DE2219635C3

DE2219635C3 - Insulinsalz-Protamin-Komplexe und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2219635C3
Application number: DE2219635A
Authority: DE
Inventors: Richard Lee Indianapolis Ind. Jeckson
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1971-04-30
Filing date: 1972-04-21
Publication date: 1981-10-15
Also published as: IL39181A; YU114272A; FI49773C; NO137178C; PL86966B1; ZA722243B; SU508162A3; SE378066B; FR2134658A1; RO64387A; DE2219635A1; IL39181A0; NL178258C; FI49773B; NL178258B; US3758683A; NO137178B; DD100708A5; GB1385086A; DK131760C

Description

Die derzeit verfügbaren Insulinpräparate werden nach ihrer biologischen Aktivität gewöhnlich in solche mit kurzer, mittlerer oder langer anhaltender Wirkung eingeteilt. In vielen Diabetesfällen hätte man zur therapeutischen Anwendung gerne ein Präparat, dessen Wirkung rasch einsetzt und zugleich lange anhält. Keines der im Handel erhältlichen Insulinpräparate vsrfügt jedoch nun über eine solche doppelte Wirkung zur Bekämpfung von Hyperglycämie unter Verwendung einer einzigen Injektion. Seit einigen |ahren gibt es auch ein vorgemischtes Insulinpräparat, das sowohl eine kurze als auch eine mittlere hypoglycämische Aktivität aufweist. Es besteht aus einer Lösung von Zinkinsulinkristallen, die aus Schweinepancreas stammen, und aus einer Suspension von Zink-Rinderinsulin-Kristallen mit hohem Zinkgehalt. Dieses Präparat hat jedoch den Nachteil, daß es unter bestimmten Bedingungen gelagert und auch konserviert werden muß. Andere frühere Präparate, bei denen Lösungen von Zinkinsulinkristallen oder amorphem Insulin mit Protamin-Zink-Insulin oder Protamin-Insulin-Präparaten vermischt werden, sind infolge Abbau von Protamin und auch Fällung der löslichen Insulinkomponente durch überschüssiges Protamin in der Mischung instabil. Praktisch alle handelsüblichen Insulinpräparate, die Zinkinsulinkristalle enthalten, haben somit mehr oder weniger stark ausgeprägte Nachteile, wie niedere Reinheit, Unbeständigkeit, schlechte Farbe oder Verunreinigung durch den hyperglycämischen Faktor (Glucagon) und antigene Proteine mit hohem Molekulargewicht.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von Insulinsalz-Protamin-Präparaten, die die soeben erwähnten Nachteile der bekannten Präparate nicht kennen und die sich vor allem sowohl durch eine rasch einsetzende als auch durch eine lang anhaltende hypoglycämische Wirkung auszeichnen.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch die aus den Ansprüchen hervorgehenden Insulin-Protamin-Komplexe und ihr Herstellungsverfahren gelöst.

In der Praxis werden die erfindungsgemäßen Insulinsalz-Protamin-Komplexe vorzugsweise in Form von Suspensionen in Wasser oder isotonischer Lösungen angewandt, die die vorliegenden Komplexe in solcher Menge enthalten, daß sich 90 bis 115 Einheiten Insulin auf 100 ml wäßriger Suspension oder isotonischer Lösung ergeben, wobei diese Zubereitungen zweckmäßigerweise einen pH-Wert von 6,5 bis 8 haben.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung, wie bereits erwähnt, liegt darin, daß sie eine Einzelinjektionsinsulinsuspension bietet, die beim Gebrauch ein rasches Einsetzen der Wirkung und eine verlängerte Dauer der Wirkung ergibt Weiter zeichnen sich die erfindungsgemäßen Komplexe auch dadurch aus, daß sie als solche oder in Form entsprechender Zubereitungen langzeitig ohne wesentliche Verschlechterung gelagert werden können.

