KR20200038502A - 신규한 아실화 인슐린 유사체 및 이의 용도 - Google Patents
신규한 아실화 인슐린 유사체 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200038502A KR20200038502A KR1020207006535A KR20207006535A KR20200038502A KR 20200038502 A KR20200038502 A KR 20200038502A KR 1020207006535 A KR1020207006535 A KR 1020207006535A KR 20207006535 A KR20207006535 A KR 20207006535A KR 20200038502 A KR20200038502 A KR 20200038502A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- insulin
- seq
- nos
- desb29
- desb30
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
본 발명은 특히 당뇨병, 비만 및 심혈관 질환과 관련된 병태를 치료하거나 예방함에 있어서 아실화 인슐린 유사체와 같은 신규한 인슐린 유사체 및 이의 유도체, 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 특히 당뇨병, 비만 및 심혈관 질환과 관련된 의료 상태의 치료 또는 예방에 있어서 아실화 인슐린 유사체와 같은 새로운 인슐린 유사체 및 이의 유도체, 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
"SEQUENCE LISTING"이라는 명칭의 서열 목록은 8,00 킬로바이트이고, 2018년 5월 13일에 생성되었으며, 참조로서 본원에 통합된다.
당뇨병은 글루코오스를 이용하는 능력이 부분적으로 또는 완전히 상실되는 대사 장애이다. 전 세계 인구 중 5% 이상이 당뇨병을 앓고 있으며, 수백만명이 이 병에 걸릴 위험이 있다.
현재 치료법으로, 당뇨병 환자 중 여전히 약 50%가 심혈관 질환으로 사망하며, 당뇨병 환자들이 또한 (신병증, 망막병증 및 신경병증과 같은) 미세혈관 합병증에 걸릴 위험이 있기 때문에, 개선된 치료를 위한 새로운 약물 개발에 대한 지속적인 필요가 있다. 특히 2형 당뇨병의 경우, 이들 환자들은 고혈당과 더불어 다양한 대사 장애, 예컨대 현재 인슐린 치료가 제한된 유익한 효과만을 갖는 예를 들어 이상지질혈증, 비만 및 심혈관 합병증을 종종 겪는다.
간에서 인슐린은 포도당 신생합성과 글리코겐 분해를 억제하고, 글리코겐 합성을 증가시켜, 간으로부터 포도당 방출을 감소시킨다. 이러한 과정은 간세포 인슐린 저항성에 의해 현저하게 손상되고, 이는 대사 증후군에서 공복 고혈당증의 주요 원인이다. 포도당 대사에 미치는 효과와 더불어, 인슐린은 또한 전사 인자 SREBP-1c의 활성화를 통해 간에서의 지방산 및 중성지방의 합성을 증가시키고, 이는 차례로 아세틸-조효소 A 카르복실라제 및 지방산 합성효소(FAS)를 포함하는 지방형성 효소에 대한 유전자의 전사를 증가시킨다. 그러나, 글리코겐 합성 및 포도당 생성에 미치는 영향과는 대조적으로, 인슐린에 의한 지질 합성 증가는 전혀 영향을 받지 않거나, 2형 당뇨병의 인슐린 저항성 설치류 모델 및, 지방이상증 또는 세포 내 인슐린 신호전달 경로에서 특정 노드에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 야기되는 당뇨병으로 고통 받는 인간에서 적어도 덜 손상된다. 따라서, 대사 증후군과 관련된 고인슐린혈증은 간 지질 합성 증가를 직접적으로 야기하여 중성지방 순환 수준의 증가를 악화시킬 수 있다. 이는 여러 연구가, 간 인슐린 저항성이 인간 이상지질혈증, 간 지방증, 심혈관 혈관 기능 장애, 및 심지어 2형 당뇨병 환자에서 관찰된 신장 기능 저하에 기여한다는 것을 보여주는 매우 가능성이 높은 이유이다. 같은 맥락에서, 혈당 수치를 낮추기 위해 고농도 인슐린을 동반한 인슐린 저항성 대상체의 치료는 예컨대 드 노보 지질 합성(de novo lipogenesis)에 관여하는 비-저항성 경로의 과자극을 초래할 수 있다. 비내성 경로(예: 지질 합성 경로)를 과도하게 자극하지 않고 혈당 수치를 낮추기 위해, 혈당 저하 경로를 선택적으로 활성화하는 인슐린 유사체에 대해 접근하는 것이 바람직할 것이다. 기능적으로 선택적인 이러한 인슐린 유사체는 혈당 수치를 저하시켜, 이상지질혈증, 간 지방증, 죽상 경화증 및 심혈관 질환(CVD)에 대한 개선된 효과를 나타낸다.
WO 2005 054291은 B28K 아실화를 갖는 단쇄 인슐린을 기술한 것으로 알려진다. WO 2009 112583은 B28K를 포함하는 프로테아제 안정화 인슐린 유사체를 기술한 것으로 알려진다. WO90/07511, WO96/15804, WO200043034, US2012241356, WO2012015692 및 WO9731022는 B28K를 포함하는 인슐린 유사체를 개시한 것으로 알려지며, 그 중 일부는 또한 동일한 위치에 아실화를 개시한 것으로 알려진다.
매우 다양한 인슐린 유사체 및 유도체가 보고되었다. 그러나 이들은 모두 상당히 동일한 방식으로 인슐린 수용체를 활성화시킨다. 다시 말해, 인슐린 수용체 활성화의 하류 효과는, 활성화가 고친화도 유사체에 대한 결합 또는 저친화도 유사체에 대한 결합으로 인한 것인지 여부와 무관하게 아주 유사하며, 효능만 상이하다.
따라서, 저항성 및 비-저항성 경로, 예컨대, 포도당 신생합성 및 지질 대사 경로에 기능적으로 선택적인 특성을 갖는 인슐린 유사체 및 유도체에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
제1 양태에서, 본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것으로서, 상기 인슐린 유도체는 B5Y 및 아실기를 포함하는 치환기를 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것으로서, 상기 인슐린 유도체는 B5F 및 아실기를 포함하는 치환기를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것으로서, 상기 인슐린 유도체는 B5Y, B26G 또는 B26A, 및 B28K, B26K 또는 B29K에 부착된 아실기를 포함하는 치환기를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것으로서, 상기 인슐린 유도체는 B5F, B26G 또는 B26A, 및 B28K, B26K 또는 B29K에 부착된 아실기를 포함하는 치환기를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 본 발명의 인슐린 유도체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음의 치료용 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 용도에 관한 것이다: 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 혈당 내성, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 내성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상 경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 혈관 장애, 관동맥성 심장병, 뇌졸중, 염증성 장 증후군, 소화불량, 저혈압 또는 위궤양.
추가적으로 또는 제2 양태의 대안으로, 본 발명은 비만, 이상지질혈증 또는 심혈관 합병증과 관련된 프로세스에 대해 개선된 효과를 갖는, 예컨대, 체중 증가를 감소시키고, 체지방량 증가를 감소시키고, 간 중성 지방 증가를 감소시키거나, 혈관 내피 기능을 개선하는 인슐린 유도체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 지질 대사에 부정적 영향을 미치지 않으면서 혈당을 낮출 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린 수용체 인산화를 준최대 값으로 유도하고, 선택적 신호 전달을 유도하여 선택적 세포 반응을 유도하며, 인간 인슐린과 비교해, 혈당 저하 경로보다 지질 대사 경로에 대해 최대 반응을 저하시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 인슐린 유도체는, 혈당 저하 외에도, 특히 지방량 증가를 저하시킴으로써 체중 증가를 또한 저하시킨다.
일 양태에서, 본 발명은, 특히 인간 인슐린과 비교해 간 중성지방 저하를 증가시킴으로써 간 지질이상 혈증, 간 지방증 또는 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD)와 관련된 프로세스에 대해 개선된 효과를 갖는 인슐린 유도체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 심혈관 장애와 관련된 프로세스에 대해 개선된 효과을 갖는, 예컨대 인간 인슐린과 비교해 개선된 혈관 내피 기능을 갖는 인슐린 유도체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 당뇨병 환자에서 부정적인 심혈관 이상 사례의 발생을 낮춘다.
일 양태에서 본 발명은 제형 상태에서 안정성이 개선된 인슐린 유도체를 제공한다.
본 발명은 예시적인 구현예의 개시로부터 명백해지는 추가적인 문제를 해결할 수도 있다.
도 1은 가용화된 IR-A를 이용한 경쟁 결합 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 수용체 결합 곡선을 보여주고(CPM = 분당 계수);
도 2는 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 IRpY1158 인산화 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 3은 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 AKT 인산화 분석(세린 잔기 번호 473의 인산화)에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 4는 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 ERK 인산화 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 5는 랫트 1차 지방세포에서의 지방형성(lipogenesis) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고(DPM = 분당 붕해);
도 6은 랫트 1차 간세포에서의 글리코겐 합성 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 7은 랫트 1차 간세포로부터 단리한 cDNA를 이용해 수행된 fasn에 대한 정량 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 8은 랫트 1차 간세포로부터 단리한 cDNA를 이용해 수행된 g6pc에 대한 정량 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 9는 랫트 1차 간세포에서의 드노보 지방형성(de novo lipogenesis) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고(CPM = 분당 계수);
도 10은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 HbA1c 수준에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 11은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 체중에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 12는 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 체지방량에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 13은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 간 TG에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 14는 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 간막 동맥의 ACh-자극 혈관 이완에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 15는 3 Zn/6ins, 30 mM 페놀, 1.6% 글리세롤 및 7 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 포함하는 pH 7.6의 0.6 mM 비교기 화합물, 즉 비교기 화합물 9(검은 선)의 제형에 대한 대표적인 SEC 데이터를 보여주고; 인간 알부민, Co(III)인슐린 헥사머 및 단량체 인슐린 유사체(B9Asp, B27Glu)의 SEC 기준 혼합물이 포함된다(회색 선).
도 16은 실시예 3의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주고;
도 17은 실시예 11의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주고;
도 18은 실시예 12의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주며;
도 19는 실시예 15의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여준다.
도 2는 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 IRpY1158 인산화 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 3은 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 AKT 인산화 분석(세린 잔기 번호 473의 인산화)에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 4는 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 ERK 인산화 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 5는 랫트 1차 지방세포에서의 지방형성(lipogenesis) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고(DPM = 분당 붕해);
도 6은 랫트 1차 간세포에서의 글리코겐 합성 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 7은 랫트 1차 간세포로부터 단리한 cDNA를 이용해 수행된 fasn에 대한 정량 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 8은 랫트 1차 간세포로부터 단리한 cDNA를 이용해 수행된 g6pc에 대한 정량 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고;
도 9는 랫트 1차 간세포에서의 드노보 지방형성(de novo lipogenesis) 분석에서 인간 인슐린(●) 및 실시예 15의 화합물(▲)에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고(CPM = 분당 계수);
도 10은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 HbA1c 수준에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 11은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 체중에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 12는 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 체지방량에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 13은 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 간 TG에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 14는 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 간막 동맥의 ACh-자극 혈관 이완에 대한 대표적인 곡선을 보여주고;
도 15는 3 Zn/6ins, 30 mM 페놀, 1.6% 글리세롤 및 7 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 포함하는 pH 7.6의 0.6 mM 비교기 화합물, 즉 비교기 화합물 9(검은 선)의 제형에 대한 대표적인 SEC 데이터를 보여주고; 인간 알부민, Co(III)인슐린 헥사머 및 단량체 인슐린 유사체(B9Asp, B27Glu)의 SEC 기준 혼합물이 포함된다(회색 선).
도 16은 실시예 3의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주고;
도 17은 실시예 11의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주고;
도 18은 실시예 12의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여주며;
도 19는 실시예 15의 화합물과 유사한 제형(검은 선)의 대표적인 SEC 데이터를 보여준다.
본 발명은, 인간 인슐린의 신규한 유사체를 제공하는데, 상기 유사체는 아실화되고, 당생성 및 지질 대사에 관여하는 경로에 대해 기능적으로 선택적인 특성을 나타낸다.
본 발명은 광범위하게는 B5Y 또는 B5F, 및 아실기를 포함하는 치환기를 포함하는 인슐린 유도체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린은 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 65% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체 아실기를 포함하는 치환기를 포함한다.
일 구현예에서, 치환기는 B28K, B26K 또는 B29K에 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 B28K에 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 B26K에 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 B29K에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 B26G 또는 B26A를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 A14E를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 desB30, desB29-30 또는 desB27-30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 desB30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 desB29-30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유도체는 desB27-30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 1 내지 46의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다:
본 발명은 당뇨병의 치료 및 예방용 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 용도에 관한 것이다.
놀랍게도, 본 발명의 인슐린 유도체가 지질 대사 또는 혈관 내피 기능 장애에 부정적인 영향을 덜 미치면서 혈당을 낮출 수 있다는 것이 동물 모델에서 밝혀졌다. 이는 심혈관 이상 사례의 발생 저하를 유도하는 것으로 여겨지며, 이러한 동물 실험은 종래의 인슐린 치료와 비교해 혈당 저하가 체중 감소, 특히 지방량 감소를 수반한다는 것을 또한 보여준다.
동물 실험도 종래의 인슐린 치료와 비교해 혈당 저하가 간 중성 지방 감소의 증가를 수반한다는 것을 보여주므로, 이는 간 질환의 발생 또는 진행에 유익한 효과를 초래할 가능성이 있다.
또한, 생체 내 하향 스트림 신호 전달을 조사했을 때, 본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린 수용체 인산화를 준최대 값으로 유도하고, 선택적 신호 전달을 유도하여 선택적 세포 반응을 유도하며, 인간 인슐린과 비교해, 혈당 저하 경로보다 지질 대사 경로에 대해 최대 반응을 저하시키는 것으로 나타났다.
마지막으로, 본 발명의 인슐린 유도체는 원하는 선택적 신호 전달 및 제형에서의 개선된 안정성도 갖는다.
인슐린
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 인슐린"은 구조 및 특성이 잘 알려져 있는 인간 인슐린 호르몬을 의미한다. 인간 인슐린은 A-사슬과 B-사슬로 명명된 2개의 폴리펩티드 사슬을 갖는다. A-사슬은 21개 아미노산 펩티드이고, B-사슬은 30개 아미노산 펩티드이며, 2개의 사슬은 다음의 이황화 브리지에 의해 연결된다: A-사슬의 위치 7에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 7에 있는 시스테인 사이의 제1 브리지; 및 A-사슬의 위치 20에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 19에 있는 시스테인 사이의 제2 브리지. 제3 브리지는 A-사슬의 위치 6에 있는 시스테인과 11에 있는 시스테인 사이에 존재한다.
인간 인슐린 A-사슬은 다음 서열: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(서열번호 1)을 갖는 반면, B-사슬은 다음 서열을 갖는다: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(서열번호 2).
인간 신체에서, 호르몬은 24개의 아미노산으로 이루어진 단쇄 전구체 프로인슐린(인슐린전구물질)으로서 합성되고, 86개의 아미노산을 포함하는 프로인슐린이 이 구성(프리펩티드-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A)에 이어지며, 여기서 C는 31개 아미노산의 연결 펩티드이다. Arg-Arg 및 Lys-Arg는 A 및 B 사슬로부터 연결 펩티드를 절단하기 위한 절단 부위이다.
본 발명에 따른 "인슐린"은 본원에서 인간 인슐린, 또는 돼지 또는 소 인슐린과 같이 다른 종에서 유래된 인슐린으로서 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 펩티드"는 인슐린 활성을 갖는 인간 인슐린 또는 이의 유사체 또는 유도체인 펩티드를 의미한다.
인슐린 유사체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린으로부터 결실되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린에 추가 및/또는 삽입된, 변형된 단일 인간 인슐린 분자를 의미한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린에 대해 10개 미만의 아미노산 변형(치환, 결실, 추가(삽입 포함) 및 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 대안적으로는 인간 인슐린에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 변형을 포함한다.
인슐린 분자에서의 변형은 사슬(A 또는 B), 위치, 및 천연 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 대한 1자 또는 3자 코드를 나타내는 것으로 표시된다.
"연결 펩티드" 또는 "C-펩티드"는 단쇄 프로인슐린 분자의 B-C-A 폴리펩티드 서열 중 연결 모이어티 "C"를 의미한다. 인간 인슐린 사슬에서, C-펩티드는 B 사슬의 위치 30과 A 사슬의 위치 1을 연결하고, 35개 아미노산 잔기 길이이다. 연결 펩티드는 2개의 말단 이염기 아미노산 서열, 예를 들어 Arg-Arg 및 Lys-Arg를 포함하는데, 이들은 A 및 B 사슬로부터 연결 펩티드를 절단해 2쇄 인슐린 분자를 형성하기 위한 절단 부위의 역할을 한다.
"desB30" 또는 "B(1-29)"는 B30 아미노산이 결여된 천연 인슐린 B 사슬 또는 이의 유사체를 의미하고, "A(1-21)"은 천연 인슐린 A 사슬을 의미한다. 따라서, 예를 들어, B5Y, B28K, desB29-desB30 인간 인슐린은 B 사슬의 위치 5에서 아미노산이 티로신(Tyr 또는 Y)으로 치환되고, B 사슬의 위치 28에서 아미노산은 리신(Lys 또는 K)로 치환되고, B 사슬의 위치 29 및 30에서 아미노산이 결실되는, 인간 인슐린의 유사체이다.
본원에서, "A1", "A2" 및 "A3" 등과 같은 용어는 인슐린의 A 사슬에서 위치 1, 2 및 3 등에 있는 아미노산을 각각 나타낸다(N-말단 단부로부터 계수됨). 유사하게, "B1", "B2" 및 "B3" 등과 같은 용어는 인슐린의 B 사슬에서 위치 1, 2 및 3 등에 있는 아미노산을 각각 나타낸다(N-말단 단부로부터 계수됨).
