CN104364262A - N末端修饰的胰岛素衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含额外的一个或多个二硫键的新型N末端修饰的胰岛素衍生物、包含其的药物组合物及其制备方法。

Description

N末端修饰的胰岛素衍生物
发明领域
本发明涉及包含一个或多个额外的二硫键的新型N末端修饰的胰岛素及其制备方法。
发明背景
糖尿病是代谢病，在这种病中，利用葡萄糖的能力部分或完全丧失。该病症可以例如通过施用胰岛素来治疗。
到目前为止，口服途径是最广泛使用的药物施用途径。然而，由于一些障碍如在胃肠(GI)道和肠粘膜中的酶促降解、药物流出泵、从肠粘膜吸收不足和变化、以及在肝中的首过代谢，胰岛素的施用常常局限于肠胃外途径，而不是优选的口服施用。
人胰岛素由两个多肽链组成，即A和B链，其分别包含21个和30个氨基酸残基。A和B链通过两个二硫键相互连接。多种蛋白酶的作用使人胰岛素在胃肠道的内腔中迅速降解，限制了其吸收进入循环。当与天然胰岛素相比，亲水的并且对蛋白水解性降解稳定的胰岛素类似物在动物模型中表现出更高的生物利用度。
将二硫键引入蛋白是改善蛋白稳定性一种天然方式。也有许多成功地将二硫键工程改造进蛋白并伴随稳定性增加的实例。至今，没有胰岛素中工程改造的二硫键的报道。
WO 2008/145721涉及某些肽，所述肽已经被N末端修饰以保护所述肽免于氨肽酶和二肽基肽酶的降解。WO 2010/033220描述了与聚合物和任选一个或多个具有最高达10个碳原子的部分偶联的肽缀合物。
治疗性肽的药物组合物需要具有数年的保存限期以适合于常规使用。然而，由于对化学和物理降解的敏感性，肽组合物本质上是不稳定的。
WO 08/145728、WO 2010/060667和WO 2011/086093公开了用于口服施用的脂质药物组合物的实例。
药物组合物经常含有浓度最高达200 ppm的醛和酮。醛和酮可以与胰岛素反应，因此引起组合物中胰岛素的大量的化学降解。作为结果，胰岛素组合物的保存限期可能低于3个月。药物开发需要至少2年的保存限期。
已知，出于稳定性目的，含水药物组合物可以包含化合物诸如乙二胺。例如，WO 2006/125763描述了包含乙二胺作为缓冲剂的含水药物多肽组合物。
然而，仍然寻求在不将乙二胺或其它稳定化合物加入组合物的情况下使药物组合物、特别是无水脂质组合物中的胰岛素稳定的方法。
发明概述
本发明涉及由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分具有不存在于人胰岛素中的至少一个二硫键。
在一个方面，本发明涉及由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分具有两个或更多个半胱氨酸取代，且保留了人胰岛素的三个二硫键。
在一个方面，本发明涉及包含两个或更多个半胱氨酸取代的N末端修饰的胰岛素，其中保留了人胰岛素的三个二硫键，其中以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，并且其中所述N末端修饰的胰岛素具有具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但不具有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。在一个方面，N末端修饰的胰岛素具有具有相同肽部分、存在于人胰岛素中的二硫键和相同白蛋白结合部分、但不具有N末端修饰基团的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素包含修饰基团，所述修饰基团为一个或两个有机取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量(MW)，且其缀合于亲本胰岛素(parent insulin)的N末端。
本发明还涉及包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物。
发明描述
本发明涉及新型N末端修饰的胰岛素，在本文中也命名为N末端保护的胰岛素，其中将一个或多个二硫键工程改造进胰岛素。本发明的新型N末端修饰的胰岛素特别适合用于在口服制剂中使用。因此，本发明的一方面也考虑了包含新型N末端修饰的胰岛素(其中将一个或多个二硫键工程改造进胰岛素)的口服药物组合物。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有两个或更多个半胱氨酸取代，并且保留了人胰岛素的三个二硫键。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有侧链。在一个方面，侧链连接于赖氨酸残基的ε氨基。在一个方面，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有两个或更多个半胱氨酸取代，保留的人胰岛素的三个二硫键以及连接于诸如B-链中的赖氨酸残基的ε氨基的侧链。
在本发明的一个方面，以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。
本发明人已经令人惊讶地发现，本发明的N末端修饰的胰岛素在包含醛和/或酮诸如微量醛和/或酮的药物组合物中是稳定的，同时当与亲本胰岛素即没有N末端修饰的类似胰岛素相比时，所述胰岛素保留生物和药理性质。
本发明人已经令人惊讶地发现，本发明的N末端修饰的胰岛素是物理稳定的并且不易于产生原纤化，同时当与亲本胰岛素即没有N末端修饰的类似胰岛素相比时，所述胰岛素保留生物和药理性质。
在本发明的一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素用于含水制剂中，以用于皮下注射胰岛素治疗。
在本发明的一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素可用作超长效胰岛素，其或者在含水制剂中以注射治疗或以口服治疗。
在一个方面，除了赋予对醛和/或酮的化学稳定性之外，本发明的N末端修饰的胰岛素的N末端修饰可以改变胰岛素受体亲和力。例如，如下文所述，在生理pH下使N末端中性或带负电荷的N末端修饰可以为胰岛素受体赋予更低亲和力。
本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，诸如本发明的酰化的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其具有令人满意的生物利用度。与以相似剂量给予的没有N末端修饰的相似胰岛素(亲本胰岛素)的生物利用度相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的生物利用度是相似的。在一个方面，生物利用度比以相似剂量给予的具有额外的一个或多个二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素的生物利用度高至少10％，在一个方面生物利用度高至少20％，在一个方面生物利用度高至少25％，在一个方面生物利用度高至少30％，在一个方面生物利用度高至少35％，在一个方面生物利用度高至少40％，在一个方面生物利用度高至少45％，在一个方面生物利用度高至少50％，在一个方面生物利用度高至少55％，在一个方面生物利用度高至少60％，在一个方面生物利用度高至少65％，在一个方面生物利用度高至少70％，在一个方面生物利用度高至少80％，在一个方面生物利用度高至少90％，在一个方面生物利用度高至少100％，在一个方面生物利用度比亲本胰岛素的高多于100％。
当本文中使用时，术语“亲本胰岛素”应当是指没有N末端修饰的类似胰岛素。例如，如果N末端修饰的胰岛素是酰化的N末端修饰的胰岛素，那么亲本胰岛素是具有相同肽部分和相同白蛋白结合部分、但没有N末端修饰的酰化胰岛素，或者例如，如果N末端修饰的胰岛素是酰化的蛋白酶稳定的N末端修饰的胰岛素，那么亲本胰岛素是具有相同肽部分和相同白蛋白结合部分、但没有N末端修饰的酰化的蛋白酶稳定的胰岛素。
在一个方面，生物利用度比以相似剂量给予的没有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的相似酰化且N末端修饰的胰岛素的生物利用度高至少10％，在一个方面生物利用度高至少20%，在一个方面生物利用度高至少25%，在一个方面生物利用度高至少30%，在一个方面生物利用度高至少35%，在一个方面生物利用度高至少40%，在一个方面生物利用度高至少45%，在一个方面生物利用度高至少50%，在一个方面生物利用度高至少55%，在一个方面生物利用度高至少60%，在一个方面生物利用度高至少65%，在一个方面生物利用度高至少70%，在一个方面生物利用度高至少80%，在一个方面生物利用度高至少90%，在一个方面生物利用度高至少100%，在一个方面，生物利用度比没有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的相似酰化且N末端修饰的胰岛素的生物利用度高多于100％。
本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其相对于作为静脉内(i.v.)施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修饰的胰岛素为静脉内施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度(相对于静脉内施用)是至少0.3％，在一个方面是至少0.5％，在一个方面是至少1％，在一个方面是至少1.5％，在一个方面是至少2％，在一个方面是至少2.5％，在一个方面是至少3％，在一个方面是至少3.5％，在一个方面是至少4％，在一个方面是至少5％，在一个方面是至少6％，在一个方面是至少7％，在一个方面是至少8％，在一个方面是至少9％，在一个方面是至少10％。
本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当口服施用时，其相对于当作为s.c.(皮下)施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修饰的胰岛素为皮下施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度(相对于皮下施用)是至少0.3％，在一个方面是至少0.5％，在一个方面是至少1％，在一个方面是至少1.5％，在一个方面是至少2％，在一个方面是至少2.5％，在一个方面是至少3％，在一个方面是至少3.5％，在一个方面是至少4％，在一个方面是至少5％，在一个方面是至少6％，在一个方面是至少7％，在一个方面是至少8％，在一个方面是至少9％，在一个方面是至少10％。
本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，当皮下施用时，其相对于当作为静脉内施用而施用时具有令人满意的生物利用度。相对于当N末端修饰的胰岛素为静脉内施用时的生物利用度，本发明的优选化合物的生物利用度(相对于静脉内施用)是至少10%，在一个方面是至少15%，在一个方面是至少20%，在一个方面是至少25%，在一个方面是至少30%，在一个方面是至少35%，在一个方面是至少40%，在一个方面是至少45%，在一个方面是至少50%，在一个方面是至少55%，在一个方面是至少60%，在一个方面是至少70％，在一个方面是至少80％，在一个方面是至少90％。
用于测量胰岛素生物利用度的标准试验对于本领域中技术人员是已知的，并且尤其包括测量相同物种中口服和静脉内(i.v.)施用的、讨论中的胰岛素的浓度的曲线下的相对面积(AUC)。血液(血浆)样品中胰岛素浓度的定量可以使用例如抗体测定(ELISA)或通过质谱来完成。
本发明的进一步方面涉及提供具有令人满意的效力的本发明的N末端修饰的胰岛素。与人胰岛素的效力相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的效力可以是人胰岛素的效力的至少5％，在一个方面是至少10％，在一个方面是至少20％，在一个方面是至少30％，在一个方面是至少40％，在一个方面是至少50％，在一个方面是至少75％，和在一个方面是至少100％。
表观体内效力可以通过比较讨论的胰岛素与以相似剂量给予的比较胰岛素的血糖对时间曲线来测量。测量体内效力的其它方法在在实施例中给出。
用于测量胰岛素体外效力的标准试验是本领域技术人员已知的，尤其包括下面的试验：(1) 胰岛素放射受体试验，其中将胰岛素的相对效力定义为替代特异性结合于例如细胞膜，例如大鼠肝质膜部分上存在的胰岛素受体的50％的125I-胰岛素所需的胰岛素和胰岛素类似物/衍生物的比例；(2) 脂肪生成试验，例如用大鼠脂肪细胞进行，其中将相对的胰岛素效力定义为实现[3-3H]葡萄糖向有机可提取的材料(即脂质)的最大转化的50％所需的胰岛素和胰岛素类似物/衍生物的比例；(3) 在分离的脂肪细胞中的葡萄糖氧化试验，其中将胰岛素类似物/衍生物的相对效力定义为实现葡萄糖-1-[14C]向[14CO2]的最大转化的50％的胰岛素和胰岛素类似物/衍生物的比例；(4) 胰岛素放射免疫测定法，其可以通过测量胰岛素或胰岛素类似物/衍生物与125I-胰岛素竞争结合至特异性抗胰岛素抗体的效果而测定胰岛素类似物/衍生物的免疫原性；以及(5) 其它试验，其测量胰岛素或胰岛素类似物或衍生物与抗体在动物血浆样品中的结合，诸如具有特异性胰岛素抗体的ELISA试验。
本发明的N末端修饰的胰岛素可以具有延长的时间作用特征，即在高血糖例如糖尿病患者中提供比人胰岛素持续更长的胰岛素作用。换言之，与人胰岛素相比，具有延长的时间作用特征的胰岛素具有延长的葡萄糖水平的降低。在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素在单次施用胰岛素分子后提供持续约8小时至约2周的胰岛素作用。在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约2周。在一个方面，所述作用持续约24小时至约1周。在进一步的方面，所述作用持续约1周至约2周。在又进一步方面，所述作用持续约1周。在又进一步方面，所述作用持续约2周。在一个方面，所述作用持续约1天至约7天。在一个方面，所述作用持续约1天至约3天。在一个方面，所述作用持续约1天至约2天。在一个方面，所述作用持续约2天至约3天。在进一步方面，所述作用持续约7天至约14天。在又进一步方面，所述作用持续约7天。在又进一步方面，所述作用持续约14天。在一个方面，所述作用持续约2天至约7天。在一个方面，所述作用持续约3天至约7天。在又进一步方面，所述作用持续约3天。在又进一步方面，所述作用持续约4天。在又进一步方面，所述作用持续约5天。在又进一步方面，所述作用持续约6天。在又进一步方面，所述作用持续约7天。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素在单次施用胰岛素分子后提供持续约8小时至约24小时的胰岛素作用。在一个方面，胰岛素作用持续约10小时至约24小时。在一个方面，所述作用持续约12小时至约24小时。在进一步方面，所述作用持续约16小时至约24小时。在又进一步方面，所述作用持续约20小时至约24小时。在又进一步方面，所述作用持续约24小时。
在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约96小时。在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约48小时。在一个方面，胰岛素作用持续约24小时至约36小时。在一个方面，胰岛素作用持续约1小时至约96小时。在一个方面，胰岛素作用持续约1小时至约48小时。在一个方面，胰岛素作用持续约1小时至约36小时。
作用持续时间(时间-作用曲线)可以通过抑制血糖的时间，或通过测量相关药代动力学特性，例如t½或MRT (平均停留时间)来测量。
本发明的进一步方面涉及提供本发明的N末端修饰的胰岛素，其在口服施用后相对于人胰岛素具有令人满意的延长作用。与人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的作用持续时间长至少10%。与人胰岛素的持续时间相比，在一个方面，所述持续时间长至少20%，在一个方面长至少25%，在一个方面长至少30%，在一个方面长至少35%，在一个方面长至少40%，在一个方面长至少45%，在一个方面长至少50%，在一个方面长至少55%，在一个方面长至少60%，在一个方面长至少65%，在一个方面长至少70%，在一个方面长至少80%，在一个方面长至少90%，在一个方面长至少100%，在一个方面长多于100%。
在一个方面，与每日一次的胰岛素诸如LysB29(Nε -十四烷酰基)desB30人胰岛素或A21Gly, B31Arg, B32Arg人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的作用持续时间长至少10%。与每日一次胰岛素诸如LysB29(Nε -十四烷酰基)desB30人胰岛素或A21Gly, B31Arg, B32Arg人胰岛素的相比，在一个方面，所述持续时间长至少20%，在一个方面长至少25%，在一个方面长至少30%，在一个方面长至少35%，在一个方面长至少40%，在一个方面长至少45%，在一个方面长至少50%，在一个方面长至少55%，在一个方面长至少60%，在一个方面长至少65%，在一个方面长至少70%，在一个方面长至少80%，在一个方面长至少90%，在一个方面长至少100%，在一个方面长多于100%。
在一个方面，与每日一次胰岛素诸如LysB29(Nε-十四烷酰基)desB30人胰岛素或A21Gly, B31Arg, B32Arg人胰岛素相比，本发明的优选的N末端修饰的胰岛素的作用持续时间长至少100%。与每日一次胰岛素诸如LysB29(Nε-十四烷酰基)desB30人胰岛素或A21Gly, B31Arg, B32Arg人胰岛素相比，在一个方面，所述持续时间长至少200%，在一个方面长至少250%，在一个方面长至少300%，在一个方面长至少350%，在一个方面长至少400%，在一个方面长至少450%，在一个方面长至少500%，在一个方面长至少550%，在一个方面长至少600%，在一个方面长至少650%，在一个方面长至少700%，在一个方面长至少800%，在一个方面长至少900%，在一个方面长至少1000%，在一个方面长多于1000%。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解，即针对胃肠(GI)道中或身体其它部位的快速降解，是稳定的。在一个方面，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解是稳定的。在一个方面，相对于以相似剂量给予的具有一个或多个额外二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素针对蛋白水解性降解是稳定的。
