FI93797C - Menetelmä ihmisinsuliinista ja sen johdannaisista koostuvien sekakiteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

93797

Menetelmä ihmisinsuliinista ja sen johdannaisista koostuvien sekaklteiden valmistamiseksi

Diabetes mellitus on aineenvaihduntasairaus, jonka 5 tärkeimpänä oireena on veren kohonnut sokerioitoisuus. Sen syynä on, että insuliini-haimahormonia ei vapaudu riittävästi. Luonnon hormoni korvataan nykyisin yleensä eläinin-suliinilla, jota eristetään teuraseläinten rauhasista, tai ihmisinsuliinilla, jota voidaan valmistaa puolisynteetti-10 sesti sian insuliinista tai geeniteknisin menetelmin.

Insuliinin kemiallisen erityisluonteen takia hoito tapahtuu yleensä parenteraalisesti; hormoni pilkkoutuisi esimerkiksi mahalaukussa/suolistossa täydellisesti, ennen kuin se pääsee vaikuttamaan. Pilkkoutumisreaktioita, jotka 15 ovat pääasiassa erilaisten suhteellisen epäspesifisten proteolyyttisten entsyymien aiheuttamia, tapahtuu kuitenkin myös injektioalueella ja verenkierrossa. Tähän liittyvä lyhyt puoliintumisaika in vivo, vain noin 7 min, on fysiologisesti elimistön sisäisen tasapainon kannalta pe-20 riaatteessa järkevä, se vaikeuttaa kuitenkin huomattavasti hoitoa, koska diabeetikon täytyy ottaa ruiske jopa neljä kertaa vuorokaudessa, yleensä vähän ennen aterioita.

Diabeteksen hoidossa otetaan nykyisin huomioon yksilölliset vaikuttavat tekijät, kuten erot aterioiden hyö-. , 25 dynnettävyydessä ja erot ihonalaisen kudoksen ominaispiirteissä, mutta lisäksi myös kulloisetkin ruokailutavat, liikunnallinen aktiivisuus ja monet muut tekijät. Verensokerin hyvän säätelyn kannalta on siten välttämätöntä, että käytettävissä on joukko vaikutusominaisuuksiltaan 30 erilaisia insuliinivalmisteita, jotka sopivat yksilölli-.. siin tarpeisiin. Ei-optimaalisen säädön yhteydessä keskus- ’ teilaan välittömien subjektiivisten ja objektiivisten vai kutusten, kuten hyper- tai hypoglykemian ohella erityisesti diabetekseen liittyvistä myöhemmistä vaurioista. Niihin 35 kuuluvat ennen kaikkea pienten ja suurten verisuonten sai- • 93797 2 raudet, hermosairaudet, munuaissairaudet ja verkkokalvo-sairaudet .

Valmisteina, jotka on sovitettu potilaiden tarpeiden mukaisiksi, on käytetty pelkkien hidastettujen insu-5 liinien ohella ennen kaikkea niin kutsuttuja välimuotoin-suliineja. Ne ovat seoksia hidastetusti vaikuttavasta ja välittömästi ja lyhyen aikaa vaikuttavasta komponentista. Tällaiset seokset ovat monimutkaisia monifaasijärjestel-miä, jotka ovat pitkäaikaisesti stabiileja vain suhteelli-10 sen rajoitetuissa sekoitussuhteissa. Niinpä esimerkiksi 2-sinkki-sikainsuliinikiteiden suspensio ei ole vapaasti sekoitettavissa liuotettuun sian insuliiniin. Joukkoon sekoitettu liuotettu insuliini saostuu heti tai ajan kuluessa suhteellisen suuren sinkkipitoisuuden (joka on 15 välttämätön kiteiden stabiloimiseksi) takia. Tällaiset seokset ovat stabiileja ahtaissa rajoissa, jos liuotettuna insuliinina käytetään naudan insuliinia (tämä heikentää kuitenkin puhtautta spesieksen suhteen, lääketieteellisesti toivottua ominaisuutta) tai liuotetun sikainsuliinin ja 20 des-fenyylialaniini(Bl)sikainsuliinin seosta (GB-hakemus-julkaisu 1 491 837). Liuotettuun insuliiniin sekoitettavuuden kannalta edullisempia ovat protamiini-insuliinival-misteet, jos hidastettuna komponenttina käytetään prota-miini- ja insuliinikiteitä isofaani-insuliinin suhteessa.