본원에서, 용어 "아미노산 잔기"는 형식적으로 수산기가 카르복시기로부터 제거되었고/되었거나, 형식적으로 수소 원자가 아미노기로부터 제거된 아미노산이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 2~10개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 2~6개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 2~3개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 2개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 3개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 4개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 5개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 6개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 7개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 8개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 9개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 10개의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 10개 미만의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 7개 미만의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 5개 미만의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 4개 미만의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체로서 3개 미만의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B26A 또는 B26G를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B26A를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B26G를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린 유사체는 A14E를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 및 B26A를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 및 B26G를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 및 B26A를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 및 B26G를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B28K, B26K 또는 B29K를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B28K를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B26K를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B29K를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린 유사체는 B26G 또는 B26A를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린은 유사체는 desB30, desB29-30 또는 desB27-30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린 유사체는 desB30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린 유사체는 desB29-30을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인슐린 유사체는 desB27-30을 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 최대 10개의 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 최대 5개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 2개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 3개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 4개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 5개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 6개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 7개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 8개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5Y 이외에 9개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 최대 10개의 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 최대 5개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 2개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 3개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 4개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 5개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 6개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 7개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 8개의 치환을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 B5F 이외에 9개의 치환을 추가로 포함한다.
본 발명의 인슐린 유사체의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 다음을 포함한다:
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
A14E, B5Y, B26G, desB30(서열 번호 3 및 14) 및
A14E, B5Y, B26A, desB30(서열 번호 3 및 15).
인슐린 유도체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 유도체"는 하나 이상의 측쇄가 펩티드에 공유 부착된, 화학적으로 변형된 부모 인슐린 또는 이의 유사체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "측쇄"는 "치환기" 또는 "알부민 결합 모이어티"로서 지칭될 수도 있다. 측쇄의 비제한적인 예는 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르, PEG화물 등이며, 이들은 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알부민 결합 모이어티"는 알부민에 대한 비공유결합이 가능한 임의의 화학기를 지칭하며, 알부민 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 아실기를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 측쇄는 알부민 결합 및 이에 의한 연장(protraction)과 특히 관련된 부분을 포함하는데, 따라서 이 부분은 "연장 모이어티" 또는 "프로트랙터(protractor)" 또는 "아실기"로서 지칭될 수 있다. 연장 모이어티는 펩티드의 부착점에 대해, 알부민 결합 모이어티의 근처에 있고, 바람직하게는 이의 말단 (또는 원위, 또는 유리) 단부에 있을 수 있다.
본 발명에 따른 "치환기", "측쇄" 또는 "알부민 결합 모이어티"는 다음의 화학식 (I)을 가지되,
Acy-L1-L2-L3
식 중,
-
Acy는 아실기이고, 리토콜산으로 표시되고, 다음 화학식의 작용기에 의해 표시되거나:
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH; 또는
Chem. 2: -CO-(CH2)x-테트라졸일;
(여기서, x는 12 내지 20의 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸릴기는 1H-테트라졸-5-일임)
다음 화학식의 지방산에 의해 표시되며:
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(여기서, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄)
-
L1은 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L2는 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L3은 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 부재하되
식 중,
-
OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸 또는 아미노산 잔기 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 -NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-를 나타내고, 다음의 구조로 표시되고:
-
gGlu는 다음의 구조로 표시된 감마 글루탐산 잔기를 나타내고:
(여기서 상기 구조도의 우측에 있는 카르복실기는 이웃하는 아미노기에 대한 결합을 형성하는 감마-카르복시기임)
-
DgGlu는 다음의 구조로 표시된 감마 글루탐산 잔기를 나타내며:
(여기서 상기 구조도의 우측에 있는 카르복실기는 이웃하는 아미노기에 대한 결합을 형성하는 감마-카르복시기임)
-
설폰이미드 C-4는 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 화학식 (I)의 L1-L2-L3은 다음에 의해 독립적으로 표시된다:
-
없음
-
gGlu
-
OEG
-
2xgGlu
-
gGlu-OEG
-
gGlu-2xOEG
-
설폰이미드-C4
-
2x설폰이미드-C4
-
DgGlu
일 구현예에서, 치환기는 화학식 (I) Acy-L1-L2-L3을 가지며, 다음에 의해 독립적으로 표시된다:
-
리토콜산
-
리토콜산-gGlu
-
C14
-
C16 이산
-
C16 이산-gGlu
-
C18 이산
-
C18 이산-gGlu
-
C18 이산-2xgGlu
-
C18 이산-DgGlu
-
C18 이산-gGlu-OEG
-
C18 이산-gGlu-2xOEG
-
C18 이산-OEG
-
C18 이산-설폰이미드-C4
-
C20 이산
-
C20 이산-gGlu
-
C20 이산-gGlu-OEG
-
C20 이산-gGlu-2xOEG
-
테트라졸-C16
-
테트라졸-C16-gGlu-OEG
-
테트라졸-C16-gGlu-2xOEG
-
테트라졸-C16-2x설폰이미드-C4
-
테트라졸-C17
-
테트라졸-C17-설폰이미드-C4
-
테트라졸-C18;
-
테트라졸-C18-설폰이미드-C4
-
테트라졸-C18-2x설폰이미드-C4
일 구현예에서, 치환기는 실시예 15의 치환기이며, 여기서 Acy-L1-L2-L3는 C18이산-gGlu-OEG로 표시되고, 다음의 구조에 의해 표시된다:
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 1~46의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 1~36의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 10~34의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 3, 4, 12~16, 18~20, 22, 23, 25, 26, 28~30의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 14~16, 18, 20 및 26의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 37~39 또는 46의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 40~45의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 실시예 15의 화합물이다: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
아실기
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 아실기이다. 따라서, 아실기를 포함하는 인슐린 유도체는 "아실화 인슐린 유사체"로서 지칭될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 아실기(Acy)를 포함하고, 여기서 아실기는 리토콜산, 또는 다음 화학식의 작용기를 나타내거나,
-
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH; 또는
-
Chem. 2:--CO-(CH2)x-테트라졸릴-
(여기서, x는 12 내지 20의 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸릴기는 1H-테트라졸-5-일임)
하기 화학식의 지방산을 나타낸다:
-
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(여기서, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄).
일 구현예에서, Acy는 리토콜산, 1,16-헥사데칸디오익산, 1,18-옥타데칸디오익산, 1,20-에이코산디오익산, 테트라졸-C16, 테트라졸-C17, 테트라졸 C18 및 테트라데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 디카르복실산을 포함하는 아실기를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 Chem 1의 아실기를 포함한다(식 중, x는 12 내지 20 범위의 정수를 나타냄).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 Chem 1의 아실기를 포함한다(식 중, x는 12 내지 18 범위의 정수를 나타냄).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 Chem 1의 아실기를 포함한다(식 중, x는 12 내지 16 범위의 정수를 나타냄).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 Chem 1의 아실기를 포함한다(식 중, x는 12 내지 14 범위의 정수를 나타냄).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 Chem 1의 아실기를 포함한다(식 중, x는 14, 16 또는 18의 정수, 지방이산기 1,16-헥사데칸디오익산, 1,18-옥타데칸디오익산, 및 1,20-에이코산디오익산을 각각 나타냄).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 -CO-(CH2)12-COOH의 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 1,16-헥사데칸디오익산으로도 명명된 화학식 -CO-(CH2)14-COOH의 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 1,18-옥타데칸디오익산으로도 지칭된 화학식 -CO-(CH2)16-COOH의 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 1,20-에이코산디오익산으로도 지칭된 화학식 -CO-(CH2)18-COOH의 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 -CO-(CH2)20-COOH의 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 리토콜산을 포함하는 아실기를 포함하며, 다음 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 화학식 -CO-(CH2)12-CH3의 지방산을 포함하는 아실기를 포함하며, 다음의 구조로 표시된다:
또 다른 구현예에서, 인슐린 유도체는 적어도 하나의 작용기를 포함하는 아실기를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 카르복실산 및 테트라졸 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 아실기를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 다음 화학식으로부터 선택된 작용기를 포함하는 아실기를 포함한다:
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH; 또는
Chem. 2:--CO-(CH2)x-테트라졸릴-
(식 중, x는 12 내지 20의 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸일기는 1H-테트라졸-5-일임).
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 테트라졸-C16, 테트라졸-C17 및 테트라졸 C18로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라졸 모이어티를 포함하는 작용기를 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 다음의 구조로 표시되는 테트라졸-C16인 작용기를 포함한다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 다음의 구조로 표시되는 테트라졸-C17인 작용기를 포함한다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 다음의 구조로 표시되는 테트라졸-C18인 작용기를 포함한다:
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 지방산을 포함한다.
일 구현예에서, 인슐린 유도체는 다음 화학식의 지방산을 포함한다:
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(식 중, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄).
링커
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 아실기와 같은 모이어티를 인슐린 또는 인슐린 유사체에 결합시킬 수 있는 적절한 측쇄를 포함한다.ㅋ 따라서, 링커와 아실기는 함께 측쇄가 된다. 링커에 결합된 모이어티는 임의의 적절한 모이어티일 수 있다. 예는 알부민 결합 모이어티를 포함한다.
링커는 모이어티(예를 들어, 알부민 결합 모이어티)의 결합 효과에 기여하고/하거나 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, gGlu를 포함하는 링커는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 알부민 결합 효과를 향상시킬 수 있다.
일 구현예에서, 측쇄는 아실기와 인슐린 또는 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 사이의 부분을 포함하며, 상기 부분은 "링커", "링커 모이어티", "링커기", "연결기", "스페이서" 등으로 지칭될 수 있다. 링커는 임의적일 수 있으며, 따라서, 측쇄는 아실기와 동일할 수 있다.
아실기 또는 링커는 아실화에 의해, 즉 (아실기, 알부민 결합 모이어티, 연장 모이어티, 또는 링커의) 카르복실산기와 N-말단에 있는 리신 잔기 또는 아미노산 잔기의 아미노기 사이에 형성된 아미드 결합을 통해, 인슐린 펩티드의 리신 잔기에 공유 부착될 수 있다. 추가적인 또는 대안적인 접합 화학(conjugation chemistry)은 알킬화, 에스테르 형성, 아미드 형성, 또는 예컨대 말레이미드 또는 할로아세트아미드 결합(예컨대, 브로모-/플루오로-/요오드-결합)에 의한 시스테인 잔기에 대한 결합을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 바람직하게는 연장 모이어티 및 링커를 포함하는 아실기의 활성 에스테르는, 전술한 바와 같이, 아미드 결합의 형성 하에 리신 잔기의 아미노기에, 바람직하게는 이의 엡실론 아미노기에 공유 연결된다.
또 다른 구현예에서, 링커기는 부재하고 공유 결합을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 화학식 -L1-L2-L3의 링커 기를 포함하며, 식 중,
-
L1은 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L2는 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L3은 부재하거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내며,
여기서,
gGlu는 다음의 구조로 표시된 감마 글루탐산 잔기를 나타내고:
(여기서 상기 구조도의 우측에 있는 카르복실기는 이웃하는 아미노기에 대한 결합을 형성하는 감마-카르복시기임)
-
DgGlu는 다음의 구조로 표시된 감마 글루탐산 잔기를 나타내며:
(여기서 상기 구조도의 우측에 있는 카르복실기는 이웃하는 아미노기에 대한 결합을 형성하는 감마-카르복시기임)
-
OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸을 나타내고, 다음의 구조로 표시되며:
-
설폰이미드 C-4는 다음의 구조로 표시되며:
-
2x설폰이미드-C4 또는 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4는 다음의 구조로 표시된다:
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 펩티드는 DgGlu, gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, OEG, 설폰이미드-C4, 및 2x 설폰이미드-C4로부터 선택된 이가 연결기를 나타내는 링커기를 포함하며, 여기서
-
gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내고;
-
OEG는 화학식 NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOH를 갖는 아미노산을 나타내되, 이는 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸로도 지칭되는 -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-의 기 또는 잔기에 상응하며;
-
설폰이미드-C4는 다음의 구조에 의해 표시되며:
-
2x설폰이미드-C4 또는 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4는 다음의 구조에 의해 표시된다:
링커의 비제한적인 예는 다음으로 이루어진 목록으로부터 선택된다: DgGlu, gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, OEG, 설폰이미드-C4, 2x 설폰이미드-C4.
일 구현예에서, 연결기는 부재한다.
일 구현예에서, 연결기는 DgGlu이다.
일 구현예에서, 연결기는 gGlu이다.
일 구현예에서, 연결기는 gGlu-gGlu이다.
일 구현예에서, 연결기는 gGlu-OEG이다.
일 구현예에서, 연결기는 gGlu-OEG-OEG이다.
일 구현예에서, 연결기는 OEG이다.
일 구현예에서, 연결기는 설폰이미드-C4이다.
일 구현예에서, 연결기는 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4 또는 2x설폰이미드 C-4이다.
중간 생성물
본 발명은 추가로 신규한 골격 형태의 중간 생성물에 관한 것으로서, 상기 중간 생성물은 본 발명의 치환기에 부착될 때 본 발명의 인슐린 유도체 펩티드를 유도한다.
본 발명은 또한 본 발명의 인슐린 펩티드의 신규한 백본 형태의 중간 생성물에 관한 것으로서, 상기 중간 생성물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
ii.
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
iii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
iv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
v.
B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
vi.
A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
vii.
B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
viii.
B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
ix.
B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
x.
B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
xi.
B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
xii.
B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
xiii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
xiv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
xv.
B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
xvi.
A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
xvii.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
xviii.
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
xix.
A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
xx.
A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
xxi.
A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
xxii.
A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
xxiii.
A14E, B5Y, B26G, desB30(서열번호 3 및 14)
xxiv.
A14E, B5Y, B26A, desB30(서열번호 3 및 15),
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르
본 발명의 중간 생성물, 유사체 및 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르의 형태일 수 있다.
염은 예를 들어, 염기와 산 사이의 화학 반응에 의해 형성된다 (예: 2 NH3 + H2SO4 --> (NH4)2SO4).
염은 염기성 염 또는 산성 염이거나, 둘 다 아닐 수도 있다(즉, 중성 염). 염기성 염은 물 속에서 수산화물 이온과 산성 염 하이드로늄 이온을 생성한다.
본 발명의 유도체의 염은 음이온성 또는 양이온성 기와 각각 반응하는 첨가 양이온 또는 음이온과 함께 형성될 수 있다. 이들 기는 본 발명의 유도체의 펩티드 모이어티 내 및/또는 측쇄 내에 위치할 수 있다.
본 발명의 유도체의 음이온기의 비제한적인 예는, (존재 하는 경우) 측쇄에서 뿐만 아니라 펩티드 모이어티에서의 유리 카르복실기를 포함한다. 펩티드 모이어티는 종종 C-말단에서 유리 카르복실산기를 포함하며, Asp 및 Glu와 같은 내부 산성 아미노산 잔기에서도 유리 카르복실기를 포함할 수 있다.
펩티드 모이어티 내의 양이온기의 비제한적인 예는, (존재하는 경우) N-말단에서의 유리 아미노기뿐만 아니라, His, Arg 및 Lys와 같은 내부 염기성 아미노산 잔기의 임의의 유리 아미노기도 포함한다.
본 발명의 유도체의 에스테르는 예를 들어, 알코올 또는 페놀과 유리 카르복실산기의 반응에 의해 형성될 수 있고, 이는 적어도 알콕시 또는 아릴옥시기에 의한 하나의 히드록실기의 치환을 초래한다.
에스테르 형성은 펩티드의 C-말단에서 유리 카르복실기 및/또는 측쇄에서 임의의 유리 카르복실기를 포함할 수 있다.
본 발명의 유도체의 아미드는 예를 들어, 활성화된 형태의 유리 카르복실산기와 아민 또는 치환된 아민과의 반응에 형성되거나, 유리 또는 치환된 아미노기와 활성화된 형태의 카르복실산과의 반응에 의해 형성될 수 있다.
아미드 형성은 펩티드의 C-말단에서 유리 카르복실기, 측쇄에서 임의의 유리 카르복실기, 펩티드의 N-말단에서 유리 아미노기, 및/또는 펩티드 및/또는 측쇄에서 펩티드의 임의의 유리 아미노기 또는 치환된 아미노기를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태이다. 또 다른 특정 구현예에서, 유도체는 약학적으로 허용 가능한 아미드의 형태이고, 바람직하게는 펩티드의 C-말단에서 아미드기를 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용 가능한 에스테르의 형태이다.
안정성
인슐린 유도체의 안정성은 3차원 구조(물리적 안정성)를 유지하는 능력뿐만 아니라 구조(화학적 안정성)의 공유 변화를 견디는 능력으로서 정의된다. 바람직한 안정성은 인슐린 유도체의 고유한 특성에만 기인하거나 인슐린 유도체와 비히클에 포함된 하나 이상의 성분 간의 바람직한 상호 작용의 결과에 기인한 것일 수 있다.
인슐린 유도체의 만족스러운 안정성은 인슐린 아스파르트와 비슷하거나 더 나은 안정성으로서 정의된다.
일 양태에서 본 발명은 제형 상태에서 만족스러운 안정성을 갖는 인슐린 유도체를 제공한다.
일 양태에서 본 발명은 제형 상태에서 안정성이 개선된 인슐린 유도체를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 인슐린 유도체가 제형 상태에서 만족스러운 안정성을 갖는다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체가 만족스러운 안정성을 가지면서 인슐린 수용체의 부분적 활성화를 유지한다는 것을 밝혀냈다.
안정성은 통상의 방법 및 당업자에게 공지된 다양한 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
인슐린 유도체는 예를 들어, 아연과 페놀을 포함하는 제형 상태에서의 안정성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일 구현예에서, 목표는 저장하는 동안 또는 온도가 올라가도 변하지 않는 단일 인슐린 자기-결합 상태(예를 들어, 헥사머 상태)를 포함하는 제형을 수득하는 것이다.