针对蛋白水解性降解稳定的N末端修饰的胰岛素在本文被理解为本发明的N末端修饰的胰岛素，相对于人胰岛素，其经受由一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在一个实施方案中，相对于人胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素经受由一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在本发明的进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对由一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：胃蛋白酶(诸如例如，同种型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶(诸如例如，同种型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶(IDE)，弹性蛋白酶(诸如例如，同种型胰腺弹性蛋白酶I和/或II)，羧肽酶(例如，同种型羧肽酶A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，组织蛋白酶D及源自大鼠、猪或人的肠提取物中存在的其它酶。
在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶(IDE)，弹性蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶和组织蛋白酶D。在进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和羧肽酶。
“蛋白酶(protease)”或“蛋白酶(protease enzyme)”是消化酶，其可以使蛋白和肽降解，并且可以在人体的各种组织中发现它，诸如例如胃(胃蛋白酶)，肠腔(糜蛋白酶，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，羧肽酶等)或胃肠道的粘膜表面(氨肽酶，羧肽酶，肠肽酶，二肽基肽酶，内肽酶等)，肝(胰岛素降解酶，组织蛋白酶D等)，和其它组织中。
可以测定T½作为本发明的N末端修饰的胰岛素对蛋白酶诸如糜蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A或者对酶的混合物诸如组织提取液(来自肝，肾，十二指肠，空肠，回肠，结肠，胃等)的蛋白水解稳定性的量度。在本发明的一个实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加。在进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加至少2倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加至少2倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加至少3倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加至少3倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加至少4倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加至少4倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加至少5倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加至少5倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T½增加至少10倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，T½增加至少10倍。
术语“稳定性”在本文中用于包含N末端修饰的胰岛素的药物组合物来描述组合物的保存期限。当是指本发明的N末端修饰的胰岛素时，术语“稳定化的”或“稳定的”因此是指相对于包含没有N末端修饰的胰岛素的组合物或相对于没有一个或多个额外二硫键的胰岛素具有增加化学稳定性、增加物理稳定性或增加物理和化学稳定性的组合物。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学稳定性。在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的物理稳定性。在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和物理稳定性。
在一个方面，相对于人胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和/或物理稳定性。在一个方面，相对于没有一个或多个额外的二硫键的N末端修饰的胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和/或物理稳定性。在一个方面，相对于具有一个或多个额外二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的化学和/或物理稳定性。
本文所用的术语“物理稳定性”是指，胰岛素暴露于热-机械应激和/或与使之不稳定的界面和表面诸如疏水表面和界面的相互作用导致的N末端修饰的胰岛素形成胰岛素的无生物活性的和/或不溶性的聚集体的趋势。因此，物理不稳定性涉及相对于人胰岛素的构象变化，其包括更有序结构的损失、聚集、原纤化(fibrillation)、沉淀和/或吸附至表面。已知肽诸如胰岛素倾向于例如原纤化导致的不稳定。通过在不同温度不同时间期间将填充合适的容器(例如，盒或小瓶)的溶液暴露于机械/物理应激(例如搅动)之后例如目视检查、比浊法和/或浊度测定法的常规方法，可以评价包含N末端修饰的胰岛素的溶液的物理稳定性。在具有黑背景的尖锐聚焦光中进行溶液的目视检查。通过例如在从0到3的等级(显示无浊度的溶液对应于目测评分0，且日光下显示可见浊度的溶液对应于目测评分3)排序浊度的程度的目测评分而表征溶液的浊度。当溶液在日光下显示可见浊度时，对于蛋白聚集，溶液被分类为物理不稳定的。或者，可以通过本领域技术人员公知的简单的浊度测定评价溶液的浊度。也可以通过使用N末端修饰的胰岛素的构象状态的光谱试剂或探针评价本发明的N末端修饰的胰岛素的物理稳定性。探针优选与蛋白的非天然构象体优先结合的小分子。蛋白结构的小分子光谱探针的一个实例是硫磺素T。硫磺素T是已经广泛用于淀粉样原纤维的检测的荧光染料。在原纤维和还可能其它蛋白构型存在的情况下，当结合于原纤维蛋白形式时，硫磺素T产生在约450 nm的新的最大激发和在约482 nm的增强的发射。未结合的硫磺素T在该波长基本上无荧光。例如如实施例109中所述可以测定本发明的N末端修饰的胰岛素的物理稳定性。
可以使用其它小分子作为蛋白结构从天然至非天然状态的变化的探针。例如，优先结合于蛋白的暴露的疏水斑块(patch)的“疏水性斑块”探针。疏水性斑块通常埋在天然状态的蛋白的三级结构内，但当蛋白开始解折叠或变性时变得暴露。这些小分子的光谱探针的实例是芳族的疏水性染料，诸如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光谱探针是金属-氨基酸复合物，诸如疏水性氨基酸诸如苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸和缬氨酸等的钴金属复合物。
本文所用的N末端修饰的胰岛素的术语“化学稳定性”是指导致化学降解产物的形成的蛋白结构中的化学共价变化，与天然蛋白结构相比，该化学降解产物具有潜在的更低的生物学效力和/或潜在的增加的免疫原性特性。根据天然蛋白的类型和性质和蛋白暴露的环境，可以形成各种化学降解产物。化学降解的消除最可能不能完全避免，在本领域技术人员公知的药物组合物的储存和使用期间经常看到逐渐增加量的化学降解产物。大多数蛋白倾向于脱酰胺化，在该过程中谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基被水解形成游离的羧酸。其它降解途径涉及形成高分子量转化产物，其中两个或更多的蛋白分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此共价结合，导致形成共价结合的二聚体，寡聚体和多聚体降解产物(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。氧化可以作为化学降解的另一种变体被提及。可以通过在暴露于不同的环境条件之后在各个时间点测定化学降解产物的量评价N末端修饰的胰岛素的化学稳定性(例如经常可以通过升高温度来加速降解产物的形成)。经常通过根据分子大小、亲水性、疏水性和/或电荷使用各种层析技术(例如，SEC-HPLC 和/或 RP-HPLC)分离降解产物来测定各个降解产物各自的量。
在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素具有很少或没有聚集的趋势。当在硫磺素测定中试验时，相对于没有一个或多个额外的二硫键的人胰岛素和/或N末端修饰的胰岛素的聚集趋势，聚集趋势优选显著改善。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的热力学稳定性，诸如例如，折叠稳定性，构象的稳定性和/或更高的熔解温度。
当本文使用时，如果与没有一个或多个额外的二硫键的人胰岛素或N末端修饰的胰岛素相比，所述衍生物的变性需要更高的应激水平诸如更高的温度和/或更高浓度的变性剂，那么N末端修饰的胰岛素被称为具有改善的“热力学稳定性”。
可以通过诸如例如Hudson和Andersen, Peptide Science, vol 76 (4), pp. 298-308 (2004)中所述圆二色光谱和NMR评价构象的稳定性。熔解温度被理解为胰岛素结构可逆或不可逆地变化的温度。更高的熔解温度对应更稳定的结构。可以，例如，通过圆二色光谱和/或NMR将构象稳定性评价为温度的函数，或通过差示扫描量热法而测定熔解温度。也可以在逐渐增加浓度的变性剂诸如例如盐酸胍存在的情况下通过CD光谱和或NMR测定热力学稳定性。可以从这种实验测定以前所述(Kaarsholm, N.C., 等人，1993, Biochemistry, 32, 10773-8)的解折叠的自由能。蛋白变性后，远UV范围(240-218-nm)内的负CD逐渐减小，与伴随蛋白解折叠的有序的二级结构的损失一致(Holladay等人, 1977, Biochim. Biophys.Acta, 494, 245-254; Melberg和Johnson, 1990, Biochim. Biophys.Acta, 494, 245-254)。在近UV范围(330-250-nm)内的胰岛素CD谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境(Morris等人, 1968, Biochim.Biophys. Acta., 160, 145-155; Wood等人, 1975, Biochim. Biophys. Acta, 160, 145-155; Strickland & Mercola, 1976, Biochemistry, 15, 3875-3884)。从这些研究以前计算的胰岛素的解折叠的自由能为4.5 kcal/mol (Kaarsholm, N.C., 等人，1993, Biochemistry, 32, 10773-8)。
在近UV范围(330-250-nm)内的胰岛素CD谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境。由于酪氨酸残基是胰岛素二聚体表面的部分，在该区域(尤是在276 nm)的摩尔椭圆率(molar elipticity)的变化反映在胰岛素的结合状态上。测量胰岛素的结合状态的另一种方式是通过在本领域已知并且在实施例中描述的非解离条件下应用大小排阻层析法。
可以选择N末端修饰的胰岛素的N末端修饰基团的电荷，使得与亲本胰岛素的胰岛素受体亲和力相比，N末端修饰的胰岛素已经保留或改变对于胰岛素受体(IR)的亲和力。
例如，与没有N末端修饰的亲本胰岛素相比，在生理pH下(即pH7.4)为中性或带负电荷的N末端修饰基团可以导致降低的IR亲和力。作为另一个实例，与没有N末端修饰的亲本胰岛素相比，在生理pH下带正电荷的N末端修饰基团可以导致保留的或仅仅稍微降低的IR亲和力。
根据本发明的一个方面，用于本发明的N末端修饰基团在生理pH下可以是中性或带正电荷或带负电荷的。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成。
当将术语“在生理pH下带正电荷”使用为关于如本文中所述的N末端修饰基团时，是指在包含N末端修饰多肽的溶液中，至少10％的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。在一个方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少30％的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。在进一步方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少50％的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少70％的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽的溶液中至少90％的N末端修饰基团在生理pH下具有+1的电荷。
在生理pH下带正电的N末端修饰基团的实例包括但不限于：N,N-二-C1-4烷基诸如N,N-二甲基和N,N-二乙基、N-脒基(amidinyl)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酰基、3-(1-哌啶基)丙酰基、3 - (N,N-二甲基氨基)丙酰基和
N,N-二甲基-甘氨酰基：
化学式I。
当本文中使用时，当将术语“在生理pH下中性”使用为关于如本文中所述的N末端修饰基团时，是指在包含N末端修饰的胰岛素的溶液中，至少10％的N末端修饰基团在生理pH下具有中性电荷(即电荷为0)。在一个方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少30％的N末端修饰基团在生理pH下具有中性电荷。在进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少50％的N末端修饰基团在生理pH下具有中性电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少70％的N末端修饰基团在生理pH下具有中性电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少90％的N末端修饰基团在生理pH下具有中性电荷。
在生理pH下中性的N末端修饰基团的实例包括但不限于：氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基和C1-4链酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基和
焦谷氨酰基：
化学式II。
当本文中使用时，当将术语“在生理pH下带负电荷”使用为关于如本文中所述的N末端修饰基团时，是指在包含N末端修饰的胰岛素溶液中，至少10％的N末端修饰基团在生理pH下具有-1(即负1)的电荷。在一个方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少30％的N末端修饰基团在生理pH下具有-1的电荷。在进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少50％的N末端修饰基团在生理pH下具有-1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少70％的N末端修饰基团在生理pH下具有-1的电荷。在又进一步方面，在N末端修饰的多肽溶液中至少90％的N末端修饰基团在生理pH下具有-1的电荷。
在生理pH下带负电荷的N末端修饰基团的实例包括但不限于：草酰基、戊二酰基、二羟乙酰基(diglycolyl)(其它名称：3-氧代戊二酰基和羧基甲氧基乙酰基)。
在一个方面，本发明的在生理pH下带负电荷的N末端修饰基团不是丙二酰基或丁二酰基。在一个方面，本发明的在生理pH下带负电荷的N末端修饰基团不是丙二酰基。在一个方面，本发明的在生理pH下带负电荷的N末端修饰基团不是丁二酰基。
在本发明的一个方面，获得了N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰具有一个或多个带正电荷的N末端修饰基团。
在本发明的一个方面，获得了N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰具有一个或多个带负电荷的N末端修饰基团。
在本发明的一个方面，获得了N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰具有一个或多个中性的N末端修饰基团。
在一个方面，获得本发明的N末端修饰的胰岛素，其中肽部分在除了胰岛素的N末端之一以外的位置为白蛋白结合部分取代。在一个方面，白蛋白结合部分由任选通过接头与所述胰岛素连接的脂肪酸或二脂肪酸(difatty acid)组成。接头可以是脂肪酸或脂肪二元酸(fatty diacid)和与胰岛素的连接点之间的任何合适部分，其部分也可以被称为接头部分、间隔区等。
在一个方面，接头存在并包含一个或多个选自如下的实体(entity)：Gly、D-Ala、L-Ala、D-αGlu、L-αGlu、D-γGlu、L-γGlu、D-αAsp、L-αAsp、D-βAsp、L-βAsp、βAla、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、D-Glu-α-酰胺、L-Glu-α-酰胺、D-Glu-γ-酰胺、L-Glu-γ-酰胺、D-Asp-α-酰胺、L-Asp-α-酰胺、D-Asp-β-酰胺、L-Asp-β-酰胺，或：
化学式III
已经由其除去氢原子和/或羟基，其中q为0、1、2、3或4并且，在此实施方案中，可以可选择地是7-氨基庚酸或8-氨基辛酸，并且其中箭头表示与蛋白酶稳定的胰岛素的氨基的连接点，或者如果存在更多接头，表示朝向蛋白酶稳定的胰岛素的氨基的连接点。
在一个方面，接头存在并包含γ-Glu (γGlu)实体、一个或多个OEG实体或其组合。
本文中，术语“脂肪酸”包括直链或支链脂族羧酸，其具有至少14个碳原子并且是饱和或不饱和的。脂肪酸的非限制性实例为肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。
