NO175641B

NO175641B -

Info

Publication number: NO175641B
Application number: NO882207A
Authority: NO
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1994-08-01
Also published as: ATE71842T1; EP0291863A2; DE3867903D1; DK278088A; IL86452A0; HUT46546A; PH25587A; AU601280B2; NO882207D0; NO882207L; NO175641C; DE3717370A1; IL86452A; ZA883599B; JPS63303930A; HU203840B; AU1648788A; ES2032896T3; FI93797C; NZ224715A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av blandingskrystaller av nativt insulin og minst et basisk modifisert insulin.

Diabetes mellitus er en stoffskifteforstyrrelse, som som vesentlig symptom viser et øket blodsukkerspeil. Den har sin grunn i, at det pankreatiske hormon insulin ikke frigjøres i tilstrekkelig mengde. Substitusjonen av det naturlige hormon foregår i dag vanligvis ved hjelp av animalsk insulin, som isoleres fra slaktedyrkjertler eller humant insulin, som semisyntetisk er tilgjengelig fra svineinsulin eller ved hjelp av genteknologiske metoder.

Insulinets spesielle kjemiske natur medfører at terapien vanligvis foregår parenteralt, hormonet ville for eksempel ved passering av mage/tarm nedbygges fullstendig, ennå før det kan komme til virkning. Avbygningsreaksjoner, idet vesentlige ved hjelp av forskjellige relativt uspesifikke proteolytiske enzymer, finner imidlertid også sted ved injeksjonsstedet og i sirkulasjonen. Den derved betingede korte halveringstid in vivo på bare ca. 7 minutter er prinsipielt fysiologisk hensiktsmessig i form av en homøo-stase, terapien vanskeliggjøres imidlertid derved betraktlig for de diabetikere må ta sprøyter inntil 4 ganger daglig, vanligvis kort før måltidene.

Nå er Diabetesterapien karakterisert ved individuelle innvirkningsfaktorer, som forskjeller i utnyttbarhet av måltidene, forskjeller i karakteristikken av underhudvevet, hertil imidlertid også de spesifikke spisevaner, kroppslig aktivitet og meget mer. Det er således uunngåelig for en god blodsukkerinnstilling, å ha til disposisjon en rekke insulinpreparater med forskjellig virkningskarakteristikk som er tilpasset de individuelle behov. I forbindelse med ikke-optimal innstilling, diskuteres ved siden av de umiddelbare subjektive og objektive effekter, som hyper- eller hypoglyke-mier, spesielt formkretsen av de diabetiske senskader. Dertil hører frem for alt makro- og mikroangiopati, neuropati, nefropati og retinopati.

Som preparater, som er tilpasset pasientenes behov, har, ved siden av rene forsinkelsesinsuliner, frem for alt såkalte intermediærinsuliner vist seg brukbare. De er blandinger av en forsinket og en med en gang og kort tid virksom komponent. Slike blandinger er kompliserte flerfasesystemer, som over lengre tid bare forblir stabile i relativt snevert begrensede blandingsforhold. Således er for eksempel en suspensjon av 2-sink-insulinkrystaller fra svin ikke fritt blandbare med oppløst svineinsulin. Med en gang eller i løpet av tiden, faller det tilblandede oppløste insulin ut på grunn av det relativt høye sinkinnhold, som imidlertid er nødvendig for krystallenes stabilisering. Slike blandinger er stabile innen snevre grenser, når det som oppløst insulin anvendes storfeinsulin (hermed tapes imidlertid artsrenheten, en medisinsk ønsket egenskap) eller en blanding av oppløst svininsulin og av fenylalanin(Bl)-svineinsulin (GB-A-1492837). Fordelaktig med hensyn til blandbarheten av oppløst insulin, er protamin-insulin-tilberedninger, når det som forsinkelseskomponenter anvendes krystaller av protamin og insulin i isofant forhold. Med disse preparater kan det fremstilles NPH (= Neutral-Protamin-Zubereitung nach Eagedorn)-typiske virkningsprofiler. Nærvær av protaminet (som sådan eller i saltform) som tilsetninger, synes riktignok anvendbar, fordi protamin er et relativt ufarlig kroppsfremmed protein som imidlertid allikevel forblir et kroppsfremmed stoff som i det minste hos pasienter som er spesielt følsomme - mot kroppsfremmede proteiner kan føre til uønskede reaksjoner.