안정성을 측정하는 방법의 예는 시차주사 열량측정(DSC)이며, 이는 일반적으로 풀림(unfolding)의 시작 온도(Tonset)를 평가하거나, 더 빈번하게는, 인슐린 유도체 자기-결합에서의 열 풀림(Tm)의 중간점에 의해 단백질 안정성을 평가하는 흔한 방법이다 (DSC에 의한) 인슐린의 열 풀림이 어떻게 아연-헥사머의 안정성에 상관되는지(Huus 등의 Biochemistry (2005) 44, 11171-11177), 및 인슐린의 제형 안정성에는 어떻게 상관되는지는 문헌(Huus 등의 Pharm Res (2006) 23(11), 2611-20)에 기술되어 있다. 낮은 시작 온도는 인슐린 해리로서 보일 수 있는 반면, 보다 높은 시작 온도는 풀림 온도가 될 때까지 인슐린 유도체 복합체가 안정함을 나타낸다. 약학적 제형과 유사한 조건에서의 인슐린 아스파르트(B28D 인간 인슐린)에 대한 만족스러운 안정성은 Tonset 및 Tm에서 얻어지거나 대략 Tonset 및 Tm 또는 그 이상에서 수득된다.
이러한 방법의 또 다른 예는, 제형 조건과 유사한 용리액을 사용하고, 페놀을 첨가하여 이온 강도를 낮게 유지하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 인슐린 자가-결합을 평가하는 것이다. 넓고 뒷쪽이 끌리는 피크(tailing peak)는 크로마토그래피 중에 자가-결합 상태가 여러 번 변한다는 것을 나타내는 반면, 단일 날카로운 피크(sharp peak)는 안정적인 자가-결합 상태를 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 인슐린 유도체는 인슐린 아스파르터에 비해 만족스러운 화학적 및/또는 물리적 안정성을 갖는다..
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인슐린 유도체는 B5Y 또는 B5F가 없는 상응 인슐린 유도체에 비해 만족스러운 화학적 및/또는 물리적 안정성을 갖는다..
본 명세서에 달리 언급되지 않는 한, 단수 형태로 제시된 용어는 또한 복수인 형태도 포함한다.
시험관 내 생물학
인슐린 결합 및 수용체 활성화/인산화
인슐린에 의한 인슐린 수용체의 활성화는 수용체의 활성화, 즉 수용체 상의 여러 잔기의 인산화를 초래하고, 활성화는 혈장 포도당 농도 저하에 기여하는 세포 공정, 지질 대사를 조절하는 세포 공정, 및 세포 성장 및 증식을 촉진하는 세포 공정을 포함하는 연쇄적인 세포 반응을 일으킨다.
본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린 유도체로부터 인간 인슐린을 완전히 변위시킬 수 있으며, 이들은 실제로 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다. 따라서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린 수용체 인산화에 대해 부분 작용제로 간주될 수 있으며, 이들은 "부분 인슐린 유도체"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "부분 인슐린 유도체"는 인슐린 수용체 인산화를 유도하는 인슐린 유사체로서 정의되지만, 수득한 최대 반응, 즉 최대 인슐린 수용체 인산화 수준은 인간 인슐린에 의해 유도된 최대 반응보다 작다(즉, 인간 인슐린에 의해 유도된 최대 반응의 65% 미만임).
준최대 반응 또는 준최대 효과는 본 발명의 부분 인슐린 유도체에 의해 유도된 최대 반응으로서 정의될 수 있으며, 이는 인간 인슐린에 의해 유도된 최대 반응보다 낮다. 인슐린 유도체가 준최대 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해서는, 분석에서 상기 유도체의 최대 반응을 결정해야 하고, 인간 인슐린의 최대 반응과 비교해야 한다. 투약량-반응 곡선을 얻기 위해, 인슐린 유도체의 양을 증가시켜 가며 반응을 측정해 인슐린 유도체의 최대 반응을 결정할 수 있다. 투약량-반응 곡선으로부터 최대 반응(상단)을 계산해 인간 인슐린에 의해 유도된 최대 반응과 비교할 수 있다.
인슐린 결합과 수용체 인산화는 종래의 방법에 의해 결정할 수 있고, 다양한 표준 분석법이 당업자에게 공지되어 있다. 시험관 내 결정을 위한 이러한 표준 분석법은 특히: 인슐린 수용체, 예를 들어 전체 세포, 세포막 분획 또는 정제된 수용체에 특이적으로 결합된 표지된 125I-인슐린의 50%를 변위시키는데 필요한 인슐린 대 인슐린 유도체의 비율로서 인슐린 유도체의 상대 친화도를 정의하는 인슐린 방사선 수용체 분석법뿐만 아니라; 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 웨스턴 블롯 기술을 사용해 인슐린 수용체 상에서 티로신 잔기의 인산화를 측정하여, 인슐린 수용체를 활성화시키는 인슐린 유도체의 능력을 결정하는 인슐린 수용체 인산화 분석법을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 65% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 60% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 50% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 40% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 30% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 20% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 15% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 12% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 1% 또는 그 이상의 인슐린 수용체의 인산화를 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인슐린 수용체의 인산화를 유도할 수 있다.
인슐린 수용체 신호 전달
인슐린 수용체의 활성화는, MAP 키나아제(MAPK)로도 알려진 세포 외 조절 키나아제(ERP), 및 단백질 키나아제 B(PKB)로도 알려진 AKT를 포함하여, 다양한 세포 내 단백질 상의 잔기의 인산화 및 이들 세포 내 단백질의 활성화와 같은 연쇄 세포 내 반응을 개시한다. AKT의 활성화는 혈당 농도를 낮추는데 기여하는 세포 공정을 유도하는 데 중요한 반면, ERK의 활성화는 세포 성장의 촉진 및 성장 세포의 증식에 기여하는 세포 공정을 유도하는 데 중요하다.
AKT 신호 전달 경로는 AKT가 핵심 단백질인 혈당 저하 경로에 중요한 신호 전달 경로의 예이다. 2형 당뇨병이 있는 사람들에서는 AKT 신호 전달 경로가 크게 손상되는데, 이는 예를 들어 골격근과 지방 조직으로의 포도당 흡수 감소를 초래한다. 그러나, ERK 신호 전달 경로는 인슐린에 대한 반응성을 유지하며, 치료 중에 과도하게 자극될 수 있는 비 저항성 경로의 예이다. 인슐린에 의한 ERK 경로의 활성화는 또한, 죽상경화성 병변의 진행에 중요한 단계인 VSMC의 이동과 증식 및 콜라겐 합성을 촉진한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 ERK 신호 전달 경로에 대해 준최대 효과를 유도한다.
인슐린에 의해 활성화된 신호 전달, 예를 들어 ERK 및 AKT와 같은 신호 전달 분자를 인산화하는 능력을 시험관 내에서 측정하기 위한 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 웨스턴 블롯 기술, Surefire 및/또는 ELISA 기술을 포함한다.
본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린의 효과와 비교했을 때, AKT 활성화(인산화)보다는 ERT 활성화(인산화)에 대해 더 낮은 준최대 효과를 갖는다.
놀랍게도, 발명자들은 시험 화합물이 유도할 수 있는 최대 인슐린 수용체 인산화(즉, 인슐린 수용체 편중도)와 비 저항성 경로를 과도하게 자극하지 않고 혈당 저하 경로를 활성화하는 시험 화합물의 능력 사이에는 상관 관계가 있음을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린과 비교했을 때, AKT 활성화(인산화)보다는 ERK 활성화(인산화)에 대해 더 낮은 준최대 효과를 가지며, 상기 화합물은 혈당 수준을 감소시킬 수 있지만, 예를 들어, 체중 증가의 감소, 체지방량 증가의 감소, 및 간 TG 감소의 촉진 및/또는 내피 기능 향상과 같은 지질 대사와 관련된 과정에 대해 개선된 효과를 갖는다.
편중도(partiality)는 시험 화합물의 최대 인슐린 수용체 인산화/인간 인슐린의 최대 인슐린 수용체 인산화의 비율이 1 미만인 것으로 정의된다.
일 구현예에서, 본 발명은 인슐린 수용체 편중도를 측정하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a)
시험 화합물에 의해 유도된 최대 인슐린 수용체 인산화를 측정하는 단계; 및
b)
인간 인슐린에 의해 유도된 최대 인슐린 수용체 인산화를 측정하는 단계를 포함하되,
a)/b)의 비는 1 미만이다.
일 구현예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.65 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.6 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.5 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.4 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.3 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.2 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.15 미만이다.
일 실시예에서, 상기 인슐린 수용체 편중도는 0.12 미만이다.
선택도는 비내성 경로를 과도하게 자극하지 않고 혈당 저하 경로를 활성화시키는 시험 화합물의 능력으로 정의되며, 여기서 비율은 1 미만이다.
일 구현예에서, 본 발명은 선택도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 인간 인슐린과 비교해 혈당 저하 경로 및 비내성 경로의 최대 인산화를 독립적으로 측정하는 단계, 및 혈당 저하 경로/비내성 경로의 비율이 1 미만인지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 선택도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 인간 인슐린과 비교해 ERK 및 AKT의 최대 인산화를 독립적으로 측정하는 단계, 및 ERK/AKT의 비율이 1 미만인지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 비율은 0.8 미만이다.
일 구현예에서, 상기 비율은 0.7 미만이다.
일 구현예에서, 상기 비율은 0.6 미만이다.
일 구현예에서, 상기 비율은 0.5 미만이다.
일 구현예에서, 상기 비율은 0.4 미만이다.
지질 대사/비내성 경로
본 발명의 인슐린 유도체는, 인간 인슐린과 비교했을 때, 비내성 경로를 과도하게 자극하지 않고 혈당 수준을 낮출 수 있으며, 예를 들어 지질 대사 경로에 대한 준최대 효과를 나타낼 수 있다.
전술한 바와 같이, 인슐린 수용체를 통해 인슐린에 의해 개시된 연쇄적인 신호 전달은 지질 대사 경로에 미치는 영향을 포함하여, 광범위한 세포 효과를 유도한다. 본원에서 정의된 바와 같이, 용어 "지질 대사 경로"는 인슐린에 의해 유도되거나 억제된 생물학적 작용을 포함하는데, 이러한 작용은, 예를 들어, 간 내 중성 지방의 합성에 영향을 미친다. 비 저항성 경로의 예는 ERK 신호 전달 경로를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린의 효과와 비교했을 때, 1차 간세포에서의 드 노보 지질 합성(DNL)과 관련된 대사 경로에 대해 준최대 효과를 유도한다. 간 내 지방산 합성에 대한 효과를 측정하기 위한 표준 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 1차 간세포에서 14C-표지된 아세테이트의 유기-추출성 물질(예: 지질)로의 전환을 측정함으로써 드 노보 지질 합성에 대한 효과를 결정하는 것을 포함한다. .
인슐린 수용체를 통해 인슐린에 의해 개시되는 연쇄 신호 전달은 지질 대사를 조절하는 데 필요한 효소의 유도로 이어진다. 이러한 효소의 예는 지방산 합성효소(FAS)이다. FAS는 지질 합성을 조절하는 역할을 하는 세포 공정에서 핵심 효소이다.
또한, 본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교했을 때, 1차 간세포에서 본 발명의 인슐린 유도체에 의해 준최대로만 유도되는 FAS와 같이, 지질 합성에 관여하는 mRNA 암호화 인자에 대해 준최대 효과를 갖는다.
지질 대사 경로에 관여하는 유전자의 mRNA 발현을 유도하거나 억제하는 인슐린 및 이의 유사체와 유도체의 능력을 측정하기 위한 표준 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용해 mRNA의 발현을 측정하는 것을 특히 포함한다.
혈당 저하 경로
본 발명의 인슐린 유도체는 지질 대사와 같은 비 저항성 경로와 관련된 경로에 대해 더 낮은 준최대 효과를 나타내지만, 이들은 혈당 저하 경로에 대해서는 인간 인슐린과 동일한 최대 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 맥락에서의 용어 "혈당 저하 경로"는 혈장 포도당 농도를 저하시키는(예컨대 간 내 포도당 저장의 촉진하는), 인슐린에 의해 유도된 생물학적 작용을 포함하며, 여기서 인슐린은 당 분해 및 당 합성을 촉진하는 효소를 활성화하고, 당 합성에 관여하는 효소(예를 들어, 지방 세포의 지질에 포도당이 혼입되는 것을 촉진하고, 포도당이 예를 들어 근육에 흡수되는 것을 증가시키는 것들)를 억제한다.
전술한 바와 같이, 인슐린 수용체를 통해 인슐린에 의해 개시된 연쇄적인 신호 전달은 혈당 저하 경로에 미치는 영향을 포함하여, 광범위한 세포 효과를 유도한다. 인슐린에 의해 자극된 세포 공정으로서, 혈장 포도당 농도를 낮추는 역할을 하는 세포 공정의 예로는 근육, 지방 조직 및 여러 가지 다른 조직 내로 포도당의 진입을 용이하게 하는 것, 및 간을 자극하여 포도당을 글리코겐의 형태로 저장하게 하는 것 등이 있다. AKT 신호 전달 경로는 AKT가 핵심 단백질인 혈당 저하 경로에 중요한 신호 전달 경로의 예이다.
인간 인슐린 또는 이의 유사체와 유도체가 혈당 저하 경로에 미치는 효과를 측정하기 위한 시험관 내 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히, 랫트의 단리된 간세포를 사용하는 분석법(여기서, 글리코겐 합성은 글리코겐 축적을 측정함으로써 결정됨); 및 예를 들어, 랫트의 간세포를 사용하는 지질 합성 분석법(유기 추출성 물질(지질)로 전환된 [3-3H] 포도당의 양을 측정함)을 포함한다.
인슐린 수용체를 통해 인슐린에 의해 개시된 연쇄 신호 전달은 또한 혈당 저하 경로를 조절하는데 필요한 효소와 전사 인자의 활성화 및/또는 유도로 이어진다. 이러한 효소의 예는 포도당-6-포스파타아제(G6Pc)이다. G6Pc는 피루브산염, 락트산염, 글리세롤, 당 합성 아미노산, 및 외사슬 지방산(odd-chain fatty acid)과 같은 비-탄수화물 탄소 기질로부터 포도당을 생성하는 포도당 합성에 있어서의 속도 제한 효소이다.
본 발명의 인슐린 유도체는 간세포 및/또는 근육에 포도당을 글리코겐의 형태로 저장하는 것을 자극하는데 동일한 최대 효과를 나타낸다.
본 발명의 인슐린 유도체는 랫트의 1차 간세포에서 포도당 합성에 관여하는 mRNA 암호화 인자에 대해 인간 인슐린과 동일한 최대 효과를 갖는다.
혈당 저하 경로에 관여하는 유전자의 mRNA 발현을 유도하거나 억제하는 인슐린 및 이의 유사체와 유도체의 능력을 측정하기 위한 표준 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, RT-PCR을 사용해 mRNA의 발현을 측정하는 것을 특히 포함한다.
본 발명의 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교했을 때, 1차 세포(예: 근육, 간세포 및/또는 지질 세포)에서 혈당 저하 경로에 대해 완전한 (최대) 효과, 예컨대, 포도당 합성에 관여하는 mRNA 암호화 효소의 발현, 글리코겐 합성의 자극, 지질 내로 포도당의 혼입 등을 나타낸다.
인슐린 유도체는 랫트 1차 지방 세포에서 지질 내로 포도당의 혼입을 자극하는 것에 대해 인간 인슐린과 동일한 최대 반응을 나타낸다.
생체 내 생물학
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 생체 내에서 혈당 수준을 감소시킬 수 있고, 인간 인슐린과 비교해 지질 대사와 관련된 공정에 대해 개선된 효과, 예컨대 체중 증가의 감소, 체지방량 증가의 감소, 간 중성 지방 감소의 강화, 또는 개선된 내피 기능을 가지는데, 이는 임의의 적절한 동물 모델에서 뿐만 아니라 임상 실험에서도 당업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다.
C57BL/6J-식단-유도 비만(DIO) 마우스는 적절한 동물 모델의 일례이며, 혈당 및/또는 지질 대사와 관련된 공정에 대한 효과(예: 체중 증가의 감소, 체지방량 증가의 감소 또는 간 중성 지방 감소의 강화)는 이러한 마우스에서, 예를 들어 분석 (II)에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
내피의 구조적 및 기능적 무결성은 혈관의 항상성을 유지하고 죽상 경화증을 예방하는데 있어 중요하다. 내피 기능 장애는 혈관 내피에서 다수의 기능적 변경을 포함하며, 동맥 내피 기능의 손상은 죽상 경화증의 초기 사례이고 심혈관 질환의 주요 위험 인자와 상관 관계가 있다. 따라서, 내피 기능 장애를 예방하거나 감소시키는 인슐린 유도체를 갖는 것이 주요 장점인데, 이는 이러한 인슐린 유도체가 죽상 경화증 및/또는 CVD에 대해 유익한 효과를 가져다 줄 것이기 때문이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 혈당 수준을 낮출 수 있고 종래의 인슐린 요법과 비교해 내피 기능에 대해 개선된 효과를 갖는, 예를 들어, 내피 기능 장애를 예방하거나 감소시키는 인슐린 유도체를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 당뇨병 대상체에서 심혈관 질환을 예방하거나 감소시키고/시키거나 죽상 경화증의 발생을 예방하거나 감소시키는 인슐린 유도체를 제공한다.
동맥 내피 기능은, 예를 들어, 분석 (II)에 기술된 바와 같이, 장간맥 동맥에서의 아세틸-콜린 유도 혈관 이완에 대한 효과의 측정과 같은, 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
당뇨병에서는 간장 대사가 심각하게 이상 조절된다. 일반적으로, 간 부피의 5% 미만이 지방이지만, 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 비알코올성 지방 간 질환(NAFLD) 환자에서는 간 중량의 최대 50% 내지 80%가 지방으로 이뤄지고, 대부분 중성 지방의 형태를 갖는다(예를 들어, Sanyal, A. J.의 "AGA technical review on non-alcoholic fatty liver disease", Gastroenterology 2002; 123, 1705-1725 참조).
바람직한 구현예에서, 본 발명은 혈당 수준을 낮출 수 있지만, 종래의 인슐린 요법과 비교해 간 중성 지방 함량을 감소시키는 인슐린 유도체를 제공한다.
간 중성 지방 함량은, 예를 들어 분석 (II)에 기술된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.
