NO137178B - Fremgangsm}te for fremstilling av et insulinsalt-protaminkompleks - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av et insulinsalt-protaminkompleks, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man i et vandig medium omsetter slike mengder protamin og et alkalimetall- eller ammoniumsalt av insulin, som inneholder mindre en 0,05% sink eller andre tungmetaller, at det foreligger 0,2-1,5 mg protamin pr. 100 enheter insulin, for dannelse av en suspensjon av et uoppløse-

lig kompleks som hvis ønsket, isoleres.

De kjente insulinpreparater karakteriseres vanligvis

som kortvirkende, mellomvirkende eller lengevirkende med henblikk på den biologiske aktivitet. I mange tilfeller av dia-betes er et ønskelig preparat, for terapeutisk bruk, ett med hurtig innsetning av virkningen og en forlenget varighet for virkningen. Slik dobbeltvirkning for effektiv kontroll av hyperglykemia ved bruk av én enkelt injeksjon, er ikke vist ved noe insulinpreparat, som er kommersielt tilgjengelig.

Selvom det i de siste år er innført på markedet et forblandet insulinpreparat med både den ønskede korte og mel-lomliggende hypoglykemi ske virkning,, krever preparatet fremdeles lagringsspesifikasjoner og konservering. Det er således et behov for forbedring. Det forblandede preparat er sammensatt av en oppløsning av sinkinsulinkrystaller avledet fra pankreas i svin og en suspensjon av insulinkrystaller med høyt sinkinn-hold fra storfe. Andre tidligere preparater, hvori oppløsninger av sinkinsulinkrystaller eller amorft insulin ble blandet med protaminsinkinsulin eller protamininsulinpreparater, medførte stabilitetsproblemer på grunn av nedbrytning av protamin og også utfelling av den oppløselige insulinbestanddel ved overskudd av protamin i blandingen. Mange problemer, slik som lav renhetsgrad, ustabilitet, farge, forurensning med den hypergly-kemiske faktor (glukagon), og antigene proteiner med høy mole-kylvekt, alt forbundet med kommersielle sinkinsulinkrystaller, har forhindret utviklingen av preparater med både hurtig innsetning av virkningen og lengevarende hypoglykemisk virkning.

En fordel ved insulinproduktet, fremstilt ved foreliggende oppfinnelse, er at det ved bruk gir en hurtig innsetning av virkningen og en forlenget varighet av denne virkning.

Det er en ytterligere fordel at insulinkomplekset eller suspensjonen, fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, kan lagres i lengre tidsrom uten vesentlig forringelse. Figurene 1, 2, 3, 4 og 5 er diagrammer som viser blodsukkernivået som fremkommer ved forskjellige insulinpreparater i dyr etter injeksjon,■hvor tiden er avsatt på abscissen og blodsukkernivået i det injiserte dyr er avsatt på ordinaten. Figur 1 er et diagram som sammenligner virkningen av injeksjonen av protamin-natriuminsulin med isofaninsulin (NPH)

(nøytralt protamin-Hagedorn-insulin).

Figur 2 er et diagram som sammenligner virkningen av komplekset eller suspensjonen, fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, med virkningen av en blanding av surt vanlig insulin- og isofaninsulin. Figur 3 er et diagram som sammenligner tre suspensjoner, ifølge oppfinnelsen, nemlig storfeinsulin, svineinsulin og blandinger av disse. Figur 4 er et diagram som viser virkningen av komplekset, fremstilt ifølge oppfinnelsen, etter lagring. Figur 5 er et diagram som sammenligner fire komplekser og suspensjoner/ fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Insulinsalt-protaminkomplekset, som dannes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er brukbart som aktiv bestand-del i et hypoglykemisk preparat med både hurtig innsetning av virkningen og lengevarende virkning. Insulinsaltet foreligger i form av et alkalimetallsalt eller ammoniumsalt, og protat-minet er helst til stede som sulfatet i andeler på omkring 0,2 mg til omkring 1,5 mg, helst fra omkring 0,4 til omkring 0,8 mg/100 enheter insulin.