Die F i g. 1, 2, 3,4 und 5 sind Diagramme, in denen die Blutzuckerwerte dargestellt sind, die sich nach Injektion von verschiedenen Insulinpräparaten bei Tipren ergeben. Die Zeit ist auf der Abszisse und der Blutzuckerspiegel des Tieres, das die Injektion erhält, auf der 3d Ordinate aufgetragen.

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Injektion von Protamin-Natriuminsulin im Vergleich zu Isophaninsulin (NPH) zeigt;

Fig 2 ist ein Diagramm, das die Wirkung der erfindungsgemäßen Komplexe oder entsprechender Suspensionen im Vergleich zu der Wirkung einer Mischung aus saurem regulärem Insulin und Isophaninsulin zeigt;

Fig. 3 ist ein Diagramm, das drei auf erfindungsge-•lo mäßen Komplexen (Rinderinsulin, Schweineinsulin und eine Mischung aus beiden) beruhende Suspensionen vergleicht;

Fig.4 ist ein Diagramm, das die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Komplexe nach Lagerung vergleicht;

F i g. 5 ist ein Diagramm, das beispielhafte erfindungsgemäße Komplexe und entsprechende Suspensionen vergleicht.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeug-

te Insulinsalz-Protamin-Komplex ist als Wirkstoff in einem hypoglycämischen Mittel vorteilhaft, das sowohl eine rasch einsetzende als auch eine lang anhaltende Wirkung hat. Das Insulinsalz ist ein Alkalisalz oder Ammoniumsalz, und das Protamin liegt vorzugsweise als Sulfat in Mengen von 0,2 mg bis 1,5 mg Protamin und vorzugsweise etwa 0,4 bis etwa 0,8 mg Protamin je 100

Einheiten Insulin vor.

Das Insulinsalz, das praktisch frei von Zink und anderen Schwermetallen ist, wird vorzugsweise durch alkalische Kristallisation des Insulins unter Verwendung von Natriumhydroxid, eines anderen Alkalihydroxids oder Ammoniumhydroxid hergestellt. Nach der Kristallisation werden die Kristalle gewaschen und auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% getrocknet. Das Insulinsalz ist in Wasser bei neutralem pH-Wert sofort löslich und kann in Lösung so lange Zeit wie 3 Monate ohne wesentliche Verschlechterung gelagert werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden das oben beschriebene Insulinsalz und Protamin in einem wäßrigen Medium in solcher Weise vereinigt, daß sich ein Komplex aus dem Insulinsalz und Protamin bildet. Das wäßrige Medium hat einen pH-Wert voi. 6,5 bis 8,0. Der jeweilige Insulinsalz-Protamin-Komplex kann von dem flüssigen Medium leicht durch .'Titration oder ähnliche Maßnahmen abgetrennt und getrocknet werden. Der Komplex kann in trockener Form mindestens 1 Jahr und langer ohne Verschlechterung gelagert werfen. Wenn der Protamin-Insulinsalz-Komplex zur Anwendung kommen soll, wird das getrocknete Material in einem wäßrigen Medium, vorzugsweise einem isotonischen Verdünnungsmittel, mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 8,0 rekonstituiert. Nach der Rekonstitution ist der Komplex injektionsfertig. Bei dem Patienten, der das rekonstituierte Präparat erhält, zeigt sich sowohl ein rasches Einsetzen der Wirkung als auch eine längere Dauer der hypoglycämischen Aktivität.