인슐린 펩티드의 생산
폴리펩티드, 예를 들어, 인슐린을 생성하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 인슐린은, 예를 들어, t-Boc 또는 Fmoc 화학을 사용하는 고상 펩티드 합성과 같은 고전적인 펩티드 합성, 또는 잘 구축된 다른 기술을 사용해 생성할 수 있다(예: Greene 및 Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999 참조). 인슐린은, 유사체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고 인슐린 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 적절한 영양 배지에서 인슐린 유사체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해서도 생성될 수 있다. 인간 인슐린 및 인간 인슐린 유사체의 생산에는 여러 가지 재조합 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균 및 사카로마이세스 세레비시에와 같은 미생물에서 인슐린을 생산하는 데 사용할 수 있는 방법의 실시예는 예를 들어 WO2008034881에 개시되어 있다.
일반적으로, 인슐린 유사체는 예를 들어 EP1246845 또는 WO2008034881에 개시된 바와 같은 공지된 기술에 의해, 적절한 숙주 세포에서 해당 인슐린 유사체 또는 이의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 생성된다.
인슐린 유사체는 EP 1,246,845에 개시된 바와 같이 N-말단 연장부와 함께 발현될 수 있다. 배양 배지로의 분비 및 회수 후, 인슐린 전구체는 가능한 N-말단 연장 서열 및 연결 펩티드를 제거하여 인슐린 유도체를 수득하기 위한 다양한 시험관 내 절차를 거치게 된다. 이러한 방법은 L-트레오닌 에스테르의 존재 하에 트립신 또는 아크로모백터 리티쿠스(Achromobacter lyticus) 프로테아제에 의해 효소 전환에 이어서, US4343898 또는 US4916212에 기술된 바와 같이 염기성 또는 산성 가수분해에 의해 트레오닌 유사체를 인슐린 유사체로 전환하는 것을 포함한다.
본 발명에 적합한 유형의 N 말단 연장부의 예는 US5395922 및 EP765395에 개시되어 있다.
비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 인슐린 유사체의 경우, 비-천연 아미노산이 예를 들어 tRNA 돌연변이체의 사용에 의해 유사체에 통합되도록 재조합 세포가 변형되어야 한다. 따라서, 요약하자면, 본 발명에 따른 인슐린 펩티드는 알려진 인슐린 유사체을 제조하는 것과 유사하게 제조된다.
단백질 정제
본 발명의 인슐린 유도체를 제조하는 데 사용된 인슐린 유사체는 세포 배양 배지로부터 회수된다. 본 발명의 인슐린 유도체를 제조하는 데 사용된 인슐린 유사체는 당업계에 알려진 다양한 절체에 의해 정제될 수 있으며, 이에는 크로마토그래피(예: 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 절차(예: 분취 등전 포커싱(IEF), 차등 용해도(예: 황산 암모늄 침전), 또는 추출(예: 단백질 정제, J.-C. Janson 및 Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 이들은 항-"[인슐린/인슐린 유사체/인슐린 유도체]" 항체 컬럼을 이용한 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 추가 정제는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 종래의 화학적 정화 수단에 의해 달성될 수 있다. 시트르산바륨 침전을 포함하는 다른 정제 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 기술된 신규한 "[인슐린/인슐린 유사체/인슐린 유도체]"의 정제에 적용될 수 있다 (예를 들어, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982 참조).
약학적 제형
본 발명의 인슐린 유도체를 함유하는 주사 가능한 조성물은 제약 산업의 종래 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 기술은 원하는 최종 생성물을 수득하기 위해 성분을 적절히 용해시키고 혼합하는 것을 포함한다. 따라서, 하나의 절차에 따르면, 본 발명의 인슐린 유도체는 제조 대상 조성물의 최종 부피보다 다소 적은 양의 물에 용해된다. 필요에 따라 등장제, 보존제 및 완충액을 첨가하고, 필요에 따라, 염산과 같은 산 또는 수산화나트륨과 같은 염기를 사용해 용액의 pH 값을 조절한다. 마지막으로, 용액의 부피를 물로 조정하여 성분의 원하는 농도를 수득한다.
임의로, 본 발명의 인슐린 제제, 예를 들어 용액 또는 현탁액은 본 발명의 인슐린 유도체를 수성 매질에 용해시킴으로써, 예를 들어 약 240 내지 약 6000 nmol/ml 범위의 농도로 제조될 수 있다. 수성 매질은, 예를 들어 염화나트륨, 프로필렌글리콜 또는 글리세롤을 사용해 등장성으로 만들어진다. 또한, 수성 매질은 아세테이트 또는 시트레이트와 같은 완충제, m-크레졸이나 페놀 같은 보존제, 및 예를 들어 최대 약 12 Zn/6ins의 농도로 아연 이온을 함유할 수 있다. 용액의 pH 값은 잠재적인 침전을 피하기 위해, 본 발명의 화합물의 등전점에 너무 가깝지 않게 중성으로 조절된다. 최종 인슐린 제제의 pH 값은 사용된 본 발명의 화합물, 아연 이온의 농도 및 본 발명의 화합물의 농도에 따라 달라진다. 인슐린 제제는, 예를 들어, 무균 여과에 의해 멸균된다.
구현예
본 발명은 다음의 비제한적 구현예에 의해 추가로 기술된다:
1.
인슐린 유도체로서, 상기 인슐린 유도체는 B5Y 또는 B5F 및 아실기를 포함하는 치환기, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드 또는 에스테르인, 인슐린 유도체.
2.
실시예 1에 따른 인슐린 유사체로서, 상기 인슐린 유도체는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
3.
실시예 1 또는 2에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 최대 5개의 추가 치환 및/또는 결실을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
4.
실시예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 추가로 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
5.
구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B26G 또는 B26A를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
6.
구현예 5에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B26G를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
7.
구현예 5에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B26A를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
8.
구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환기는 하기 화학식 (I)을 가지되,
Acy-L1-L2-L3
식 중,
Acy는 아실기이며, 리토콜산으로 표시되거나, 다음 화학식의 작용기에 의해 표시되거나
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH; 또는
Chem. 2: -CO-(CH2)x-테트라졸일;
(여기서, x는 12 내지 20의 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸릴기는 1H-테트라졸-5-일임)
다음 화학식의 지방산으로 표시되며
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(여기서, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄)
-
L1은 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L2는 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
-
L3은 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내는
(식 중, gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내고, OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸을 나타냄), 인슐린 유도체.
9.
구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 A14E를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
10.
구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B28K, B26K 또는 B29K를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
11.
구현예 10에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B28K를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
12.
구현예 10에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B26K를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
13.
구현예 10에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B29K를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
14.
구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환기는 B26K, B28K 또는 B29K의 라이신의 엡실론 아미노기에 부착되는, 인슐린 유도체.
15.
구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 desB30, desB29-30 또는 desB27-30을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
16.
구현예 15에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 desB30을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
17.
구현예 15에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 desB29-30을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
18.
구현예 15에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 desB27-30을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
19.
구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체:
i.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
ii.
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
iii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
iv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
v.
B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
vi.
A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
vii.
B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
viii.
B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
ix.
B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
x.
B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
xi.
B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
xii.
B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
xiii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
xiv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
xv.
B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
xvi.
A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
xvii.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
xviii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
xix. A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
xx. A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
xxi.
A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
xxii.
A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
xxiii. A14E, B5Y, B26G, desB30(서열번호 3 및 14)
xxiv. A14E, B5Y, B26A, desB30(서열번호 3 및 15).
20.
구현예 1 내지 19 중 어느 하나에서, 상기 아실기는 리토콜산이거나, 다음 화학식의 작용기를 포함하거나
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH ;
Chem. 2:--CO-(CH2)x-테트라졸일,;
(식 중, x는 12 내지 20의 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸일기는 1H-테트라졸-5-일임).
다음 화학식의 지방산인
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(식 중, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄), 인슐린 유도체.
21.
구현예 20에 있어서, Acy는 리토콜산, 1,16-헥사데칸디오익산, 1,18-옥타데칸디오익산, 1,20-에이코산디오익산, 테트라졸-C16, 테트라졸-C17, 테트라졸 C18 및 테트라데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
22.
구현예 21에 있어서, 상기 치환기는 리토콜산을 포함하는, 인슐린 유도체.
23.
구현예 21에 있어서, 상기 아실기는 1,16-헥사데칸디오익산, 1,18-옥타데칸디오익산, 및 1,20-에이코산디오익산으로부터 선택된 지방이산기를 포함하는, 인슐린 유도체.
24.
구현예 23에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 지방이산기 1,16-헥사데칸디오익산을 포함하는, 인슐린 유도체.
25.
구현예 23에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 지방이산기 1,18-옥타데칸디오익산을 포함하는, 인슐린 유도체.
26.
구현예 23에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 지방이산기 1,20-에이코산디오익산을 포함하는, 인슐린 유도체.
27.
구현예 21에 있어서, 상기 테트라졸 모이어티는 테트라졸-C16, 테트라졸-C17 및 테트라졸 C18로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
28.
구현예 27에 있어서, 상기 테트라졸 모이어티는 테트라졸-C16인, 인슐린 유도체.
29.
구현예 27에 있어서, 상기 테트라졸 모이어티는 테트라졸-C17인, 인슐린 유도체.
30.
구현예 27에 있어서, 상기 테트라졸 모이어티는 테트라졸-C18인, 인슐린 유도체.
31.
구현예 20에 있어서, 상기 지방산은 테트라데칸산 또는 C14인, 인슐린 유도체.
32.
구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환기는 링커기를 포함하는, 인슐린 유도체.
33.
구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 링커기는 부재하고, 공유 결합에 의해 표시되는, 인슐린 유도체.
34.
구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, -L1-L2-L3은 DgGlu, gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, OEG, 설폰이미드-C4 및 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4로부터 선택된 2가 링커기를 나타내고, 여기서 gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내고; OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸을 나타내는, 인슐린 유도체.
35.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 DgGlu인, 인슐린 유도체.
36.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 gGlu인, 인슐린 유도체.
37.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 gGlu-gGlu인, 인슐린 유도체.
38.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 gGlu-OEG인, 인슐린 유도체.
39.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 gGlu-OEG-OEG인, 인슐린 유도체.
40.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 OEG인, 인슐린 유도체.
41.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 설폰이미드-C4인, 인슐린 유도체.
42.
구현예 34에 있어서, 상기 2가 링커기는 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4인, 인슐린 유도체.
43.
구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환기는 다음에 의해 독립적으로 표시되는, 실시예 1 내지 46의 화합물의 치환기인, 인슐린 유도체:
-
리토콜산
-
리토콜산-gGlu
-
C14
-
C16 이산
-
C16 이산-gGlu
-
C18 이산
-
C18 이산-gGlu
-
C18 이산-2xgGlu
-
C18 이산-DgGlu
-
C18 이산-gGlu-OEG
-
C18 이산-gGlu-2xOEG
-
C18 이산-OEG
-
C18 이산-설폰이미드-C4
-
C20 이산
-
C20 이산-gGlu
-
C20 이산-gGlu-OEG
-
C20 이산-gGlu-2xOEG
-
테트라졸-C16
-
테트라졸-C16-gGlu-OEG
-
테트라졸-C16-gGlu-2xOEG
-
테트라졸-C16-2x설폰이미드-C4
-
테트라졸-C17
-
테트라졸-C17-설폰이미드-C4
-
테트라졸-C18
-
테트라졸-C18-설폰이미드-C4
-
테트라졸-C18-2x설폰이미드-C4.
44.
구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 실시예 1 내지 46의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
45.
구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 실시예 1 내지 36의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
46.
구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 실시예 10 내지 34의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
47.
구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 실시예 3, 4, 12 내지 16, 18 내지 20, 22, 23, 25, 26, 28 내지 30의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
48.
구현예 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 실시예 14 내지 16, 18, 20 및 26의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
49.
구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 실시예 37 내지 39 및 46의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
50.
구현예 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 실시예 40 내지 45의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
51.
구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 실시예 15의 화합물에 의해 표시되는, 인슐린 유도체: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
52.
구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 65% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
53.
구현예 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 60% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
54.
구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 50% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
55.
구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 40% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
56.
구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 30% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
57.
구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 20% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
58.
구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 인간 인슐린과 비교해 약 12% 또는 그 이하의 인슐린 수용체의 준최대 인산화를 유도하는, 인슐린 유도체.
59.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
60.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
61.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
62.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 죽상경화증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
63.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 혈관내피 기능 장애의 예방 또는 감소에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
64.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 지질 파라미터를 개선하는 데 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
65.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 간 중성 지방의 예방 또는 간 중성 지방 함량의 감소에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
66.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 체중 증가의 예방 체중 증가의 감소에 사용하기 위한, 인슐린 유도체.
67.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 다음의 치료에 사용하기 위한, 인슐린 유도체:
-
이상지질혈증의 예방 및/또는 치료와 같은 지질 파라미터 개선; 총 혈청 지질 저하; HDL-C 증가; LDL-C 저하; 작고 조밀한 LDL-C 저하; VLDL-C 저하; 중성 지방 저하; 콜레스테롤 저하; 지단백 a(Lp(a))의 혈장 수준 저하; 아포지단백 A(apo(A))의 생성 억제;
-
심장 증후군 X, 죽상 경화증, 심근경색, 관상동맥 심장 질환, 재관류 손상, 뇌졸중, 내뇌 허혈증, 조기 심장 질환 또는 조기 심혈관 질환, 좌심실 비대증, 관상동맥 질환, 고혈압, 본태성 고혈압, 급성 고혈압 긴급증, 심근증, 심부전, 운동 불내성, 급성 및/또는 만성 심부전, 부정맥, 심장 부정맥, 실신, 협심증, 심장 우회 및/또는 스텐트 재폐색, 간헐적 파행증(동맥경화성 동맥폐쇄), 심장확장성 기능장애, 및/또는 심장수축성 기능장애와 같은 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료; 및/또는 수축기 혈압 강하와 같은 혈압 강하; 심혈관 질환의 치료.
68.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
69.
구현예 68에 있어서, 피하 투여용 약학적 조성물.
70.
당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에서 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체의 치료적 유효량을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 약학적 조성물.
71.
구현예 68 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 약학적 조성물.
72.
구현예 68 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 당뇨병이 있고 심혈관 질환의 위험이 높은 환자의 치료에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
73.
구현예 68 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 죽상 경화증 발생의 예방 또는 감소를 위한, 약학적 조성물.
74.
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체의 용도로서, 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 혈당 내성, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 내성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상 경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 혈관 장애, 관동맥성 심장병, 뇌졸중, 염증성 장 증후군, 소화불량, 저혈압 또는 위궤양의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 용도.
75.
지질 파라미터를 개선하기 위한 방법으로서, 전술한 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체의 약학적 활성 양을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
76.
지질 파라미터를 개선하기 위한 방법으로서, 전술한 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체의 약학적 활성 양을 투여하는 단계를 포함하되, 지질 파라미터의 개선은 예컨대, 지질이상혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 지질의 감소; HDL 증가; LDL-C 감소; 작고 조밀한 LDL-C 감소; VLDL-C 감소; 비_HDL-C; 중성 지방 감소; 콜레스테롤 감소; 지단백 a (Lp(a))의 혈장 수준 감소; 아포지단백 A (apo(A))의 발생 억제인, 방법.
77.
심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체의 치료적 활성 양을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
78.
당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 혈당 내성, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 내성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상 경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 혈관 장애, 관동맥성 심장병, 뇌졸중, 염증성 장 증후군, 소화불량, 저혈압 또는 위궤양을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 따른 인간 인슐린 유도체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
79.
중간 생성물로서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 백본을 포함하는, 중간 생성물:
i.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
ii.
A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
iii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
iv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
v.
B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
vi.
A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
vii.
B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
viii.
B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
ix.
B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
x.
B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
xi.
B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
xii.
B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
xiii.
B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
xiv.
B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
xv.
B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
xvi.
A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
xvii.
A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
xviii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
xix.
A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
xx.
A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
xxi.
A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
xxii.
A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
xxiii. A14E, B5Y, B26G, desB30(서열번호 3 및 14)
xxiv.
A14E, B5Y, B26A, desB30(서열번호 3 및 15) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르.
80.
화합물의 선택도를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
-
인간 인슐린에 비해 상기 화합물에 의해 유도되는 최대 AKT 인산화를 측정하는 단계; 및
-
인간 인슐린에 비해 상기 화합물에 의해 유도되는 최대 ERK 활성화를 측정하는 단계를 포함하되,
ERK/AKT 비율은 1 미만인, 방법.
81.
구현예 80에 있어서, 상기 화합물은 인슐린 화합물인, 방법.
82.
구현예 81에 있어서, 상기 인슐린 화합물은 구현예 1 내지 58의 화합물인, 방법.
실시예
약리학적 방법
분석 (I) 시험관 내 생물학
인슐린 수용체 결합
인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 본 발명의 인슐린 유도체의 상대 결합 친화도는 섬광 근접 측정법(SPA)에서의 경쟁 결합에 의해 결정하였다(Glendorf T 등의 Biochemistry 2008 47 4743-4751에 따름).
요약하자면, 96-웰 플레이트에서 인간 인슐린 표준체 및 인슐린 유도체의 연속 희석을 수행하고, 이어서 SPA 비드(항-마우스 폴리비닐톨루엔 SPA 비드, GE Healthcare), 항IR 마우스 항체 83-7(예를 들어, Thermo Fisher Scientific으로부터 구매 가능함), 가용화된 인간 IR-A(IR-A를 과발현하는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포로부터 정제함), 및 [125I-TyrA14]-인간 인슐린을 결합 완충액에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고 ToPcount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)를 이용해 계수하였다.
4-파라미터 로지스틱 모델(Vølund A; Biometrics 1978 34 357-365 참조)에 따라 SPA의 데이터를 분석하고, 유사체의 결합 친화도를 동일한 플레이트 내에서 측정한 인간 인슐린 표준체의 결합 친화도에 대해 계산하였다.
본 발명을 대표하는 인슐린 유사체의 상대 결합 친화도는 아래 표 1에 나열되어 있다. 도 1은 가용화된 IR-A를 사용한 경쟁 결합 분석에서 인간 인슐린 및 실시예 15의 화합물에 대한 수용체 결합 곡선을 보여준다.