本文中，术语“脂肪二元酸(fatty diacid)”包括直链或支链脂族二羧酸，其具有至少14个碳原子并且是饱和或不饱和的。脂肪二元酸的非限制性实例为十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本发明还考虑了如本文所述包含N末端修饰的胰岛素的口服药物组合物。在一个方面，口服药物组合物是包含一种或多种脂质和本发明的N末端修饰的胰岛素的组合物。
当用于脂质药物制剂中时，本发明的N末端修饰的胰岛素令人惊讶地是化学稳定的。在一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的脂质药物制剂对于使用至少2周和储存1年是化学稳定的。在一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的脂质药物制剂对于使用至少4周和储存1年是化学稳定的。在一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的脂质药物制剂对于使用至少4周和储存2年是化学稳定的。在一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的脂质药物制剂对于使用至少6周和储存2年是化学稳定的。
本领域技术人员已知的是，用于稳定含水药物制剂中的胰岛素的常用方法是将锌加入药物制剂，从而形成与锌的胰岛素六聚体。在本发明的一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素且不含锌或仅含痕量锌的药物脂质组合物与包含N末端修饰的胰岛素和锌的含水药物制剂是类似地化学稳定的。
已经令人惊讶地发现，包含N末端修饰的胰岛素、一种或多种脂质和任选一种或多种表面活性剂的无水液体胰岛素药物组合物是化学稳定的。在一个方面，本发明的药物组合物包含N末端修饰的胰岛素、一种或多种脂质、一种或多种表面活性剂和助溶剂。在本发明的一个方面，助溶剂是丙二醇。
在本发明的一个方面，所述N末端修饰的胰岛素以在组合物中成分总量的0.1-30%(w/w)的浓度存在于药物组合物中。在另一个方面，所述N末端修饰的胰岛素以0.5-20%(w/w)的浓度存在。在另一个方面，所述N末端修饰的胰岛素以1-10 %(w/w)的浓度存在。
在本发明的一个方面，N末端修饰的胰岛素以0.2 mM-100 mM的浓度存在于药物组合物中。在另一个方面，N末端修饰的胰岛素以0.5-70 mM的浓度存在。在另一个方面，N末端修饰的胰岛素以0.5-35 mM的浓度存在。在另一个方面，N末端修饰的胰岛素以1-30 mM的浓度存在。
术语“脂质”在本文中用于和与水相比更易与油混合的物质、材料或成分。脂质在水中是不溶的或几乎不溶的，但是在油或其它非极性溶剂中是易溶的。
脂质，用于包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物，可以包含一种或更多种亲脂性物质，即与油而非与水形成均质混合物的物质。多种脂质可以构成无水液体药物组合物的亲脂相并且形成油方面。在室温下，脂质可以是固体、半固体或液体。例如，固体脂质可以作为糊剂、粒剂形式、粉剂或薄片存在。如果多于一种赋形剂包含脂质，则脂质可以是液体、固体或两者的混合物。
固体脂质，即，在室温下是固体或半固体的脂质的实例包括，但不限于，以下：
1.甘油单酯、二酯和三酯的混合物，诸如氢化椰子-甘油酯(熔点(m.p.)约33.5℃到约37℃)，作为WITEPSOL HI5可从Sasol Germany (Witten, Germany)商购；脂肪酸甘油三酯的实例，例如，C10-C22脂肪酸甘油三酯包括天然的和氢化的油，诸如植物油；
2.酯，诸如硬脂酸丙二醇(PG)酯，作为MONOSTEOL(m.p.约33℃到约36℃)可从Gattefosse Corp. (Paramus, NJ)商购；棕榈酸硬脂酸二甘醇酯(diethylene glycol palmito stearate)，可作为HYDRINE (m.p.约44.5℃到约48.5℃)从Gattefosse Corp.商购；
3.多糖基化饱和的甘油酯，诸如氢化棕榈油/棕榈坚果油PEG-6酯(m.p.约30.5℃到约38℃)，可作为LABRAFIL M2130 CS从Gattefosse Corp. 或 Gelucire 33/01商购；
4.脂肪醇，诸如肉豆蔻醇(m.p.约39℃)，可作为LANETTE 14从Cognis Corp. (Cincinnati, OH)商购；脂肪酸和脂肪醇的酯，例如，棕榈酸鲸蜡酯(m.p.约50℃)；单月桂酸异山梨酯，例如，可以商品名ARLAMOL ISML从Uniqema (New Castle, Delaware)商购，例如具有约43℃的熔点；
5. PEG-脂肪醇醚，包括聚氧乙烯(2)鲸蜡基醚，例如可作为BRlJ 52从Uniqema商购，具有约33℃的熔点，或者聚氧乙烯(2)硬脂基醚，例如可作为BRIJ 72从Uniqema商购，具有约43℃的熔点；
6.脱水山梨糖醇酯，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单棕榈酸酯或脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，例如，作为SPAN 40或SPAN 60从Uniqema商购，分别具有约43℃至48℃或约53℃至57℃、以及41℃至54℃的熔点；以及
7.单-C6-C14-脂肪酸甘油酯。这些物质通过甘油和植物油酯化，随后分子蒸馏来获得。甘油单酯包括但不限于对称的(即，β-甘油单酯)以及不对称的甘油单酯(α-甘油单酯)。它们还包括均一的甘油酯(其中脂肪酸成分主要由单一的脂肪酸构成)，以及混合的甘油酯(即，其中脂肪酸成分由多种脂肪酸构成)。脂肪酸成分可以包括饱和和不饱和脂肪酸，具有例如C8-C14的链长度。特别适合的是甘油单月桂酸酯，例如可作为IMWITOR 312从Sasol North America(Houston, TX)商购，(m.p.约56℃-60℃)；甘油单二椰油酸酯(glyceryl mono dicocoate)，可作为IMWITOR 928从Sasol商购(m.p.约33℃-37℃)；甘油单柠檬酸酯，可作为IMWITOR 370商购，(m.p.约59℃至约63℃)；或甘油单硬脂酸酯，例如，可作为IMWITOR 900从Sasol商购(m.p.约56℃-61℃)；或自乳化的甘油单硬脂酸酯，例如，可作为IMWITOR 960从Sasol商购(m.p.约56℃-61℃)。
液体和半固体脂质，即，在室温下是液体或半固体的脂质的实例包括，但不限于，以下：
1.甘油单酯、二酯和三酯的混合物，诸如中链的甘油单酯和甘油二酯，甘油辛酸酯/癸酸酯，可作为CAPMUL MCM从Abitec Corp. (Columbus, OH)商购；和甘油单辛酸酯(作为RYLO MG08 Pharma商购)和甘油单癸酸酯(作为RYLO MG10 Pharma从DANISCO商购)；
2. 甘油单-或二脂肪酸酯，例如C6-C18，例如C6-C16，例如C8-C10，例如C8脂肪酸，或其乙酰化的衍生物，例如来自Eastman Chemicals(Kingsport, TN)的MYVACET 9-45或9-08，或来自Sasol的IMWITOR 308或312；
3.丙二醇单-或二-脂肪酸酯，例如C8-C20，例如C8-C12，脂肪酸，例如来自Abitec Corp.或Gattefosse的LAUROGLYCOL 90、SEFSOL 218或CAPRYOL 90或CAPMUL PG-8(与丙二醇辛酸酯相同)；
4. 油，诸如红花油、芝麻油、杏仁油、花生油、棕榈油、麦胚芽油、玉米油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、大豆油、橄榄油和矿物油；
5. 脂肪酸或醇，例如C8-C20饱和的或单-或二-不饱和的，例如油酸、油醇、亚油酸、癸酸、辛酸、己酸、十四烷醇、十二烷醇、癸醇；
6. 中链脂肪酸甘油三酯，例如，C8-C12，例如MIGLYOL 812，或长链脂肪酸甘油三酯，例如植物油；
7. 酯交换的乙氧基化的植物油，例如可作为LABRAFIL M2125 CS从Gattefosse Corp商购；
8.脂肪酸和伯醇的酯化的化合物，例如C8-C20脂肪酸和C2-C3醇，例如亚油酸乙酯，例如可作为NIKKOL VF-E从Nikko Chemicals(Tokyo, Japan)商购，丁酸乙酯，辛酸乙酯油酸(ethyl caprylate oleic acid)，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯和辛酸乙酯；
9. 精油，或任何类型的挥发油，其给予植物它们的特征性气味，诸如留兰香油、丁香油、柠檬油和薄荷油；
10. 精油的部分或组分，诸如薄荷醇、香芹酚和百里香酚；
11. 合成油，诸如三乙酸甘油酯，三丁酸甘油酯；
12. 柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三丁酯；
13.聚甘油脂肪酸酯，例如二甘油单油酸酯，例如来自Nikko Chemicals的DGMO-C、DGMO-90、DGDO；以及
14. 脱水山梨糖醇酯，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯，例如可作为SPAN20从Uniqema商购；
15.磷脂，例如烷基-O-磷脂、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、二酰基磷脂酰甘油、二-O-烷基磷脂酸、L-α-溶血磷脂酰胆碱(LPC)、L-α-溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、L-α-溶血磷脂酰甘油(LPG)、L-α-溶血磷脂酰肌醇(LPI)、L-α-磷脂酸(PA)、L-α-磷脂酰胆碱(PC)、L-α-磷脂酰乙醇胺(PE)、L-α-磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)、L-α-磷脂酰肌醇(PI)、L-α-磷脂酰丝氨酸(PS)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰甘油、可从LARODAN商购的半合成甘油磷酰胆碱或可从Lipoid GmbH商购的大豆磷脂(Lipoid S100)；
16. 聚甘油脂肪酸酯，诸如聚甘油油酸酯(来自Gattefosse的Plurol Oleique)。
在本发明的一个方面，脂质是选自甘油单酯、二酯和三酯的一种或多种。在进一步方面，脂质是选自甘油单酯和二酯的一种或更多种。在又进一步方面，脂质是Capmul MCM或Capmul PG-8。在更进一步方面，脂质是Capmul PG-8。在进一步的方面，脂质是甘油单辛酸酯(来自Danisco的Rylo MG08 Pharma)。
在一个方面，用于包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物的脂质选自：甘油单辛酸酯(诸如例如Rylo MG08 Pharma)和甘油单癸酸酯(诸如例如来自Danisco的Rylo MG10 Pharma)。在另一个方面，脂质选自：丙二醇辛酸酯(诸如例如来自Abitec的Capmul PG8或来自Gattefosse的Capryol PGMC或Capryol 90)。
在本发明的一个方面，脂质存在于药物组合物中，其浓度为在组合物中包含胰岛素的成分总量的10%-90% (w/w)。在另一个方面，脂质以10-80 %(w/w)的浓度存在。在另一个方面，脂质以10-60 %(w/w)的浓度存在。在另一个方面，脂质以15-50 %(w/w)的浓度存在。在另一个方面，脂质以15-40 %(w/w)的浓度存在。在另一个方面，脂质以20-30 %(w/w)的浓度存在。在另一个方面，脂质以约25 %(w/w)的浓度存在。
在本发明的一个方面，脂质存在于药物组合物中，其浓度为在组合物中包含胰岛素的成分总量的100 mg/g-900 mg/g。在另一个方面，脂质以100-800 mg/g的浓度存在。在另一个方面，脂质以100-600 mg/g的浓度存在。在另一个方面，脂质以150-500 mg/g的浓度存在。在另一个方面，脂质以150-400 mg/g的浓度存在。在另一个方面，脂质以200-300 mg/g的浓度存在。在另一个方面，脂质以约250 mg/g的浓度存在。
在本发明的一个方面，助溶剂存在于药物组合物中，其浓度为在组合物中包含胰岛素的成分总量的0 %-30 % (w/w)。在另一个方面，助溶剂以5 %-30 % (w/w)的浓度存在。在另一个方面，助溶剂以10-20%(w/w)的浓度存在。
在本发明的一个方面，助溶剂存在于药物组合物中，其浓度为在组合物中包含胰岛素的成分总量的0 mg/g-300 mg/g。在另一个方面，助溶剂以50 mg/g-300 mg/g的浓度存在。在另一个方面，助溶剂以100-200 mg/g的浓度存在。
在本发明的一个方面，口服药物组合物不含HLB低于7的油或任何其它脂质组分或表面活性剂。在进一步方面，组合物不含HLB低于8的油或任何其它脂质组分或表面活性剂。在又进一步方面，组合物不含HLB低于9的油或任何其它脂质组分或表面活性剂。在又进一步方面，组合物不含HLB低于10的油或任何其它脂质组分或表面活性剂。
本发明的液体无水药物组合物的各种非离子型表面活性剂的亲水亲脂平衡(HLB)高于10，藉此达到高胰岛素肽(诸如N末端修饰的胰岛素)药物负载能力和高口服生物利用度。在一个方面，本发明的非离子型表面活性剂是HLB高于11的非离子型表面活性剂。在一个方面，本发明的非离子型表面活性剂是HLB高于12的非离子型表面活性剂。
本文所用的术语“约”是指所述数值的合理邻近值，诸如±10%。
脂质药物组合物(用作包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物)的非限制性实例可以，例如在专利申请WO 08/145728、WO 2010/060667和WO 2011/086093中找到。
本发明的N末端修饰的胰岛素的肽部分具有至少一个不存在人胰岛素中的二硫键。
通过两个硫醇基的偶联得到二硫键，二硫键在本文理解为两个硫原子之间的连接，即具有整体连接R-S-S-R的结构。二硫键也可以被称为连接性二硫键、SS-键或二硫键(disulfide bridges)。通过将两个半胱氨酸氨基酸残基引入肽并且随后将两个硫醇基氧化为一个二硫键而产生二硫键。这种氧化可以化学地进行(如本领域技术人员已知的)或者可以，例如在酵母中，胰岛素表达期间发生。
当将新的半胱氨酸残基引入N末端修饰的胰岛素的肽部分时，半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。例如，如果放置两个新的半胱氨酸残基，三维结构中新的半胱氨酸残基的邻近使得在两个新的半胱氨酸残基之间可以形成二硫键。
通过如，例如实施例115中所述的准确的完整质量测量，可以容易地测定蛋白(诸如胰岛素)中二硫键的数量。通过本领域已知的标准技术，诸如肽作图，可以验证(确定)二硫键连接性。在胰岛素肽中二硫键作图的一般策略包括以下步骤：1)将非还原的胰岛素片段化为包含（如果可能）每个肽只有一个单一的二硫键的二硫键键合的肽。选择的条件也使得避免二硫键的重排，2)二硫键键合的肽彼此分离，和3)鉴定参与单个二硫键的半胱氨酸残基。
通常，通过Glu-C蛋白酶消化人胰岛素，产生包含两个二硫键(A6-A11和A7-B7)的肽I和包含一个单一的二硫键(A20-B19)的肽II。为了明确指定肽I中的二硫键，进一步片段化是必要的。以前采用酸水解(Ryle 等人, 1955 Biochem J. 60, 541-56)，手工Edman降解(Kumazaki T, Ishii, S. 1990 J. Biochem (Tokyo) 17, 414-9)，或用嗜热菌蛋白酶延长的消化(Ota M, Ariyoshi, Y., 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1956-7)来水解蛋白中的CysCys键。指定肽I中的二硫键的另一种方式是用三羧基乙基膦部分还原(A7-B7二硫键的还原)，使用不同的烷基使还原的半胱氨酸残基的烷基化以及随后的完全还原以及半胱氨酸的烷基化(Yen, T.-Y., Yan, H., Macher, B., 2001 J Mass Spectrom. 37, 15-30)。包含额外的二硫键的胰岛素的二硫键作图的策略在原则上与对于每种类似物以容许新的二硫键的方式调整的人胰岛素的上述策略是相同的。通过NMR或X-射线晶体学测定胰岛素结构是用于验证二硫化物键连接性的一种另外的方法。解析胰岛素的NMR和/或X-射线结构的条件以前已经描述并且是本领域已知的。
在本发明的一个方面，提供了具有N末端修饰、白蛋白结合部分和至少两个半胱氨酸取代的N末端修饰的胰岛素，其中保留了人胰岛素的三个二硫键。
术语“半胱氨酸取代”在本文中是指用半胱氨酸替代存在于人胰岛素中的氨基酸。例如，可以通过半胱氨酸残基各自替代人胰岛素的A链的10位的异亮氨酸(IleA10)和B链的4位的谷氨酰胺(GlnB4)。术语“其它氨基酸残基取代”在本文中是指用不是半胱氨酸的氨基酸替代存在于人胰岛素中的氨基酸。
本发明获得的一个额外的二硫键可以连接相同链的两个半胱氨酸，即胰岛素的A-链的两个半胱氨酸或B-链的两个半胱氨酸，或者连接胰岛素的A-链的一个半胱氨酸和B-链的一个半胱氨酸。在一个方面，获得本发明的N末端修饰的胰岛素，其中至少一个额外的二硫键连接A-链的两个半胱氨酸或连接B-链的两个半胱氨酸。在一个方面，获得本发明的N末端修饰的胰岛素，其中至少一个额外的二硫键连接A-链的一个半胱氨酸和B-链的一个半胱氨酸。
当在本文中使用时，术语“额外的二硫键”是指不存在于人胰岛素的一个或多个二硫键。
在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素具有肽部分，所述肽部分选自下述胰岛素肽(其中“肽部分”是指本发明的N末端修饰的胰岛素的不包括N末端修饰和/或“白蛋白结合部分”或酰基部分的部分)：
在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素具有肽部分，所述肽部分选自下述胰岛素肽：
。
本文所用的术语“人胰岛素”是指人胰岛素激素，其二维和三维结构和性质是公知的。例如，通过许多不同的条件下由NMR和X-射线晶体学确定人胰岛素的三维结构，许多这些结构保存在蛋白数据库。人胰岛素结构的非限制性实例是T6结构和R6结构。人胰岛素有两条多肽链，名为A-链和B-链。A-链是21个氨基酸的肽，B-链是30个氨基酸的肽，两条链通过二硫键连接：在A-链7位的半胱氨酸和B-链7位的半胱氨酸之间的第一桥键(bridge)和在A-链20位的半胱氨酸和B-链19位的半胱氨酸之间的第二桥键。第三桥键存在于A-链的6和11位的半胱氨酸之间。因此，其中“其中保留人胰岛素的三个二硫键的N末端修饰的胰岛素”在本文中理解为包含人胰岛素的三个二硫键的N末端修饰的胰岛素，即在A-链的7位的半胱氨酸和B-链的7位的半胱氨酸之间的二硫键，在A-链的20位的半胱氨酸和B-链的19位的半胱氨酸之间的二硫键以及在A-链的6位和11位的半胱氨酸之间的二硫键。