Nach einer typischen Methode zur Herstellung des Protamin-Insulinsalz-Komplexes wird das Natriumsalz von Insulin so hergestellt, daß das Natriuminsulin praktisch zinkfrei ist, d. h. weniger als etwa 0,05% Zink enthält Das Natriumsalz hat kristalline Form, ist jedoch in Wasser oder einem isotonischen Verdünnungsmittel löslich. Das Natriumsalz wird dann in dem flüssigen Medium in solchem Verhältnis gelöst, daß 90 bis etwa 115 Einheiten pro 100 ml flüssiges Medium vorliegen. Dann wird das flüssige Medium mit der richtigen Menge Protaminsulfat versetzt. Es entsteht sofort ein unlösli eher Komplex in Form eines sehr feinen Niederschlags. Der feinteilige Niederschlag bleibt in dem flüssigen Medium ziemlich gut suspendiert und eignet sich für eine leichte Injektion durch den Verbraucher. Wenn der π Komplex in dem flüssigen Medium gelagert wird, bleibt er stabil und zeigt für Zeiten von mindestens einem Jahr keinen Aktivitätsverlusl.

Wenn getrockneter Protamin-Insulinsalz-Komplex rekonstituiert wird, ist es zweckmäßig, den Komplex in die Flüssigkeit einzumischen, um den Niederschlag in dem flüssigen Medium zum Zweck der Injektion zu verteilen.

Die genaue Art der Assoziation zwischen dem Insulinsalz und dem Protamin ist nicht bekannt. Die <r> Assoziation ist jedoch genügend fest, so daß sich der unlösliche Komplex leicht von dem flüssigen Medium abtrennen und zur leichteren Verfrachtung oder für sehr lange Lagerzeiten trocknen läßt. In trockenei Form kann das Produkt unbegrenzte Zeit gelagert werden.

Zunächst wurde angenommen, daß das rasche Einsetzen der Wirkung, das bei dem Protamin-Insulinsalz-Präparat beobachtet wird, durch freies Insulin in der Mutterlauge bedingt ist. Die Analyse hat jedoch gezeigt, daß nur 0,015% der gesamten Insulinaktivität des Präparats in der löslichen Form verbleiben. Es scheint daher, daß die Assoziat'on des Insulins mit dem Protamin ziemlich locker ist und das Insulin daher leicht für die Absorption nach der Injektion verfügbar ist. Es hat ferner den Anschein, daß die Natur des Komplexes von den bekannten handelsüblichen Protamin-Zink-Insulinprodukten verschieden ist, bei denen die Dissoziation des Insulins aus dem Komplex in den Geweben wesentlich langsamer stattfindet und kein rasches Einsetzen der Wirkung beobachtet wird.

Der Protamin-Insulinsalz-Komplex wird in einem flüssigen Medjum mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 8,0 und vorzugsweise etwa Ί ,2 bis etwa 7,6 erzeugt.

Das benötigte Alkalimetallsalz von Insulin wird erhalten, indem man rohes Insulin einer Behandlung in Gegenwart von Alkalimetailionen zur Kristallisation des Insulins als AlkaJisalz unterwirft. Aus Gründen der Wirtschaftfichkeit und eines einfachen Betriebs wird Natriumhydroxid als Quelle für Alkalimetailionen, die zur Erzeugung des Alkalisalzes von Insulin verwendet werden, bevorzugt. Das Natriumsalz wird hergestellt, indem man rohes Insulin in wäßriger Lösung einer Behandlung mit Natriumhydroxid, das in genügender Menge vorhanden ist, um einen pH-Wert von etwa 8 bis 8,5 zu ergeben, unterwirft. Die Behandlung besteht darin, daß die alkalische Lösung wenigstens 15 Minuten und vorzugsweise etwa 1 Stunde oder mehr gelinde gerührt wird. Das Natriuminsulinsalz scheidet sich in der Lösung ab und läßt sich leicht durch Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen abtrennen. Das Natriuminsulinsalz kann durch anschließendes Auflösen des Salzes und erneute Erzeugung des Niederschlags, der kristallin aussieht, gereinigt werden. Die Analyse hat gezeigt, daß im Fall des Natriums-alzes von insulin etwa 1 Mol Natrium pro Mol Insulin vorliegt. Die Natriuminsulinkristalle können von Rinder- oder Schweine-Insulin stammen und sind in Wasser und isotonischen Lösungen bei pH-Werten um den Neutralpunkt sehr gut löslich.