Insulinsaltet, som i det vesentlige er fritt for sink eller andre tunge metaller, fremstilles helst ved alkalisk krystallisering av insulinet ved bruk av natriumhydroksyd, et annet alkalimetallhydroksyd eller ammoniumhydroksyd. Nærværet av sink i større mengder ville resultere i at det dannes sinkinsu-lin i stedet for alkalimetallinsulin, da insulin har større affinitet til sink. Etter krystallisering vaskes krystallene og tørkes til et fuktighetsinnhold på mindre enn omkring 10%. Insulinsaltet er øyeblikkelig oppløselig i vann ved nøytral pH-verdi, og det kan lagres i oppløsninger opptil 3 måneder uten vesentlig forringelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse omsettes det ovenfor nevnte insulinsalt og protamin i et vandig medium på en slik måte, at det dannes et kompleks av insulinsaltet og protamin. Det vandige medium har ifølge oppfinnelsen for å oppnå de gunstigste betingelser for kompleksdannelsen en pH-verdi på 6,5-8,0. Det skal tilsettes så meget protamin at det foreligger 0,2-1,5 mg protamin pr. 100 enheter insulin. Protamin-insulinsaltet kan lett separeres ved filtrering eller på lignende måte og deretter tørkes. Komplekset kan lagres i tørr tilstand i minst 1 år eller lenger uten nedbrytning. Når man ønsker å an-vende protamin-insulinkomplekset, oppløses det tørkede stoff i et vandig medium, fortrinnsvis et isotonisk fortynningsmiddel, ved en pH-verdi på 6,5-8,0. Etter oppløsning kan komplekset injiseres. Pasienten, som mottar injeksjonen, oppnår både en hurtig virkning og en langvarig hypoglykemisk virkning.

I US-patent nr. 2.343.625 beskrives det et flytende insulinpreparat som omfatter både oppløst insulin og insulin-presipitat, det hele stabilisert ved hjelp av et proteinpepti-seringsmiddel.

Ifølge foreliggende oppfinnelse oppnår man således

den fordel at man oppnår både hurtig innsetning av virkningen og en langvarig virkning kun ved hjelp av ett insulin.

En typisk fremgangsmåte til fremstilling av protamin-insulinsaltkomplekset omfatter fremstilling av natriumsaltet av insulin på en slik måte at natriuminsulin i det vesentlige er sinkfritt, dvs. mindre enn omkring 0,05% sink. Natriumsaltet foreligger i krystallinsk form, men er oppløselig i vann eller et isotomisk fortynningsmiddel. Natriumsaltet oppløses deretter i væskemediet i andeler, slik at det foreligger fra 90 enheter til omkring 115 enheter pr. 100 ml væskemedium. Protaminsulfat i den egnede mengde tilsettes deretter til væskemediet. Et uoppløselig kompleks dannes øyeblikkelig i form av en meget fin utfelling. Den fint oppdelte utfelling forblir forholdsvis godt suspendert i væskemediet og er egnet til lett injeksjon av brukeren. Hvis komplekset lagres i væskemediet, forblir det stabilt og viser intet tap av virkningskraft i tidsrom på minst ett år.

Det uoppløselige kompleks kan ifølge oppfinnelsen også separeres fra det vandige medium og tørkes til et fuktighetsinnhold på under 10%. Herved oppnås et produkt som er lagrings-stabilt ved romtemperatur og atmosfærestrykk i meget lang tid.

Hvis tørkede protamin-insulinsaltkomplekser skal suspen-deres, er det ønskelig å blande komplekset i væsken for å for-dele utfellingen homogent i væskemediet for injeksjonsformål.

Den nøyaktige art av forbindelsen mellom insulinsalt

og protaminet er ikke kjent; imidlertid er bindingen tilstrekkelig sterk til at det uoppløselige kompleks lett separeres fra væskemediet og tørkes for å lette forsendelse eller for meget lange lagringsperioder. Produktet i tørr form kan lagres i u-bestemte tidsrom.

Opprinnelig var det antatt at den hurtige innsetning

av virkningen, som ble bemerket ved protamin-insulinsaltprep-aratet, skyldtes fritt insulin i moderlutene; imidlertid har analyser vist at kun 0,015% av den totale insulinvirkning, som er tilstede i preparatet, forblir i den oppløselige form. Således fremgår det at forbindelsen mellom insulin og protaminet kan være heller løs, og således at insulinet lett kan gjøres tilgjengelig for absorbsjon etter injeksjon. Det ser også ut til at arten av dette kompleks er forskjellig fra de kjente kommersielle protamin-sinkinsuliner hvor disosiasjonen av insulinet fra komplekset er meget langsommere i vevet, og hvor det ikke bemerkes noen hurtig innsetning av virkningen.

Protamin-insulinsaltkompleks dannes i et væskemedium med en pH-verdi på fra 6,5 til omkring 8,0, helst fra omkring 7,2 til omkring 7,6.

