DE3033030C2 - Thermostabiles Derivat der Urokinase und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Thermostabiles Derivat der Urokinase und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf thermostabile Derivate der Urokinase und ein Verfahren zu
deren Herstellung (vgl. Ansprüche 1 und 2). Der Anspruch 3 nennt eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Die genannten neuen Verbindungen besitzen thrombolytische Aktivität und können in der Medizin als
Wirkstoffe thrombolytischer Präparate sowie in der Biologie und Biochemie zur Anwendung kommen, wo
Untersuchungen über die Thrombenbildung und über das Funktionieren von Fermentsystemen durchgeführt
werden.
Breit bekannt ist die Verwendung von Urokinase in der Medizin als Aktivator des Plasminogens, weil sie
gut ausgeprägte thrombolytische Eigenschaften besitzt. Die Urokinase wird bei der Bchadlung solcher Erkrankungen
wie Lungencmbolic. Thrombosen der tiefliegenden Venen. Erkrankungen von Gehirngefäßen und Myokardinfakt
verwendet. Die Behandlung mit nativer Urokinase wird jedoch im Zusammenhang mit ihrer Inaktivierung
unter Einwirkung von Blutinhibitoren und endogenen Proteasen sowie infolge der Unmöglichkeit
der Schaffung eines hohen lokalen Gehaltes an dem Präparat in dem jeweiligen erkrankten Organ kompliziert.
Bei der Behandlung mit Urokinase ist es erforderlich, mehrmals eine hohe Präparatdosis einzuführen. Zur
Überwindung der obengenannten Schwierigkeiten führt man eine Vereinigung der Fermente mit hochmolekularen
Trägersubstanzen durch. Fermentderivate weisen eine erhöhte Stabilität gegenüber verschiedenen inaktivierenden
Einwirkungen sowie eine verzögerte Ausführung derselben aus dem Organismus auf.
Bekannt sind Derivate der Urokinase, die mit hochmolekularen Trägersubstanzen gebunden sind, sowie
Verfahren zu ihrer Herstellung. So wird die Urokinase mit Sepharose-4B (Wiman B.. Wallen P., J. I. Biochem.
36. 25. 1973) unter Aktivierung der Trägersubstanz mit Bromzyan gebunden. Die Verwendung einer derartigen
hochtoxischen Verbindung für medizinische Zwecke ist nicht möglich.
Bekannt ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Urokinase, wobei die Urokinase in ein
Polyacrylamidgcl (Capet-Antonini F. C. Tamcnasse J..
Can. J. Biochem. 53. 890. 1975) nach seiner Behandlung
mit Natriumnitrit in einem sauren" Medium »vernetzt«
wird, wobei die dadurch diazotierte Trägersubstanz unter Azoyerbüidimgmit einem Ferment umgesetzt wird. Dabei
.wird ein wasserunslösliches Derivate der Urokinase genommen, das ebenfalls nicht in der; Medizin verwendet
werden kann. , />,',;■.-.,
Der Erfindung wurde die Aufgabe'zugrunde gelegt,
neue thermostabile Derivateder Urokinase zu entwickeln, die wasserlöslich sind und thrombolytische Aktivität mit
prolongierter Wirkung besitzen, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Aufgabe wurde, wie aus den vorstehenden Ansprüchen
ersichtlich, gelöst.
Die erfindungsgemäßen neuen Derivatcder Urokinase
stellen ein weißliches Pulver dar, das in Wasser leicht löslich ist. Diese Verbindungen besitzen eine erhöhte
Thermestabilität infolge der Entstehung von iCovalenzbindungen
zwischen dem jeweiligen Ferment und der Trägersubstanz; sie besitzen auch eine prolongierte
thrombolytische Aktivität.
■ ti ucin eiiiiiuuilgagcuiaijcii YCiiattii.il gviii un. rwi-
gliederung der Urokinase an das genannte Copolymer durch die Stufe der Aktivierung von Carboxylgruppen
des Copolymers mit l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid vor sich:
+ Ri N=C=CNR2
OH
Il
τ—c—o—c
HNR1
NR,
wo T eine Trägersubstanz darstellt: dann reagieren die
Carboxylgruppen der Trägersubstanz mit Aminogruppen des Eiweißes
O HNR1
T-C-O-C^ + H2N-P-*
Il H H
T—C—NH-P + N—C—N ,
R1 Il R2
O
R1 Il R2
O
worin P ein Ferment darstellt.
Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt.
Fine hochmo!ekulare Trägersubstanz, das Copolymer des Acrylamid.·· und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht
von 10000 bis 200000 und einem Gehalt an Acrylsäure von I bis 20% wird bei schwachalkalischem
pH-Wert in der Lösung eines Phosphatpuffergemisches (0,001 — 1,0 Mol) aufgelöst; dann wird bei
einer Temperatur von 0° bis 25°C ein Aktivator. 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid,
in die Lösung eingeführt und nach einiger Zeit eine Urokinaselösung
in destilliertem Wasser hinzugefügt. Die Reaktion der Bindung wird vorzugsweise während 10 — 20 Stunden
durchgeführt, wonach man das gewonnene Derivat der Urokinase von anderen Stoffen im gei-chromatographischen
Verfahren trennt.