인슐린 수용체 인산화 (IRpY1158)
본 발명의 인슐린 유도체가 인슐린 수용체(IR)에 미치는 효과는, Hansen BF 등의 문헌[PLOS One May 2012 7 e34274]에 기술된 바와 같이, 인슐린 수용체의 위치 1158에 있는 티로신 잔기를 인산화시키는 인슐린 유도체의 능력에 의해 평가하였다.
요약하자면, CHO-hIR 세포(인슐린 수용체-A를 과발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포)를 증가하는 농도의 인슐린 유사체로 30분 동안 자극하고, 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수(PBS)에서 세척하고, 급속 동결하고, 용해 완충액 중에서 용해시켰다. 동일한 양의 단백질을 인산-IR-ELISA 웰(IRPy1158)에 첨가하고, 제조사(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 인산화를 측정하였다.
증가하는 양의 상기 인슐린 수용체가 존재하는 가운데 인슐린 유도체의 인산화 수준을 측정함으로써 인슐린 수용체 인산화 수준에 대한 본 발명의 인슐린 유도체의 최대 반응을 결정하여 투약량-반응 곡선을 얻었다. 표준 투약량-반응 곡선은 4개의 파라미터, 즉 베이스라인 반응(하단), 최대 반응(상단), 기울기, 베이스라인과 최대 값의 중간 반응을 유도하는 약물 농도(EC50)에 의해 정의하였다.
인슐린 수용체 인산화 데이터 투약략-반응 곡선을, GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 7을 사용해 비선형 회귀에 의해(4-파라미터 모델 (Y=하단 + (상단-하단)/(1+10^((LogEC50-X)*기울기))) 피팅하였다. 추정 매개변수를 사용해 각각의 리간드에 대한 최대 값(%)을 (상단(유사체)-하단(유사체))*100/(상단(인슐린)-하단(인슐린))으로서 계산하였다.
본 발명의 대표적인 인슐린 유도체의 계산된 최대 값(%)은 아래 표 1에 나열되어 있다. 도 2는 IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 IRpY1158 인산화 분석에서 인간 인슐린 및 실시예 15의 화합물에 대한 이러한 투약량-반응 곡선의 예를 보여준다.
따라서, 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 어떻게 인슐린 수용체로부터 인간 인슐린을 완전히 변위시킬 수 있었는지(도 1), 인슐린 수용체의 준최대 인산화만을 유도할 수 있었는지(도 2) 도 1 및 2로부터 알 수 있다.
인슐린 수용체 신호 전달
AKT 및 ERK 경로를 통한 본 발명의 유사체의 인슐린 수용체(IR) 신호 전달을 전통적인 웨스턴 블롯팅 기술에 의하거나 Surefire, 알파스크린(alphascreen) 기술을 사용해 평가하였다.
웨스턴 블롯팅
요약하자면, CHO-hIR 세포를 증가하는 농도의 인슐린 유사체로 10분 동안 자극하고, 얼음처럼 차가운 PBS 중에서 세척하고, 급속 동결시키고, 용해 완충액(Biosource)에 용해시켰다. 동일한 양의 단백질을 겔에 첨가하고 니트로셀룰로오스 막에 대해 블롯팅하였다. 인산화된 AKT 및 ERK를 인산-AKT (Ser473) (Cell signalling #9271) 및 pMAPK 44/42 ERK1/2 토끼 (Cell Signalling # 4376) 항체로 각각 가시화하였다. 밴드 강도는 LAS3000(Fuji)을 사용해 평가하였다.
Surefire
세포를 96웰 조직 배양 플레이트에 도말하고, 하루 지나서 37℃에서 인슐린 또는 인슐린 유도체로 10분 동안 자극하고, 제조자의 프로토콜에 따라 분석하였다(AKT1/2/3 (p-Ser473) cat # TGRA4S10K 및 ERK1/2 p-T202/Y204 Cat # TGRESB10K).
각 유사체에 대한 반응성 값(범위)은 GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 7의 비선형 회귀를 사용해 계산하고, 인슐린의 반응성 백분율로서 표현하였다(최대 AKT(%) 또는 최대 ERK(%)).
도 3 및 4는, IR-A를 과발현하는 CHO-hIR 세포에서의 AKT 인산화 분석 및 ERK 인산화 분석으로부터 인간 인슐린 및 실시예 15의 화합물에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주며, 본 발명의 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 어떻게 인간 인슐린과 비교해 AKT의 준최대 활성화보다 더 낮은 ERK의 준최대 활성화를 유도하는지 보여준다. 본 발명의 대표적인 인슐린 유사체 및 기준 인슐린 유도체의 계산된 값(최대ERK(%)/최대 AKT(%))은 아래 표 1에 나열되어 있다.
표 1에 주어진 결과는, 인간 인슐린에 의해 유도된 최대 반응의 65% 미만으로 인슐린 수용체 인산화를 유도하는 인슐린 유도체만이, 인간 인슐린의 효과와 비교했을 때, AKT 활성화(인산화)보다 ERK 활성화(인산화)에 대해 더 낮은 준최대 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
랫트 유리 지방세포 분석(지질 합성)에서의 효능
본 발명의 인슐린 유도체의 대사 효능은 단리된 랫트 지질 세포를 사용하여 지질 합성에 의해 결정하였다. 분석은 대부분 Moody AJ 등의 문헌[Horm Metab Res 1974 6 12-16 (Rodbell M; J Biol Chem 1964 239 375-380에 기술된 분석법의 개정판)]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
요약하자면, 희생시킨 스프래그-다울리 랫트로부터 부고환 지방 패드를 떼어 낸 다음, 지방 패드를 단일 세포 현탁액으로 분해하기 위해 콜라게나아제(Worthington)가 포함된 분해 완충액에 넣었다. 세포 현탁액을 PBS로 세척하고, 0.1 또는 1% HSA (A-1887, Sigma) 및 HEPES가 공급된 크렙스 완충액(Krebs buffer)에 재현탁하였다. 세포 현탁액 분취액을 인간 인슐린 표준체 또는 인슐린 유도체의 농도를 증가시키면서 D-[3-3H]글루코오스(PerkinElmer)가 포함된 포도당 용액과 함께 인큐베이션하였다. MicroScint-E (PerkinElmer)를 첨가하여 인큐베이션을 중단시키고, ToPcount NXT (PerkinElmer)에서 계수하였다.
4-파라미터 로지스틱 모델(Vølund A; Biometrics 1978 34 357-365 참조)에 따라 데이터를 분석하고, 유사체의 대사 효능을 동일한 플레이트 내에서 측정한 인간 인슐린 표준체의 대사 효능에 대해 계산하였다.
본 발명을 대표하는 인슐린 유사체의 대사 효능은 아래 표 1에 나열되어 있다. 도 5는, 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 랫트의 1차 지방 세포에서의 지질 합성의 자극에 대해 인간 인슐린과 동일한 최대 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
랫트 간세포의 단리
Berry M N 및 Friend D S의 J Cell Biol 1969 43 506-520의 개정판을 사용해, 콜라게나아제(Sigma)를 사용하는 간의 역행성 관류에 의해 수컷 스프래그-다울리로부터 랫트 간세포를 단리하였다.
인간 인슐린, 덱사메타손 및 우태 혈청(Gibco)이 보충된 배지 199(Gibco)에서 간세포를 세척하고, 콜라겐-코팅된 플레이트(BD BioCoat, BD Biosciences)에 시딩한 다음, 부착되도록 1~4시간 동안 방치하였다.
랫트 1차 간세포에서의 글리코겐 합성의 자극
글리코겐 축적의 자극에 대해 본 발명의 인슐린 유사체가 미치는 효과는 M. Kilcoyne 등의 Analytical Biochemistry 416 (2011) 18-26에서 다소 변형한, PAS(과요오드산-시프) 분석법으로 명명된 특이적이고 간단한 효소적 방법(simple enzymatic method)을 사용해 1차 간세포(단리 절차는 상기 참조)에서 결정하였다. 이 방법은 마이크로타이터 플레이트 비색 분석을 위해 PAS 시약 염색을 다소 변형한 것이다. 랫트 1차 간세포는 다양한 농도의 인간 인슐린 또는 인슐린 유도체와 함께 18~24시간 동안 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포 글리코겐 함량을 결정하기 위해, 간세포를 실온에서 30분 동안 진탕기 내에서 1% 트리톤(Triton)에 용해시켰다. 과요오드산 용액(0.1% 과요오드산 + 7% 아세트산이 포함된 MQ 물)(과요오드산 3951, Sigma)을 각 웰에 첨가하고, 진탕기로 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하여 포도당의 히드록실기가 알데히드로 산화되도록 하였다. 그런 다음, 쉬프 용액(Schiff's solution)을 첨가하고, 플레이트를 빛으로부터 차단하고, 5분 동안 진탕한 후, 실온에서 25분 동안 방치하였다. 그런 다음, SpectrAmax 분광계를 사용해 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. GraphPad Prism 7에서 데이터를 분석하고, 인슐린 유사체의 상대적인 대사 효능을 인간 인슐린에 대한 추정 EC50 값과 인슐린 유사체에 대한 추정 EC50 값 간의 비율로서 계산하였다.
본 발명의 대표적인 인슐린 유사체가 간세포 내 글리코겐 축적에 미치는 효능은 아래 표 1에 나열되어 있다. 도 6은, 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 랫트 1차 간세포 내 글리코겐 축적의 자극에 대해 인간 인슐린과 동일한 최대 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
유전자 발현
유전자 발현에 대해 본 발명의 인슐린 유도체가 미치는 효과는 랫트 1차 간세포(단리 절차는 상기 참조)로부터 단리된 cDNA를 이용한 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 결정하였다.
단리 후 1일차에, 1 μM 덱사메타손 및 0.1% HSA(A-1887, Sigma)가 보충된 분석 배지 199(Gibco)에서 간세포를 2시간 동안 글루카곤으로 처리하였다. 사전 인큐베이션 후, 분석 배지에서 세포를 인간 인슐린 또는 인슐린 유사체로 16시간 동안 처리하였으며, 배지는 2, 4 및 6시간 후에 새로운 배지로 교환하였다.
RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용해 간세포로부터 RNA를 추출하여 정제하고, iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용해 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. 주문형 TagMan Fast Advanced Master mix 및 프라이머/프로브를 사용해 유전자 발현을 결정하였다(Applied BioSystems; Ppib #Rn03302274_m1 rFAS #Rn00565347_m1; rG6Pc #Rn00565347_m1). 유전자 발현을 Ppip (cycB, 시클로필린 b)의 발현에 대해 정규화하고, GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 7을 사용해 S자형 투약량-반응 곡선에 피팅하였다.
도 7 및 8은, 랫트 1차 간세포로부터 단리한 cDNA를 이용해 수행된 fasn 및 g6pc에 대한 RT-PCR 분석에서 인간 인슐린 및 실시예 15의 화합물에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여준다. 도 7에 주어진 결과는, 인간 인슐린과 비교했을 때, 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 어떻게 FAS mRNA의 준최대 유도를 유도하는지를 보여준다.
도 8은 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이, 랫트 1차 간세포에서 인간 인슐린과 동일한 수준으로 G6Pc RNA의 발현을 억제한다는 것을 보여준다.
드 노보
지질 합성
본 발명의 인슐린 유도체가 지질의 드 노보 합성(DNL)에 미치는 효과는 표지된 아세테이트를 사용해 1차 간세포(단리 절차는 상기 참조)에서 결정하였다.
단리 후 1일차에, 인간 인슐린 또는 인슐린 유도체가 보충된 분석 배지(배지 199(Gibco), HSA(Sigma))에서 24시간 동안 간세포를 미리 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, 간세포를 분석 배지에서 인간 인슐린 또는 인슐린 유도체 및 14C-표지된 아세테이트(PerkinElmer)로 24시간 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS에서 세척하고 MicroScint-E (PerkinElmer)로 용해시켰다.
방사성 아세테이트가 지질(DNL)로 통합되는 것은 TopCount NXT (PerkinElmer Life Sciences)를 사용하여 결정하고, 그 결과는 GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 7을 사용해 S자형 투약량-반응 곡선에 피팅하였다.
도 9는 랫트 1차 간세포 내 드 노보 지질 합성에서 인간 인슐린 및 실시예 15의 화합물에 대한 대표적인 투약량-반응 곡선을 보여주고, 본 발명의 대표적인 화합물, 즉 실시예 15의 화합물이 어떻게 랫트 1차 간세포에서 드 노보 지질 합성에 대한 준최대 반응을 나타내는지를 보여준다.
분석 (II) 당뇨병성 마우스를 이용한 아만성 생체 내 연구
동물 및 화합물
Research Diet의 D12492 고지방 먹이를 이용한, Jackson Laboratory의 12주령 수컷 C57BL/6J-먹이-유도 비만(DIO) 마우스를 2주 동안 시설에 순응화시킨 다음, 간단한 이소플루란 가스로 마취시킨 상태에서 150 mg/kg 스트렙토조토신(STZ)(Sigma)을 피하(s.c.) 주입하여 당뇨병을 유발하였다. 당뇨병이 안정하게 발생하도록 2주 동안 동물을 방치한 후, 체중, 혈당 수준, 혈액 당화 헤모글로빈(HbA1c) 수준의 측정치에 기초하여 치료군으로 배정하였다. 동물을 표준 조명 및 온도 조건 하에 수용하고, D12492 먹이와 물에 항시 즉흥적으로 접근할 수 있도록 하였다.
동물들에게 비히클 치료(n=16)를 배정하거나, PK 비교기(대조군 번호 5) 또는 실시예 15의 화합물 중 하나를 상이한 투약량으로 배정하였다(투여군당 n=26).
시험 화합물, 즉 PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물을 5 mM 인산염, 140 mM 염화나트륨, 및 70 ppm 폴리소르베이트-20으로 제형화하였다.
PK 비교기(비교기 번호 5)는 아실화되었지만, 부분 작용제가 아닌 인슐린 유도체이다.
치료 프로토콜
동물에게 배정된 치료제를 1일 2회 피하 주사하여 6주 동안 동물을 치료하였다. 주사는 12시간 간격으로, 07:30~08:30과 19:30~20:30의 시간 틀에 맞게 매일 주었다. 투여 부피는 2 mL/kg이었고, 주사는 NovoPen® 주사 장치를 사용해 투여하였다.
임상시험 전반에 걸쳐, 체중 및 혈당 수준에 대해 동물을 측정하였으며, 혈액 HbA1c 수준과 신체 조성은 임상시험의 시작 시 및 완료 시 측정하였다. 또한, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물의 혈장 노출 수준을 평가하였다.
분석 방법
혈당 농도는 EBIO 완충 용액에 전혈을 희석한 다음, EKF Diagnostic의 Biosen 자동분석기를 이용해 측정하여 결정하였다.
혈액 HbA1c 수준은 용혈 완충액에 전혈을 희석시킨 다음, Hitachi Cobas 6000 자동분석기를 이용해 측정하고, Roche Diagnostics의 HbA1c 키트를 사용해 결정하였다.
신체 조성은 정량 자기 공명(EchoMRI-100TM, Echo Medical Systems)에 의해, 마취되지 않은 마우스를 지방량 및 제지방에 대해 스캐닝함으로써 결정하였다.
간 TG 함량은 안락사 직후에 채취한 간 조직의 샘플에서 결정하였다. 간 샘플의 균질화, 비누화 및 원심분리 후, Hitachi Cobas 6000 분석기(Roche)를 이용해 상청액에서 TG 농도를 측정하였다. 그런 다음, TG 함량을 원래의 균질화 간 샘플의 질량으로 나누어 간 조직 1 mg당 μmol의 TG로 표현하였다.
내피 기능은 와이어 근위계에 작창된 장간막 동맥에서 ACh-유도된 혈관 이완을 사용해 HbA1c 일치군(비히클 n=12, 비교기(비교기 번호 5; n=15) 및 실시예 15의 화합물(n=15))에서 생체 외 평가하였다. 동맥을 페닐에프린을 사용해 최대 탄력의 70%까지 미리 수축시킨 후, 투약량을 누적적으로 증가시키면서 ACh로 자극하였다.
자체적인 발광 산소 채널링 면역 분석법(LOCI)을 사용해 혈장 샘플을 분석함으로써 PK 비교기(비교기 번호 5) 및 실시예 15의 화합물의 혈장 노출 수준을 결정하였다.
도 10~14는, 비히클, PK 비교기(비교기 번호 5) 및 본 발명의 대표적인 인슐린 유사체, 즉 실시예 15의 화합물을 1일 2회 6주간 피하 투여한 당뇨병 STZ-DIO 마우스에서의 아만성(sub-chronic) 생체 내 연구에서 HbA1c 수준, 체중, 체지방량, 간 TG 및 장간막 동맥의 ACh-자극 혈관 이완에 대한 대표적인 곡선을 보여준다.
동물 실험은, 고지방 먹이를 먹인 당뇨병 마우스를 본 발명의 인슐린 유도체로 사용하면 약동학적(PK) 비교기(비교기 번호 5)와 유사하게 혈당 수준을 낮출 수 있다는 것을 보여주었다. PK 비교기(비교기 번호 5)는 인슐린 수용체 인산화에 대한 부분적 작용제가 아닌 아실화된 인슐린 유사체이지만, 본 발명의 실시예 15의 화합물과 유사한 PK 프로파일을 갖는다.
고지방 사료를 먹인 당뇨병 마우스의 아만성(6주) 치료에, 동일한 수준의 혈당 조절에 도달하도록(HbA1c 수준으로 측정함) 투여된 PK 비교기(비교기 번호 5)와 비교해 본 발명의 인슐린 유도체, 즉 실시예 15를 사용한 결과, 생체 외에서 체중 증가의 상당한 감소, 체지방량 증가의 상당한 감소, 간 중성 지방(TG)의 감소 강화, 및 아세틸콜린(ACh) 자극된 혈관 이완이 생체 외에서 유도되었다.
따라서, 본 발명은, 혈당 수준을 낮출 수 있지만, 지질 대사와 관련된 공정에 대해서는 개선된 효과, 예컨대, 체중 증가의 감소, 체지방량 증가의 감소, 및 간 TG의 감소 강화 효과를 가질 뿐만 아니라 PK-일치 비교기에 비해 내피 기능이 개선된 인슐린 유도체를 제공한다.