Geeignete Alkaliionen, mit denen das Insulinsalz hergestellt werden kann, sind beispielsweise Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Natrium- sowie außerdem Ammoniumionen.

Das Protamin liegt im allgemeinen in Form von Protaminsulfat vor oder kann in anderen geeigneten wasserlöslichen Formen verwendet werden. Falls ein isotonisches Verdünnungsmittel als flüssiges Medium für das Protaminsulfat und Insulinsalz verwendet wird, enthält das Verdünnungsmittel vorzugsweise ein Konservierungsmittel. Geeignete Konservierungsmittel sind beispielsweise Phenol und Methyl-p-hydroxybenzoal.

Die biologische Aktivität des Protamin-Insulin-Komplexes wurde an Kaninchen nach folgender Methode bestimmt:

36 Kaninchen wurden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt und 24 Stunden vor dem Test fasten gelassen. Während des Tests wurde Wasser sowie Futter vorenthalten. Aus der Ohrrandvene wurde zur ersten Blutzuckerbestimmung eine Blutprobe entnommen. Der Kaninchenkontrollgruppe wurde die vorgegebene Dosis des neutralen Protamin-Hagedorn-lnsulins (NPH) injiziert. Der Testgruppe wurde der Protamin-Natriuminsulinkomplex (PSI) injiziert. In jedem der Tests betrug eine Einzeldosis 1,0 Einheiten/Kaninchen, was etwa 0,01 ecm des Insulinpräparats entsprach. Die ersten Blutproben wurden den Kaninchen jeweils nach einer V2 Stunde entnommen. Weitere Blutproben wurden 1,5, 3,0, 5,0, 7,0 und 9,0 Stunden nach der Injektion entnommen. Jede Blutprobe wurde auf den Blutzuckerspiegel analysiert und die Ergebnisse wurden in mg % Glucose angegeben. Für beide Gruppen wurde die mittlere Blutzuckerkonzentration bei jeder Blutprobenentnahmezeit berechnet.

In den Fällen, in denen ein Kreuz-Test angewandt wurde, wurde den Kaninchen, die die Kontrollprobe erhielten, der Protamin-Natriuminsulin-Komplex injiziert und umgekehrt. Diese Tests wurden eine Woche nach Beendigung der ursprünglichen Tests durchgeführt. Die Gesamtergebnisse sind als mittlere Blutzuckerkonzentration in mg % in F i g. 1 und in der folgenden Tabelle I dargestellt:

Tabelle I Blutzuckerspiegel,	mg %	0,5	1,5	3,0	5,0	7,0	9.0
	Zeit, Stunden 0	64,9 51,1	43,3 36,9	41,3 36,1	64,6 51,1	67,4 60,6	69,8 70,9
Kontrolle (NPH) PSI	83,8 80,1

Es ist zu ersehen, daß bei dem Protamin-Natriuminsulin-Komplex die Wirkung rascher einsetzt und länger anhält, als bei dem NPH-Produkt.

PSl (Protamin-Natriuminsulin) wurde mit einer Mischung aus ARI (saures reguläres Insulin) und NPH im Verhältnis 1 :1, bezogen auf die Aktivität, verglichen. Die Protaminsulfatkonzentration betrug 0,8 mg/ml.

Bei diesem Test wurden 36 Kaninchen in einer Kreuzversuchsanordnung verwendet. Jedem Kaninchen wurden etwa 0,01 ml des Insulinprodukts injiziert, so daß es eine Einheil Insulin pro Injektion erhielt. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 und in der folgenden Tabelle 11 dargestellt:

Tabelle Il Blutzuckerspiegel,	mg %	0.5	1.5	3.0	5.0	7,0	f f
	/eil. Stunden 0	45.9 59.3	34.2 47.1	43,5 45.2	71,6 51,9	84,2 58,0	i 9.0 I
ARI & NPIl PSI	88.0 87.2					88,6 64,3

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen das rasche Einsetzen der Wirkung, das mit dem Protamin-Insulin-Komplex erzielt wird, sowie seine langanhaltende Wirkung.

