AT215599B - Verfahren zur Herstellung eines Plasmapräparates zur Frühdiagnose des Karzinoms - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines Plasmapräparates zur   Frühdiagnose   des Karzinoms 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmapräparates, welches bei der Durchführung eines bestimmten   blochemischentestes zur Frtihdiagnose des Karzinoms   Verwendung findet. 



  Es ist bekannt, dass sich im Blut von Krebskranken und Krebsdisponierten Abwehrfermente, sogenannte 
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    bilden,deren Anwesenheit sich   durch Blauviolettfärbung mit Ninhydrin nachweisen lässt. Auf diesen Gegebenheiten wurde bereits früher   einTest aufgebaut, bei   welchem   dieLösungen vonTierfibrin   und einem Calciumsalz dem Harnferment der zu testenden Person zugesetzt wurden. Nach etwa 16 Stunden bei Brutschranktemperatur wurde der Abbau durch die Ninhydrinreaktion nachgewiesen. War die zu testende Person krebskrank oder krebsdisponiert, so trat innerhalb einer bestimmten Zeit eine Blauviolettfärbung ein. War diese Person gesund, so trat die Blauviolettfärbung entweder gar nicht oder erst später ein. 



   Es ist bereits ein gefriergetrocknetes pulverförmiges Plasmapräparat mit einem Gehalt an Fibrinogen und Natriumchlorid bekannt, welches sich durch eine gute Löslichkeit und Stabilität auszeichnen soll. 



  Dasselbe wird in   der Weise gewonnen, dass manBlutplasma   zu einem Kuchen einfriert, nahe bei   00C   langsam auf einem Netz liegend auftaut, wobei das Prothrombin und nahezu das gesamte Fibrolysin zusammen mit etwa   20-30o   des ursprünglich vorhandenen Fibrinogens durch das Netz gehen, das am Netz verbliebeneFibrinogen mit der Hälfte seines Volumens an 0,   9%iger NaCl-Lösung   bei   00C   fünfmal nacheinander wäscht und zentrifugiert, das verbliebene Fibrinogen bei   350C   in physiologischer Kochsalzlösung löst und darin   11/2 - 3   Stunden lang zentrifugiert.

   Das nunmehr in der klaren Lösung befindliche Fibrinogen besteht zu   85 - 100ago   aus reinem koagulierbarem Fibrinogen und wird durch Gefriertrocknung als das oben erwähnte weisse, gut lösliche und stabile Plasmapräparat aus der Lösung gewonnen. Dieses vorbekannte Plasmapräparat ist   zur Durchführung der Frühdiagnose   des Karzinoms mit Hilfe der Ninhydrinreaktion nicht geeignet, da die   charakteristlschcBlauviolettfärbung mitNinhydrin   auch bei fermentfreien Kontrollproben eintritt, so dass daraus ein positives oder negatives Ergebnis des Testes nicht abgeleitet werden kann. 



   Seit einiger Zeit sind Präparate im Handel, welche im wesentlichen Tierfibrin und ein Calciumsalz enthalten und als Hilfsstoffe zur Durchführung dieses Testes zur Frühdiagnose des Karzinoms verwendet werden können. Derartige Fibrinpräparate, bei welchen die Eiweisskörper durch Schlagen von Blut frischgeschlachteter Tiere und Entfernen der   sogenannten"Blutegel"sowie   durch Schütteln mit Glaskugeln und   nachfolgendesstundenlangesKochen in CalciumionenenthaltendenLösungendargestellt   bzw. von den übrigenBestandteilen des Blutes abgetrennt sind, weisen jedoch denNachteil auf, dass sie die erwähnte Blau-   violettf1 ! rbung mit Ninhydrin in   Gegenwart proteolytischer Fermente nicht mit der für derartige Teste unbedingt erforderlichen Eindeutigkeit geben.

   Bei der Durchführung des Testes ist es nämlich aus Gründen der Zuverlässigkeit unbedingt erforderlich, dass die Blauviolettfärbung auch schon bei der Anwesenheit allerkleinsterMengen proteolytischer Fermente nach einer kurzen und sehr merklich unter der erfahrungsgemässen Höchstdauer liegenden Testzeit eindeutig und ausgeprägt eintritt, während die Blauviolettfärbung bei   völliger Abwesenheit proteolytischer Fermente   gar nicht oder erst nach einer wesentlich längeren Zeitspanne als die Testdauer eintreten darf. Dieser Bedingung genügen die bekannten Präparate nicht. 



  Vielmehr tritt bei ihnen die Blauviolettfärbung auch bei Abwesenheit proteolytischer Fermente in manchen Fällen noch innerhalb der Testzeit und vielfach auch sehr zögernd ein, so dass das Ergebnis der Untersuchung zweifelhaft und unter Umständen sogar falsch ist. 

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   Erfindungsgemäss geht man bei der Herstellung des neuen Plasmapräparates so vor, dass Plasma aus Blut, zweckmässig aus Pferdeblut, unter Zusatz einer Citratlösung geschieden, vorzugsweise durch Ab-   hebern   und Zentrifugieren vom Blutkuchen getrennt, mit einer   Natriumchloridlösung   versetzt, der gewascheneNiederschlag in Wasser gelöst, der Gefriertrocknung unterworfen und gegebenenfalls nachDigerieren mit Aceton und abermaligem Trocknen in doppelt destilliertem Wasser gelöst, mit Natriumchlorid zur Einstellung eines Standardwerte in den Grenzen 200-300, für das Verhältnis   mg/cm   Natriumchlorid zu mg/cm3 Proteinstickstoff versetzt und die so eingestellte Lösung der Gefriertrocknung unterworfen wird. 



