DE2619667C2 - Pharmazeutisches Mittel - Google Patents

Pharmazeutisches Mittel

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DE2619667C2
DE2619667C2 DE2619667A DE2619667A DE2619667C2 DE 2619667 C2 DE2619667 C2 DE 2619667C2 DE 2619667 A DE2619667 A DE 2619667A DE 2619667 A DE2619667 A DE 2619667A DE 2619667 C2 DE2619667 C2 DE 2619667C2
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Description

gemäß Patent 24 56 589, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein sulfathaltiges Polysaccharid in Mengen von IO bis 30 Gew.-%, bezogen auf den als Protein bestimmten Aktivator, enthält.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfathaltige Polysaccharid ein Dextransulfat
3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Dextransulfat ein Molekulargewicht zwischen 3000 und 15 000 aufweist und 10 bis 20% Schwefel enthält.
4. Mittel nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivalor und das sulfal-.15 haltige Polysaccharid in Form eines Komplexes vorliegen, der gewonnen ist durch Zugabe des sulfatierten Polysaccharids zum Plasminogen-Aktivator in Lösung bei einem pH-Wert nahe dem Neutralpunki, und anschließende Ausfällung des Komplexes durch Ansäuern der Lösung auf einen pH-Wert von 6.
Die Erfindung betrilTt eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des pharmazeutischen Mittels gemäß Patent 24 56 589.
Gegenstand des Patents 24 56 589 ist ein pharmazeutisches Mittel mit einem Gehalt an einem Plasminogen-Aktivator, der dadurch erhalten wird, daß man Acetonpulver aus tierischen Organen, welches aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen oder aus Schweine-, Rinderoder Schafeierstöcken besteht, behandelt durch
a) Suspendieren des angegebenen Pulvers in einer wäßrigen Salzlösung schwacher lonenstärke bei neutralern pH-Wert,
b) Aufnahme des in Verfahrensstufe a) erhaltenen Niederschlags in einer wäßrigen Salzlösung mit einer lonenstärke zwischen 0,6 bis 1 bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5,
c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in Verfahrensstufe b) erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes oder eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5,
d) Aufnahme des in Verfahrensstufe c) erhaltenen Niederschlags in Wasser oder einer Salzlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert nahe oder leicht über 7 und
e) Aufnahme des in Verfahrensstufe d) erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse der erhaltenen Lösung bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm · cm bei 100C,
wobei man vorzugsweise in Verfahrensstufe a) als Salz Kaliumacetat oder Kaliumchlorid in Konzentratio-
w) nen zwischen 1 und 10 g/l einsetzt oder
in Verfahrensstufe b) Kaliumchlorid, -acetat oder -sulfat in Konzentrationen zwischen 20 und 80 g/l einsetzt oder
in Verfahrensstufc c) als Salz Ammoniumsulfat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen 100 und ψ
200 g/l verwendet oder V
<i5 in Verfahrensstufe d) als Salz Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat verwendet oder ir
die Verfahrensstufen a) und b) bei 4°C durchführt oder als tierisches Organ Mutterschweineierstöcke ?*.;
einsetzt. '.1J
Es wurde nun gefunden, daß sich die Aktivität des im Hauptpatent beschriebenen pharmazeutischen Mittels stark erhöhen läßt durch Kombination des als aktive Komponente vorliegenden Plasminogen-Aktivators mit einem sulfathaltigen Polysaccharid.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein pharmazeutisches Mittel gemäß Patent 24 56 589, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich ein sulfathaltiges Polysaccharid in Mengen von 10 bis 30 Gew.-%, bezogen auf den als Protein bestimmten Aktivator, enthält.
In besonders vorteilhafter Weise wird als sulfathaltiges Polysaccharid ein Dextransulfat, das vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen 3000 und 15 000 aufweist und 10 bis 20% Schwefel enthält, verwendet.
Das sulfathaltige Polysaccharid ist erfindungsgemäß entweder in Form einer einfachen Vereinigung mit dem Plasminogen-Aktivator, die durch einfaches Vermischen der beiden Verbindungen erhalten wird, oder in Form eines Komplexes mit dem Plasminogen-Aktivator verwendbar. Versuche haben gezeigt, daß die Aktivitäten der einfachen Vereinigung und des Komplexes sehr ähnlich sind.