약어 목록
ACh - 아세틸콜린
AKT - 단백질 키나제 B (PKB)
BHK - 새끼 햄스터 신장
CHO - 차이니즈 햄스터 난소
CPM - 분당 계수
CVD - 심혈관 질환
DIO - 식단-유도 비만
DNL - 드 노보 지질 합성
DPM - 분당 분리
ELISA - 효소-결합 면역흡착 분석
ERK - 세포외 조절된 키나아제(MAPK로도 알려짐)
FAS - 지방산 합성효소
G6Pc - 글루코오스-6-포스파타아제
HbA1c - 글리코실화 헤모글로빈
HEPES - 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산
HI - 인간 인슐린
HSA - 인간 혈청 알부민
IR - 인슐린 수용체
IR-A - 인슐린 수용체 이소형 A
LOCI - 발광 산소 채널링 면역 분석
MAPK - 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (ERK로도 알려짐)
NAFLD - 비알코올성 지방간 질환
PAS - 과요오드산 용액
PBS - 인산 완충 식염수
PK - 약동학
PKB - 단백질 키나제 B (AKT로도 알려짐)
Ppip - 시클로필린 b (cycB)
RT-PCR - 실시간 중합효소 연쇄 반응
SPA - 섬광 근접 분석
SREPB1c - 스테롤 조절 요소-결합 전사 인자 1c
STZ - 스트렙토조토신
STZ-DIO - 스트렙토조토신 처리된 식단-유도 비만
TG - 트리글리세리드
안정성
본 발명의 인슐린 유도체의 안정성은 시차주사 열량측정(DSC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용해 평가하였다.
시차주사 열량 측정(DSC)에 의한 인슐린 유도체 자가-결합 및 안정성의 평가
제형
인슐린 유도체를 약 0.2 mM로 용해시키고 수산화나트륨과 염산을 사용해 pH를 약 7.6까지 조절하였다. 2.5 M 아세트산, 4 mM L-아르기닌 및 20%(V/V) 아세토니트릴을 함유하는 용리액을 사용해 SEC Waters PROTEIN PAK 125 (250*8mm)에 의해 주위 온도에서 농도를 측정하였으며, 유속은 1 ml/분이었다. Pace에 따른 흡수계수 보정을 사용하여 인간 인슐린 기준에 대한 280 nm에서의 검출.
0.1 mM의 최종 인슐린 농도에 대해 16 mM 페놀, 7 mM 인산염, 10 mM NaCl 및 0.1 mM 아세트산아연을 첨가하였다. pH는 염산과 수산화나트륨으로 7.4까지 조절하였다.
MicroCal VP-모세관 DSC(Malvern Instruments Ltd)를 사용해 데이터를 수집하였다. 모든 주사(scan)는 기준 세포에서 비히클(인슐린 샘플과 동일한 조성이지만 인슐린 및 아세트산아연 불포함)을 사용해 20℃내지 110℃ 4℃/분의 주사 속도로 수행하였다. 기기의 피드백 모드는 "낮음"으로 설정하고, 데이터 필터링 기간은 2초로 설정하였다. 완충액-완충액 기준 주사(전술한 비히클로 수행함)를 각 샘플 주사에서 차감한 다음 농도를 정규화하고 베이스라인을 생성하였다. 인슐린 아연 복합체는 인슐린과 관련하여 헥사머가 아닌 다른 결합 상태에 있을 수 있지만, 단순화를 위해 아연 안정화된 인슐린 복합체를 헥사머로서 지칭한다는 것에 유의해야 한다.
(Tonset)과 헥사머 풀림 피크(Tm,hexamer)이 중간 점을 상이한 인슐린 유도체에 대해 비교하였고, T,onset 및 Tm,hexamer 의 값을 표 2에 표시하였다. 결과는 B5Tyr 및 B5Phe 돌연변이가 인슐린 아연 헥사머에 대해 어떻게 고도의 안정화 효과를 가지는지를 보여준다.
| 화합물 |
Tm, 발생
(℃) |
Tm, 헥사머
(℃) |
SEC, ≥헥사머 3Zn/6ins (%) | SEC, ≥헥사머 6Zn/6ins (%) |
| 실시예 1의 화합물 | 71.3 | 83.8 | 100 | 100 |
| 실시예 2의 화합물 | 77.3 | 92.1 | ND | ND |
| 실시예 3의 화합물 | 73.7 | 88.6 | 100 | 100 |
| 실시예 4의 화합물 | 77.2 | 91.7 | 96.7 | 97.1 |
| 실시예 5의 화합물 | 67.9 | 82.2 | 98.3 | 97.5 |
| 실시예 6의 화합물 | 75.4 | 90.3 | 86.7 | 92.4 |
| 실시예 7의 화합물 | 74.1 | 89 | ND | ND |
| 실시예 8의 화합물 | 59.1 | 85 | 96.1 | 93 |
| 실시예 9의 화합물 | 56.5 | 89.4 | 85.5 | 74.1 |
| 실시예 10의 화합물 | 71.7 | 82.1 | 91.5 | 88.5 |
| 실시예 11의 화합물 | 67 | 79.4 | 95.4 | 93.2 |
| 실시예 12의 화합물 | 66 | 77.3 | 89.4 | 76.3 |
| 실시예 13의 화합물 | 68.5 | 79.4 | 92.8 | 96.5 |
| 실시예 14의 화합물 | 71.5 | 82.3 | 78.5 | 87.3 |
| 실시예 15의 화합물 | 69.9 | 81 | 97.1 | ND |
| 실시예 16의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 78.7 | 51.4 |
| 실시예 17의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 21.7 | 71.1 |
| 실시예 18의 화합물 | 64.3 | 76.9 | 90.4 | 90.1 |
| 실시예 19의 화합물 | 60 | 73.6 | 80.7 | 74.2 |
| 실시예 20의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 88.1 | 76.3 |
| 실시예 21의 화합물 | ND | ND | ND | ND |
| 실시예 22의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 93 | 68.6 |
| 실시예 23의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 42.5 | 44.1 |
| 실시예 24의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 26.8 | 26.9 |
| 실시예 25의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 52 | 67.1 |
| 실시예 26의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | ND | ND |
| 실시예 27의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 18 | 42.5 |
| 실시예 28의 화합물 | 67 | 78.5 | ND | ND |
| 실시예 29의 화합물 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | ND | ND |
| 실시예 30의 화합물 | 68.9 | 79.7 | 95.4 | 98.9 |
| 실시예 31의 화합물 | 67.9 | 97.7 | 91.7 | 86.5 |
| 실시예 32의 화합물 | 67.2 | 78.4 | 76.9 | 89.7 |
| 실시예 33의 화합물 | 67.4 | 98.2 | ND | ND |
| 실시예 34의 화합물 | 67.7 | 78.9 | 84.4 | 89.6 |
| 실시예 35의 화합물 | 67.6 | 91.4 | 91.4 | 91.4 |
| 실시예 36의 화합물 | 68.5 | 80.6 | 95.9 | 92 |
| 실시예 37의 화합물 | 60.8 | 74.1 | 74.2 | 64.7 |
| 실시예 38의 화합물 | 70.1 | 101.8 | ND | ND |
| 실시예 39의 화합물 | 76.3 | 97.3 | ND | ND |
| 실시예 40의 화합물 | 90.7 | 103.1 | ND | ND |
| 실시예 41의 화합물 | 67.8 | 82.6 | ND | ND |
| 실시예 42의 화합물 | 71.1 | 84 | 90.2 | 97.4 |
| 실시예 43의 화합물 | 71.8 | 82.7 | 89 | 97 |
| 실시예 44의 화합물 | 71.2 | 82.9 | 89 | 81 |
| 실시예 45의 화합물 | 73.6 | 84.3 | 86.2 | 80.5 |
| 실시예 46의 화합물 | 72 | 102 | 82.7 | 79.9 |
| 인슐린 아스파르트 | 52 | 72 | ND | ND |
| 비교기 1 | ND | ND | ND | ND |
| 비교기 2 | ND | ND | ND | ND |
| 비교기 3 | ND | ND | ND | ND |
| 비교기 4 | ND | ND | ND | ND |
| 비교기 5 | ND | ND | ND | ND |
| 비교기 6 | 56.6 | 75 | 100 | 78 |
| 비교기 7 | 44.5 | 68.8 | 100 | 90 |
| 비교기 8 | 59.5 | 79 | 100 | 96 |
| 비교기 9 | 낮은 신호 | 낮은 신호 | 45.1 | 77.6 |
ND: 미 결정
크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 인슐린 유도체 자가-결합의 평가
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 인슐린 유도체 자가-결합을 평가하는 흔한 방법이다.
제형
인슐린 유사체를 약 2 mM로 용해시키고 수산화나트륨과 염산을 사용해 pH를 7.6까지 조절하였다. 2.5 M 아세트산, 0.065% L-아르기닌 및 20%(V/V) 아세토니트릴을 함유하는 용리액을 사용해 SEC Waters PROTEIN PAK 125 (250*8mm)에 의해 주위 온도에서 농도를 측정하였으며, 유속은 1 ml/분이었다. Pace CN에 따른 흡수계수 보정을 사용하여 인간 인슐린 기준에 대한 280 nm에서의 검출(Pace CN, Protein Science (1995) 4, 2411-2433 참조).
0.6 mM의 최종 인슐린 농도에 대해 1.6% 글리세롤, 30 mM 페놀, 7 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 0.3 mM 아세트산아연을 첨가하였다. pH는 염산과 수산화나트륨으로 pH 7.6까지 조절하였다.
인슐린 유도체 제형화 조건을 시뮬레이션하기 위해, 용리액에 16 mM 페놀, 20 mM 염화 나트륨, 및 10 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 포함시키고, 염산에 의해 pH를 7.3까지 조절하였다. 사용된 컬럼은 Waters Corporation(미국 매사추세츠주 밀포드 소재)의 ACQUITY UPLC® BEH200 (150*4.6 mm, d = 1.7 μm)이었다. 유속은 0.3 mL/분, 주입 부피는 20 μL였고, 자외선 검출은 286 nm에서 수행하였다. 컬럼 온도는 23℃로 유지하였다.
도 15~19는 SEC 실험에서의 대표적인 크로마토그램을 보여준다. 도 15는 비교기 화합물, 즉 비교기 9가 제형에서 얼마나 불안정했는지를 보여주는데, 이는 다양한 피크들이 넓고 뒷쪽이 끌리는 피크이기 때문이고, 이는 여러 번의 중첩된 자가-결합 상태를 나타내는 것이다. 대조적으로 도 16~19에 주어진 결과는, 본 발명을 대표하는 화합물, 즉 실시예 3, 11, 12, 15의 화합물들이 제형에서 얼마나 안정한지를 보여주는데, 이는 크로마토그램이 우세한 단일 뾰족한 피크를 나타내기 때문이다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 구현예는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해해야 한다.
일반적인 제조 방법
다음의 실시예 및 일반 절차는 본 명세서에서 및 합성 반응식에서 식별된 중간 화합물 및 최종 생성물을 지칭한다. 본 발명의 화합물의 제조는 다음의 실시예를 사용하여 상세히 설명되지만, 기술된 화학적 반응은 본 발명의 화합물의 제조에 대한 이의 일반적인 적용 가능성의 측면에서 개시된다.
때때로, 반응은 본 발명의 개시된 범위 내에 포함된 각 화합물에 설명된 바와 같이 적용되지 않을 수 있다. 이러한 것이 발생하는 화합물은 당업자에 의해 쉽게 인식될 것이다. 이러한 경우, 반응은 당업자에게 공지된 종래의 변형에 의해, 즉 간섭기를 적절하게 보호함으로써, 다른 종래의 시약으로 바꿈으로써, 또는 반응 조건의 통상적인 변경에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.
대안적으로, 본원에 개시된 다른 반응이나 달리 통상적인 반응은 본 발명의 상응하는 화합물의 제조에 적용할 수 있을 것이다. 모든 제조 방법에서, 모든 출발 물질은 알려져 있거나 공지된 출발 물질로부터 쉽게 제조될 수 있다. 모든 온도는 섭씨로 제시되며, 달리 명시되지 않는 한, 고형물을 지칭할 때의 모든 부(parts) 및 백분율은 중량 기준이고, 용매 및 용리액을 지칭할 때의 부는 부피 기준이다.
본 발명의 화합물은, 당업계에 통상적인 다음의 절차 중 하나 이상을 사용함으로써 정제될 수 있다. 이러한 절차는 개인의 선호도에 따라 - 필요한 경우 - 구배, pH, 염, 농도, 유속, 컬럼 등에 대해 변경될 수 있다. 해당 인슐린의 불순물 프로파일, 용해도 등과 같은 요인에 따라, 이러한 변형은 당업자에 의해 쉽게 인식되고 이뤄질 수 있다.
(방법 1) 제조 실시예 - 백본 발현 및 정제
백본 발현
본 발명에 따른 용도를 위한 인슐린 펩티드 백본, 즉 2쇄 비-아실화 인슐린 유사체는 예를 들어 US 6500645에 개시된 바와 같이 잘 알려진 기술에 의해 적절한 숙주 세포에서 해당 인슐린 백본을 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 재조합적으로 생산된다. 인슐린 펩티드 백본은 직접 발현되거나, B사슬 상에 N-말단 연장부를 갖고/갖거나 B-사슬과 A-사슬 사이에 연결 펩티드(C-펩티드)를 가질 수 있는 전구체 분자로서 발현된다. 이러한 N-말단 연장부 및 C-펩티드는 적절한 프로테아제, 예를 들어, 아크로모백터 리티쿠스 프로테아제(ALP) 또는 트립신에 의해 시험관 내에서 절단되고, 따라서 위치 B1 및 A1 다음에 각각 절단 부위를 갖게 된다. 본 발명에 따른 용도에 적합한 유형의 N-말단 연장부 및 C-펩티드는 예를 들어 US 5395922, EP 765395 및 WO 9828429 A1에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 인슐린 유사체 펩티드 백본 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 확립된 방법, 예를 들어, Beaucage 등에 의해 기술된 포스포라미디트법(phosphoamidite method)(Tetrahedron Letters 1981 22 1859-1869 참조); 또는 Matthes 등에 의해 기술된 방법(EMBO Journal 1984 3 801-805 참조)에 의해 합성하여 제조할 수 있다. 포스포라미디트법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 이중화되고, 결합되어 합성 DNA 작제물을 형성한다. 현재, DNA 작제물을 제조하는 바람직한 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 것이다.
재조합 방법은, 선택된 미생물 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 펩티드 백본 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 벡터를 일반적으로 활용하게 된다. 재조합 벡터는 자가 복제 벡터, 즉, 염색체 외 독립체로서 존재하고, 이의 복제는 염색체 복제, 예를 들어, 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니 염색체, 또는 인공 염색체와 독립적인 벡터일 수 있다. 벡터는 확실한 자가 복제를 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 숙주 세포 내로 도입될 때 게놈에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 총 DNA를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용되거나, 트랜스포존(transposon)이 사용될 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있고, 바람직하게는, 숙주 세포의 게놈 내로 벡터의 안정한 통합을 가능하게 하거나, 세포 내에서 게놈과 무관하게 자율적인 복제를 가능하게 하는 요소(들)를 함유하게 된다.
재조합 발현 벡터는 효모에서 복제가 가능한 것일 수 있다. 효모에서 벡터의 복제를 가능하게 하는 서열의 예는 효모 플라스미드 2 μm 복제 유전자 REP 1-3 및 복제 기원이다.
벡터는 트랜스-형성 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양 요구성에 대한 독립 영양성 등을 가능하게 하는 유전자 산물이다. 세균 선택성 표지의 예로는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스에서 유래된 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커 등이 있다. 사상 진균류 숙주 세포에서 사용하기 위한 선택성 마커는 amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카르바모일전이효소), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제) 및 trpC(안트라닐산염 신타아제)를 포함한다. 효모 숙주 세포에 적절한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 효모에 잘 맞는 선택성 마커는 스키조사카로마이세스 폼페(Schizosaccharomyces pompe) TPI 유전자이다(Russell; Gene 1985 40 125-130 참조).
벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 돌연변이체 프로모터, 절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 상동이거나 이종인 세포 외 또는 세포 내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다.
세균 숙주 세포에서 전사를 유도하기에 적절한 프로모터의 예는, 대장균 락토스 오페론(E. coli lac operon), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 아가라제 유전자(Streptomyces coelicolor agarase gene, dagA), 바실러스 서브틸러스 레반슈크라제 유전자(Bacillus subtilis levansucrase gene, sacB), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene, amyL), 바실러스 스테아로테르모필루스 말토게닉 아밀라제 유전자(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, amyM), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene, amyQ), 및 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(Bacillus licheniformis penicillinase gene, penP)로부터 수득된 프로모터이다. 사상 진균류 숙주 세포에서 전사를 유도하기에 적절한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리지에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 메이헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트 프로테이나제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 및 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 산성 안정한 알파-아밀라제에 대한 유전자로부터 수득된 프로모터이다. 효모 숙주에서 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) Ma1, TPI, ADH, TDH3 또는 PGK 프로모터이다.
본 발명에 따른 용돌르 위해 인슐린 펩티드 백본을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열도 일반적으로 적절한 종결자에 작동 가능하게 연결될 것이다. 효모에서 적절한 종결자는 TPI 종결자이다(Alber 등; J. Mol. Appl. Genet. 1982 1 419-434 참조).
본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 펩티드 백본을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 프로모터 및 종결자를 각각 조합하고, 선택된 숙주에서 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내에 이들을 삽입하기 위해 사용된 절차는, 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터는, 먼저 본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 백본을 암호화하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 작제물을 제조하고, 후속하여 적절한 발현 벡터 내에 이러한 단편을 삽입함으로써 작제되거나; 개별 요소(예컨대, 신호 및 프로-펩티드(B-사슬의 N-말단 연장부), C-펩티드, A- 및 B-사슬)에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 단편을 순차적으로 삽입한 후, 결합시킴으로써 작제될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 백본을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 염색체 통합 벡터로서, 또는 자가-복제성 염색체 외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 도중에 발생하는 돌연변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않은 부모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대 원핵생물, 또는 비-단세포성 미생물, 예컨대 진핵생물일 수 있다. 유용한 단세포는 그람 양성 박테리아와 같은 박테리아 세포로서, 바실러스 세포, 스트렙토마이세스 세포, 또는 그람 음성 박테리아, 예컨대 대장균 및 슈도모나스 종을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 진핵생물 세포는 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포일 수 있다.