Das gewonnene Produkt stellt eine Urokinase dar, die mit einem synthetischen Polymerträger chemisch
gebunden ist. Das Produkt erhält vollständig seine biologische Aktivität nach hochmolekularen Substraten
aufrecht, vertiert nicht seme katalytische Aktivität bei
Lagerung im Kühlschrank (4—5°C) im aufgelösten Zustand während 3 Monate (im Unterschied zu Lösungen
eines nativen Fermentes) und besitzt eineerhöhteThermostabilität
und eine prolongierte thrcmbolytische Wirkung.
Die Synthese des genannten wasserlöslichen Polymerträgers wird mittels radikaler Copolymerisation von
Monomeren in Gegenwart des Ammoniumperoxydisulfats in wässeriger Lösung durchgeführt. Die Copolymerisation
führt man bei einer Temperatur von 600C während vier Stunden durch. Die Gesamtkonzentration
der Monomere im Reaktionsgemisch beträgt 5 Gew.-%. Das Copolymer wird mit Methanol gefällt und mit
Aceton getrocknet. Der Gehalt an Acrylsäure im Co- is
polymer beträgt von 1 bis 20 Gew.-%.
Es soll hervorgehoben werden, daß die Erhöhung des Gehaltes an Acrylsäure im Copolymer über 20 % hinaus
zu keiner Vergrößerung der Menge des gebundenen Eiweißes führt, wiä der niedrige Gehalt (unter 1 %)
an Acrylsäure im Copolymer es biologisch inen macht.
Die biologische Verträglichkeit der Trägersubstanzen solcher Art wurde vorher nachgewiesen; dadurch konnten
sie als Plasmasubstituenten verwendet werden.
Zur besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung führen wir folgende Beispiele für neue thermostabile
Derivate der Urokinase, für das Verfahren ihrer Herstellung sowie Versuche auf ihre thrombolytische Wirkung
an.
30
In 4 ml 0,001 molarem Phosphatpuffergemisch mit pH 8,3 werden 20 mg Copolymer des Acrylamids und
der Acrylsäure mit einem Molekulargewk.nl von 100000
und einem Gehalt an Acrylsäure von 3 % aufgelöst. Dann werden an der Kälte (4°C) 2,5 mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodtimid
in diese Lösung eingeführt und 20 Minuten danach gießt man 1 ml der Lösung der nativen Urokinase in destilliertem Wasser hinzu
(250000 ME/ml). Die Reaktion der Bindung wird während 16 Stunden durchgeführt und dann trennt man
das gewonnene Derivat der Urokinase mit der hochmolekularen Trägersubstanz mit Hilfe der Gel-Chromatographie in einer Kolonne mit Sephadex G-150. Das
hergestellte Produkt steht nach den kinetischen Parametern der Hydrolyse niedermolekularer Substrate und
nach der Thermostabilität dem nativen Ferment nicht nach. Mit der Trägersubstanz werden bis 80% der Ausgangsmenge
der Urokinase gebunden, die Esterase- und amidolytische Aktivität wird in Höhe von 78-81%
aufrechterhalten. Die gewonnene Verbindung verliert nicht ihre katalytische Aktivität nach hochmolekularen
Substraten (Plasminogen), und lysiert im System »in vitro« mit der gleichen Geschwindigkeit einen
Modellthrombus wie das Präparat der nativen Urokinase. Unter physiologischen Bedingungen bei einer
Temperatur von 370C verliert die hergestellte Verbindung
praktisch nicht ihre katalytische Aktivität während zweier Tage. Das native Ferment verliert unter μ
den gleichen Bedingungen über 50% seiner katalytischen Aktivität.
Das Verfahren führt man ähnlich wie in Beispiel 1 durch. Als Polymerträgersubstanz wird ein Copolymer
des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem MoIe-
65 kulargewicht von 10000 und einem Gehalt an Acrylsäure
von 1% verwendet. Die Umsetzung erfolgt in 0,1 molarer Lösung eines Phosphatpuffergemisches bei
einer: Temperatur von 25°C während 20 Stunden. In diesem Fall beträgt die Menge der mit der Trägersubstanz
gebundenen Urokinase 53%, und die vom Präparat bewahrte Esterase- und amidolytische Aktivität
beträgt 50-51%.
Das Verfahren wird ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Man verwendet ein Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von
2000CO und einem Gehalt an Acrylsäure von 20%. Die Umsetzung führt man in 1,0 molarer Lösung eines
Phosphatpuffergemisches bei einer Temperatur von 00C durch. In diesem Fall werden 20% Urokinase mit
der Trägersubstanz, bezogen auf die Gesamtmenge des Fermentes, gebunden. Die vom Präparat bewahrte
Esterase- und amidclytische Aktivität beträgt J7%.