Vorzugsweise wird das sulfathaltige Polysaccharid in Mengen von 20 Gew.-%, bezogen auf den Aktivator, der als Protein bestimmt ist, angewandt.
Das erfindungsgemäß verwendbare sulfathaltige Polysaccharid kann nach üblichen bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Veresterung eines Polysaccharids mit einer schwefelhaltigen Mineral-oder organischen Säure in Gegenwart einer das Wasser bindenden Base. Das erfindungsgemäß verwendbare Dextransulfat ist herstellbar durch Abbau des Dextrans in der Warme in schwefelsaurem Milieu zur Verminderung des Molekulargewichts des Dextrans und anschließende Veresterung des erhaltenen Dextrans mit Chlorsulfonsäure in Pyridin.
Wird die aktive Komponente des erfindungsgemäßen Mittels in Form eines Komplexes angewandt, so erfolgt die Komplexbildung bei einem pH-Wert nahe dem Neutralpunkt durch Zugabe der erforderlichen Menge an sulfatiertem Polysaccharid zu dem in Lösung befindlichen Aktivator, worauf der pH-Wert der Lösung allmählich angesäuert wird bis auf einen Wert nahe 6, wodurch die Ausfallung des gewünschten Komplexes bewirkt wird. Nach Isolierung des Niederschlags kann dieser in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7 erneut gelöst und anschließend lyophilisiert werden.
Bei der Komplexbildung wird vorzugsweise Phosphorsäure zur Erniedrigung des pH-Wertes der Lösung verwendet und die Ausfallung wird bei etwa +40C durchgeführt.
Vorzugsweise erfolgt das Suspendieren des Acelonpulvers in der Verfahrensstufe a) in einer Acetatpufferlösung mit einer lonenstärke zwischen 0,01 und 0,1 bei ungefähr neutralem pH-Wert. Die Aufnahme des in der :·ο Verfahrensstufe a) erhaltenen Niederschlags kann in einer AcetatpufTerlösung mit einer lonenstärke zwischen 0,6 und 1 bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5 erfolgen. Die Aufnahme des in der Verfahrensstufe c) erhaltenen Niederschlags kann ebenfalls in einer AcetatpufTerlösung erfolgen.
Die Reinigung des in der Verfahrensstufe d) erhaltenen Niederschlags erfolgt vorzugsweise durch Ausfällung des Plasminogen-Aktivators beim isoelektrischen Punkt, d. h. bei einem pH-Wert zwischen 6,3 und 6,5. und bei .-5 einem spezifischen Widerstand der Lösung in der Größenordnung von 450 Ohm · cm, und durch Chromatographie des erhaltenen Niederschlags nach Lösen desselben. Die angewandte Chromatographie ist vorzugsweise eine Affinitätschromatographie.
Wie im Verfahren gemäß Hauptpatent handelt es sich bei dem zur Ausfällung in den Verfahrensstufen (c), (d) und (e) verwendeten Salz vorzugsweise um kristallines Ammoniumsulfat. Wird in Verfahrensstufe (c) als Aus- -40 fällsalz Ammoniumsulfat verwendet, so wird es in einer Konzentration von 200 bis 300 g/l angewandt, während es in den Verfahrensstufen (d) und (e) in einer Konzentration von 60 bis 80 g/l eingesetzt wird.
Das als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Plasminogen-Aktivators dienende Acetonpulver wird vorzugsweise wie folgt hergestellt:
Nach dem Auftauen und Zerkleinern werden die behandelnden Organe in einem Acetonbad bei einer Temperatur unter - 100C dispergiert und kräftig gerührt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird filtriert und der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und anschließend unter StickstofTatmosphäre getrockne·.
Im einzelnen kann man die Behandlung des Acetonpulvers wie folgt durchführen:
1) Vorwaschen des Acetonpulvers
Das Acetonpulver wird in einer AcetatpufTerlösung einer lonenstärke in der Größenordnung von 0.02 suspendiert, wobei der pH-Wert der Lösung nahe dem Neutralpunkt liegt. Die erhaltene Suspension wird 1 Stunde lang bei +4°C gerührt, worauf der Rückstand aus Acetonpulver getrocknet und die überstehende Lösung verworfen wird.