Drei Typen von neutralen Prolamin-Nairiuminsulin-Produkten wurden in Kombination mit 0,02 mg Zink pro 100 Einheiten Insulin verglichen. Jedes der Insulinprodukte enthielt 0,02 mg Zink pro 100 Einheiten Insulin. Durch die Zugabe des Zinks sollte festgestellt werden, ob das Zink entweder das rasche Einsetzen der Wirkung oder die verlängerte Dauer der Wirkung, die mit dem

Protaniin-Natriuminsulin-Komplex erzielt wurden, beeinträchtigt. Wie aus den folgenden Angaben zu ersehen ist, wurde kein nachteiliges Ergebnis beobachtet.

Es wurden drei Produkte verglichen, nämlich Schweineinsulin, Rinderinsulin und eine Mischung, die 75% Rinderinsulin und 25% Schweincinsulin enthielt.

Jeder Test wurde an b Kaninchen mit einer Einzelinjektion von etwa 0,01 ml, die ungefähr eine Dosis von einer Einheit Insulin ergab, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 und in der folgenden Tabelle III dargestellt:

Tabelle III Blutzuckerspiegel,	mg "/,.	1.5	3.0	5.0	7.0	9.0
	/eil. Stunden 0	41.5 40.5 42.6	44,5 37.6 35 }	55,4 53.1 38.5	73.0 60.7 53.4	76.7 65.6 63.0
Schwein Gemischt Rind	80.3 80.2 85.5

Das Schweineinsulin zeigt ein rasches Finset/en der Wirkung, seine Wirkungsdauer ist aber nicht ganz so lang wie bei den anderen Insulinprodukten. Da>Rindennsulin- und Mischprodukt ergeben dagegen eine rasch einsetzende und lang anhaltende Wirkung.

Außerdem ist zu beachten, daß dem Protamin-Natriuminsulin-Komplex eine kleine Menge Zink zugesetzt wurde. Es wurde gefunden, daß während der Bildung des Nairiumsalzes von Insulin ein z\\emenises Metall wi wie Zink nicht in irgendeiner beträchtlichen Menge vorhanden sein soll. Mit dem Zusatz des Zinks zu dem Protamin-Natriuminsuiin-Komplex sollte festgestellt werden, ob das Zink irgendeine Wirkung auf den Insulinkomplex hat oder nicht. Aus den Ergebnissen ist

hi zu ersehen, daß das Zink den therapeutischen Wert weder beeinträchtigte noch erhöhte.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläuten.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung des Prolamin-Insulin-Komplexes in zur Verabreichung geeigneter Form.

Kristallines Natriumrinderinsulin wurde wie folgt hergestellt:

Insulin wurde aus Rinderpancreas mit einem angesäuerten wäßrig-alkoholischen Medium extrahiert, durch Vakuumdestillation eingeengt und durch fraktionierte Fällung mit Natriumchlorid und isoelektrische Fällung teilweise gereinigt. Das Insulin wurde durch eine alkalische Kristallisation bei pH 8,2 weiter gereinigt. Die erhaltenen Kristalle wurden in verdünnter (0.5 n) Essigsäure gelöst und durch Filtration an Sephadex®G-50 Gel weiter fraktioniert.