在人体中，胰岛素激素被合成为结构为前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A(其中C是31个氨基酸的连接肽)的由24个氨基酸的前肽以及随后的包含86个氨基酸的胰岛素原组成的单链前体胰岛素原(前胰岛素原)。Arg-Arg和Lys-Arg是用于从A和B链的连接肽的切割的切割位点。
在本发明的一个方面，提供了具有两个或更多个半胱氨酸取代的N末端修饰的胰岛素，其中保留了人胰岛素的三个二硫键，并且其中用半胱氨酸取代选自A-链的A9、A10和A12的位置中的至少一个氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B1、B2、B3、B4、B5和B6的位置中的至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位中的氨基酸。在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B1、B2、B3和B4的位置中的至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代选自A-链的A9、A10和A12的位置中的至少一个氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B1、B2、B3、B4、B5和B6的位置中的至少一个氨基酸残基，用不是半胱氨酸的氨基酸取代选自A14、A21、B1、B3、B10、B16、B22、B25、B26、B27、B28、B29、B30、B31、B32的位置中的至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。
可以理解的是，当B1或B3是半胱氨酸时，相同的氨基酸可以不是其不是半胱氨酸的氨基酸，而如果，例如B1是半胱氨酸，可以根据本发明的方面用其不是半胱氨酸的氨基酸取代B3，反之亦然。
在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B1、B2、B3和B4的位置中的至少一个氨基酸残基，任选地用不是半胱氨酸的氨基酸取代至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B3和B4的位置中的至少一个氨基酸残基，任选地用其不是半胱氨酸的氨基酸取代至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代B-链的B3位的氨基酸残基，任选地用其不是半胱氨酸的氨基酸取代至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。在本发明的一个方面，用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代B-链的B4位的氨基酸残基，任选地用其不是半胱氨酸的氨基酸取代至少一个氨基酸残基，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的ε氨基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。
在一个方面，获得本发明的N末端修饰的胰岛素，其中缺失B30位。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进N末端修饰的胰岛素的两个位置，其中所述位置选自：
。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进胰岛素类似物的两个位置，其中所述位置选自：
。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进N末端修饰的胰岛素的两个位置，其中所述位置选自：
。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进胰岛素类似物的两个位置，其中所述位置选自：
。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进胰岛素类似物的两个位置，其中所述位置是A10C和B3C。
在本发明的一个方面，半胱氨酸被取代进胰岛素类似物的两个位置，其中所述位置是A10C和B4C。
在本发明的一个方面，除了半胱氨酸取代以外，本发明的N末端修饰的胰岛素包含选自如下的一个或多个氨基酸： 和desB30。
在本发明的一个方面，除了半胱氨酸取代以外，本发明的N末端修饰的胰岛素包含选自如下的一个或多个氨基酸： 和desB30。
在本发明的一个方面，除了半胱氨酸取代以外，本发明的N末端修饰的胰岛素包含选自如下的一个或多个氨基酸：和 desB30。
在本发明的一个方面，除了半胱氨酸取代以外，本发明的N末端修饰的胰岛素包含选自如下的一个或多个氨基酸：和desB30。
本文中，术语“酰化的胰岛素”包括任选通过接头将一个或多个白蛋白结合部分连接至胰岛素肽的胰岛素的修饰。
“白蛋白结合部分”在本文中被理解为由，任选通过接头在氨基酸位置(如LysB29或等同物中)连接至胰岛素的脂肪酸或脂肪二元酸组成的侧链。
在一个实施方案中，连接于N末端修饰的胰岛素的“白蛋白结合部分”具有以下通式：
(化学式IV),
其中n为0或1-3范围内的整数；m为0或1-10范围内的整数；p为0或1-10范围内的整数；Acy是包含约14个-约20个碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸；AA1是中性的线性或环状氨基酸残基；AA2是酸性氨基酸残基；AA3是中性的含烷撑二醇(alkyleneglycol)的氨基酸残基；AA1、AA2和AA3在所述式中出现的顺序可以独立地互换；AA2可以沿所述式出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；AA2可以沿所述式独立地(=不同的)出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，所述酰胺(肽)键形式上可通过除去Acy、AA1、AA2和AA3各自的氢原子或羟基(水)来获得；且与肽部分的连接可以来自化学式IV酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自化学式IV部分中存在的AA2残基的一个或多个侧链中的一个。
可以根据本发明使用的白蛋白结合部分的非限制性实例可以，例如，在专利申请WO 2009/115469中找到，其中包括在WO 2009/115469的第25页第3行开始段落中描述的酰化多肽的白蛋白结合部分。
在本发明的一个方面，白蛋白结合部分选自：
在本发明的一个方面，白蛋白结合部分选自：
在本发明的一个方面，白蛋白结合部分选自：
“N末端修饰的胰岛素”在本文中和“N末端保护的胰岛素”是相同的，且在本文中被定义为包含一个或多个N末端修饰基团(在本文中也被命名为N末端保护基团)的胰岛素。
“N末端修饰基团”在本文中和“N末端保护基团”是相同的，根据本发明，其是如下基团：当与胰岛素的A和/或B链的N末端氨基缀合时，所述基团保护胰岛素的N末端氨基酸的所述氨基(通常，但并不总是)，分别为A-和B-链的甘氨酸和苯丙氨酸，免于和例如药物制剂中的一种或多种赋形剂的醛杂质反应。在本发明的一个方面，N末端修饰是一个或两个与亲本胰岛素的N末端缀合的有机取代基，所述有机取代基具有低于200 g/mol的MW。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素包含与至少一个、优选两个N末端氨基酸连接的N末端修饰基团Y’和Z，如化学式V中所示，其具有显示为(GIVE….)的胰岛素A链N末端的前4个残基。
化学式V:
在本发明的一个方面，Y’和Z是不同的，且：
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H、NH2、直链或支链的C1-C4烷基、(任选地被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、三甲基铵、三乙基铵或三丙基铵取代)、C5-C6环烷基(任选取代的)、5 -或6元饱和杂环基(heterocyclyl)(任选取代的)，且
X是O或S。
在本发明的一个方面，当Y’是R-C(=X)-且Z是H时，胰岛素可以含有desA1和desB1突变。
在本发明的另一个方面，Y’ = Z是C1-C4烷基。
在本发明的一个方面，A-和B-链的N末端氨基的各个N末端保护基团是相同的。
在本发明的一个方面，本发明的两个N末端保护基团各自具有低于150 Da的分子量。
在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团在生理pH下各自带正电荷，即当N末端修饰基团与N末端氨基连接/缀合时，氨基或氨基上的取代基具有正电荷。在本发明的一个方面，N末端保护基团选自：二甲基、二乙基、二正丙基、二仲丙基、二正丁基、二异丁基等。在本发明的另一个方面，N末端保护基团选自二甲基和二乙基。在本发明的另一个方面，N末端保护基团是二甲基。
在本发明的一个方面，N末端保护基团选自：N,N-二甲基甘氨酰基、N,N-二甲基氨基丁酰基、N,N-二甲基氨基丙酰基和3-(1-哌啶基)丙酰基。
在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团在生理pH下各自除去N末端氨基的标准正(或部分正)电荷。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自小酰基残基。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自甲酰基、乙酰基、丙酰基和丁酰基基团。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自环状酰基残基，例如焦谷氨酰胺酰基(pyroglutaminyl)(= 5-氧代-吡咯烷-2-酰基)基团。
在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团在生理pH下各自除去N末端氨基的标准正(或部分正)电荷。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自氨基甲酰基和硫代氨基甲酰基。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自为氨基甲酰基。
在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团在生理pH下各自除去N末端氨基的标准正(或部分正)电荷。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基(其它名称：3-氧代戊二酰基、羧基甲氧基乙酰基)。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自选自戊二酰基和二羟乙酰基(其它名称：3-氧代戊二酰基、羧基甲氧基乙酰基)。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自为戊二酰基。在本发明的一个方面，本发明的N末端保护基团各自为二羟乙酰基(其它名称：3-氧代戊二酰基、羧基甲氧基乙酰基)。
当用于本文中时，术语“缀合”意指将取代基键合至多肽以修饰所述多肽的性质的过程。因此，分子和多肽的“缀合”或“缀合产物”是键合至多肽的氨基酸的所述取代基的术语，因此，本文中所述的“取代基”是指连接至多肽的取代基。
“单烷基化”在本文中被理解为一个烷基取代基与多肽的游离氨基的缀合，“双烷基化”被理解为如下所示例的两个烷基取代基与多肽的游离氨基的缀合，其中“游离氨基”被理解为伯胺R–NH2或仲胺R1-NH-R2，其中R、R1和R2代表取代基。
“胍基化(Guadinylation)”在本文中被理解为脒基取代基(也可以被称为甲脒，即形式R n C(=NR)NR2的取代基，其中R n 为多肽)与多肽的游离氨基的缀合，其导致如下所示例的氨基转化为胍基。　
化学式VI。
如本文中使用的“胰岛素类似物”是多肽，其具有可以形式上来源于天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)的结构的分子结构，通过缺失和/或取代天然胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基，和/或通过添加至少一个氨基酸残基。
在一个方面，相对于人胰岛素，本发明的胰岛素类似物包含小于8个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于7个修饰(取代、缺失、添加)。在一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于6个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于5个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于4个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于3个修饰(取代、缺失、添加)。在另一个方面，相对于人胰岛素，胰岛素类似物包含少于2个修饰(取代、缺失、添加)。
“胰岛素衍生物”是已经被化学修饰的天然存在的人胰岛素或胰岛素类似物，例如，通过在胰岛素主链的一个或多个位置引入侧链，或通过氧化或还原胰岛素中氨基酸残基的基团，或通过将游离羧基转化成酯基或酰胺基。通过酰化游离氨基或羟基，诸如人胰岛素或desB30人胰岛素的B29位置，获得其它衍生物。包含白蛋白结合部分的胰岛素分子因此是根据该定义的胰岛素衍生物。
因此，胰岛素衍生物是包含至少一个共价修饰(如与胰岛素肽的一个或多个氨基酸连接的侧链)的人胰岛素或胰岛素类似物。
本文中，根据以下原则进行胰岛素的命名：根据相对人胰岛素的突变和修饰(酰化)给予名称。对于酰基部分(白蛋白结合部分)的命名，根据肽命名法命名。例如，命名酰基部分：
化学式VII
可以是例如“十八烷二酰基-γ-L-Glu-OEG-OEG”、“十八烷二酰基-γGlu-2xOEG”、“十八烷二酰基-gGlu-2xOEG”、“17-羧基十七烷酰基-γ-L-Glu-OEG-OEG”或“17-羧基十七烷酰基-γ-L-Glu-2xOEG”，其中
OEG是氨基酸残基-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-的简化符号，
γ-L-Glu(可替代地记录为g-L-Glu、gGlu、γGlu或γ-L-Glu)是L型的氨基酸γ谷氨酸部分的简化符号。
如果γ谷氨酸部分的对映异构体形式没有被指定，该部分可以是纯对映异构体的形式，其中手性氨基酸部分的立体构型是D或L(或者如果使用R/S术语：R或S)，或者它可以是对映异构体的混合物形式(D和L/R和S)。
修饰的肽或蛋白的酰基部分可呈纯对映异构体的形式，其中手性氨基酸部分的立体构型为D或L (或者如果采用R/S术语：R或S)或者它可呈对映异构体混合物的形式(D和L/R和S)。在本发明的一个方面，酰基部分呈对映异构体混合物的形式。一方面，酰基部分呈纯对映异构体的形式。一方面，酰基部分的手性氨基酸部分呈L型。一方面，酰基部分的手性氨基酸部分呈D型。
关于“desB30人胰岛素”，是指缺乏B30氨基酸残基的人胰岛素类似物。关于“B1”、“A1”等，分别是指胰岛素B链第1位的氨基酸残基(从N末端起计)和胰岛素A链第1位的氨基酸残基(从N末端起计)。特定位置上的氨基酸残基还可标示为例如PheB1或B1F，其是指在B1位的氨基酸残基是苯丙氨酸残基。
例如，实施例1的胰岛素(具有下面给出的序列/结构)命名为“A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰-gGlu), desB30人胰岛素”，以表明：A10位的氨基酸(其是人胰岛素中的I)已突变为C，人胰岛素中A14位的氨基酸Y已突变为E，人胰岛素中B3位的氨基酸N已突变为C，人胰岛素中B25位的氨基酸F已突变为H，A1和B1位的氨基酸(分别为甘氨酸和苯丙氨酸)已通过(形式上)N末端(α)氨基的二甲基化修饰，以及人胰岛素中B27位的氨基酸T已缺失，人胰岛素中B29位的氨基酸K通过在B29的赖氨酸残基中的ε氮(表示为N ε )上被残基十八烷二酰-γGlu酰化而被修饰，以及人胰岛素中B30位的氨基酸T缺失。下式中的星号表示与人胰岛素相比，讨论的残基是不同的(即，突变的)。可选择地，实施例1的胰岛素(具有下面给出的序列/结构)也可以命名为“A1G(N α,N α-二甲基), A10C,A14E, B1F (N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K (N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素”，以进一步表明：A1和B1位的氨基酸残基分别为G (Gly)和F (Phe)。此外，符号“N α” 和 “N ε”也可以分别写为“N(α)”或“N(a)”，和写为“N(ε)”或“N(eps)”。
SEQ ID No: 1
相同的胰岛素也可以以可选择的代表来示例：
此外，还根据IUPAC命名法(OpenEye, IUPAC类型)命名本发明的胰岛素。根据该命名法，上述酰化的N末端修饰的胰岛素被指定为如下名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)
N末端修饰的符号：
N末端修饰绘制为没有α氨基，且应当理解为如下实例中所示。
多肽的生产是本领域中公知的。多肽如本发明的N末端修饰的胰岛素的肽部分可以例如通过经典的肽合成来制备，例如，利用t-Boc或Fmoc化学作用的固相肽合成、或其它充分建立的技术，参见，例如Greene和Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999。通过包括在允许肽表达的条件下在适合的营养培养基中培养含有DNA序列的宿主细胞的方法，也可以制备多肽，所述DNA序列编码多肽并能够表达所述多肽。对于包含非天然氨基酸残基的多肽，重组细胞应当被修饰，从而非天然氨基酸例如通过使用tRNA突变体掺入到多肽中。
通常，药物组合物在使用和储存过程中必须是稳定的(依照推荐的使用和储存条件)，直到到达失效日期。
在本发明的一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物诸如脂质药物组合物对于使用超过6周和对于储存超过2年是稳定的。
在本发明的另一个方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物诸如脂质药物组合物对于使用超过4周和对于储存超过两年是稳定的。