. . 25 Näillä valmisteilla on saatavissa aikaan NPH-tyyppisiä (NPH = Hagedornin mukainen neutraali protamiinivalmiste) vaikutuskäyriä. Protamiinin (sellaisenaan tai suolan muodossa) läsnäolo lisäaineena vaikuttaa kylläkin puolustettavissa olevalta, koska protamiini on suhteellisen haita-30 ton, elimistölle vieras proteiini; siitä huolimatta se on .. kuitenkin elimistölle vieras aine, joka ainakin vieraille # * proteiineille erityisen herkissä potilaissa saattaa johtaa epätoivottaviin reaktioihin.

Siksi on tärkeää saada aikaan stabiileja farmaseut-35 tisia aineita, joilla on diabeetikon yksilöllisiin tarpei- • 93797 3 siin sovitetut vaikutusominaisuudet ja jotka sisältävät lisäksi vain hyvin pieniä määriä elimistölle vieraita proteiineja, mieluimmin ei ollenkaan tällaisia aineita. Vaikuttavien aineiden yhdistelmät, jotka koostuvat luontai-5 sesta insuliinista tai sen des-Phe(Bl)analogeista ja insu-liinijohdannaisista, joiden B-ketjun C-päässä on luonteeltaan emäksinen orgaaninen ryhmä, merkitsevät tässä suhteessa huomattavaa edistystä (vertaa esimerkiksi EP-hake-musjulkaisu 132 769).

10 Insuliinijohdannaiset, joiden B-ketjun C-päässä on ryhmä Arg-OH tai Arg-Arg-OH, ovat tunnettuja. Näitä johdannaisia muodostuu proinsuliinin entsymaattisessa muuttumisessa insuliiniksi in vivo luonnollisina välituotteina, ja niitä on havaittavissa pieninä määrinä myös haimauut-15 teissä. Mainitut ryhmät lohkeavat normaalisti trypsiinin ja/tai karboksipeptidaasi B:n tai spesifisyydeltään samankaltaisten entsyymien vaikutuksesta, jolloin vapautuu luontainen insuliini.

Muita C-terminaalisesti emäksisiksi muunnettuja 20 insuliinijohdannaisia kuvataan esimerkiksi EP-hakemusjul kaisuissa 132 770 ja 140 084.

Näille insuliinijohdannaisille on yhteistä, että molekyylin pinnalla olevat yksi tai useampi positiivinen lisävaraus antavat molekyylille neutraalialuetta kohden ·, . 25 siirtyneen isoelektrisen pisteen. Isoelektrisessä fokusoinnissa saadaan johdannaisesta riippuen isoelektrisiä pisteitä noin 5,8 - 8,5, erityisesti niukkaliukoisempia kuin luontainen insuliini, jonka isoelektrinen piste ja siten niukkaliukoisuusmaksimialue on pH-arvossa noin 5,4 30 ja joka on neutraalialueella normaalisti liuenneena.