Der Abfluß, der aus 0,5 η Essigsäure, die das Insulin enthielt, bestand, wurde mit 1,On Natriumhydroxid bis pH 8,2 neutralisiert und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Natriuminsulinkristalle wurden dann aus der Kristallisationsmischung durch Filtration gewonnen und mit zweiprozentiger Natriumchloridlösung gewaschen. Die mit Salzlösung gewaschenen Kristalle wurden dann unter intensivem Rühren in einen Überschuß an absolutem Alkohol gegeben, abfiltriert und gewonnen. Nach einer zweiten Wäsche mit absolutem Alkohol wurden die Kristalle mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Das erhaltene kristalline Natriumrinderinsulin wies folgende Merkmale auf:

Aktivität
Stickstoff
Feuchtigkeit
Farbindex

25,08 Einhciten/mg

15,82%

8,0%

0,005 für Iprozentige

Lösung bei 340 nm

Ein Anteil des getrockneten Natriuminsulins von 3.98 g wurde in 990 ml pyrogenfreiem Wasser gelöst, das 2,27 g verflüssigtes Phenol und 1,5 ml lOprozentige HCl enthielt. Dann wurde der pH-Wert mit 1.7 ml lOprozentiger NaOH auf 7.4 eingestellt. Immunotests, die nach der U.S.P.-Standardprüfmethode durchgeführt wurden, ergaben eine Insulinaktivität von 101,3 Einheilen/ml. Diese Lösung wurde steril filtriert und dann in Phiolen in einer Menge von 1,0 ml pro Phiole abgefüllt. Die Phiolen wurden einer Gefriertrocknung unter aseptischen Bedingungen unterworfen, wodurch in jeder Phiole getrocknetes Natriuminsulin erhalten wurde. Das Insulin wurde in dieser Form bis zur Verwendung für Tests aufbewahrt.

In jede Phiole wurde eine genügende Menge eines isotonischen Verdünnungsmittels injiziert, um das Insulin in einem wäßrigen Medium so zu rekonstituieren, daß 101,3 Einheiten Insulin/ml flüssiges Medium vorlagen. Das isotonische Verdünnungsmittel enthielt

H 0,4 mg Protaminsulfat/ml, 1,6% Glycerin und 0,25% Phenol (Gewicht/Volumen). Der pH-Wert des isotonischen Verdünnungsmittels betrug 7,4. Bei Zugabe der isotonischen Flüssigkeit zu dem getrockneten Natriuminsulin in der Phiole fand augenblickliche Bildung des Protamin-Natriuminsulin-Komplexes statt. Dieser Komplex ließ sich in der Phiole als sehr feinteihger Niederschlag erkennen. Der Niederschlag blieb in dem wäßrigen Verdünnungsmittel genügend gleichmäßig suspendiert, so daß beim Aufziehen in eine Injektionsspritze eine gleichmäßige Menge Insulin in jedem entnommenen Anteil vorlag.

Beispiel 2

jo Dieses Beispiel erläutert die ausgezeichnete Stabilität des Protamin-Insulin-Komplexes. Das in diesem Beispiel verwendete neutrale PSl wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das isotonische Verdünnungsmittel 1.2 mg Protamin pro ml enthielt.

j-5 Jeder Test wurde an 9 Kaninchen durchgeführt. Die Zusammensetzung, nämlich der in dem isoionischen Verdünnungsmittel suspendierte Protamin-Natriuminsulin-Komplex wurde in dem Intervall zwischen den Tests bei 25°C aufbewahrt. Wie vorher wurden den Kaninchen 0.01 ml des Insulinprodukts injiziert.

Die Ergebnisse sind in F i g. 4 .und in der folgenden Tabelle IV dargestellt:

Tabelle IV	mg "/..	1.5	3,0	5.(1	7.0	9.0
Blutzuckerspiegel,	/cit. Stunden	51,2	43,4	54.0	59,5	65,8
	(I	49,3	43,2	48,4	52,1	61,2
	91.0	45,0	33.5	37,6	48,9	54.6
Am Anfang	84.1	40,9	29,8	36.6	45.7	55,8
Nach 1 Woche	78.3
Nai-h 2 Wochen	95,3
Nach 4 Wochen

Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen deutlich, daß selbst nach Lagerung der isotonischen Lösung, die den Protamin-Natriuminsulin-Komplex suspendiert enthält, bei 25" C eine bemerkenswerte Stabilität der Insulinaktivität bezüglich der Erhaltung des raschen Einsetzens der Wirkung und der langanhaltenden Dauer der Wirkung festgestellt wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Erzeugung und Verwendung des Protaminkomplexes von Ammoniuminsulin. Lithiuminsulin und Kaliuminsulin sowie des Natriuminsulinsvon Beispiel 1.