숙주 세포는 특히 효모 세포일 수 있다. 효모 유기체는 배양 시, 인슐린 펩티드 백본 또는 이의 전구체를 배양 배지 내로 분비하는 임의의 적절한 효모 유기체일 수 있다. 적절한 효모 유기체의 예는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카리마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 유바룸(Sacchoromyces uvarum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 종(Candida sp.), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 게오트리쿰 종(Geotrichum sp.), 및 게오트리쿰 페르멘탄스(Geotrichum fermentans)로부터 선택된 균주를 포함한다.
효모 세포의 형질변환은 예를 들어 원형질체가 형성되고, 이어서 공지된 방법에 의한 형질변환에 의해 수행될 수 있다. 세포를 배양하는데 사용된 배지는 효모 유기체를 성장시키기에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
백본 정제
분비된 인슐린 펩티드 백본 또는 이의 전구체는, 원심분리에 의해, 여과에 의해, 또는 인슐린 펩티드 백본 또는 이의 전구체를 이온 교환 기질 또는 역상 흡착 매트릭스 상에서 포획하는 것에 의해 효모 세포를 매질로부터 분리하는 단계; 황산암모늄과 같은 염을 사용하는 여과에 의해 상청액의 단백질성 성분을 침전시킨 후, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 절차에 의해 이를 정제하는 단계를 포함하는 종래 절차에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 인슐린 펩티드 백본의 정제 및 분해는 다음과 같이 수행된다:
B-사슬의 N-말단 연장부 및 B-사슬과 A-사슬 사이에서 변형된 C-펩티드를 함유할 수 있는 단쇄 인슐린 펩티드 골격 전구체를 양이온 교환에 의해 효모 배양 상청액으로부터 정제하고 농축시킨다(Kjeldsen 등; Prot. Expr. Pur. 1998 14 309-316 참조). 단쇄 인슐린 펩티드 백본 전구체를 리신-특이적 고정된 ALP와 함께 분해하거나(Kristensen 등; J. Biol. Chem. 1997 20 12978-12983 참조), 트립토판을 사용해 B-사슬의 N-말단 연장부(존재하는 경우) 및 C-펩티드를 절단함으로써 단쇄 인슐린 펩티드 백본 전구체를 이중쇄(two-chain) 인슐린 펩티드 백본으로 성숙시킨다.
ALP 분해
인슐린 펩티드 백본 전구체를 함유하는, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 유래된 용리액을 15~20%의 에탄올 농도가 되도록 물로 희석한다. 글루탐산나트륨을 15 mM의 농도로 첨가하고, NaOH로 pH를 9.7까지 조절한다. 고정된 ALP(4 gram/L)를 1:100(부피:부피)의 비율로 첨가하고, 실온에서 가볍게 교반하면서 밤새 분해시킨다.
C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 분석 LC에 의해 분해 반응을 분석하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광계(MS)(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)에 의해 분자량을 확인한다.
고정된 ALP는 0.2 μm 필터를 사용해 여과로 제거한다. 아세토니트릴 구배를 사용하는 C18 칼럼을 이용해 역상 HPLC(Waters 600 시스템)에 의해 이중쇄 인슐린 펩티드 백본을 정제한다. 원하는 인슐린 펩티드 백본, 즉 B28K desB29-B30 인간 인슐린을 동결건조에 의해 회수한다.
트립신 분해
인슐린 펩티드 백본 전구체를 함유하는, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 유래된 용리액을 15~20%의 에탄올 농도가 되도록 물로 희석한다. 글리신을 50 mM의 농도로 첨가하고, NaOH로 pH를 9.0~9.5까지 조절한다. 트립신을 1:300(w:w)의 비율로 첨가하고, 4℃에서 분해가 진행되도록 한다. 분해가 완료될 때까지 20분마다 분해를 분석적으로 모니터링한다. 1 M 구연산을 3:100(부피:부피)의 비율로 첨가하여 분해를 종결한다.
C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 분석 LC에 의해 분해 반응을 분석하고, MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)에 의해 분자량을 확인한다.
아세토니트릴 구배를 사용하는 C18 칼럼을 이용해 역상 HPLC(Waters 600 시스템)에 의해 이중쇄 인슐린 펩티드 백본을 정제한다. 원하는 인슐린 펩티드 백본을 동결건조에 의해 회수된다.
C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 분석 LC에 의해 순도를 결정되고, MALDI-TOF MS에 의해 분자량을 확인한다.
(방법 2) 제조 실시예 - 아실화 및 정제 절차
정제 절차
정제 방법 1
컬럼: Waters xBridge PrepC18, 30x250 mm
유속: 20 ml/분
완충액 A: 물 중 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA
구배: 40분에 걸쳐, 20~45%B 또는 30~40%B 또는 20~60%B 또는 20~40%B 또는 25~50%B 또는 20~55%B 또는 30~45%B
정제 방법 2
컬럼: Phenomenex, 5u, C18, 110Å, 30x250 mm
유속: 20 ml/분
완충액 A: 물 중 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA
구배: 80분에 걸쳐 10~60%B, 또는 95분에 걸쳐 0~60%B, 또는 60분에 걸쳐 25~55%B
아실화 시약을 제조하기 위한 일반 절차
간단한 이산: NMP 중에서 TSTU와 DIPEA로 이산-모노-t-부틸 에스테르를 활성화하여 NHS-활성화 일산을 제조해 직접 사용하거나, 이산-모노-NHS를 제조해 사용하였다. 터트-부틸 보호된 아실화 시약을 사용할 때, 생성된 인슐린 유도체를 TFA로 처리하여 탈보호시켰다.
OEG 링커를 갖는 이산: Fmoc-화학 물질을 사용해 클로로트리틸 수지 상에서의 단계적 고상 합성에 의해 시약을 제조하고, HFIP, TFA, HFIP/DCM 혼합물, 또는 TFA/DCM 혼합물을 사용해 이를 수지로부터 절단하였다.
일부 아실화제를 제조하고, 단리하여 보호기가 없는 NHS-에스테르로서 사용하였다.
일반적인 아실화 절차 1
100 mg의 적절한 인슐린 유사체를 1.2 ml의 0.1 M Na2CO3 및 0.6 ml의 NMP에 용해시키고 10.7±0.3까지 pH를 조절하였다. 필요에 따라 4 M NaOH를 첨가하여 10.7±0.3로 유지된 pH에서, 0.3 ml NMP 중 0.03 mmol의 아실화 시약을 첨가하였다. 30분 내지 60분 후 반응을 완료하고, 40 ml의 이소프로판올을 첨가하여 생성물을 침전시켜 원심 분리하고, 에테르로 세척하고 건조시켰다. 대안적으로, 30 ml의 물로 희석시켜 pH를 4.5~5.0으로 조절함으로써, 등전점 침전을 유도하여 생성물을 분리할 수도 있다. 대안적으로는, 반응 혼합물을 아세트산 또는 TFA로 산성화시키고 즉시 정제하였다.
이어서, 전술한 바와 같이 TFA-아세토니트릴 중에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 생성물을 정제하고, 순수한 분획을 동결 건조시켰다. 생성물의 정체는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석법(MALDI-MS) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)/전기분무-MS에 의해 확인하였다.
일부 경우에, 더 많거나 더 적은 양이 생성되도록 합성의 규모를 조절하였다. 그 경우, 출발 물질, 시약 및 용매의 모든 양은 동일한 인자에 의해 조절하였다.
변형 1
아실화 시약이 터트-부틸 보호기를 함유한 경우, 이소프로판올 침전 또는 등전 침전 후의 생성물을 5분 동안 5 ml의 TFA 또는 TFA:물(95:5)에 용해시켜 35 ml 에테르로 침전시키고, 에테르로 2회 세척하고 건조시켰다.
변형 2
아실화 시약이 터트-부틸 보호기를 함유한 경우, 등전 침전시킨 원시 생성물을 5 ml의 TFA 또는 TFA:물(95:5) 또는 TFA:트리이소프로필실란(99:1)에 용해시켰다. 용액을 20~30분 동안 교반한 다음, 물로 희석시키고, 일부 경우에는 DMSO 또는 NMF로 추가로 희석하고, 분취 HPLC로 즉시 정제하였다.
변형 3
아실화 시약이 반응 혼합물 중에 잘 용해되지 않는 것으로 보이는 일부 경우에, 더 많은 NMP를 첨가하여(최대 1 ml) 반응 혼합물을 37℃까지 일시적으로 가온시킨다.
일반적인 아실화 절차 2
100 mg의 적절한 인슐린을 2 ml의 DMSO 및 40 ul의 Barton 염기(2-t-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘)에 용해시켰다. 20 umol의 아실화제를 첨가하고, 1분 후 반응을 완료하였다. 반응 혼합물을 산성화시키고, 물로 희석한 다음 즉시 정제하였다.
(방법 3) 인슐린 유도체의 화학적 합성
예를 들어, Prelude 또는 Liberty 합성기 상에서 표준 Fmoc 펩티드 합성에 의해 인슐린 A-사슬을 합성하였다. DMF 중 10% 또는 20% 피페리딘으로 탈보호를 수행하였다. Cys 6, 11 및 20이 Trt 보호기를 가지고 Cys 7이 Acm을 갖는 것을 제외하고는 모든 보호기가 표준이었다. C-말단 잔기가 Asn인 경우, PAL 또는 링크 수지 상에서 펩티드를 제1 아미노산으로의 Fmoc-Asp-OBut와 합성하였다.
합성 후, DCM으로 수지를 세척하고, DCM/HFIP(4:1) 중 1% 요오드로 1분 동안 처리하였고, DCM/HFIP(4:1) 중에서 15분 동안 인큐베이션하여 A6-A11 이황화물을 형성하였다. cDCM으로 세척하고 건조한 다음, TFA/물/DPDS(93:5:2)로 펩티드를 절단하여, 피리딜설파이드를 가진 인슐린 A-사슬을 Cys20 상에 제공하였다. 에테르 침전, 세척 및 건조를 통해 원시 A-사슬을 생성하고, 이를 후속 사슬 조합에 사용하였다.
예를 들어, Liberty 또는 Prelude 합성기 상에서 표준 Fmoc 펩티드 합성에 의해 인슐린 B-사슬을 합성하였다. 수지는 예를 들어, 미리 첨가된 Wang 수지였다. Cys 7이 Acm을 가지고 Cys19가 Trt를 갖는 것을 제외하고는 모든 보호기가 표준이었다.
절단은 TFA/물/TIPS(93:4:3)로 수행하였다. 에테르 침전, 세척 및 건조를 통해 원시 B-사슬을 생성하고, 이를 후속 사슬 조합에 사용하였다.
측쇄 변형된 리신을 갖는 인슐린 유도체가 바람직한 경우, 변형은 펩티드를 합성하는 동안에 도입하였다. 변형될 리신을 Fmoc-리신(Mtt)-OH으로서 도입하고, (마지막 결합 단계에서 Boc 보호된 아미노산의 결합에 의해, 또는 DMF 중 5당량의 Boc-무수물과 수지 결합 펩티드의 반응에 의해) Boc로 펩티드의 N-말단을 보호하였다 수지를 DMF/HFIP(1:4)로 30분 동안 처리하여 Mtt기를 제거하고, 펩티드 백본에 대해 기술한 바와 같이 표준 Fmoc 화학에 의해 측쇄를 합성하였다.
원시 A-사슬 및 B-사슬(각각 0.14 mmol)을 DMSO 40 ml에 용해시켰다. 2 ml의 2M 트리스 완충액 pH 8.5를 첨가하여 사슬 조합을 약 10분 만에 완료하였다. 40 ml의 DMSO 및 200 ml의 40% 아세토니트릴, 1% TFA로 용액을 희석하였다. N-클로로숙신이미드를 5 mM의 최종 농도가 될 때까지 첨가하였다. 이렇게 하여 10분이 되기 전에 3번 째 이황화 브릿지를 형성하였다. 600 ml의 0.2 M 트리스 pH 7.8로 용액을 희석하여 중화시키고, 20 mM 인산염 pH 7.2 중 아세토니트릴의 구배를 흘리는 C18 컬럼을 이용해 RP-HPLC로 정제하였다.
원하는 화합물을 함유하는 분획을 합치고, 동일 컬럼 상에서 0.1% TFA 중 아세토니트릴의 구배를 사용해 재정제하였다. 순수한 분획을 조합하고 동결건조시켰다. 수율은 일반적으로 20~50 mg의 원하는 인슐린 유도체였으며, 후속하여 UPLC 및 LC-MS에 의해 이들의 특징을 분석하였다.
본 발명의 인슐린 유도체의 실시예
실시예 1: N{엡실론-B28}-15-카르복시펜타데칸오일-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함.
계산된 질량 = 5903.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1476.66
실시예 2: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함.
계산된 질량 = 6032.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1509.07
실시예 3: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함.
계산된 질량 = 5931.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1484
실시예 4: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6060.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1516.73
실시예 5: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6077.0; 발견된 LC-MS m/5 = 1216.34
실시예 6: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]부탄오일]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6190.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1548.37
실시예 7: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6206.1; 발견된 LC-MS m/4 = 1552.37
실시예 8: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-[[(4R)-4-[(3R,10S,13R,17R)-3-히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일]펜탄오일]아미노]부탄오일]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6123.1; 발견된 LC-MS m/4 = 1531.7
실시예 9: N{엡실론-B28}-[(4R)-4-[(3R,10S,13R,17R)-3-히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일]펜탄오일]-[TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5993.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1499.16
실시예 10: N{엡실론-B28}-15-카르복시펜타데칸오일-[TyrB5,LysB28,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5797.7; 발견된 LC-MS m/4 = 1449.93
실시예 11: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5825.7; 발견된 MALDI-MS = 5825.7
실시예 12: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5791.6; 발견된 LC-MS m/3 = 1931.44
실시예 13: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5920.8; 발견된 LC-MS m/5 = 1185.04
실시예 14: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]부탄오일]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6049.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1513.32
실시예 15: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6065.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1517.34
실시예 16: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6094.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1524.36
실시예 17: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6239.1; 발견된 LC-MS m/4 = 1560.4
실시예 18: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데칸오일아미노)부탄오일]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5948.8; 발견된 LC-MS m/5 = 1190.69
실시예 19: N{엡실론-B28}-19-카르복시노나데칸오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5819.7; 발견된 LC-MS m/4 = 1455.67
실시예 20: N{엡실론-B28}-15-(1H-테트라졸-5-일)펜타데칸오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5787.6; 발견된 LC-MS m/4 = 1448.14
실시예 21: N{엡실론-B28}-17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데칸오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5815.7; 발견된 LC-MS m/4 = 1455.19
실시예 22: N{엡실론-B28}-16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5801.7; 발견된 LC-MS m/4 = 1451.6
실시예 23: N{엡실론-B28}-4-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸오일설파모일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5950.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1488.81
실시예 24: N{엡실론-B28}-4-(1H-테트라졸-5-일)펜타데칸오일설파모일]부탄오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6086.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1522.65
실시예 25: N{엡실론-B28}-4-(1H-테트라졸-5-일)헵타데칸오일설파모일]부탄오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5964.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1492.41
실시예 26: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[15-(1H-테트라졸-5-일)펜타데칸오일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6207.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1552.95
실시예 27: N{엡실론-B28}-4-[4-[17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데칸오일설파모일]부탄오일설파모일]부탄오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6114.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1529.62
실시예 28: N{엡실론-B28}-4-(17-카로복시헵타데칸오일설파모일)부탄오일-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5940.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1486.34
실시예 29: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[15-(1H-테트라졸-5-일)펜타데칸오일아미노]부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6061.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1516.63
실시예 30: N{엡실론-B28}-[(4R)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5920.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1481.13
실시예 31: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6100.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1525.8
실시예 32: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6079.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1520.77
실시예 33: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 6114.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1529.2
실시예 34: N{엡실론-B28}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[GluA14,TyrB5,AlaB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 2에 의해 합성함
계산된 질량 = 5934.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1484.5
실시예 35: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[PheB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5915.8; 발견된 MALDI-MS = 5916
실시예 36: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[GluA14,PheB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5775.6; 발견된 LC-MS m/4 = 1444.8
실시예 37: N{엡실론-B26}-17-카르복시헵타데칸오일-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5667.6; 발견된 LC-MS m/3 = 1889.9
실시예 38: N{엡실론-B26}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5796.7; 발견된 LC-MS m/3 = 1933.1
실시예 39: N{엡실론-B26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시펩타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6087.0; 발견된 LC-MS m/4 = 1522.5
실시예 40: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6130.0; 발견된 LC-MS m/3 = 2044.3
실시예 41: N{엡실론-B29}-테트라데칸오일-[TyrB5],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5942.9; 발견된 LC-MS m/3 = 1982
실시예 42: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6023.9; 발견된 MALDI-MS = 6026
실시예 43: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,AlaB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6037.9; 발견된 LC-MS m/4 = 1510.5
실시예 44: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6051.9; 발견된 MALDI-MS = 6052
실시예 45: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]-[TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 6066.0; 발견된 MALDI-MS = 6065
실시예 46: N{엡실론-B26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)부탄오일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[TyrB5,LysB26],des-(B27-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5941.8; 발견된 LC-MS m/4 = 1486
비교기
비교기 1: [TyrB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 1에 의해 합성함
계산된 질량 = 5635.4; 발견된 MALDI-MS 5635
비교기 2: [TyrB5,GlyB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 1에 의해 합성함
계산된 질량 = 5626.4; 발견된 MALDI-MS = 5626
비교기 3: [TyrB5,AlaB26],des-ThrB30-인슐린
합성 방법 1에 의해 합성함
계산된 질량 = 5640.4; 발견된 MALDI-MS = 5641
비교기 4: [GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 1에 의해 합성함
계산된 질량 = 5495.2; 발견된 LC-MS m/4 = 1374.83
비교기 5: N{엡실론-B29}-[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데칸오일아미노)부탄오일]-인슐린
비교기 6: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[LeuB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5881.8; 발견된 MALDI-MS = 5882
비교기 7: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[SerB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5875.7; 발견된 MALDI-MS = 5876
비교기 8: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[AlaB5,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5839.7; 발견된 MALDI-MS = 5840
비교기 9: N{엡실론-B28}-17-카르복시헵타데칸오일-[GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린
합성 방법 3에 의해 합성함
계산된 질량 = 5799.7; 발견된 MALDI-MS = 5800
SEQUENCE LISTING
<110> Novo Nordisk A/S
<120> 신규한 아실화 인슐린 유사체 및 이의 용도
<130> 170001WO01
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 호모 사피엔스
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 호모 사피엔스
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 4
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Ala Thr Lys
20 25
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Gly Thr Lys
20 25
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 6
Phe Val Asn Gln Phe Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Ala Thr Lys
20 25
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 7
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Ala Thr Lys
20 25
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 8
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Gly Thr Lys
20 25
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 9
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys
20 25
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 10
Phe Val Asn Gln Phe Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Gly Thr Lys
20 25
<210> 11
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 11
Phe Val Asn Gln Phe Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys
20 25
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성 서열
<400> 12
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Lys
20 25
<210> 13
<211> 29
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 13
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 14
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Gly Thr Pro Lys
20 25
<210> 15
<211> 29
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성
<400> 15
Phe Val Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Ala Thr Pro Lys
20 25
Claims (15)
- 인슐린 유도체로서, 상기 인슐린 유도체는 B5Y 또는 B5F 및 아실기를 포함하는 치환기, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르인, 인슐린 유도체.