在本发明的进一步方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物诸如脂质药物组合物对于使用超过4周和对于储存超过3年是稳定的。
在本发明的甚至进一步方面，包含本发明的N末端修饰的胰岛素的药物组合物诸如脂质药物组合物对于使用超过2周和对于储存超过两年是稳定的。
在一个实施方案中，本发明的N末端修饰的胰岛素具有很少或没有聚集物的趋势。当在硫磺素测定中试验时，相对于没有一个或多个额外的二硫键的人胰岛素和/或N末端修饰的胰岛素的聚集趋势，聚集趋势优选显著改善。在一个方面，相对于具有一个或多个额外二硫键但没有N末端修饰的相似酰化胰岛素的聚集趋势，聚集趋势改善。
在一个方面，本发明的N末端修饰的胰岛素具有改善的热力学稳定性，诸如例如折叠稳定性，构象的稳定性和/或更高的熔解温度。
当本文使用时，如果与以相似剂量给予的人胰岛素、没有一个或多个额外二硫键的N末端修饰的胰岛素或具有一个或多个额外二硫键但没有N末端修饰的相似酰化的胰岛素相比，N末端修饰的胰岛素的变性需要更高的应激水平诸如更高的温度和/或更高浓度的变性剂，那么所述N末端修饰的胰岛素被称为具有改善的“热力学稳定性”。
可以通过诸如例如Hudson和Andersen, Peptide Science, vol 76 (4), pp. 298-308 (2004)中所述圆二色光谱和NMR评价构象的稳定性。熔解温度被理解为胰岛素结构可逆或不可逆地变化的温度。更高的熔解温度对应更稳定的结构。可以，例如，通过圆二色光谱和/或NMR将构象稳定性评价为温度的函数，或通过差示扫描量热法而测定熔解温度。也可以在逐渐增加浓度的变性剂诸如例如盐酸胍存在的情况下通过CD光谱和或NMR测定热力学稳定性。可以从这种实验测定如以前所述(Kaarsholm, N.C., 等人，1993, Biochemistry, 32, 10773-8)的解折叠的自由能。蛋白变性后，远UV范围(240-218-nm)内的负CD逐渐减小，与伴随蛋白解折叠的有序的二级结构的损失一致(Holladay等人, 1977, Biochim. Biophys.Acta, 494, 245-254; Melberg和Johnson, 1990, Biochim. Biophys.Acta, 494, 245-254)。在近UV范围(330-250-nm)内的胰岛素CD谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境(Morris等人, 1968, Biochim.Biophys. Acta., 160, 145-155; Wood等人, 1975, Biochim. Biophys. Acta, 160, 145-155; Strickland & Mercola, 1976, Biochemistry, 15, 3875-3884)。从这些研究以前计算的胰岛素的解折叠的自由能为4.5 kcal/mol (Kaarsholm, N.C., 等人，1993, Biochemistry, 32, 10773-8)。
在近UV范围(330-250-nm)内的胰岛素CD谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境。由于酪氨酸残基是胰岛素二聚体表面的部分，在该区域(尤是在276 nm)的摩尔椭圆率(molar elipticity)的变化反映在胰岛素的结合状态上。测量胰岛素的结合状态的另一种方式是通过在本领域已知并且在实施例中描述的非解离条件下应用大小排阻层析法。
以下是本发明的方面的非限制性列表：
1. 由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分具有至少一个不存在于人胰岛素中的二硫键。
2. 由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分具有两个或更多个半胱氨酸取代，且保留了人胰岛素的三个二硫键。
3. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，并且其中所述N末端修饰的胰岛素具有具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但不具有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。
4. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中胰岛素受体亲和力是具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但没有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的至少10%、诸如至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。
5. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中，所述修饰基团是一个或两个有机取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量(MW)，且缀合于亲本胰岛素的N末端。
6. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中修饰基团在化学式V (针对A链N末端图示)中指定为Y’和Z
且其中Y’和Z连接至胰岛素肽的N末端氨基酸。
7. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二甲基铵、二乙基铵或二丙基铵、CO2H或-OCH2CO2H取代的直链或支链的C2-C4烷基，C5-C6环烷基，取代的C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，且
X是O或S。
8. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO2H取代的C1-C4烷基，C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，且
X是O或S。
9. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO2H取代的C1-C4烷基，且
X是O。
10. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是直链或支链的C1-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、三甲基铵、三乙基铵或二丙基铵取代的直链或支链的C2-C4烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，脒基，且
Z是H。
11. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是直链的C1-C4烷基、5 -或6元饱和杂环基，并且
Z是H。
12. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’=Z=C1-C4烷基。
13. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是相同的且选自：甲基、乙基、正丙基、仲丙基、正丁基和二异丁基。
14. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是相同的且选自二甲基和二乙基。
15. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是相同的且是甲基。
16. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰在生理pH下带正电荷。
17. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰选自：N,N-二-C1-4烷基、N-脒基、4-(N,N-二甲基氨基)丁酰基、3-(1-哌啶基)丙酰基、3-(N,N-二甲基氨基)丙酰基、N,N-二甲基-甘氨酰基。
18. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是N,N-二-C1-4烷基。
19. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是N,N-二甲基或N,N-二乙基。
20. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团不是丙二酰基或丁二酰基。
21. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团不是丙二酰基。
22. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团不是丁二酰基。
23. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团选自：N,N-二甲基、N,N-二乙基、氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
24. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰在生理pH下为中性。
25. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基和焦谷氨酰基。
26. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、乙酰基、丙酰基和丁酰基。
27. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是氨基甲酰基。
28. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是乙酰基。
29. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰在生理pH下带负电荷。
30. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰选自：草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
31. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰选自：草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
32. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是戊二酰基。
33. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰是二羟乙酰基。
34. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分是在选自以下的位置被至少两个半胱氨酸取代的人胰岛素：
。
35. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
36. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
37. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
38. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置为A10C和B3C。
39. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其进一步包含突变使得至少一个疏水氨基酸已经被亲水氨基酸取代，且其中所述取代在所述胰岛素的一个或多个蛋白酶切割位点内或邻近处。
40. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
41. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
42. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
43. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸：A14E、B16H、B25H、desB27和desB30。
44. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25A, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, desB1, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14H, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；和A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素。
45. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素。
46. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述白蛋白结合部分是由连接至所述胰岛素，任选经由接头连接至所述肽部分的氨基酸位置，的脂肪酸或脂肪二元酸组成的侧链。
47. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分包含仅一个赖氨酸残基，且所述白蛋白结合部分任选经由接头连接至所述赖氨酸残基。
48. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述白蛋白结合部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (化学式IV)
其中
n为0或1-3范围内的整数；
m为0或1-10范围内的整数；
p为0或1-10范围内的整数；
Acy是包含约14个-约20个碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸；
AA1是中性的线性或环状氨基酸残基；
AA2是酸性氨基酸残基；
AA3是中性的含烷撑二醇的氨基酸残基；
AA1、AA2和AA3在式中出现的顺序可独立地互换；AA2可以沿所述式出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；AA2可以沿所述式独立地(=不同的)出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，所述酰胺(肽)键形式上可通过除去Acy、AA1、AA2 和AA3各自的氢原子或羟基(水)来获得；且与肽部分的连接可以来自化学式IV酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自化学式IV部分中存在的AA2残基的一个或多个侧链中的一个。
49. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
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A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
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A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
50. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
51. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
52. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
53. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
54. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
55. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
56. 在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素，其是上述说明书中具体提到的任一种化合物。
57. 药物组合物，其包含在可能范围内根据前述方面中任一项的N末端修饰的胰岛素。
58. 根据方面57所述的药物组合物，其是口服药物组合物。
59. 口服药物组合物，其包含一种或多种脂质和N末端修饰的胰岛素。
60. 根据方面59所述的口服药物组合物，其中所述N末端修饰的胰岛素由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成。
61.根据方面59-60中任一项的口服药物组合物，其是无水的。
62.根据方面59-61中任一项的口服药物组合物，其中所述脂质选自：甘油单辛酸酯(诸如例如Rylo MG08 Pharma)和甘油单癸酸酯(诸如例如来自Danisco的Rylo MG10 Pharma)。在另一个方面，所述脂质选自：丙二醇辛酸酯(诸如例如来自Abitec的Capmul PG8或来自Gattefosse的Capryol PGMC或Capryol 90)。
63. 根据方面59-62中任一项的口服药物组合物，其是固体或半固体药物组合物，所述药物组合物包含N末端修饰的胰岛素(a)、用于所述N末端修饰的胰岛素的至少一种极性有机溶剂(b)、至少一种表面活性剂(c)、至少一种亲脂性组分(d)和任选的至少一种固体亲水性组分(e)，其中所述药物组合物是自发可分散的。
64. 根据方面59-63中任一项的口服药物组合物，其是无水液体药物组合物，所述药物组合物包含N末端修饰的胰岛素(a)、用于所述N末端修饰的胰岛素的至少一种极性有机溶剂(b)、至少一种亲脂性组分(c)和任选的至少一种表面活性剂(d)，其中所述药物组合物是澄清溶液的形式。
65. 根据方面59-64中任一项的口服药物组合物，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
66. 根据方面59-65中任一项的口服药物组合物，其中所述表面活性剂是选自泊洛沙姆(poloxamer)和泊洛沙姆类如Pluronic F-127或Pluronic F-68的混合物的固体表面活性剂。