Viktig er derfor tilveiebringelsen av stabile farmasøytiske midler, som har en til de individuelle krav av diabetikere tilpasset virkningskarakteristikk og som dessuten bare inneholder minimale mengder kroppsfremmede hjelpestoffer, spesielt bare minimale mengder kroppsfremmede proteiner eller helst overhodet ingen slike stoffer. Virksomme stoffkombina-sjoner av nativt insulin eller dets Des-Phe<B1->analog og insulinderivater, hvis B-kjede C-terminalt har en organisk gruppe av basisk karakter, er i denne henseende et betraktlig fremskritt (se for eksempel EP-A-132769).

Insulinderivater, som ved den C-terminale ende av B-kjeden har restene Arg-OH eller Arg-Arg-OH er kjent. Disse derivater oppstår som naturlige mellomprodukter ved den enzymatiske omdannelse av proinsulin til insulin in vivo og er også påvisbart i små mengder i pankreasekstrakter. De nevnte rester avspaltes normalt ved Trypsin og/eller karboksypepti-dase B eller enzymer med tilsvarende spesifitet under frigjøring av det native insulin.

Ytterligere C-terminalt basisk modifiserte insulinderivater er for eksempel kjent fra EP-A-132770 samt også EP-A-140084.

Felles for disse insulinderivater er at det eller de ekstra, positive ladninger på overflaten av molekylet, gjør at det isoelektriske punkt er skjøvet inn i det nøytrale område. Alt efter derivat måles isoelektriske punkter av 5,8 til 8,5, spesielt 6,2 til 8,2, i den isoelektriske fokusering. Dermed er derivatene mindre oppløslig i nøytralområdet enn nativt insulin, som har sitt isoelektriske punkt og dermed området av maksimal oppløslighet ved pH = ca. 5,4, mens de i nøytralt område normalt foreligger oppløst.

Til anvendelse kommer terapeutisk interessante kombinasjoner, som for eksempel blandingen av insulin i oppløst form eller i form av NPH-krystaller eller andre klassiske forsinkelses-former + insulinderivat. På denne måte lar det seg blant annet fremstille meget langsomt virkende preparater med differensiert basalprofil. Nettopp ved humaninsulin er dette ønskelig, da, efter de tidligere erfaringer, dets virkningsvarighet, hverken i form av sinkkrystaller eller i form av NPH-krystaller, har en ekte ultraretardprofil (som for eksempel de analoge storfeinsulinpreparater). Disse kjente tilberedninger inneholder inntil 1 % sinkioner, fortrinnsvis ikke over 0,8$ beregnet på insulin-insulinderivat-massen. Vanligvis er det til krystallisering nødvendig med relativt små sinkmenger på maksimalt bare ca. 40 pg/100 internationale enheter (I.E.), fortrinnsvis imidlertid ikke over ca. 300 jjg/100 i.e., som under tiden allerede er inneholdt i tørrstoffet. De kan dessuten inneholde hjelpemidler med forsinkende virkning på insulinfrigjøringen, som globulin eller protaminsulfat.

Ved siden av fordelene med hensyn til krystallstørrelse og deres homogenitet betinger det relativt lav sinkinnhold som ligger under den konsentrasjon hvor sink er å betrakte som depotbærer, at krystallsuspensjonen er fritt blandbart med oppløst insulin. Den er således for eksempel mulig å forene insulinoppløsninger med suspensjoner av insulinderivatkry-stallene før applikasjon.

Ved variasjon av mengde av enkelte komponenter kan virknings-profilene av det således dannede legemiddel styres.

Således har krystallsuspensjoner av de omtalte derivater på fordelaktig måte de egenskaper som er ønskelig for behandling av Diabetes mellitus. Forsinkelsesprinsippet er inherent for insulinderivatene og skyldes et proteinkjemisk fenomen, nemlig den lave oppløslighet ved det isoelektriske punkt. Det foreligger i praksis faktisk en ekte ultra-forsinkelses-prof il.

Dessuten er det imidlertid også ønskelig, ved siden av ultra-retard-profilen å ha midlere retardprofiler til disposisjon.