: Käyttöön saadaan terapeuttisesti kiintoisia yhdis- j * telmiä, kuten esimerkiksi liuenneessa tai NPH-kiteiden muodossa olevan insuliinin tai muiden klassisten hidastettujen muotojen ja insuliinijohdannaisen seoksia. Tällä 35 tavalla voidaan valmistaa muiden muassa sangen pitkävai- m % 4 93797 kutteisia valmisteita, joilla on erilaistunut peruskäyrä. Tämä on toivottavaa erityisesti ihmisinsuliinin kohdalla, sillä tähänastisten kokemusten mukaan sen vaikutuksen kesto ei sinkkikidemuodossa eikä NPH-kidemuodossa vastaa to-5 dellista voimakkaasti hidastettua vapautumista (kuten esimerkiksi analogisilla nautainsuliinivalmisteilla). Nämä tunnetut valmisteet sisältävät sinkki-ioneja korkeintaan 1 %, erityisesti kuitenkin korkeintaan 0,8 % insuliinijoh-dannaisen massasta laskettuna. Tavallisesti kiteytymiseen 10 riittävät suhteellisen pienet sinkkimäärät, esimerkiksi korkeintaan vain 40 pg/100 ky (kansainvälistä yksikköä), edullisesti korkeintaan noin 30 pg/100 ky, jotka ovat tietyissä olosuhteissa sisällytettyinä valmiiksi kuiva-aineeseen. Ne voivat lisäksi sisältää apuaineita, joilla on 15 insuliinin vapautumista hidastava vaikutus, kuten globii-nia tai protamiinisulfaattia.

Kiteiden koko- ja homogeenisuusetujen ohella suhteellisen pienellä sinkkipitoisuudella (joka on pienempi kuin pitoisuus, jossa sinkki on katsottava depot-kantajak-20 si) saadaan aikaan se etu, että kidesuspensio on vapaasti sekoitettavissa liuenneen insuliinin kanssa. Siten on esimerkiksi mahdollista yhdistää insuliiniliuoksia insuliini-johdannaiskiteiden suspensioihin ennen antoa. Vaihtelemalla yksittäisten komponenttien osuuksia voidaan ohjata si-,· : 25 ten saadun lääkkeen vaikutusprofiilia.

Kuvatuista johdannaisista valmistetuilla kidesus-pensioilla on siten edullisella tavalla kaikki ominaisuudet, jotka ovat diabeteksen hoidon kannalta toivottavia. Hidastusmekanismi on insuliinijohdannaisten luontainen 30 ominaisuus ja perustuu erääseen proteiinikemialliseen il- ·;' miöön, niukkaliukoisuuteen isoelektrisessä pisteessä. Se « saa käytännössä aikaan todellisen voimakkaasti hidastetun vapautumisen.

Lisäksi on kuitenkin toivottavaa saada käyttöön 35 voimakkaasti hidastetun vapautumisen lisäksi myös keskinkertaisesti hidastettu vapautuminen.

t 5 93797 Tähän päämäärään päästiin keksinnön mukaisesti kehittämällä menetelmä sekakiteiden valmistamiseksi, jotka sisältävät (A) ihmisinsuliinia ja 5 (B) Arg-B31-ihmisinsuliinia ja/tai Arg2-(B31-32)- ihmisinsuliinia.

Menetelmälle on tunnusomaista, että valmistetaan vesiliuos, joka sisältää (A) ihmisinsuliinia ja (B) Arg-B31-ihmisinsuliinia 10 ja/tai Arg2-(B31-32)-ihmisinsuliinia painosuhteessa noin (10-90):(90-10), vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää säilöntäainetta, vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää isotonisuuden aikaansaavaa ainetta, vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää happoa sekä mahdollises-15 ti muita fysiologisesti hyväksyttäviä lisä- ja apuaineita, ja jolloin vesiliuoksen pH on noin 2,5 - 3,5, minkä jälkeen liuoksen pH säädetään arvoon noin 5,5 - 6,9, edullisesti arvoon noin 5,9 - 6,5, lisäämällä fysiologisesti hyväksyttävää emästä, edullisesti NaOH:ta, 20 ja mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttävää puskuria, ja komponenttien A ja B kokonaispitoisuus vesiliuoksessa säädetään arvoon noin 0,2 - 40 mg/ml, edullisesti arvoon noin 1-7,5 mg/ml, ja kiteytetään tästä liuoksesta komponenteista A ja 25 B koostuvia sekakiteitä.

Komponenttina A käytetyn ihmisinsuliinin isoelekt-rinen piste on korkeintaan noin 5,5; ja emäksisiksi muunnettujen, komponenttina B käytettävien insuliinien iso-elektrinen piste on noin 5,8 - 8,5.