67. 根据方面59-66中任一项的口服药物组合物，其中所述亲脂性组分是甘油单酯-甘油二酯。
68. 根据方面59-67中任一项的口服药物组合物，其中选择所述亲脂性组分使得当所述亲脂性组分与丙二醇混合时获得溶液。
69. 根据方面59-68中任一项的口服药物组合物，其中所述亲脂性组分是甘油单酯和/或甘油二脂或丙二醇辛酸酯。
70. 根据方面59-69中任一项的口服药物组合物，其是液体药物组合物，该液体药物组合物包含至少一种N末端修饰的胰岛素、至少一种极性有机溶剂和至少两种HLB高于10的非离子型表面活性剂，其中所述组合物不含有油或任何其它脂质组分或HLB低于7的表面活性剂。
71. 根据方面59-70中任一项的口服药物组合物，其中所述组合物在含水介​​质中稀释后形成微乳剂或纳米乳剂。
72. 根据方面59-71中任一项的口服药物组合物，其中所述有机溶剂选自多元醇。
73. 根据方面59-72中任一项的口服药物组合物，其中所述有机溶剂选自丙二醇、甘油及其混合物。
74. 根据方面59-73中任一项的口服药物组合物，其中所述有机溶剂是丙二醇。
75. 根据方面59-74中任一项的口服药物组合物，其中所述非离子型表面活性剂中的一种或多种包含中链脂肪酸基团诸如C8脂肪酸(辛酸酯)、C10脂肪酸(癸酸酯)或C12脂肪酸(月桂酸酯)。
76. 根据方面59-75中任一项的口服药物组合物，其中所述非离子型表面活性剂中的一种或多种选自Labrasol(也被命名为聚乙二醇甘油辛酸癸酸酯(Caprylocaproyl Macrogolglycerides))、Tween 20 (也被命名为聚山梨醇酯20或聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween 80 (也被命名为聚山梨醇酯80)、二甘油单辛酸酯(Diglycerol monocaprylate)、聚甘油辛酸酯和Cremophor RH 40。
77. 根据方面59-76中任一项的口服药物组合物，其中所述有机溶剂以约1％至约15％的量存在。
78. 根据方面59-77中任一项的口服药物组合物，其中所述修饰基团是一个或两个有机取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量(MW)，且缀合于亲本胰岛素的N末端。
79. 根据方面59-78中任一项的口服药物组合物，其中修饰基团在化学式V中指定为Y’和Z：
且其中Y’和Z连接至胰岛素肽的N末端氨基酸。
80.根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是不同的，并且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二甲基铵、二乙基铵、二丙基铵、CO2H或-OCH2CO2H取代的直链或支链的C2-C4烷基，C5-C6环烷基，取代的C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，且
X是O或S。
81. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是不同的，并且
Y’是R-C(=X)-，
Z 是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO2H取代的C1-C4烷基，C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，且
X是O或S。
82. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是不同的，并且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO2H取代的C1-C4烷基，且
X是O。
83. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是不同的，并且
Y’是直链或支链的C1-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、三甲基铵、三乙基铵或二丙基铵取代的直链或支链的C2-C4烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，脒基，且
Z是H。
84. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是不同的，并且
Y’是直链C1-C4烷基，5或6元饱和杂环基，且
Z是H。
85. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’ = Z = C1-C4烷基。
86. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是相同的，且选自：甲基、乙基、正丙基、仲丙基、正丁基和异丁基。
87. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是相同的，且选自二甲基和二乙基。
88. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中Y’和Z是相同的，且是甲基。
89. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰在生理pH下带正电荷。
90. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：N,N-二-C1-4烷基、N-脒基、4-(N,N-二甲基氨基)丁酰基、3-(1-哌啶基)丙酰基、3-(N,N-二甲基氨基)丙酰基和N,N-二甲基-甘氨酰基。
91. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是N,N-二-C1-4烷基。
92. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是N,N-二甲基或N,N-二乙基。
93. 根据方面59-92中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰基团不是丙二酰基或丁二酰基。
94. 根据方面59-92中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰基团不是丙二酰基。
95. 根据方面59-92中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰基团不是丁二酰基。
96. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰基团选自：N,N-二甲基、N,N-二乙基、氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
97. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、短链酰基、草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
98. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、焦谷氨酰基、草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
99. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰在生理pH下是中性的。
100. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基和焦谷氨酰基。
101. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：氨基甲酰基、乙酰基、丙酰基和丁酰基。
102. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是氨基甲酰基。
103. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是乙酰基。
104. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰在生理pH下带负电荷。
105. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰选自：草酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
106. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是戊二酰基。
107. 根据方面59-79中任一项的口服药物组合物，其中所述N末端修饰是二羟乙酰基。
108. 根据方面59-107的任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分是在选自以下的位置被至少两个半胱氨酸取代的人胰岛素：
。
109. 根据方面59-108的任一项的口服药物组合物，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
110. 根据方面59-109的任一项的口服药物组合物，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
111. 根据方面59-110的任一项的口服药物组合物，其中半胱氨酸取代的位置选自：
。
112. 根据方面59-111的任一项的口服药物组合物，其中半胱氨酸取代的位置是A10C和B3C。
113. 根据方面59-112的任一项的口服药物组合物，其进一步包含突变使得至少一个疏水氨基酸已经被亲水氨基酸取代，且其中所述取代在所述胰岛素的一个或多个蛋白酶切割位点内或邻近处。
114. 根据方面59-113的任一项的口服药物组合物，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
115. 根据方面59-113的任一项的口服药物组合物，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
116. 根据方面59-113的任一项的口服药物组合物，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸： 和desB30。
117. 根据方面59-113的任一项的口服药物组合物，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸：和desB30。
118. 根据方面59-117的任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25A, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, desB1, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14H, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；和A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素。
119. 根据方面59-117的任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素。
120. 根据方面59-117的任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25A, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, desB1, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14H, B4C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；和 A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30人胰岛素。
121. 根据方面59-117的任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素。
122. 根据方面59-121中任一项的口服药物组合物，其中所述白蛋白结合部分是由任选通过接头在所述肽部分的氨基酸位置中连接至所述胰岛素的脂肪酸或脂肪二元酸组成的侧链。
123. 根据方面59-122中任一项的口服药物组合物，其中所述肽部分仅包含一个赖氨酸残基，并且所述白蛋白结合部分任选通过接头连接至所述赖氨酸残基。
124. 根据方面59-123中任一项的口服药物组合物，其中所述白蛋白结合部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (化学式IV)，
其中
n为0或1-3范围内的整数；
m为0或1-10范围内的整数；
p为0或1-10范围内的整数；
Acy是包含约14至约20个碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸；
AA1是中性的线性或环状氨基酸残基；
AA2是酸性氨基酸残基；
AA3是中性的含烷撑二醇的氨基酸残基；
AA1、AA2和AA3在所述式中出现的顺序可以独立地互换；AA2可以沿所述式出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；AA2可以沿所述式独立地(=不同的)出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，所述酰胺(肽)键形式上可通过除去Acy、AA1、AA2 和AA3各自的氢原子或羟基(水)来获得；且与肽部分的连接可以来自化学式IV酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自化学式IV部分中存在的AA2残基的一个或多个侧链中的一个。
125. 制备方面1 - 56中任一项的N末端修饰的胰岛素衍生物的方法。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用被完整地并入，其程度如同每份参考文献被单独且明确地指明通过引用并入并且在本文中完整地记载 ( 法律允许的最大程度 ) 。
本文使用的所有的标题和副标题仅仅为了方便，不应当被解释为以任何方式限制本发明。
本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言 ( 例如，“如” ) 的使用，除非另有要求，仅仅为了更好地阐明本发明，并不构成对本发明的范围的限制。说明书中任何语言都不应当被解释为指明任何非要求保护的要素对于本发明的实施是必需的。
在本文中专利文件的引用并并入仅仅是为了方便，并不反映此类专利文件的有效性、可专利性和 / 或可执行性的任何观点。
本发明包括本文所附加权利要求中所记载主题的所有修改和等同内容，其是为适用的法律所允许的。
实施例
以示例而非限制地提供下列实施例。
本文中所用的缩写如下：βAla为β-丙氨酰基，Aoc为8-氨基辛酸，tBu为叔丁基，CV为柱体积，DCM为二氯甲烷，DIC为二异丙基碳二亚胺，DIPEA = DIEA，为N,N-二异丙基乙胺，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，DMSO为二甲基亚砜，EtOAc为乙酸乙酯，Fmoc为9-芴基甲氧羰基，γGlu为γ L-谷氨酰基，HCl为盐酸，HOBt为1-羟基苯并三唑，NMP为N-甲基吡咯烷酮，MeCN为乙腈，OEG为[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基羰基，Su为琥珀酰亚胺基-1-基= 2,5-二氧代-吡咯烷-1-基，OSu为琥珀酰亚胺基-1-基氧基= 2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基，RPC为反相层析法，RT为室温，TFA为三氟乙酸，THF为四氢呋喃，TNBS为2,4,6-三硝基苯磺酸，TRIS为三(羟甲基)氨基甲烷，和TSTU为O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。
以下实施例和通用程序涉及说明书和合成方案中鉴定的中间化合物和最终产物。采用以下实施例对本发明化合物的制备进行详细描述，但描述的化学反应根据它们对本发明化合物制备的一般适用性来公开。有时，所述反应可能不能适用于如所述的本发明公开范围内包括的每种化合物。本领域技术人员容易识别会发生这种情况的化合物。在这些情况下，所述反应可成功地通过本领域技术人员已知的常规改变进行，也就是说，通过干扰基团的合适保护，通过改变为其它常规试剂，或通过反应条件的常规改变。或者，本文中公开的或另外常规的其它反应将适用于制备本发明的相应化合物。在所有制备方法中，所有原料都是已知的或能容易地采用已知原料制备的。所有温度都以摄氏度给出，除非另外明确指出，当提到产率时，所有份和百分比都以重量计，并且当提到溶剂和洗脱液时，所有份都以体积计。
可以通过采用本领域中常用的以下方法中的一种或多种来纯化本发明的化合物。如果需要，可将这些方法针对梯度、pH、盐、浓度、流速、柱子等等进行改进。根据因素诸如杂质特征、考虑的胰岛素溶解性等等，本领域技术人员容易认识和进行这些改进。
酸性HPLC或脱盐后，通过冷冻干燥纯的部分来分离化合物。
中性HPLC或阴离子交换层析后，使所述化合物脱盐，在等电pH下沉淀或通过酸性HPLC纯化。
典型的纯化方法：
HPLC系统为由以下组成的Gilson系统：215型液体处理系统, 322-H2型泵和155型UV检测器。一般在210 nm和280 nm下进行检测。
Äkta Purifier FPLC系统(GE Health Care)由如下组成：P-900型泵，UV-900型UV检测器，pH/C-900型pH和电导率检测器，Frac-950型级分收集器。通常在214 nm、254 nm和276 nm下进行UV检测。Äkta Explorer Air FPLC系统(Amersham BioGE Health Caresciences)由如下组成：P-900型泵、UV-900型UV检测器、pH/C-900型pH和电导率检测器、Frac-950型级分收集器。通常在214 nm、254 nm和276 nm下进行UV检测。　
酸性 HPLC:
柱 Phenomenex, Gemini, 5µ, C18, 110 Å, 250x30 cm
流速： 20 ml/min’
洗脱液： A: 水中的0.1% TFA B: CH3CN中的0.1% TFA
梯度： 0-7.5 min: 10% B
7.5- 87.5 min: 10% B至60% B