2) Extraktion
Der erhaltene Rückstand wird in einer AcetatpufTerlösung mit einem pH-Wert von 3 bis 5 suspendiert und die erhaltene Suspension wird 3 Stunden lang bei +40C gerührt. Nach dem Trocknen wird der Rückstand des nicht mi extrahierten Pulvers abgetrennt und die isolierte Lösung durch eine Klärvorrichtung geschickt.
c) Erste Ausfällung in saurem Milieu
Der in Vcrfahrcnsstulc (b) anfallende geklärte Extrakt wird in saurem Milieu bei einem pH-Wert von etwa 4.5 <o ausgefällt durch Zugabe von Ammonsulfat in einer Konzentration zwischen 290 und 300 g/l, und der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in einer AcetatpulTcrlösung gelöst, worauf der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf einen Wert zwischen 7 und 8 erhöht wird mit Hilfe von konzentrierter Natronlauge.
,■' d) Zweite Ausfällung in schwach basischem Milieu
Die erhaltene Lösung wird erneut ausgefällt durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Konzentration zwischen etwa 60 und 80 g/L Nach Durchleiten durch eine Klärvorrichtung wird der inaktive Niederschlag verworfen und die erhaltene Lösung auf ein>;n pH-Wert von etwa 7 gebracht
e) Dritte Ausfällung nahe dem Neutralpunkt
Die erhaltene Lösung wird ein drittes Mal ausgefallt durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Konzentration zwischen 60 und 80 g/l. Der gebildete Niederschlag wird in einer Klärvorrichtung abgetrennt und mit neutralem flftstilliertem Wasser gewaschen.
Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser dispergiert und die erhaltene Lösung wird auf einen pH-Wert von 4 angesäuert Nach Zentrifugation wird der erhaltene Überstand mehrere Male mit destilliertem Wasser verdünnt bis ein spezifischer Widerstand von 600 bis 650 Ohm · cm erreicht ist.
Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird sodann auf einen Wert zwischen 6,3 und 6,5 gebracht unter Erzie-"1^ lung eines spezifischen Widerstands in der Größenordnung von 450 Ohm - cm.
Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in einer Phosphatpufferlösung dispergiert. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung, der sodann nahe dem Neutralpunkt liegt, wird mit Hilfe einer Base auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt und anschließend auf einen ungefähr neutralen pH-Wert gebracht.
Die nach Zentrifugation erhaltene Lösung wird sodann isoliert. Die dabei erhaltenen Lösung wird einer Affinitätschromatographie unterworfen.
Das bei der Chromatographie verwendete Trägermaterial ist solches vom Typ »AH-Sepharose 4 B«, auf welchem zuvor ein spezifischer Inhibitor für den Plasminogen-Aktivator mit Hilfe eines Carbodiimide aufgekuppelt wurde.
Typische geeignete Inhibitoren sind z. B. f-Aminocapronsäure, Aminoäthylcyclohexansäure, trans-4-Aminoäthyl-cyclohexancarbonsäure und p-Aminomethylbenzoesäure.
Die Affinitätschromatographie ist auch auf einem mit CNBr aktivierten Sepharose-Trägermaterial durchführbar, auf welchem Lysin oder eine der angegebenen Verbindungen fixiert werden kann. Selbstverständlich ist es ^o auch möglich, andere Trägermaterialien zu verwenden, auf welchen ein derartiges Aufkuppeln oder Aufpfropfen realisierbar ist, z. B. Materialien aus der Reihe der Biogele.
Die auf das Trägermaterial gebunden gebliebene Fraktion wird mit Hilfe eines lonenstärke-Gradienten eluiert. Das erhaltene Eluat wird auf Proteingehalt und Aktivität untersucht nach den weiter unten beschriebenen Methoden.
.'5 Die erhaltene Lösung wird bei einem in der Nähe des Neutralpunkts gelegenen pH-Wert mit einem sulfathaltigen Polysaccharid in einer Menge von 20%, bezogen auf die Menge an in der Lösung vorhandenem Protein versetzt; die erhaltene Lösung wird sodann angesäuert bis zu einem pH-Wert nahe 6. Der Plasminogen-Aktivator fällt dabei in Form eines Komplexes mit dem sulfatierten Polysaccharid aus. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, danach in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert nahe 7 gelöst und anschüe-Bend lyophilisiert.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.