30 Keksinnön mukaisesti valmistetuille sekakiteille on tunnettuihin samojen yksittäiskomponenttien puhtaasti fy- , · sikaalisiin seoksiin nähden vertailukelpoisesta stabiili-suudesta (ilman sinkkiä tai vain pienen sinkkimäärän läsnäollessa) huolimatta ominaista äärimmäisen pitkän vaiku-35 tusajan selvä lyheneminen vaikutustehon ollessa vastaava 93797 6 kuin klassisilla depot-insuliinivalmisteilla (jotka sisältävät protamiini-insuliinikiteitä tai 2-sinkki-insuliini-kiteitä), joiden vaikutusaika on lyhyempi. Vaikutusaika on kuitenkin klassisiin depot-insuliinivalmisteisiin verrat-5 tuna selvästi pidempi; se on siis mainittujen klassisten depot-insuliinivalmisteiden vaikutusajan ja yksittäiskom-ponenttien A ja B puhtaasti fysikaalisten seosten äärimmäisen pitkän vaikutusajan välissä. Tämä ilmiö on erityisesti ihmisinsuliinihoidon ollessa kyseessä toivottava, 10 eikä se ole tähän menneessä ollut mahdollinen. On erittäin yllättävää, että keksinnön mukaisesti valmistetuilla seka-kiteillä on juuri tämä vaikutus.

Insuliiniosan A välttämätön nopea vaikutuksen alkaminen on sekakiteytyksestä huolimatta tallella, ja sitä 15 voidaan mahdollisesti nopeuttaa sekoittamalla joukkoon mekaanisesti tai fysikaalisesti liuennutta insuliinia.

Tämä odottamaton, terapeuttisesti erittäin hyödyllinen vaikutus perustuu todennäköisesti emäksisiksi muunnettujen insuliinien B kidehilasidosten helpompaan pilk-20 koutumiseen fysiologisissa pH-arvoissa, kun hiloihin on tarkoituksellisesti sisällytetty häiriökohtia komponentin A, jonka isoelektrinen piste on alhaisempi, avulla.

Komponenttien A ja B edullinen massasuhde keksinnön mukaisissa sekakiteissä on noin (10-90):(90-10). Tämä . 25 tarkoittaa sitä, että kumpaakin komponenteista A ja B täy tyy normaalisti olla läsnä sekakiteissä vähintään 10 pai-no-%.

Sekakidekomponenttina A käytetään ihmisinsuliinia.

Sekakidekomponentti B koostuu vähintään yhdestä 30 B-ketjun C-päästä emäksiseksi muunnetusta insuliinista; . Keksinnön mukaisesti käytetään Arg(B31)-ihmisinsuliinia ja/tai Arg2(B31-32)ihmisinsuliinia, jolloin näitä voi olla läsnä käytännöllisesti katsoen kaikissa halutuissa sekoitussuhteissa .

93797 7

Komponenteista A ja B koostuvia sekakiteitä voidaan keksinnön mukaisesti saada vain suhteellisen kapealla pH-alueella olevasta liuoksesta; tämän kapean pH-alueen ulkopuolella ei yllättävästi saada sekakiteitä - tai ei 5 ainakaan optimaalisia sekakiteitä.

Komponentin A isoelektrinen piste on korkeintaan noin 5,5; ja komponenttien B noin 5,8 - 8,5.

Käytettäessä useampaa kuin yhtä komponenttia B on haluttu verensokerin alenemiskäyrä saatavissa hyvin aikaan 10 niiden sekoitussuhdetta säätämällä.

Komponenttien A ja B sekoitussuhde (massasuhde) on suunnilleen (10-90):(90-10). Komponentteja A ja B on seka-kiteissä suurin piirtein samassa massasuhteessa kuin läh-töaineliuoksessakin.