Jedes der genannten Insulinsalze wurde nach der

Arbeitsweise von Beispiel 1 erzeugt, mit einer isotonischen Lösung, die 0,4 mg Protaminsulfat pro ml enthielt, vermischt und wie in Beispiel 1 18 Kaninchen

10

injiziert. Die Ergebnisse sind in Fig.5 und in der folgenden Tabelle V dargestellt.

Tabelle V	mg %	1,5	3,0	5,0	7,0	9,0
Blutzuckerspiegel,	Zeit, Stunden	42,1	51,6	81,5	79,4	88,9
	0	38,6	38,6	60,2	75,9	81,1
	86,1	42,9	50,8	67,1	74,6	79,4
Ammonium	87,1	36,9	36,1	51,1	60,6	70,9
Lithium	86,6
Kalium	80,1
Natrium

Das Natriuminsulin zeigt zwar eine langer anhaltende Wirkung, jedes der anderen Mittel ergibt jedoch eine beträchtliche Senkung der Blutzuckerspiegel.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die Stabilität des Protamin-Natriuminsulin-Komplexes.

Der Komplex wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 0,4 mg/ml Protaminsulfat in dem isoto.iischen Verdünnungsmittel hergestellt. Nach Herstellung des Komplexes wurde der Komplex in mehrere Zentrifugenröhrchen gegeben. Dann wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Der abgeschiedene Niederschlag wurde mit etwa 15 ml absolutem Alkohol und anschließend mit etwa 15 ml Äther gewaschen. Dann wurde der gewaschene Niederschlag bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet.

Das getrocknete Material wurde in einem neutralen isotonischen Verdünnungsmittel, wie es vorher beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß es kein Protaminsulfat enthielt, resuspendiert. Das resuspendierte Material wurde auf seine Aktivität analysiert und es wurde gefunden, daß die Aktivität von 88 bis 95 Einheiten/ml reichte, was einen geringen Verlust an Insulinmaterial zeigt, der beim Waschen des Protamin-Natriuminsulin-Komplexes vor dem Trocknen auftritt.

Die Tests wurden wie vorher an 9 Kaninchen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle VI. Der eine Test wurde mit Material durchgeführt, das in Wasser resuspendiert und dann gefriergetrocknet worden war.

Tabelle VI
Blutzuckerspiegel, mg %

Vakuumgetrocknet
Gefriergetrocknet

82,0
85,4

52,5
44,7

57,3 45,6 67,8
53,1

76,7
78,9

74,3
80,7

77,3
80,0

Jedes der getrockneten Insulinpräparate bewirkte nach Senkung der Blutzuckerspiegel.

Rekonstitution und Injektion eine beträchtliche

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. !nsulinsalz-Protamin-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Alkalioder Ammoniumsalz von Insulin und 0,2 mg bis 1,5 mg eines Protamins je 100 Einheiten Insulin bestehen, weniger als etwa 0,05% Zink enthalten und einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% aufweisen.

2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Natriumsalz von Insulin enthalten.

3. Verfahren zur Herstellung der Insulinsalz-Protamin-Komplexe nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Bereich von 6,5 bis 8,0 ein Alkali- oder Ammoniumsalz von Insulin, das weniger als etwa 0,05% Zink enthält, mit 0,2 mg bis 1,5 mg eines Protamins je 100 Einheiten Insulin versetzt, den Insulinsalz-Protamin-Komplex aus der erhaltenen Suspension abtrennt und auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% trocknet.