. Пример 3. Процесс проводитс аналогично примеру 1, за исклю чением того, что реакцию присоединени урокииазы-к сополимеру молекул рного веса 200000 ед. и содержанием акриловой кислоты 20% ведут в 1,0 М растворе фосфатного буфера при . С носителем св зываетс в этом случае 20% урокиназы от исходного общего количества фермента. Сохран ема препаратом эстеразна и амидолитическа активность 17%. Таким образом, производные урокиназы , полученные в примерах 1-3,содержат различное количество фермента , св занного с носителем, что объ сн етс важной ролью величины ионной силы раствора, завис щей от концентрации фосфатного буфера, при. проведении реакции св зывани . Все производные обладают тромболитичёской активностью, сравниваемой с таковой дл нативной урокиназы. КроМе того, как видно из примера, 1, полученные соединени обладают повышенной термостабильностью й-длительный срок сохран к т свою каталитическую активность. Тромболитические свойства стабилизированной урокиназы оцениваютс по скорости лизиса тромба в среде буфера рН 7,4 в присутствии человеческого плазминогена (1 мг/мл). npenapai нативной и св занной с сополимером урокиназы вз ты дл тромболизиса в соотношении, обеспечивающем их одинаковую эотеразную актив .ность по низкомолекул рному субстрату (метиловый эфир ацетилглициллизина ) .

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице, где tgcLпредставл ет-собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболиэисе нерастворимого фибринового .сгустка и переходе его фрагментов в раствор) к величине Промежутка времени, за который оно происходит и вл етс параметром, характеризующим скорость тромболизиса .

15

20

100

0,49

о

25

125

0,61 110 0,54 104 0,51

30

Таким образом, из результатов , приведенных в таблице, видно, что препараты ypoкинaзыJ, св занной с сополимером, даже превосход т по эффективности тромболитического дай стви нативный фермент. Повьхиенна термостабильность полученных производных урокиназы озвол ет ферменту сохран ть свою каталитическую активность более длительный период времени, чем нативному препарату, а это ведет, в свою очередь, к пролонгации тромболитического действи полученных производных урокиназы.

Синтез таких производных позвол ет получать, биологически активные препараты пролонгированного действи , пригодные дл терапевтического использовани . Варьирование количества фермента, св занного с носителем , в зависимости от значени величины Ионной силы раствора, в котором протекает реакци св зывани , удобно дл индивидуального дозировани препарата. Применение таких производных урокиназы в медицине открывает новые возможности дл эффективной борьбы с тромбозами , ведет к снижению расхода дорогосто щего ферментного препарата, облегчает его применение.

Claims

СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ УРОКИНАЗА, ОБЛАДАЮЩАЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ. (57) 1. Стабилизированная урокиназа общей формулы

T-J-Wt-Tp где Т - остаток сополимера а~криламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20% NH-Tjj урокиназа, обладающая тромболитической активнос тью.
2. Способ получения стабилизированной урокиназы по π. 1, о т л ич.ающийся тем, что урокиназу при. температуре 0-25°С и pH ΐ,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акрилоВой кислота с молекулярным весом 10-200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1—20%, предварительно обработанным карбодиимидом.