15 Fysiologisesti hyväksyttävinä säilöntäaineina voi daan käyttää tällaisiin tarkoituksiin tavanomaisia ja tunnettuja aineita, siis esimerkiksi aromaattisia hydroksyy-liyhdisteitä, kuten fenolia, m-kresolia ja/tai p-hydroksi-bentsoehappoestereitä (pääasiassa etyyliesteriä) jne. Säi-20 löntäainepitoisuuden tulee myös olla tavanomaisella alueella. Pitoisuudet noin 0,02 - 1 (paino-)% ovat tarkoituksenmukaisia .

Fysiologisesti hyväksyttävinä isotonisuuden säätö-aineina tulevat samoin kyseeseen tällaisiin tarkoituksiin 25 tavallisesti käytettävät yhdisteet, kuten esimerkiksi gly-seriini ja/tai NaCl jne. Myös niiden pitoisuuden tulee olla tavanomaisella alueella, ts. tässä yhteydessä siis edullisesti suunnilleen 300 milliosmol.

Fysiologisesti hyväksyttävinä (pH-arvon säätöön 30 käytettävinä) happoina käytetään esimerkiksi etikkahappoa, · sitruunahappoa, fosforihappoa jne. Niiden pitoisuus mää räytyy pääasiassa liuoksen pH-arvorajojen mukaan.

Kyseeseen tulevia fysiologiseeti hyväksyttäviä emäksiä ovat esimerkiksi NaOH, KOH jne. ja fysiologisesti 35 hyväksyttäviä puskureita ovat esimerkiksi natriumasetaat- • 93797 8 ti, -sitraatti ja -fosfaatti ja tris(hydroksimetyyli)ami-nometaani jne.

Kiteytysliuos voi luonnollisesti sisältää mahdollisesti myös muita fysiologisesti hyväksyttäviä lisä- ja 5 apuaineita, kuten esimerkiksi sinkkisuolaa.

Kun (ensin suhteellisen happaman) kiteytysliuoksen pH on säädetty suunnilleen arvoon 5,5 - 6,9, edullisesti noin 5,9 - 6,5, annetaan liuoksen seistä edullisesti lämpötilassa noin 3-27 °C, erityisesti noin 10 - 20 °C; täl-10 löin A:sta ja B:stä koostuvat sekakiteet kiteytyvät enemmän tai vähemmän nopeasti.

Niitä voidaan käyttää myös yhdessä emäliuoksen kanssa vastaavana farmaseuttisena aineena. Jos liuokseen lisätään Zn-ioneja (vastaavien yhdisteiden muodossa) de-15 pot-apuaineeksi, tulee niiden määrä edullisesti säätää sellaiseksi, että tuloksena oleva sekakidesuspensio sisältää korkeintaan noin 100 pg/100 ky Zn-ioneja. Tämän valmisteen muunnoksena voidaan siten valmistetut sekakiteet myös eristää sentrifugoimalla ja suspendoida kylmäkuivauk-20 sen jälkeen annoksen mukaisesti plasebopuskuriin.

Keksinnön mukaiset sekakiteet sekä vastaavat farmaseuttiset valmisteet, jotka sisältävät näitä sekakiteitä, soveltuvat erinomaisesti diabetes mellituksen hoitoon keskinkertaisesti hidastetun vapautumisensa ansiosta ja sen 25 ansiosta, että on mahdollista tehdä "hienosäätö" vaihtelemalla erityisesti komponentin B sisältämien yksittäisten yhdisteiden lajia ja määrää.

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin esimerkein.

30 Esimerkki 1 ;· Sekakidesuspensio, joka sisältää 25 % ihmisinsu- liinia ja 75 % Arg2(B31-32Jihmisinsuliinia, kokonaisaktii- visuus 40 ky/ml.

Liuotetaan vesimäärään, joka vastaa kokonaistila-35 vuutta 100 ml.