87.5 -92.5 min: 60% B
92.5-97.5 min: 60% B至100% B
中性 HPLC:
柱 Phenomenex, Gemini, C18, 5µm 250 x 30.00 mm, 110 Å
流速： 20 ml/min
洗脱液： A: 含水10mM TRIS + 15mM (NH4)SO4 pH = 7.3中的20% CH3CN B: 80% CH3CN, 20 % 水
梯度： 0-7.5 min: 0% B
7.5- 52.5 min: 0% B 至 60% B
52.5 -57.5 min: 60% B
57.5-58 min: 60% B 至 100% B
58-60min: 100% B
60-63min: 10% B
阴离子交换层析：
柱 RessourceQ, 6 ml,
流速： 6 ml/min
缓冲液A： 0.09% NH4HCO3, 0.25% NH4OAc, 42.5% 乙醇 pH 8.4
缓冲液B： 0.09% NH4HCO3, 2.5% NH4OAc, 42.5% 乙醇 pH 8.4
梯度： 在30 CV期间100% A至100% B
柱 Source 30Q, 30x250mm
流速： 80 ml/min
缓冲液A： 15 mM TRIS, 30mM 乙酸铵/ 50% 乙醇, pH 7.5 (1.25 mS/cm)
缓冲液B： 15 mM TRIS, 300mM乙酸铵/ 50%乙醇 pH 7.5 (7.7 mS/cm)
梯度： 经40 CV ，15%B 至 70%B
脱盐：
柱 Daiso 200Å 15um FeFgel 304, 30x250mm
缓冲液A： 20 v/v% 乙醇, 0.2% 乙酸
缓冲液B： 80% v/v% 乙醇, 0.2% 乙酸
梯度： 经 1.5 CV，0-80%B
流速： 80 ml/min
柱 HiPrep 26/10
流速： 10 ml/min,
梯度： 6 CV
Buffer: 10 mM NH4HCO3。
固相合成通式(II)的酰化剂的通用程序：
(II): Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act,
其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上所定义且Act为活性酯的离去基团， 诸如N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)或1-羟基苯并三唑，且
其中酰基部分的Acy和AA2部分内的羧酸作为叔丁酯受到保护。
可以采用固相肽合成领域中技术人员熟知的方法在固体载体上合成本发明通式(II)的化合物。该方法包括将Fmoc保护的氨基酸与聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂相连接。可以例如在叔胺如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺存在的情况下采用游离的N-保护的氨基酸来完成该连接(参见下面参考文献)。该氨基酸的C-末端(其与树脂相连)在与本发明亲本胰岛素偶联的合成序列的末端。Fmoc氨基酸与所述树脂相连后，采用，例如仲胺如哌啶或二乙胺使Fmoc基团脱保护，随后偶联另一种(或相同的) Fmoc保护的氨基酸并脱保护。通过单叔丁基保护的脂肪(α, ω)二元酸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁基酯的偶联而终止该合成序列。采用稀释的酸如 0.5-5% TFA/DCM (二氯甲烷中的三氟乙酸)、乙酸(例如DCM中10%，或HOAc/三氟乙醇/DCM 1:1:8)或DCM中的六氟异丙醇来完成将所述化合物从所述树脂裂解(参见例如，“Organic Synthesis on Solid Phase”, F.Z. Dörwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, “Peptides: Chemistry and Biology”, N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 或“The Combinatorial Cheemistry Catalog” 1999, Novabiochem AG, 及本文引用的文献)。这确保了化合物中作为羧酸保护基团存在的叔丁基酯没有被脱保护。最后，C-末端羧基(从所述树脂释放的)被活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)并直接或纯化后用作与本发明亲本胰岛素连接中的偶联剂。该程序描述于WO09115469中的实施例9中。
或者，可以通过下面描述的溶液相合成来制备以上通式(II)的酰化剂。
单叔丁基保护的脂肪二元酸诸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁基酯被活化，例如作为下面描述的OSu-酯或本领域技术人员已知的任何其它活化酯， 诸如HOBt-或HOAt-酯。在合适碱诸如DIPEA或三乙胺存在的情况下，在合适溶剂诸如THF、DMF、NMP(或溶剂混合物)中，将这种活性酯与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3中的一种偶联。通过萃取方法或通过层析法分离中间体。将产生的中间体再次活化(如上所述)并如上所述使之与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3中的一种偶联。重复该方法直到获得期望的受保护中间体Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OH。这依次被活化以提供通式(II) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act的酰化剂。该程序描述于WO09115469中的实施例11中。
通过以上方法中任一种制备的酰化剂可以在作为OSu酯活化后脱(叔丁基)保护。可以通过TFA处理OSu-活化的叔丁基保护的酰化剂做到这一点。任何胰岛素酰化后，获得产生的本发明的未保护的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。该程序描述于WO09115469中的实施例16中。
如果通过以上方法中任一种制备的试剂在作为OSu酯活化后不脱(叔丁基)保护，任何胰岛素的酰化提供相应的本发明的叔丁基保护的酰化的胰岛素。为了获得本发明的未保护的酰化的胰岛素，所述保护的胰岛素将被脱保护。可以通过TFA处理以获得本发明的未保护的酰化的胰岛素而做到这一点。该程序描述于WO05012347中的实施例1中。
用于制备没有N末端保护的酰化胰岛素的方法(即用于制备本发明的N末端受保护的衍生物的起始原料)可以在WO09115469中找到。
用于制备本发明的酰化胰岛素的还原性N-甲基化的通用程序(A)
将酰化的胰岛素溶解在极性非质子或质子溶剂(诸如N-甲基甲酰胺、DMF、NMP、THF或DMSO (3.8 ml))和任选含有处于酸性pH(约4，宽耐受性)的缓冲液(诸如0.2 M柠檬酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液或稀醋酸)的水的混合物中，并将混合物轻轻搅拌。添加37％甲醛水溶液(5-10或更多当量)-或乙醛，如果需要N,N-二乙基衍生物，随后添加新鲜制备的甲醇或水中氰基硼氢化钠(5-10当量)或THF或NMP等中2-.甲基吡啶硼烷的溶液。轻轻搅拌混合物。完成反应后，通过逐滴添加1N盐酸至pH2-3来将混合物小心酸化。通过制备型HPLC或阴离子交换层析(AIEC)分离产物。
在实施例1中说明了通用方法(A)。
实施例 1, 通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
将A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素(0.35 g)溶解在水(20mL)和THF(10 mL)中。用1N NaOH将pH调节至3.9。向该溶液中添加甲醛水溶液(37%, 49 μL)，随后缓慢逐滴添加THF中2-甲基吡啶硼烷的溶液(0.5 mL)。将所得混合物在室温下放置5小时，并在5℃放置过夜。向该混合物中添加水中30％乙腈至两倍体积，并用1N盐酸将pH调节至2.5。
通过制备型HPLC纯化衍生物：
柱 Phenomenex, Gemini, 5µ, C18, 110 Å, Axia 250x30 cm
流速： 25 ml/min’
洗脱液： A: 水中0.1% TFA 含有10% 乙腈
B: 水中0.1% TFA 含有 60% 乙腈
梯度： 在40分钟内，20-100% B。
合并纯级分并冻干。将干物质溶解于含有40% 乙腈的水(50 mL)中并加入1 N NaOH至pH = 8，冻干以产生0.28 g标题胰岛素衍生物。
LC-MS (电喷雾): (m+4)/4: 1506.2 (6020.8)。
类似地，制备如下衍生物：
实施例 2, 通用程序 (A) ：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)
LC-MS (电喷雾): m/z = 1610.91 ((m+4)/4). 计算值.: 1610.89。
实施例 3 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
LC-MS (电喷雾): m/z = 1531,35 ((m+4)/4). 计算值.: 1531.29。
类似地，可以制备如下本发明的胰岛素：
实施例 4 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 5 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 6 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 7 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 8 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 9 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 10 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 11 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 12 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 13 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 14 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 15 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 16 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 17 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
类似地，如上所述制备如下衍生物：
实施例 18 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
LC-MS (电喷雾): (m+4)/4: 1506.2 (6020.1)。
类似地，可以如上所述制备如下衍生物：
实施例 19 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 20 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 21 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 22 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 23 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 24 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 25 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 26 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 27 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 28 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 29 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 30 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 31 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 32 ，通用程序 (A):
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1G(N α,N α-二甲基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,GlyB1,CysB3,B16H,B25H],des-ThrB30-胰岛素(人)。
用于制备本发明的酰化胰岛素的氨基甲酰基化的通用程序(B)
将酰化胰岛素溶解在生理pH左右的缓冲液中，并加入过量氰酸钠或氰酸钾。使混合物静置以完成反应。如果需要，加入更多氰酸盐。通过制备型HPLC、离子交换层析或脱盐分离产物。
在下列实施例中示例通用程序(B)。
实施例 33 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
将A10C, A14E, B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素(0.18 g)溶解在0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3 (5 mL)中，并添加氰酸钾(0.12 g)。将混合物在室温下轻轻搅拌16小时。
用1N盐酸将pH调节至1，并通过制备型HPLC纯化该混合物：
柱 Phenomenex, AXIA, 5, C18, 110 , 250x30 cm
流速： 20 ml/min
洗脱液： A: 水中0.1% TFA ; B: 乙腈中0.1% TFA
梯度： 0-7.5 min: 25%B
7.5- 47.5 min: 25%B 至 55%B
47.5 -52.5 min: 55%B
52.5-57.5 min: 55%B 至 100%B
57.5-60 min: 100%B
合并并冻干纯级分。将产物溶解在水(50 mL)中，并用0.1N氢氧化钠将pH调节至8。冻干得到标题胰岛素(70 mg)
LC-MS (电喷雾): m/z = 1588,32 ((m+4)/4). 计算值：1588.59。
实施例 34 ，通用程序 (B):
A1(N α氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α氨基甲酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
将A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素 (300 mg)溶解在磷酸氢二钠缓冲液ph7.5 (2m mL, 0.1M)和乙腈( 3mL)中。用1N氢氧化钠将pH调节至7.5。添加氰酸钾(204 mg)，并将该混合物在室温下轻轻搅拌16小时。将混合物用水稀释至100 mL。用1N盐酸将pH调节至2.2，并通过添加乙腈(20mL)将略浑浊溶液变为澄清。将混合物脱盐：
柱 Daiso_200_15um_FEFgel304_ODDMS_30x250mm
缓冲液A： 10% 乙腈, 水中0.1% TFA
缓冲液B： 60% 乙腈, 水中0.1% TFA 。
将混合物施加到柱上，并用1.5个柱体积(CV)缓冲液A洗脱。将衍生物用缓冲液B, 1.5 CV洗脱，由此将所需衍生物分离在前峰(75 mL)中。
将混合物用水(75 mL)稀释并纯化：
柱 Phenomenex Gemini-NX 5u C18 110A AXIA P 250x30mm
缓冲液A: 水中10% 乙腈+ 0.1% TFA
缓冲液B: 水中60% 乙腈 + 0.1% TFA
流速： 25ml/min
梯度： 在40min 内，20-100%B。
将纯级分合并并冻干。将干物质溶解在40％乙腈(30 mL)中，并用1N氢氧化钠将pH调节至8。冻干得到290 mg标题胰岛素。
LC-MS (电喷雾): m/z: 1513.7 (m+4)/4. 计算值：1513.5。
实施例 35 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B4C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
类似地，如上所述制备胰岛素：
LC-MS (电喷雾): m/z: 1614.4 (m+4)/4. 计算值：1614.9。
实施例 36 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
LC-MS (电喷雾): m/z: 1516.05 (m+4)/4. 计算值：1516.01。
类似地，可以制备如下本发明的胰岛素：
实施例 37 ，通用程序 (B):
A1(N α氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α氨基甲酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 38 ，通用程序 (B):