Alkalimetallsaltet av insulin til bruk, oppnås ved å underkaste råinsulin en behandling i nærvær av alkalimetallioner for å bevirke krystallisering av insulinet som alkalimetallsalt. Av økonomiske grunner og for letthets skyld foretrekkes natriumhydroksyd som alkalimetallionkilde ved fremstilling av alkalimetallsaltet av insulin. Natriumsaltet fremstilles ved å underkaste råinsulin i vandig oppløsning en behandling med natriumhydroksyd, hvor sistnevnte er tilstede i tilstrekkelig mengde til å gi et pH-nivå på omkring 8-8,5. Behandlingen omfatter svak omrøring av den alkaliske oppløsning i minst 15 minutter og helst omkring 1 time eller mer. Natriuminsulinsaltet faller ut i oppløsningen og separeres lett ved dekantering, sentrifug-ering, filtrering eller lignende. Natriuminsulinsaltet kan renses ved etterfølgende oppløsning av saltet og gjenforming av utfellingen, som i form ligner krystaller. Analyser har vist at det, i tilfellet natriumsaltet.av insulin, er tilstede omkring 1 mol natrium/mol insulin. Natriuminsulinkrystallene kan være av storfeopprinnelse eller stamme fra svin, og er meget oppløselige i vann og isotoniske oppløsninger som er omtrent nøytrale.

Egnede alkalimetall- eller metalloidioner med hvilke saltet av insulin kan fremstilles omfatter kalium, litium, cæs-ium, natrium og ammonium, men ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis natrium.

Protaminet foreligger vanligvis i form av protaminsulfat eller det kan være tilstede i andre egnede vannoppløse-lige former.

Hvis det benyttes et isotonisk fortynningsmiddel som væskemedium for protaminsulfat og insulinsaltet, er det fore-trukket at fortynningsmidlet inneholder et preserveringsmiddel. Egnede preserveringsmidler omfatter fenol og metyl-p-hydroksy-benzoat.

Den biologiske virkning av protamin-insulinkomplekset ble bestemt i kaniner ved følgende fremgangsmåte: 3 6 kaniner ble inndelt i to like grupper, og disse fastet i 24 timer før forsøket. Vann såvel som næringsmidler ble holdt tilbake under forsøket. En blodprøve ble tatt fra den ytre ørenerve for den første blodsukkerbestemmelse. Kon-trollgruppen av kaniner ble injisert med den på forhånd best-emte dose av det nøytrale protamin-Hagedorn-insulin (NPH). For-søksgruppen ble injisert med protamin-natriuminsulinkompleks (PSI). En: enkelt dose i hver av prøvene var 1,0 enheter/kanin, noe som tilsvarte omtrent 0,01 cm 3 av insulinpreparatet. De første blodprøver ble tatt fra hver kanin etter en halv time. Etterfølgende blodprøver ble tatt 1,5, 3,0, 5,0, 7,0 og 9,0 timer etter injeksjonen. Hver blodprøve ble analysert på blodsukkernivå, og resultatene ble uttrykt som mg-% glukose. Den gjennomsnittlige blodsukkerkonsentrasjon ved hvert tidspunkt for blodprøven ble beregnet for begge grupper.

I det tilfellet hvor det ble benyttet et kryssforsøk, ble kaninene, som hadde motsatt kontrollprøve, injisert med protamin-natriuminsulinkomplekset og omvendt. Disse forsøk ble gjennomført en uke etter at de opprinnelige prøver var ferdige. De endelige resultater er uttrykt som en gjennomsnittlig blod-sukkerkonsentras jon i mg-% i fig. 1 og i tabell 1 nedenfor:

Det bemerkes at protamin-natriuminsulinkomplekset ga en hurtigere innsetning av virkningen og en forlenget virkning i forhold til NPH-produktet.

PSI (protamin-natriuminsulin) ble sammenlignet med en blanding av ARI (surt vanlig insulin) og NPH i andeler med et forhold på 1:1, basert på virkningen. Protaminsulfatkonsentra-sjonen var 0,8 mg/ml.

Ved disse forsøk ble 36 kaniner benyttet i et kryss-mønster. Hver ble injisert med omkring 0,01 ml av insulinproduktet slik at de oppnådde 1 enhet insulin pr. injeksjon. Resultatene er angitt i figur 2 og i tabell 2 nedenfor:

De i tabell 2 angitte resultater viser at ARI + NPH har en noe hurtigere virkning enn protamin-insulinkomplekset, men at dette til gjengjeld har en vesentlig mere langvarig virkning.