Denne oppgaven kan ifølge oppfinnelsen løses ved frem-bringelse og tilveiebringelse av nye blandingskrystaller av A. nativt insulin, des-Phe-Bl-insulin, des-Thr-B30-(Human)-eller des-Ala-B30-(storfe, svin)-insulih

og

B. minst et insulin som er basisk modifisert ved den C-terminale enden av B-kjeden.

De for komponent Å aktuelle stoffer er slike med et isoelektrisk punkt på mindre eller lik 5,5, de basisk modifiserte insuliner av komponent B er slike med et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5

Blandingskrystallene ifølge oppfinnelsen viser, i forhold til de kjente rent fysikalske blandinger av de samme enkeltkom-ponenter, på tross av den sammenlignbare stabilitet (uten eller ved bare lavt sinkinnhold), en tydelig nedsettelse av den ekstremt lange virkningsvarighet med en virkningsstyrke, slik de finner anvendelse til behandling av Diabetes mellitus med klassiske depot-insulin-preparater (med protamin-insulin-krystaller eller 2-sinkinsulinkrystaller) - hvis virkningsvarighet er mindre lang. Derved er imidlertid virkningsvarigheten overfor de klassiske depot-insulin-preparater tydelig forlenget, den ligger altså mellom virkningsvarigheten av de nevnte klassiske depotinsulinpreparater og den ekstremt lange virkningsvarighet av de rent fysikalske blandinger av enkeltkomponentene A og B. Denne effekt er spesielt ønskelig i tilfelle av humaninsulinterapi og er hittil ikke mulig. Det er overordentlig overraskende, at blandingskrystallene som oppnås ifølge oppfinnelsen nettopp viser denne effekt.

Den nødvendige hurtige virkningsinntreden av insulindelen A går, på tross av blandingskrystalliseringen, ikke tapt og kan eventuelt akselereres ved mekanisk eller fysikalsk blanding med oppløst insulin.

Den uventede terapeutiske overordentlige nyttige effekt kommer sannsynligvis i stand ved den lettere oppløsbarhet av krystallgittersammensetningen av de basisk modifiserte insuliner B ved fysiologiske pH-verdier efter målrettet innbygning av forstyrrelsessteder ved hjelp av komponent Å med lavere isoelektrisk punkt.

Det foretrukne vektforhold mellom komponentene A og B i blandingskrystallene som fremstilles ifølge oppfinnelsen ligger ved 10:90 til 90:10. Det betyr, at hver av de to komponenter A og B normalt skal foreligge til minst ca. 10 vekt-# i blandingskrystallene .

Blandingskrystallkomponent A er nativt insulin - hovedsakelig human-, svine- eller storfeinsulin-, des-Phe-Bl-insulin (fortrinsvis human, svin eller storfe) og des-Thr-B30-humaninsulin eller des-Ala-B30(svine,storfe)-insulin. Generelt består komponent A bare av en representant av disse insuliner, idet (nativt) humaninsulin er foretrukket.

Blandingskrystallkomponent B dannes av minst et insulin som er basisk modifisert ved den C-terminale ende av B-kjeden. Som tilsvarende slike basisk modifiserte insuliner, kommer det for eksempel insulinderivatene ifølge formel I i EP-A-132769, EP-A-132770 og EP-A-140084 på tale. Foretrukkede komponenter B er Arg-B31-humaninsulin og Arg2~(B31-32 )-humaninsulin.

Komponenten B kan bestå av så vel en som også av flere enkeltforbindelser. Enkeltforbindelser, som for eksempel de to sistnevnte humaninsulinderivater, kan være tilstede praktisk talt i enhver ønskelig blanding.

Komponentene A og B er videre fortrinnsvis fra samme art i blandingskrystallene (altså for eksempel begge human eller svin).

Spesielt foretrukkede blandingskrystaller inneholder som komponent A humaninsulin og som komponent B Arg-B31-humaninsulin eller Arg2~(B31-32)-humaninsulin eller en ønskelig blanding av sistnevnte.

Blandingskrystallene av komponentene A og B kan ifølge oppfinnelsen bare fås fra en oppløsning innen et temmelig snevert pE-område, utenfor dette snevre pH-område oppnås overraskende ingen, eller i hvert fall ingen optimale, blandingskrystaller.