Beispiel
10 kg bei -200C aufbewahrte Mutterschweineierstöcke wurden bei -50C erweichen gelassen und anschließend mit Hilfe eines Fleischwolfs einer Gitteröffnungsweite von 5 mm zerkleinert. Das zerkleinerte Produkt wurde in 75 I Aceton bei -200C dispergiert. Nach 1 Stunde langem kräftigem Rühren wurde die Suspension auf einem Buchner-Trichter filtriert und der Filterkuchen wurde auf dem Filter mit Aceton von -200C gespült. Danach wurde der Filterkuchen entnommen und in einer Säule mit einem aufsteigenden Strom trockenen Stick-Stoffs getrocknet. Es wurden 1,3 kg Acetonpulver erhalten, das bei +40C aufbewahrt werden konnte.
a) Das erhaltene Acetonpulver wurde in 30 I M/100-Acetatpuffer von pH 6,5 suspendiert. Es wurde I Stunde lang bei +4°C kräftig gerührt und anschließend die Feststoffe von der Flüssigkeit getrennt. Die Organteile wurden isoliert und das Filtrat verworfen. Die Organe wurden sodann erneut in 10 I des angegebenen Acevatpuffers suspendiert, worauf die Suspension 15 Miruten lang bei +40C gerührt und anschließend abgeschleudert wurde.
b) Nach dem Abschleudern wurden die Organe in 30 1 0,3 M-Acetatpuffer von pH 4,2 bei +40C suspendiert und das ganze wurde 3 Stunden lang bei +40C leicht gerührt.
Danach wurde abgeschleudert und die Organteile wurden verworfen. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Klärvorrichtung geleitet zur Entfernung der suspendierten Feinteile. Der erhaltene geklärte Extrakt wurde isoliert.
c) Der Extrakt wurde in einer Konzentration von 250 g/l mit kristallinem Ammonsulfat versetzt. Es wurde bis zur vollständigen Lösung gerührt und anschließend eine Nacht lang bei +40C stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wurde aus der Klärvorrichtung isoliert und die Mutterlaugen wurden verworfen. Der Niederschlag wurde sodann gelöst durch 1 Stunde langes Rühren in 8 10,1 M-AcetatpuffervonpH4,2 bei +40C. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit konzentrierter Natronlauge auf 7,5 gebracht.
ft5 d) Die aufeinen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung wurde in einer Konzentration von 64 g/l mit kristallinem Ammoniumsulfat versetzt, worauf der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,2 eingestellt wurde. Es wurde 30 Minuten lang bei +40C stehen gelassen. Nach Durchleiten durch eine !«Gärvorrichtung wurde der inaktive Niederschlag verworfen und die geklärte Lösung aufeinen pH-Wert von 6,5 gebracht.
e) Die erhaltene Lösung wurde in einer Konzentration von 72,5 g/l mit Ammonsulfat versetzt unter Aufrechterhaltung des pH-Werts mit Hilfe von N-Natronlaugc. Es wurde bis zur vollständigen Lösung gerührt, worauf 1 Ii Stunde lang bei +4t stehen gelassen wurde. Nach Behandlung in einer Klärvorrichtung wurde die Lösung verworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde aufder Klärvorrichtung gewaschen durch Durchleiten von 2,5 I neutralem destilliertem Wasser. ' s
0 Der gewaschene Niederschlag wurde sodann in 500 ml destilliertem Wasser dispergierl.
Bis zur Erreichung eines stabilen pH-Werts von 4,3 wurde verdünnte Essigsäure zugegeben, worauf I Stunde lang bei +40C gerührt wurde. Nach Zentrifugation wurde der erhaltene unlösliche Anteil verworfen und der Überstand mit destilliertem Wasser auf das 5- bis 8lache verdünnt bis zur Erzielung eines spezifischen Widerstands von 600 bis 650 Ii |()
Der pH-Wert des erhaltenen Überstands wurde sodann auf 6,3 bis 6,5 erhöht durch Zugabe von 0,5 N-Natronlauge unter Erzielung eines spezifischen Widerstands von 450 ii Dergebildetc Niederschlag wurde durch Zentrifugation sofort isoliert und der Überstand wurde verworfen.
Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml M/15-Phosphatpu(Ter von pH 7,2 bei +40C dispergiert, worauf der pH-Wert auf 9,5 bis 10 mit Natronlauge (3 N) erhöh! wurde. Es wurde 20 Minuten lang kräftig gerührt, bevor ! s der pH-Wert mit verdünnter Phosphorsäure auf 7,3 gebracht wurde. Danach wurde 30 Minuten lang stehen gelassen und anschließend zentrifugiert.
Der unlösliche Anteil wurde verworfen und der Überstand wurde durch eine Säule geleitet, die ein Trägermaterial vom Typ »AH-Sepharose 4B« enthielt.
Nach Bestimmung des Proteingehalts (der zwischen 2,5 und 3 mg/ml lag) wurde das 2fache des Proteingewichts an Glycin zugesetzt, worauidie Aktivität bestimmt wurde. In diesem Verfahrensstadium wurden 0,5 bis 0,6 g Proteine mit einem Gehalt zwischen 3000 und 4000 CTA-Einheiten/mg erhalten. Diese Einheit wurde 1964 durch das Komitee für thrombolytische Mittel (National Heart Institute) restgelegt. Die CTA-Einheit basiert aufder Aktivität eines Standard-Urokinasepräparats, das separat in verschiedenen Laboratorien getestet wurde. Das Standard-Urokinasepriiparat wurde ferner mit Hilfe des synthetischen Substrats N-Acetyl-L-lysin- ->5 methylester (ALME) bestimmt. Eine Urokinase-Einheit setzt 5 x 10 4 Mikromol/CTA-Einheit/Minute bei 370C frei (vgl. Methods in Enzymology, Bd. XlX, S. 666).
Nach Bestimmung des Proteingehalts und der Aktivität wurde die aktive Fraktion mit Dextransuirat versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde sodann mit verdünnter Phosphorsäure allmählich aul"5,8 bis 5,9 erniedrigt. Es wurde 30 Minuten lang bei +4°C stehen gelassen und anschließend zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag H) wurde isoliert und der Überstand verworfen. Der erhaltene Komplex wurde in einer Pufferlösunn von pH 7 bis 7,5 gelöst und anschließend lyophilisiert.
Im folgenden werden die Arbeitsweise und die angewandten Bestimmungsmethoden zur Feststellung der Ergebnisse experimenteller Untersuchungen angegeben.
Die in vivo-Versuche zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität eines Plasminogen-Aktivators können an der Ratte durchgeführt werden durch Messung der Lysiszeit der Plasma-Euglobuline. Diese einfache, reproduzierbare und mit kleinen Versuchstieren durchführbare Bestimmungsmethode wurde dem Wirkungsmechanismus des zu untersuchenden Produktes angepaßt.
Prinzip
Die Lysiszeit eines Plasma-Euglobulingerinnsels stellt eine empfindliche Methode dar zur Beurteilung einer Global-Lysisaktivität.
Zur Durchführung wird die Ionenstärke des Plasmas erniedrigt durch Verdünnen mit destilliertem Wasser von saurem pH-Wert, die Euglobuline werden ausgefällt, während die Pseudoglobuline im Überstand verbleiben.
Aus diesem Überstand werden außerdem die die Fibrinolyse hemmenden Antiplasmine entfernt (woraus eine größere Empfindlichkeit der Methode resultiert). Unter den ausgefällten Euglobulinen findet sich praktisch die Gesamtmenge an Fibrinogen, Plasminogen und Plasminogen-Aktivator.
Durchführungstechnik
Blutentnahme
Das entnommene Blut wurde in eine 3,8%ige Lösung von Trinatriumcitrat ■ 5,5 H,0 im Verhältnis von 1/5 eingebracht (ab seiner Entnahme muß das Blut in schmelzendem Eis aufbewahrt werden und die Durchführung der Bestimmung muß innerhalb einer Stunde ab Entnahme erfolgen). Das Blutplasma wurde durch 10 Minuten lange Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit erhalten.