Sammenligninger ble foretatt mellom tre typer nøytrale protamin-natriuminsulinprodukter sammen med 0,02 mg sink/100 enheter insulin. Hvert av insulinproduktene inneholdt 0,02 mg sink/100 enheter insulin. Hensikten med tilsetningen av sink var å bestemme hvorvidt eller ikke sinken negativt ville på-virke enten den hurtige innsetning av virkningen eller virkningens forlengede varighet, som fremkom ved protamin-natriuminsulinkomplekset. Slik det fremgår nedenfor ble det ikke notert noe slikt resultat.

Det ble sammenlignet tre produkter; nemlig insulin fra svin, insulin fra storfe og en blanding som inneholdt 75% insulin fra storfe og 25% insulin fra svin.

Hvert forsøk ble gjennomført på 6 kaniner med en enkel injeksjon på omkring 0,01 ml, noe som resulterte i en omtrent-lig dose på 1 enhet insulin. Resultatene er angitt i figur 3 og oppført i tabell 3 nedenfor:

Svineinsulin viste en hurtig virkning, selvom varig-heten for virkningen ikke var ganske så lang som de andre in-sulinprodukter; imidlertid gå både storfeinsulin og det bland-ede produkt en hurtig virkning og en lengevarende virkning.

I tillegg skal det bemerkes at en mindre mengde sink ble tilsatt til protamin-natriuminsulinkomplekset. Det er funnet at et bivalent metall, slik som sink, ikke bør være tilstede i noen vesentlig mengde under dannelsen av natriumsaltet av insulin. Hensikten med tilsetningen av sink til protamin-natriuminsulin-komplekset var å sikre hvorvidt eller ikke sinken hadde noen virkning på insulinkomplekset. Av resultatene kan det bemerkes at sinken hverken innvirket på den terapeutiske verdi eller forbedret denne noe.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen: Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av protamin-insulinkomplekset i doseform.

Krystallinsk storfe-natriuminsulin ble fremstilt som følger: Insulin ble ekstrahert fra storfepankreas med et sur-gjort vandig alkoholisk medium, konsentrert ved vakuum-destil-lasjon, og delvis renset ved fraksjonert utfelling med natrium-klorid og isoelektrisk utfelling. Insulinet ble renset ytterligere ved en alkalisk krystallisering ved pH 8,2. De resulterende krystaller ble oppløst i fortynnet eddiksyre (0,5N) og fraksjonert ytterligere ved gelfiltrering på "Sephadex G-50".

Filtratet, som var 0,5N eddiksyre, som inneholdt insulinet, ble nøytralisert til pH 8,2 med 1,0N natriumhydroksyd og omrørt i 1 time ved romtemperatur. Natriuminsulinkrystallene ble deretter utvunnet fra krystalliseringsblandingen ved filtrering og vasket med .2% natriumkloridoppløsning. De saltvask-ede krystaller ble deretter anbragt i et overskudd av absolutt alkohol under heftig omrøring, filtrert og oppsamlet. Etter en andre absolutt alkoholvasking, ble krystallene vasket med eter og tørket i vakuum.

De resulterende krystallinske storfe-natriuminsulin hadde følgende egenskaper:

En andel av det tørkede natriuminsulin i en mengde på 3,98 g, ble oppløst i 990 ml pyrogenfritt vann inneholdende 2,27 g flytendegjort fenol og 1,5 ml 10%-ig HC1. pH-verdien ble deretter justert til 7,4 med 1,7 ml 10%-ig NaOH. Prøver, som ble gjennomført i henhold til den vanlige U.S.P.-styrke-prøvingsfremgangsmåte, viste en insulinvirkning på 101,3 enheter/ml. Denne oppløsning ble underkastet steril filtrering

og deretter fylt i ampuller ved bruk av 1,0 ml/ampulle,, og ampullene ble underkastet frysetørking under aseptiske beting-

eiser for å oppnå tørr natriuminsulin i hver ampulle. Insulinet ble lagret i denne form inntil tidspunktet for" bruk i prøver. •

Til hver ampulle ble det injisert en tilstrekkelig mengde av et isotonisk fortynningsmiddel for å oppnå insulinet i et vandig medium slik at det inneholdt 101,3 enheter insulin/ ml væskemedium. Det isotoniske fortynningsmiddel inneholdt 0,4 mg' protaminsulfat/ml, 1,6% glycerin og 0,25% fenol (beregnet som vekt/volum). pH-verdien i det isotoniske fortynningsmiddel var 7,4. Ved tilsetning av den isotoniske væske til det tørkede natriuminsulin i ampullen var det en øyeblikkelig dannelse av protamin-natriuminsulinkomplekset. Dette kompleks kunne skei-nes i ampullen som en meget fint oppdelt utfelling. Utfellingen forble tilstrekkelig jevnt suspendert i det vandige fortynningsmiddel slik at det ved overføring til en injeksjonssprøyte forelå en enhetlig mengde av insulin i hver overført del.