Foreliggende oppfinnelse angår således som nevnt en fremgangsmåte for fremstilling av blandingskrystaller av den innledningsvis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteri-seres ved at man fremstiller en vandig oppløsning av: A. nativt insulin, des-Phe-Bl-insulin, des-Thr-B30(human)-eller des-Ala-B30(svin, storfe)-insulin og

B. minst et insulin som er basisk modifisert ved den C-terminale enden av B-kjeden,

minst et fysiologisk godtagbart konserveringsmiddel,

minst et fysiologisk godtagbart isotonimiddel,

minst en fysiologisk godtagbar syre,

samt eventuelt ytterligere fysiologisk godtagbare til-setnings- og hjelpestoffer

av pH-verdi fra 2,5 til 3,5,

at man derefter bringer oppløsningen ved tilsetning av en fysiologisk godtagbar base,

samt eventuelt en fysiologisk godtagbar buffer,

til en pE-verdi på 5,5 til 6,9, fortrinnsvis på 5,9 til 6,5, og bringer blandingskrystallene av komponentene A og B til krystallisasjon fra denne oppløsning.

Den samlede konsentrasjon av komponentene A og B i den vandige oppløsning før krystalliseringen kan svinge innen et relativt vidt område, foretrukket er imidlertid en konsentrasjon mellom 0,2 og 40 mg/ml, spesielt på 1 til 7,5 mg/ml.

Som komponent A anvendes fortrinnsvis slike med et isoelektrisk punkt på mindre eller lik ca. 5,5;

aktuelle komponenter B skal ha et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5.

Forøvrig gjelder for komponentene A og B det samme som allerede anført ovenfor ved omtalen av blandingskrystallene som fremstilles ifølge oppfinnelsen. Foretrukne komponenter A er humaninsulin, foretrukne komponenter B er Arg-B31-humaninsulin og/eller Arg-(B31-32)-humaninsulin. I tilfelle anvendelse av mer enn en representant av komponent B kan ved variasjon av deres blandingsforhold den ønskede blodsukker-senkningsprofil innstilles godt.

Komponentene A og B kan på sin side prinsippielt blandes i ønskelige mengdeforhold, foretrukket er imidlertid et vektforhold på 10:90 til 90:10. Omtrent de samme vektsfor-hold som innstilles i utgangsoppløsningen gjenfinnes komponentene A og B seg derefter også i blandingskrystallene.

Som fysiologisk godtagbare konserveringsmidler kan det anvendes de for slike formål vanlige og kjente midler, altså for eksempel aromatiske hydroksyforbindelser som fenol, m-kresol og/eller p-hydroksybenzosyreester (og sistnevnte hovedsakelig etylesteren) et cetera. Også konsentrasjonen av konserveringsmidler eller konserveringsmidlene skal ligge i det vanlige rammer. Hensiktsmessige konsentrasjoner ligger mellom 0,02 og 1 (vekt)#.

Som fysiologisk godtagbare isotonimidler kommer det likeledes på tale de for slike formål vanlige forbindelser som for eksempel glyserol og/eller NaCl et cetera på tale. Også deres konsentrasjon skal ligge innen den vanlige ramme, det vil si her altså fordelaktig ved ca. 300 milli-osmol.

Som fysiologisk godtagbare syrer (til innstilling av pH-verdien) anvendes for eksempel eddiksyre, sitronsyre, fosforsyre et cetera. Deres konsentrasjon fremkommer idet vesentlige ved oppløsningens pH-verdi-begrensning.

Aktuelle fysiologisk godtagbare baser er for eksempel NaOH, KOH et cetera og fysiologisk godtagbare buffere, for eksempel natriumacetat, -citrat, -fosfat, tris-(hydroksymetyl)amino-metan, et cetera.

Krystalliseringssoppløsningen kan eventuelt inneholde naturlige og ytterligere fysiologisk godtagbare tilsetninger og hjelpestoffer, som for eksempel et Zn-salt.

Efter innstillingen av pE-verdien for denne (i første rekke temmelige sure) krystallisasjonsoppløsning til 5,5 til 6,9, fortrinnsvis på 5,9 til 6,5, lar man oppløsningen stå ved en temperatur på fortrinnsvis 3 til 27°C, spesielt på 10 til 20° C, blandingskrystallene av A og B krystalliserer da mer eller mindre hurtig.

De kan sammen med den ovenfor nevnte oppløsning med en gang anvendes som tilsvarende farmasøytiske midler. Når oppløs-ningen tilsettes Zn-ioner (i form av tilsvarende forbindelser) som depot-hjelpemidler, skal mengden fortrinnsvis være blitt innstilt således, at den resulterende blandingskrystallsuspensjon inneholder inntil ca. 100 jjg/100 I.E. Zn-ioner. Som varianter av denne tilberedning, kan de således frembragte blandingskrystaller også isoleres ved avslyngning og efter frysetørkning i en placebo-puffer resuspenderes dosismessig.