- 제1항에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 B26G 또는 B26A를 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 아실기를 포함하는 상기 치환기는 B28K, B26K 또는 B29K에 부착되는, 인슐린 유도체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 하기 화학식 (I)을 가지며
Acy-L1-L2-L3
식 중,
- Acy는 아실기이고, 리토콜산으로 표시되거나 다음 화학식의 적어도 하나의 작용기를 포함하거나
Chem. 1:-CO-(CH2)x-COOH; 또는
Chem. 2: -CO-(CH2)x-테트라졸일
(식 중, x는 12 내지 20 범위의 정수를 나타내고; 테트라졸일기는 1H-테트라졸-5-일임);
다음 화학식의 지방산이고
Chem. 3: -CO-(CH2)x-CH3
(식 중, x는 8 내지 16 범위의 정수를 나타냄),
- L1은 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
- L2는 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내고,
- L3은 부재하며 공유 결합을 나타내거나 OEG, gGlu, DgGlu 또는 설폰이미드 C-4를 나타내는
(식 중, gGlu는 감마 글루탐산 잔기를 나타내고, OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸을 나타냄), 인슐린 유도체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 A14E 및/또는 desB30 및/또는 desB29-30 및/또는 desB27-30을 추가로 포함하는, 인슐린 유도체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체:
i. A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
ii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
iii. B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
iv. B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
v. B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
vi. A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
vii. B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
viii. B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
ix. B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
x. B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
xi. B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
xii. B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
xiii. B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
xiv. B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
xv. B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
xvi. A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
xvii. A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
xviii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
xix. A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
xx. A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
xxi. A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
xxii. A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
xxiii. A14E, B5Y, B26G, desB30(서열번호 3 및 14)
xxiv. A14E, B5Y, B26A, desB30(서열번호 3 및 15). - 제6항에 있어서, Acy는 리토콜산, 1,16-헥사데칸디오익산, 1,18-옥타데칸디오익산, 1,20-에이코산디오익산, 테트라졸-C16, 테트라졸-C17, 테트라졸 C18 및 테트라데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인슐린 유도체.
- 제6항에 있어서, -L1-L2-L3은 DgGlu, gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-OEG, gGlu-OEG-OEG, OEG, 설폰이미드-C4, 및 설폰이미드-C4-설폰이미드-C4로부터 선택된 2가 연결기를 나타내는, 인슐린 유도체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 유도체는 실시예 15의 하기 화합물인, 인슐린 유도체: N{엡실론-B28}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[GluA14,TyrB5,GlyB26,LysB28],des-(B29-B30)-인슐린.
- 중간 생성물로서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 백본을 포함하는, 중간 생성물
i. A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 4)
ii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 5)
iii. B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 7)
iv. B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 8)
v. B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 9)
vi. A14E, B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 10)
vii. B5F, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 11)
viii. B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 1 및 12)
ix. B5Y, desB30(서열번호 1 및 13)
x. B5Y, B26G, desB30(서열번호 1 및 14)
xi. B5Y, B26A, desB30(서열번호 1 및 15)
xii. B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 6)
xiii. B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 4)
xiv. B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 5)
xv. B5F, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 1 및 10)
xvi. A14E, B5F, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 6)
xvii. A14E, B5Y, B26A, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 7)
xviii. A14E, B5Y, B26G, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 8)
xix. A14E, B5Y, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 9)
xx. A14E, B5F, B28K, desB29-30(서열번호 3 및 11)
xxi. A14E, B5Y, B26K, desB27-desB30(서열번호 3 및 12)
xxii. A14E, B5Y, desB30(서열번호 3 및 13)
xxiii. A14E, B5Y, B26G, desB30(서열번호 3 및 14)
xxiv. A14E, B5Y, B26A, desB30(서열번호 3 및 15)
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 인슐린 유사체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병, 심혈관 질환, 죽상 경화증 및/또는 내피 기능 장애의 예방 또는 치료 및/또는 간 중성 지방의 예방 또는 간 중성 지방 함량의 감소 및/또는 체중 증가의 예방 또는 체중 감소에 사용하기 위한, 인슐린 유사체.
- 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 포도당 내성, 고혈당, 이상지질혈증, 비만, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상 경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 심혈관 질환, 관상동맥 질환, 뇌졸중, 염증성 대장 증후군, 소화불량, 저혈압 또는 위궤양의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 용도.
- 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 포도당 내성, 고혈당, 이상지질혈증, 비만, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애, 죽상 경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 심혈관 질환, 관상동맥 질환, 뇌졸중, 염증성 대장 증후군, 소화불량, 저혈압 또는 위궤양를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체 또는 제10항의 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 인슐린 화합물의 선택도를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
- 인간 인슐린에 비해 상기 인슐린 화합물에 의해 유도되는 최대 AKT 인산화를 측정하는 단계; 및
- 인간 인슐린에 비해 상기 인슐린 화합물에 의해 유도되는 최대 ERK 활성화를 측정하는 단계를 포함하되,
ERK/AKT 비율은 1 미만인, 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17186612.2 | 2017-08-17 | ||
| EP17186612 | 2017-08-17 | ||
| EP17204872.0 | 2017-12-01 | ||
| EP17204872 | 2017-12-01 | ||
| PCT/EP2018/072191 WO2019034726A1 (en) | 2017-08-17 | 2018-08-16 | NOVEL ACYLATED INSULIN ANALOGUES AND USES THEREOF |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200038502A true KR20200038502A (ko) | 2020-04-13 |
Family
ID=63165388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207006535A KR20200038502A (ko) | 2017-08-17 | 2018-08-16 | 신규한 아실화 인슐린 유사체 및 이의 용도 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10919949B2 (ko) |
| EP (1) | EP3668892A1 (ko) |
| JP (2) | JP2020531451A (ko) |
| KR (1) | KR20200038502A (ko) |
| CN (1) | CN111032685A (ko) |
| AU (1) | AU2018317810A1 (ko) |
| BR (1) | BR112020002364A2 (ko) |
| CA (1) | CA3071686A1 (ko) |
| CL (1) | CL2020000310A1 (ko) |
| CO (1) | CO2020002500A2 (ko) |
| IL (1) | IL272394A (ko) |
| MA (1) | MA49896A (ko) |
| MX (1) | MX2020001434A (ko) |
| PE (1) | PE20211264A1 (ko) |
| PH (1) | PH12020550050A1 (ko) |
| RU (1) | RU2020108281A (ko) |
| SG (1) | SG11202001077UA (ko) |
| TW (1) | TW201917134A (ko) |
| WO (1) | WO2019034726A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2371361T3 (es) | 2005-12-28 | 2011-12-30 | Novo Nordisk A/S | Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones. |
| CA3204051A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-28 | Brian Lian | Compositions and methods for the treatment of metabolic and liver disorders |
Family Cites Families (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4343898A (en) | 1980-02-11 | 1982-08-10 | Novo Industri A/S | Process for preparing esters of human insulin |
| DK58285D0 (da) | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| US5616729A (en) | 1986-07-17 | 1997-04-01 | Board Of Governors Of Wayne State University | Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers |
| DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| DK155690D0 (da) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
| DK10191D0 (da) | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte peptider |
| DK33591D0 (ko) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Novo Nordisk As | |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| ZA954983B (en) | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5693609A (en) | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
| US6451970B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
| JP4187796B2 (ja) | 1996-12-20 | 2008-11-26 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵母で発現されたｎ末端伸長タンパク質 |
| DK1146896T3 (da) | 1999-01-26 | 2002-09-02 | Lilly Co Eli | Formuleringer, som indeholder monodisperse hexamere acylerede insulin-analoger |
| AU5144400A (en) * | 1999-05-19 | 2000-12-05 | Xencor, Inc. | Novel proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes |
| WO2001049742A1 (en) | 1999-12-29 | 2001-07-12 | Novo Nordisk A/S | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogs |
| WO2005054291A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin |
| WO2006008238A1 (en) * | 2004-07-16 | 2006-01-26 | Novo Nordisk A/S | Method for selective acylation |
| ES2428510T3 (es) | 2005-02-02 | 2013-11-08 | Novo Nordisk A/S | Derivados de insulina |
| ATE482977T1 (de) * | 2006-02-27 | 2010-10-15 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
| CN101541830A (zh) | 2006-09-22 | 2009-09-23 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶抗性的胰岛素类似物 |
| WO2009022013A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
| WO2009112583A2 (en) | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Novo Nordisk A/S | Protease-stabilized insulin analogues |
| EP2910571B1 (en) | 2008-03-18 | 2016-10-05 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| JP2012512900A (ja) | 2008-12-19 | 2012-06-07 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション | インスリン受容体に対して高い活性を示すｙｌ系インスリン様増殖因子 |
| AU2009335715B2 (en) | 2008-12-19 | 2016-09-15 | Indiana University Research And Technology Corporation | Amide-based insulin prodrugs |
| WO2010080606A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-07-15 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin analogs |
| TW201105346A (en) | 2009-07-06 | 2011-02-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Heat-stable and vibration-stable insulin preparations |
| CA2802485C (en) | 2010-06-16 | 2019-09-17 | Indiana University Research And Technology Corporation | Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor |
| WO2011159882A2 (en) | 2010-06-16 | 2011-12-22 | Indiana University Research And Technology Corporation | Novel stabilized insulin agonists |
| US8815798B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues containing additional disulfide bonds |
| WO2011163460A1 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Indiana University Research And Technology Corporation | Yl-based insulin-like growth factors exhibiting high activity at the insulin receptor |
| CN103119057B (zh) | 2010-06-24 | 2016-06-15 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 基于酰胺的胰岛素前药 |
| EP2598527A4 (en) | 2010-07-28 | 2014-01-08 | Smartcells Inc | RECOMBINANT EXPRESSED INSULIN POLYPEPTIDES AND APPLICATIONS THEREOF |
| JP2013540771A (ja) | 2010-10-15 | 2013-11-07 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規ｎ末端修飾インスリン誘導体 |
| AR087433A1 (es) | 2011-08-08 | 2014-03-26 | Merck Sharp & Dohme | Analogos de insulina n-glicosilados |
| JP6392123B2 (ja) | 2011-12-20 | 2018-09-19 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 糖尿病治療のためのｃｔｐ系インスリンアナローグ |
| CN104364262A (zh) | 2011-12-21 | 2015-02-18 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | N末端修饰的胰岛素衍生物 |
| EP3395358B1 (en) | 2012-09-26 | 2019-11-06 | Indiana University Research and Technology Corporation | Insulin analog dimers |
| JP6735561B2 (ja) | 2012-12-03 | 2020-08-05 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． | Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体 |
| EP2931301B2 (en) | 2012-12-17 | 2021-09-15 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| US20160024169A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-28 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin-incretin conjugates |
| US20160193154A1 (en) | 2013-07-24 | 2016-07-07 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical Composition for Oral Insulin Administration Comprising a Tablet Core and an Anionic Copolymer Coating |
| AU2014329567B2 (en) | 2013-10-04 | 2019-07-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Glucose-responsive insulin conjugates |
| AR099569A1 (es) * | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
| JP6701208B2 (ja) | 2014-09-24 | 2020-05-27 | インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション | 脂質化アミド系インスリンプロドラッグ |
| WO2016049190A1 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Indiana University Research And Technology Corporation | Incretin-insulin conjugates |
| JP6484337B2 (ja) | 2014-11-21 | 2019-03-13 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． | インスリン受容体部分アゴニスト |
| EP3250225A1 (en) | 2015-01-29 | 2017-12-06 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition for oral insulin administration comprising a tablet core and a polyvinyl alcohol coating |
| EP3268384B1 (en) | 2015-03-10 | 2021-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
| EP3280450A4 (en) | 2015-04-08 | 2018-12-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Glucose-responsive insulin conjugates |
| WO2016172269A2 (en) | 2015-04-20 | 2016-10-27 | University Of Utah Research Foundation | Insulin analogs having shortened b chain peptides and associated methods |
| US20180244743A1 (en) * | 2015-08-25 | 2018-08-30 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
| US20190010206A1 (en) * | 2015-08-25 | 2019-01-10 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
| TW201717998A (zh) | 2015-08-25 | 2017-06-01 | 諾佛 儂迪克股份有限公司 | 新穎胰島素衍生物及其醫學用途 |
| US10745457B2 (en) | 2015-09-02 | 2020-08-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
-
2018
- 2018-08-16 MX MX2020001434A patent/MX2020001434A/es unknown
- 2018-08-16 CA CA3071686A patent/CA3071686A1/en not_active Withdrawn
- 2018-08-16 RU RU2020108281A patent/RU2020108281A/ru unknown
- 2018-08-16 MA MA049896A patent/MA49896A/fr unknown
- 2018-08-16 PE PE2020000179A patent/PE20211264A1/es unknown
- 2018-08-16 SG SG11202001077UA patent/SG11202001077UA/en unknown
- 2018-08-16 WO PCT/EP2018/072191 patent/WO2019034726A1/en active Application Filing
- 2018-08-16 CN CN201880052683.1A patent/CN111032685A/zh not_active Withdrawn
- 2018-08-16 JP JP2020508562A patent/JP2020531451A/ja not_active Withdrawn
- 2018-08-16 KR KR1020207006535A patent/KR20200038502A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-08-16 US US15/998,755 patent/US10919949B2/en active Active
- 2018-08-16 TW TW107128618A patent/TW201917134A/zh unknown
- 2018-08-16 AU AU2018317810A patent/AU2018317810A1/en not_active Withdrawn
- 2018-08-16 BR BR112020002364-7A patent/BR112020002364A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2018-08-16 EP EP18752779.1A patent/EP3668892A1/en not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-01-31 IL IL272394A patent/IL272394A/en unknown
- 2020-02-05 CL CL2020000310A patent/CL2020000310A1/es unknown
- 2020-02-07 PH PH12020550050A patent/PH12020550050A1/en unknown
- 2020-03-04 CO CONC2020/0002500A patent/CO2020002500A2/es unknown
- 2020-11-05 US US17/089,993 patent/US20210094999A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-04-25 JP JP2022071578A patent/JP2022105082A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3071686A1 (en) | 2019-02-21 |
| BR112020002364A2 (pt) | 2020-09-01 |
| TW201917134A (zh) | 2019-05-01 |
| US20190194285A1 (en) | 2019-06-27 |
| JP2020531451A (ja) | 2020-11-05 |
| PH12020550050A1 (en) | 2020-10-19 |
| MA49896A (fr) | 2020-06-24 |
| PE20211264A1 (es) | 2021-07-15 |
| CO2020002500A2 (es) | 2020-06-09 |
| CL2020000310A1 (es) | 2020-07-10 |
| WO2019034726A1 (en) | 2019-02-21 |
| RU2020108281A (ru) | 2021-08-26 |
| RU2020108281A3 (ko) | 2022-03-09 |
| CN111032685A (zh) | 2020-04-17 |
| US10919949B2 (en) | 2021-02-16 |
| SG11202001077UA (en) | 2020-03-30 |
| EP3668892A1 (en) | 2020-06-24 |
| US20210094999A1 (en) | 2021-04-01 |
| AU2018317810A1 (en) | 2020-03-19 |
| IL272394A (en) | 2020-03-31 |
| JP2022105082A (ja) | 2022-07-12 |
| MX2020001434A (es) | 2020-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11795204B2 (en) | Glucagon analogues | |
| CN103596972B (zh) | 多肽 | |
| JP7064103B2 (ja) | アミリン類似体 | |
| JP2019014734A (ja) | インスリン受容体部分アゴニスト | |
| US10766939B2 (en) | Amylin analogues | |
| JP6701075B2 (ja) | アミリン類似体 | |
| US20120295847A1 (en) | Acylated GLP-1 Compounds | |
| JP2022504153A (ja) | インスリンペプチドおよびｅｇｆ（ａ）ペプチドを含む二官能性化合物 | |
| JP2021177779A (ja) | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 | |
| KR102427426B1 (ko) | 신규한 인슐린 유사체 및 이의 용도 | |
| JP2022105082A (ja) | 新規のアシル化インスリン類似体およびそれらの使用 | |
| JP2018531901A (ja) | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 | |
| KR20230104118A (ko) | Glp-1 전구약물 및 이의 용도 | |
| JP2018531899A (ja) | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 | |
| EP2293811A1 (en) | Derivatised hybrid peptides of amylin and salmon calcitonin | |
| KR20240047956A (ko) | 단량체 융합 펩타이드 및 이의 사용 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| WITB | Written withdrawal of application |