9 93797

Arg2(B31-32)ihmisinsuliinia (27 ky/ml) 111 mg

Ihmisinsuliinia (27 ky/mg) 37 mg

Sitruunahappomonohydraattia 1050 mg

Glyseriiniä 1600 mg 5 Fenolia 65 mg m-kresolia 165 mg

Liuoksen pH on noin 3,5. Liuoksen pH säädetään kiteytymisen aikaansaamiseksi IN NaOH:lla arvoon 6,3. Kun on tapahtunut täydellinen kiteytyminen pidettäessä liuosta 10 yön yli huoneen lämpötilassa, havaitaan supernatantissa HPLC:lla (suurpainenestekromatografiällä) 3 - 5 % ihmisin-suliinia/Arg2(B31-32)ihmisinsuliinia. Niiden suhde on samoin kuin rinnakkaiskiteytyksessäkin 25/75; annettaessa kaniineille s.c. (ihonalaisesti) 100 μΐ kirkasta superna-15 tanttia ei ole havaittavissa merkittävää veren sokeripitoisuuden alenemista (koska liuos ei enää sisällä käytännöllisesti katsoen ollenkaan vaikuttavaa ainetta).

Esimerkki 2

Sekakiteytetään esimerkin 1 mukaisesti: 20 Arg2(B31-22)ihmisinsuliinia 74 mg

Arg(B31)ihmisinsuliinia (27 ky/mg) 37 mg

Ihmisinsuliinia 37 mg

Kidesedimentti erotetaan sentrifugoimalla, pestään puskuriliuoksella ja kylmäkuivataan. Kylmäkuivattu sekaki-25 dejauhe lietetään plasebopuskuriin (pH 6,5) pitoisuudeksi 40 ky/ml.

Esimerkki 3

Ihmisinsuliinia (27 ky/mg) 37 mg

Arg(B31)ihmisinsuliinia (27 ky/mg) 111 mg 30 sekakiteytetään esimerkin 2 mukaisesti, eristetään ja kyl mäkuivataan. Liete, joka sisältää tätä kidejauhetta plase-bopuskurissa (pH 6,3, 40 ky/ml), saa aikaan s.c. annettuna (0,2 ky/kg) koiralla selvästi hidastetun veren sokeripitoisuuden alenemisen, joka on verrattavissa NPH-insu-35 liiniin.

Claims (2)

93797

1. Menetelmä sekakiteiden valmistamiseksi, jotka sisältävät 5 (A) ihmisinsuliinia ja (B) Arg-B31-ihmisinsuliinia ja/tai Arg2-(B31-32)-ihmisinsuliinia, tunnettu siitä, että valmistetaan vesi-liuos, joka sisältää 10 (A) ihmisinsuliinia ja (B) Arg-B31-ihmisinsuliinia ja/tai Arg2-(B31-32)-ihmisinsuliinia painosuhteessa noin (10-90):(90-10), vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää säilöntäainetta, vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää isotonisuuden aikaansaavaa ainetta, vähintään 15 yhtä fysiologisesti hyväksyttävää happoa sekä mahdollisesti muita fysiologisesti hyväksyttäviä lisä- ja apuaineita, ja jolloin vesiliuoksen pH on noin 2,5 - 3,5, minkä jälkeen liuoksen pH säädetään arvoon noin 5,5 - 6,9, edullisesti arvoon noin 5,9 - 6,5, lisäämällä 20 fysiologisesti hyväksyttävää emästä, edullisesti NaOH:ta, ja mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttävää puskuria, ja komponenttien A ja B kokonaispitoisuus vesiliuoksessa säädetään arvoon noin 0,2 - 40 mg/ml, edullisesti arvoon noin 1-7,5 mg/ml, 25 ja kiteytetään tästä liuoksesta komponenteista A ja B koostuvia sekakiteitä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fysiologisesti hyväksyttävinä säilöntäaineina käytetään fenolia, m-kresolia ja/tai p-hyd- 30 roksibentsoehappoetyyliesteriä, fysiologisesti hyväksyttä- ;i vinä isotonisuuden säätöaineina glyseriiniä ja/tai NaCl:a, fysiologisesti hyväksyttävinä happoina etikkahappoa, sitruunahappoa ja/tai fosforihappoa, fysiologisesti hyväksyttävinä puskureina natriumasetaattia, -sitraattia ja/tai 35 -fosfaattia ja/tai tris(hydroksimetyyliJaminometaania. 93797