Eksempel 2

Dette eksempel viser den utmerkede stabilitet av protamin-insulinkomplekset. Det nøytrale PSI, som ble benyttet i dette eksempel, ble fremstilt ifølge eks. 1, bortsett fra at det isotoniske fortynningsmiddel inneholdt 1,2 mg protamin/ml.

Hvert av forsøkene ble gjennomført ved bruk av 9 kaniner. Produktet, nemlig protamin-natriuminsulinkomplekset, som var suspendert i det isotoniske fortynningsmiddel, ble lagret ved 25°C i tidsrommet mellom hvert av forsøkene. Slik som før, ble kaninene-, injisert med 0,01 ml av insulinproduktet. Resultatene er vist i fig..4 og angitt i tabell 4 nedenfor:

De angitte data i tabell 4 viser tydelig at selv etter at den isotoniske oppløsning inneholdende protamin-natriuminsulinkomplekset i suspendert form lagres ved 25°C, er det en

merkbar stabilitet i insulinvirkningen med henblikk på

både den hurtige innsetning av virkningen og virkningens varighet .

Eksempel 3

Dette eksempel viser dannelsen og bruken av.protaminkomplekset av ammoniuminsulin, litiuminsulin og kaliuminsulin samt natriuminsulinet ifølge eksempel 1.

Hver av de ovenfor nevnte insulinsalter ble dannet ved fremgangsmåten i eks. 1, blandet med en isotonisk oppløsning inneholdende 0,4 mg protaminsulfat/ml og injisert slik som i eks. 1

i 18 kaniner. Resultatene er vist i fig. 5 og angitt i tabell 5 nedenfor.

Selvom natriuminsulin viser en lengervarende virkning, viser hvert av de andre preparatene en vesentlig reduksjon av blodsukkernivået.

Eksempel 4

Dette eksempel viser stabiliteten av protamin-natriuminsulinkomplekset. Komplekset ble fremstilt slik som i eks. 1 ved bruk av 0,4 mg/ml protaminsulfat i det isotoniske fortynningsmidlet. Etter fremstilling av komplekset ble dette anbragt i forskjellige sentrifugerør. De ble deretter sentrifugert og den overliggende væske ble dekåntert. Separert bunnfall ble vasket med omkring 15 ml absolutt alkohol fulgt av omtrent 15 ml eter. Den vaskede utfelling ble deretter vakuumtørket ved romtemperatur .

Det tørkede stoff ble omsuspendert i et nøytralt isotonisk fortynningsmiddel slik som beskrevet ovenfor, bortsett fra at dette ikke inneholdt noe protaminsulfat. Det omsuspend-erte stoff ble analysert med henblikk på virkningen, og det ble funnet at denne lå i området fra 88-95 enheter/ml og viste således et tap av insulinstoff i vaskingen av protamin-natriuminsulinkomplekset før tørking.

Forsøkene ble gjennomført som tidligere på 9 kaniner. De oppnådde data er angitt i tabell 6 nedenfor: de fryse-tørkede forsøk ble gjennomført på materialet som var omsuspendert i vann og deretter frysetørket.

Hvert av de tørkede insulinpreparater bevirket etter suspendering og injisering, en vesentlig reduksjon i blodsukker-nivåene .

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et insulinsalt-protaminkompleks, karakterisert ved at man i et vandig medium omsetter slike mengder protamin og et alkalimetall-eller ammoniumsalt av insulin, inneholdende mindre enn 0,05% sink eller andre tungmetaller, at det foreligger 0,2-1,5 mg protamin/ 100 enheter insulin, for dannelse av en suspensjon av et uoppløs-elig kompleks som, hvis ønskelig, isoleres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at omsetningen skjer ved pH 6,5-8,0.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vandige medium er en isotonisk oppløs-ning.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at man separerer det uoppløselige kompleks fra det vandige medium og reduserer fuktighetsinnholdet i komplekset til mindre enn 10%.