   Das so hergestellte Plasmapräparat eignet sich in hervorragender Weise zur Durchführung der genanntenReaktion und erweist sich damit als   wesentlichstesHilfsmittel zur sicheren Erkennung   des Frühstadiums von Karzinom, indem es auch bei Anwesenheit geringster Mengen proteolytischer Fermente in dem er-   wähnten Test   schon nach kurzer Zeit die typische Blauviolettfärbung in ausgeprägter Weise gibt, während das Eintreten der Färbung bei Abwesenheit der genannten Stoffe praktisch ausbleibt bzw. so beträchtlich verzögert wird, dass eine eindeutige Entscheidung über das eventuelle Vorhandensein proteolytischer Fermente ermöglicht ist. Eine wesentliche Steigerung der Schärfe des Testes lässt sich mit Plasmapräparaten erreichen, bei welchen der genannte Quotient zwischen 240 und 280 liegt.

   Vorzugsweise wird der Kliniker jedoch mit Plasmapräparaten arbeiten, deren Quotient etwa 260 beträgt. Ausgedehnte. Versuchsreihen mit derartigen Plasmapräparaten ergaben durchwegs eindeutige und daher gut verwertbare Ergebnisse. 



   Ausser dem genannten Gehalt an lyophilisiertem genuinem Fibrinogen kann das erfindungsgemäss hergestellte neue Plasmapräparat noch verschiedene andere Substanzen enthalten und es Ist in dieser Beziehung nur dadurch eine Grenze gesetzt, dass die zusätzlich vorhandenen Stoffe den Karzinomtest nicht stören dürfen. So darf das erfindungsgemässe Plasmapräparat, wenn es für den Karzinomtest verwendet wird, selbstverständlich keine Eiweissabbauprodukte, vor allem keine Aminosäuren enthalten, da ein Gehalt an diesen Substanzen zu einer sofortigen Blauviolettfärbung führen und damit den Test fälschen würde. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist vielfacher Varianten fähig und es werden im folgenden einige besonders wichtige davon näher beschrieben. So ist es vor allem zweckmässig, das Blut mit einer isotonen, sterilen, wässerigen Natriumcitratlösung im Verhältnis 4 : 1 zu vermischen und zur Scheidungdessogenannten Citraplasmas bei etwa 20 - 250C ruhig stehen zu lassen, bis sich der Blutkuchen gut abgesetzt hat. Tiefere oder höhere Temperaturen sollen möglichst vermieden werden, um   eineHämolyse   oder Autolyse von Formelemelenten möglichst zu verhindern. Um zu einem hochwertigen Plasmapräparat zu gelangen, ist es eben zweckmässig, bereits bei der Abscheidung des Blutkuchens dafür Sorge zu tragen, dass möglichst keine Reste der abzutrennenden Substanz als Verunreinigungen zurückbleiben.

   Um ganz sicher zu sein, dass diese Abtrennung vollständig ist, hebert man das Citratplasma vom Blutkuchen ab und zentrifugiert es bei Temperaturen zwischen-10 und +10 C ab. Die grösste Arbeitssicherheit wird nach den vorliegenden Erfahrungen dann erreicht, wenn man bei etwa 0 bis   +50C   zentrifugiert. 



   Eine besonders zweckmässige Ausführungsform besteht darin, dass die Citratplasmalösung, zweckmä- ssig portionenweise unter vorsichtigem Rühren und unter tunlichster Vermeidung einer Schaumbildung mit   einemHalogensalz einesErdalkalis bzw. eines   fixen Alkalis, vorzugsweise mit Natriumchlorid pro analysis, bis zur Sättigung versetzt und nach Einstellung des pH-Wertes auf 7, 2-7, 6 bei etwa   +40 C,   stehen gelassen, der gebildete Niederschlag bei etwa   0-5 C,   am besten durch Zentrifugieren, abgetrennt, vorzugsweise gelöst und der Gefriertrocknung-unterworfen wird.

   Die Reinigung kann dadurch weiter vervollständigt werden, dass der gebildete Niederschlag vor der Gefriertrocknung noch mit gesättigter Salzlösung gewaschen und abermals zentrifugiert wird. 
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 sättigter Salzlösung gründlich gewaschen wurde, wird mit einer   l-bis 10% igen   Salzlösung in einer etwa 3/5 des Volumens des ursprünglich angewendeten Blutplasmas entsprechenden Menge unter vorsichtigem Rühren digeriert, ein etwa verbleibender Rückstand wird abgetrennt und die Lösung der Gefriertrocknung unterworfen. Das so erhaltene Präparat ist als Hilfsstoff bei der Durchführung des Karzinomtestes geeignet. 



   Die Konzentrationsgrenzen der bei diesem Reinigungsschritt verwendeten Salzlösung ergeben sich ganz allgemein dadurch, dass mit sinkender Salzkonzentration auch unerwünschte Begleitstoffe aus dem Rohprodukt in Lösung gehen, welche sodann bei der Gefriertrocknung zusammen mit dem gewünschten genuinen Fibrinogen in fester Form erhalten werden, so dass das Endprodukt durch dieselben verunreinigt ist, während mit steigender Salzkonzentration ein immer kleiner werdender Anteil des gewünschten genuinen Fibrinogens in Lösung geht, so dass die Ausbeute sinkt. Praktisch wird man daher im allgemeinen innerhalb der angegebenen Grenzen arbeiten, jedoch hat es sich als zweckmässig herausgestellt, die Salzkonzentration innerhalb engerer Grenzen, nämlich zwischen 4, 5 und 7,   5%,   zu halten. Hervorragende 

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Claims (1)

1. <Desc/Clms Page number 4> 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das vorgereinigte und getrocknete ge- EMI4.1