Reagentien
- Michaelis-Puffer von pH 7,35
- Essigsäure, l,6%ige Lösung, die bei Gebrauch frisch verdünnt wird auf 1 /100 mit auf 4°C gekühltem destil- Heitern Wasser
- Thrombaselösung mit 20 Mellanby-Einheiten pro ml in 0,05 M-Calciumchloridlösung. 1 Ampulle ROUSSEL-Thrombase enthält 500 Mellanby-Einheiten und wird in 25 ml 0,05 M-CaCl2-Lösung gelöst Zur Herstellung der 0,05 M-CaClj-Lösung werden 5 ml 0,25 M-CaCl2 (STAGO) mit 20 ml destilliertem Wasser versetzt.
Die wie angegeben erhaltene Thrombaselösung wurde in 2 ml-Fraktionen unterteilt, die im Tiefkühlschrank aufbewahrt und bei Gebrauch aufgetaut wurden.
Durchführungsmcthode
In ein konisches Zentrifugierglas wurden 0.5 ml Plasma eingebracht,
es wurden langsam und unter Rühren 9,5 ml 0,016%ige, aul"4°C gekühlte Essigsäurelösung zugegeben, - durch Umwenden nach Abdecken mit Pa mil Im wurde gemischt,
20 Minuten lang wurde bei 41XT stehen gelassen,
10 Minuten lang wurde bei 3500 UpM zentrifugiert,
der Überstand wurde entfernt,
die Röhrchen wurden auslaufen gelassen durch Umwenden auf Filterpapier.
U) - die Röhrchenwände wurden sorgfältig getrocknet unter Vermeidung des Berührens des am Röhrchenboden befindlichen Niederschlags,
der Euglobulinkuchcn wurde in 0,5 ml MichaelispulTcr aufgenommen,
nach vollständiger Lösung wurden 0,25 ml der erhaltenen Euglobulinlösung in ein I lämolyseröhrchen eingebracht,
- das Röhrchen wurde in ein Wasserbad von 37°C eingebracht,
- der Calciumgehalt wurde erneuert durch 50 μ! calciumhaltige Thrombaselösung (von 20 F./ml),
- die Stoppuhr wurde in Gang gesetzt ab Eintreten der Koagulation und
- das Gerinnsel wurde regelmäßig beobachtet und die Zeit bis zu seiner vollständigen Zersetzung (ein Aussehen wie Schneeflocken in einer klaren Flüssigkeit) wurde gemessen.
Tierversuche
Männliche Ratten des Stammes »Iffa-Credo«. die seil der letzten Fütterung etwa 16 Stunden nüchtern waren und nach den durchgeführten Untersuchungenein Körpergewicht zwischen 180 und 25.Og aufwiesen, wurden in Versuchsgruppen unterteilt und in gleicher Weise behandelt.
Die Versuchsratten für Vergleichsbestimmungen erhielten durch Injektion in die Penisvene pro 100g Körpergewicht 1 ml Phosphalpuffervon pH 7,2 oder physiologische Kochsalzlösung, je nachdem in welchem dieserTrägermittei das zu untersuchende Produkt gelöst war.
Die behandelten Ratten erhielten durch Injektion in die Penisvene pro 100g Körpergewicht 1 ml des zu untersuchenden Produktes in Form einer Lösung in solcher Konzentration, die zur Erzielung dergewünschten Dosierung erforderlich war.
Genau 15 Minuten nach den verschiedenen Injektionen wurden die Ratten leicht mit Äther anästhesiert, der Thorax wurde geöffnet und das Blut wurde durch direkte Punktion aus der Herzkammer entnommen. Das Blut wurde sodann nach der oben beschriebenen Technik behandelt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen aufgeführt. Bei dem in den Versuchen verwendeten Dextransulfat handelte es sich um ein Kalium-Hydrodextran der folgenden Formel:
)| O CH,
l_0
OSO1K ((θ H ))— O
HO
OSO1K
-CH2 ) O
HO
• \ N
OH
OSO1K
Versuch 1
Von Dextransulfat entfaltete Aktivität
55 Vergleich Lysiszcit in Minuten 85 108 115 108 Mittelwert
Dextransulfat 115 120 110 110 50 120 108,5
1 mg/kg 73 120 97,1
60 Dextransulfat 100 95 90 108
2 mg/kg 93 105 98,5
Die Ergebnisse zeigen, daß Dextransulfat in den angewandten Dosen keine merkliche Aktivität entfaltet.