Blandingskrystallene som fremstilles ifølge oppfinnelsen samt de tilsvarende farmasøytiske tilberedninger som inneholder disse blandingskrystaller, egner seg på grunn av den midlere retardprofil og muligheten av "fininnstilling" ved variasjon av type og mengde spesielt av enkeltforbindelsene av komponent B fremragende til behandling av Diabetes mellitus.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1

Blandingskrystallsuspensjon av 25$ humaninsulin, 75% Arg£-(B31-32)-humaninsulin med en samlet aktivitet på 40 I.E./ml.

Oppløsningens pE-verdi ligger ved ca. 3,5.

Oppløsningen innstilles med IN NaOE til krystallisering på pE 6,3. Efter fullstendig krystallisering over natten ved romtemperatur kan man i supernatanten påvise 3 til 5 % humaninsulin/Arg2-(B31-32)-humaninsulin ved HPLC. Deres forhold utgjør ved kokrystalliseringen 25:75%, ved s.c. (= subcutan)-applikasjon på kaniner av 100 pl av den klare supernatant lar det seg ikke måle noen tydelig blodsukkersenkning (fordi oppløsningen praktisk talt ikke lenger inneholder virksomt stoff).

Eksempel 2

Som i eksempel 1 blandingskrystalliseres:

Krystallsedimentene avslynges, vaskes med buffer og frysetør-kes. Det frysetørkede kokrystall-pulver oppslemmes med 40 I.E./ml i placebo-buffer av pH 6,5.

Eksempel 3

Blandingskrystalliseres som i eksempel 2, isoleres og frysetørkes. En oppslemning av krystallpulver i placebo-buffer av pH 6,3 (40 I.E./ml) viser med 0,2 I.E./kg s.c, applisert på hund, en tydelig forsinket blodsukkersenkning, som er sammenlignbar med den av NPH-insulin.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av blandingskrystaller av A. nativt insulin, des-Phe-Bl-insulin, des-Thr-B30(human)-eller des-Ala-B30(svin, storfe)-insulin og B. minst et insulin som er basisk modifisert ved den C- terminale ende av B-kjeden, karakterisert ved at man fremstiller en vandig oppløsning av A. nativt insulin, des-Phe-Bl-insulin, des-Thr-B30(human)-eller des-Ala-B30(svin, storfe)-insulin og B. minst et insulin som er basisk modifisert ved den C- terminale enden av B-kjeden, minst et fysiologisk godtagbart konserveringsmiddel, minst et fysiologisk godtagbart isotonimiddel, minst en fysiologisk godtagbar syre, samt eventuelt ytterligere fysiologisk godtagbare til-setnings- og hjelpestoffer av pE-verdi fra 2,5 til 3,5, at man derefter bringer oppløsningen ved tilsetning av en fysiologisk godtagbar base, samt eventuelt en fysiologisk godtagbar buffer, til en pE-verdi på 5,5 til 6,9, fortrinnsvis på 5,9 til 6,5, og bringer blandingskrystallene av komponentene A og B til krystallisasjon fra denne oppløsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som komponent A anvendes en slik med et isoelektrisk punkt mindre eller lik 5,5 og som komponent B en slik med et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at komponentene A og B anvendes i et vektforhold på 10:90 til 90:10.

4 . Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1-3, karakterisert ved at som komponent A anvendes humaninsulin og som komponent B anvendes Arg-B31-humaninsulin og/eller Arg2-(B31-32)-humaninsulin.

5 . Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1-4, karakterisert ved at den samlede konsentrasjon av komponentene A og B i den vandige oppløsning før krystallisasjonen innstilles på 0,2 til 40 mg/ml, spesielt på 1 til 7,5 mg/ml.

6. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1-5, karakterisert ved at som fysiologisk tålbart konserveringsmiddel anvendes fenol, m-kresol og/eller p-hydroksybenzosyreetylester, som fysiologisk godtagbart isotonimiddel anvendes glyserol og/eller NaCl, som fysiologisk godtagbare syrer anvendes eddiksyre, sitronsyre og/eller fosforsyre, som fysiologisk godtagbare baser anvendes NaOH og/eller KOH og som fysiologisk godtagbar buffer anvendes natriumacetat,-citrat og/eller -fosfat og/eller tris-(hydroksymetyl)-aminometan.