Hierdurch enthalten die in Beispiel 1—3 hergestellten Derivate der Urokinase unterschiedliche Mengen des
Fermentes, das mit der Trägersubstanz gebunden ist, was auf die große Rolle der Größe der Ionenstärke
der Lösung zurückzuführen ist, die ihrerseits von der Konzentration des Phosphatpöffergemisches bei der Durchführung
der Reaktion der Bindung abhängig ist. Sämtliche Derivate besitzen thrombolytische Aktivität, die
der für die native Urokinase vergleichbar ist. Wie aus Beispiel 1 zu ersehen ist, besitzen außerdem die hergestellten
Verbindungen eine erhöhte Thermostabilität und erhalten während längerer Zeit ihre katalytische Aktivität
aufrecht.
Eis wurden Versuche der throrEbolytkiten Aktivität
der hergestellten Verbindungen gemäß Beispiel 1 — 3 im Vergleich mit der thrombolytischen Aktivität des nativen
Präparats der Urokinase durchgeführt. Die Lysis des Thrombingerinnsels führte man von der Oberfläche eines
Gitters, das für eine homogene Eiweißlösung durchlässig ist und in die Lösung derartig eingetaucht ist, so daß
die Umspülung des künstlichen Thrombus mit der gleichmäßig zu vermischenden Lösung gesichert wird. Die
Zubereitung von Thromben erfolgt in einem konventionellen Verfahren durch Umsetzung 0,5 ml einer Fibrinogenlösung
(10 mg/ml) mit 0.2 ml Thrombinlösung (4 :mg/ml), wonach der jeweilige Thrombus während
einer S'unde gehalten wird. Der dadurch gewonnene Thrombus wird in eine Lösung des 0,1 molaren Phosphatpuffergemisches
mit 0,02 MoI des Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure pH = 7,4 so getaucht, daß
seine untere Oberfläche von dieser Lösung umspült wird, wobei sie Menschenplasminogen (Lys-Pmg 1,0 mg/ml)
enthält. Für die Thrombolysis wurden die native Urokinase und die hergestellten Derivate der Urokinase
mit Copo'ymeren in einem Verhältnis genommen, das ihre gleiche Esteraseaktivität nach dem niedermolekularen
Substrat (AGIMe) gewährleistet. Die Geschwindigkeit der Lysis des Fibringerinnsels wurde nach der
Änderung (Vergrößerung) der optischen Dichte der Lösung (infolge der Destruktion bei der Thrombolysis des
unlöslichen Fibringerinnsels und beim Übergang seiner Fermente in die Lösung) in einem Spektrophotometer
bei 280 nm in der Zeit kontrolliert.
pie Ergebnisse der durchgeführten Versuche sind in der'TabbJje^ angeführt, yirorai tg'a das Verhältnis'des
Zuwachses derogtischea* Picfife der Lösung (infolge
(J« Destruktion" bei def Thrombotysis des "unlösiifchen :
Fibringerinnsejs jihd des' Übergangs seiner Fermente
iri die" Lösung) zur Größe des ZeitabscKhjttes dargestellt,
iii dem'dieser erfolgte und'e'inep. Parameter darstellt,
der iijie öeschwindigkeit der Tlirombolysis charakterisieW ■■■■·■■■:
; Somit ist aus den in der Tabelle aufgeführten prgeb^ ip
nisseii zu ersehen, daß die erfindurigsgemäß hergesteHten
Derivate der Urokinase in der Efftktivität ihrer
tbirbmbölytischen Wirkung^ das native Ferment übertreffen.
Die erhöhte Therniostabilität der tiergesteUten
Derivate der L) rokinase ermöglicht es dem Fermfent, seme
katalytische: Aktivität während einer längeren Zeit im
Vergleich zum nativen Präparat ayfrechtzuerhalteh, was
seinerseits zur Prolongierung der thrombolytischen
Wirkung der hergestellten Derivate der Urokinase führt.
Art der'zu prüfcnden
Yerbindüpg ' "
Yerbindüpg ' "
Geschwindigkeit der Lysis eines Thrombus
Nafiye Urpkinase
Derivat der'Urökinase,
das gemäß Beispiel 1
gewo'nneii würde
Derivat der'Urökinase,
das gemäß Beispiel 1
gewo'nneii würde
P,49
gewönnen ^iirde
Perivat der Urokinase,
das gemäß;Beispie]!3
gewöhnen würde'
Perivat der Urokinase,
das gemäß;Beispie]!3
gewöhnen würde'
Q,54
Q,51
100 125
HQ 104
Claims (3)
1. Thermostabiles Derivat der Urokinase, dadurch erhältlich, daß man ein Copolymer von Acrylamid
und Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 200000 und einem Gehalt an Acrylsäure von 1 bis 20 % mit der Urokinase in Anwesenheit
von l-Äthyl-3-(3-dimethyl3;ninopropyl)carbodiimid
bei einer Temperatur von 0 bis 25 °C in einem schwach alkalischen Medium eines 0,001 bis 1,0 Mol
Phosphatpuffergemischs umsetzt.
2. Verfahren zur Herstellung des thermostabilen Derivats der Urokinase gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 genannte Maßnahme durchfuhrt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung im Verlauf von
10 bis 20 Stunden durchführt.
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