Versuch 2
Aktivität des Plasminogen-Aklivators allein im Vergleich zu der crllndungsgcmäß verwendbaren Kombination
In allen Versuchen Sind die angegebenen Mengen an Aktivator Proleinkonzenirationen. Dieser Versuch wurde mit Blindversuch durchgeführt.
Lysis/.cit in Minuten
MiIIeI-wcrt
Wirkuni·
Vergleich 120 155 120 135 130 - 128
Aktivator 70 85 100 100 85 92 88.7 30.7
10 mg/kg
Aktivator 65 52 45 45 35 - 48.4 62,1
10 mg/kg + Dextransulfat 2 mg/kg
Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Lösung mehr als doppelt so aktiv ist wie die nur den Plasminogen-Aktivator enthaltende Lösung.
Versuch 3
Lysiszeit in Minuten
Mittelwert
Wirkuni;
Vergleich 145 135 130 145 150
Aktivator 125 115 120 105 110
5 mg/kg
Aktivator 85 100 85 70 75
5 mg/kg
+ Dextransulfat
1 mg/kg
Die erhaltenen Ergebnisse sind die gleichen wie in Versuch 2. Versuch 4
140.8
115
85.8
18..
Lvsis7cit in Minuten 75 65 95 S5 Mittel %
100 65 70 50 wert Wirkung
Vergleich 83 80 48 55 55 79,6
Aktivator
5 mg/kg 		67 100 81,2 -
Aktivator
5 mg/kg
+ Dextransuifut
1 mg/kg 		48 53 51.5 35,3
Die Ergebnisse zeigen, daß bei der verwendeten Dosierung weder die aktive Fraktion noch das verwendete Dextransulfat eine merkliche Aktivität entfaltet, daß demgegenüber jedoch eine Kombination dieser beiden Verbindungen eine gute und eindeutige Aktivität in der Größenordnung von 35% bewirkt.
Versuch 5
Vergleich zwischen der Aktivität einer einfachen Vereinigung und eines Komplexes gcmiiB vorliegender
Erfindung
Lvsis/cit in Minuten
Mittel- %
wert
Wirkung
Vergleich 145 140 135 103 -
Komplex 85 70 95 75 95
Vereinigung 85 80 85 95 80
130,75 -
85 35
85 35
Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivitäten der einfachen Vereinigung und des Komplexes praktisch gleich sind.
Aus den angegebenen Versuchen ergibl sich, daß die erllndungsgemiißc Kombination eines sulfatierten Polysaccharide und eines Piasminogen-Aktivaiors ein pharmazeutisches Mittel ergibi, das sich in besonders vorteilhafter Weise zur Behandlung von zahlreichen Kreislaulerkrankungen eignet, z. B. insbesondere von arteriellen oder venösen Thrombosen.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Pharmazeutisches Mittel mit einem Gehalt an einem Plasminogen-Aktivator, der dadurch erhalten wird, daß man Acetonpuh'cr aus tierischen Organen, welches aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen oder aus Schweine-, Rinder- oder Schafeierstöcken besteht, behandelt durch
a) Suspendieren des angegebenen Pulvers in einer wäßrigen Salzlösung schwacher loncnstärke bei neutralem pH-Wert,
b) Aufnahme des in Verfahrensstufe a) erhaltenen Niederschlags in einer wäßrigen Salzlösung mit einer Ionenstärke zwischen 0,6 bis 1 bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5,
c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in Verfahrensstufe b) erhaltenen Lösung durch Zugabe ekies Salzes oder eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5,
d) Aufnahme des in Verfahrensstufe c) erhaltenen Niederschlags in Wasser oder einer Salzlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert nahe oder leicht über 7 und
e) Aufnahme des in Verfahrensstufe d) erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse der erhaltenen Lösung bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm cm bei 100C, wobei man vorzugsweise in Verfahrensstufe a) als,Salz Kaliumacetat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen 1 und 10 g/l einsetzt oder
in Verfahrensstufe b) Kaliumchlorid, -acetal oder -sulfat in Konzentrationen zwischen 20 und 80 {!/leinsetzt oder
in Verfahrensstufe c) als Salz Ammoniumsulfat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen 100 und 200 g/l verwendet oder
in Verfahrensstufe d) als Salz Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat verwendet oder die Verfahrensstufen a) und b) bei 4°C durchführt oder als tierisches Organ Mutterschweineierstöcke einsetzt,
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