A1(N α,N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α,N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 39 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 40 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 41 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 42 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 43 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 44 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 45 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 46 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 47 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 48 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 49 ，通用程序 (B):
A1(N α-氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α-氨基甲酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-氨基甲酰基,N{B1}-氨基甲酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
用于制备本发明的酰化胰岛素的N末端酰化的通用程序(C)
将赖氨酸-酰化的胰岛素溶解在任选地含有有机助溶剂的缓冲液中。混合物的pH可以是中性至碱性(例如，约6-8—取决于讨论的胰岛素的溶解性—最高达13或14)，并加入过量的酰化试剂，例如，作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)。使混合物静置以完成反应。如果需要，加入更多酰化试剂。通过制备型HPLC分离产物。
可选择地，反应可以在无水条件下进行，例如，在含有有机碱例如三乙胺的DMSO中。
可以根据通用程序(C)制备如下本发明的胰岛素。
实施例 50 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 51 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 52 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 53 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 54 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 55 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 56 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 57 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 58 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 59 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 60 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 61 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 62 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 63 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 64 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 65 ，通用程序 (C):
A1(N α-乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-乙酰基,N{B1}-乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
用于使用(环状)羧酸酐制备本发明的酰化胰岛素的N末端酰化的通用程序(D)
例如当加入琥珀酸酐、戊二酸酐或二甘醇酸酐时，将赖氨酸-酰化的胰岛素溶解在极性非质子溶剂中，所述极性非质子溶剂任选含有有机碱，如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺和过量的酰化试剂。使混合物静置以完成反应。如果需要，加入更多酰化试剂。例如，通过制备型HPLC或通过阴离子交换层析分离产物。
可选择地，可以如实施例55中所示例的，使用N-羟基琥珀酰亚胺活化的二元酸(或酸酐)在含水介质中进行程序(D)。
可以如通用程序(D)中所述制备如下衍生物：
实施例 66 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 67 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 68 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 69 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 70 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 71 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 72 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 73 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 74 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 75 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 76 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 77 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 78 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 79 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 80 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 81 ，通用程序 (D):
A1(N α-戊二酰基), A10C, A14E, B1(N α-戊二酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-戊二酰基,N{B1}-戊二酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 82 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 83 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 84 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 85 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 86 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基­十七烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 87 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 88 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 89 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]­氨基]­乙氧基]­乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 90 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 91 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 92 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 93 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基­十九烷酰基­氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 94 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 95 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, desB27, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 96 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例 97 ，通用程序 (D):
A1(N α-二羟乙酰基), A10C, A14E, B1(N α-二羟乙酰基), B3C, B16H, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
IUPAC (OpenEye, IUPAC模式) 名称：
N{A1}-二羟乙酰基,N{B1}-二羟乙酰基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]­乙氧基]­乙氧基]­乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。
实施例98，选择的本发明N末端修饰的胰岛素的胰岛素受体亲和力：
通过SPA试验(闪烁亲近试验(Scintillation Proximity Assay))微量滴定板抗体捕获试验来测定本发明的酰化胰岛素类似物对于人胰岛素受体的亲和力。使SPA-PVT抗体结合珠粒，抗小鼠试剂(Amersham Biosciences，目录号PRNQ0017)与25 ml结合缓冲液(100 mM HEPES pH 7.8；100 mM氯化钠，10 mM MgSO4，0.025％Tween-20)混合。关于单个Packard Optiplate(Packard No. 6005190)的试剂混合物由2.4 µl 1:5000稀释的纯化重组人胰岛素受体(含或不含外显子11)、一定量与5000 cpm/100 µl试剂混合物对应的A14Tyr[125I]-人胰岛素母液、12 µl F12抗体的1:1000稀释物、3 ml SPA珠粒和至总共12 ml的结合缓冲液构成。随后向Packard Optiplate中的每个孔加入总共100 µl试剂混合物，并且在Optiplate中制备来自合适样品的N末端修饰的胰岛素的稀释系列。随后使样品在轻轻振荡时孵育16小时。随后通过离心1分钟使各相分离，并且在Topcounter中将板计数。使用GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA)中的非线性回归算法拟合结合数据，亲和力表示为相对(以百分比(%))于人胰岛素的亲和力。
也可采用相关试验，其中结合缓冲液也含有1.5%HSA以模拟生理条件。　
*)没有N末端修饰的实施例1的胰岛素。
实施例 99, 本发明的 N 末端修饰的胰岛素的疏水性：
通过在等度条件(isocratic conditions)下运行的反相HPLC发现N末端修饰的胰岛素的疏水性。在相同条件下比较所述N末端修饰的胰岛素与人胰岛素(本文中称为HI)或具有已知亲水性的另一种衍生物的洗脱时间。疏水性k’rel计算为：k’rel衍生物 = ((t衍生物-t0)/(t参照-t0))*k’rel参照。使用HI作为参照：k’rel参照 = k’relHI = 1。通过注射5 µl 0.1 mM NaNO3测定HPLC系统的空白时间(void time) t0。运行条件：
柱 Lichrosorb RP-C18, 5µm, 4 x 250 mm
缓冲液A： 0.1 M 磷酸钠 pH 7.3, 10 体积% CH3CN
缓冲液B： 50 体积% CH3CN
注射体积： 5 µl
运行时间： 最多 60 分钟。
运行起始梯度后，选择运行衍生物和参照(例如HI)的等度水平，在以上方程中使用在等度条件下所述衍生物和参照物的洗脱时间来计算 k’rel衍生物。
实施例 100 ，采用十二指肠腔酶使胰岛素类似物降解：
采用来自SPD大鼠的十二指肠腔酶(通过过滤十二指肠腔内容物制备)使胰岛素类似物降解。该测定由机器人在96孔板(2ml)中进行，其中16孔用于胰岛素类似物和标准品。37℃下在100 mM Hepes, pH=7.4中胰岛素类似物~15 µM与十二指肠酶孵育，在1、15、30、60、120和240 min后取样并通过加入TFA使反应淬灭。通过RP-HPLC确定各时间点的完整胰岛素类似物。通过数据的指数拟合确定降解半衰期并归一到在各试验中参照胰岛素，A14E, B25H, desB30人胰岛素或人胰岛素的确定的半衰期。为了降解而加入的酶的量使得参照胰岛素的降解半衰期为60 min至180 min。按照胰岛素类似物在大鼠十二指肠中的降解半衰期除以相同试验中参照胰岛素的降解半衰期给出结果(相对的降解速率)。
实施例 101 ，大鼠脂肪细胞中的脂肪生成
作为本发明的胰岛素体外效力的量度，可以使用脂肪生成。
从附睾的脂肪垫(epididymale fat pads)分离原代大鼠脂肪细胞，在包含，例如，0.1 %无脂肪HSA以及或标准品(人胰岛素，HI)或本发明的胰岛素的缓冲液中与3H-葡萄糖孵育。以剂量依赖的方式将标记的葡萄糖转化为可提取的脂质，产生全剂量响应曲线。结果表示为本发明的胰岛素与标准品(HI)相比的具有95％置信区间的相对效力(％)。
数据在上表中给出。
通常对于本发明的测试的胰岛素衍生物，在获得的脂肪生成数据(在0.1% HSA存在的情况下)和在1.5% HSA存在的情况下获得的胰岛素受体数据之间有非常好的一致性，因此验证了受体结合被翻译为受体活化。
实施例 102,脂质制剂中配制的胰岛素衍生物的化学稳定性：
根据此处所述的方案评价脂质制剂中配制的胰岛素衍生物的化学稳定性。
制剂的制备：
制剂的组成(SNEDDS制剂):
待测试的胰岛素(600 nmol/g)
15% 丙二醇
30% 聚山梨醇酯20
55% 单辛酸二甘油单辛酸酯。
将待测试的胰岛素(从pH 7.5冻干)在暗处溶解于丙二醇中达16小时。加入二甘油辛酸酯并搅拌混合物。加入聚山梨醇酯20并将混合物搅拌5分钟。将混合物轻轻搅动，直至其均匀。
然后将各制剂等分至5个密封盒中，并在各种温度下放置多周。实施例给出如下。
试验：
制备样品用于纯度和HMWP分析：
使SNEDDS制剂达到室温。将SNEDDS制剂的各样品稀释于5% (v/v)乙醇中：将25 µl SNEDDS制剂转移到Eppendorf管中，并且记录被转移SNEDDS制剂的重量，然后添加975 µl 5% (v/v)乙醇。将混合物用涡旋器彻底混合。
使用下述方法分析样品的纯度和HMWP含量。
纯度方法：
柱：Waters Acquity CSH C18柱 (2.1x150 mm, 1.7 µm)
波长：215 nm
柱温：50℃
流速：0.3 ml/min
运行时间：60 min
注射体积: 7 µl
洗脱液A：0.09M 磷酸氢二铵 pH 3.6, 10% (v/v) 乙腈
洗脱液B：80% (v/v) 乙腈。
HMWP方法:
柱：Waters Acquity BEH200 SEC柱, 4.6x150 mm
波长：215 nm
流速：0.2 ml/min
运行时间：30 min
柱温：40 ℃
注射体积: 10 µl
洗脱液：55% (v/v) 乙腈, 0.05% TFA。
结果：
下表中列出了分别在5℃和40℃孵育1周和3周后总杂质和HMWP的增加：
制剂A-E含有以下胰岛素衍生物：
A: 没有N末端保护的实施例1和34的化合物：A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素。　
B: 实施例34的化合物：A1(N α氨基甲酰基), A10C, A14E, B1(N α氨基甲酰基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素。　
C: 实施例1的化合物：A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu), desB30人胰岛素。　
D: 没有N末端保护的实施例11的化合物：A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。　
E: 实施例11的化合物：A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
得出结论：N-末端保护保护本发明的类似物免于化学降解(如杂质的出现(形成)所测量)，并且与没有N-末端保护的相似化合物相比，在更大程度上保护本发明的类似物免于HMWP(高分子量产物)的出现(形成)。
在下图中，对于制剂A至E，就作为作为时间(1周和3周)的函数和温度(5℃和40℃)的函数的杂质的形成和HMWP的形成而言，上表中的数据已经被绘制成图。
实施例103，大鼠药代动力学，静脉内大鼠PK：
以各种剂量将胰岛素类似物静脉内(i.v.)给药于麻醉的大鼠并在给药后以4-6小时或最长达48小时或更长的特定间隔使用免疫测定或质谱测定所用化合物的血浆浓度。随后用WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)计算药代动力学参数。
使用称重为约200克的未禁食雄性Wistar大鼠(Taconic)。
测量体重并随后用Hypnorm/多美康(Dormicum)(每种化合物分别在无菌水中以1:1 稀释，然后混合；在实验的当日新鲜制备)麻醉大鼠。使用2 ml/kg Hypnorm/多美康(Doricum)混合物皮下(sc)开始麻醉，然后以30 min间隔给予两次1 ml/kg皮下维持剂量以及以45 min 间隔给予两次1 ml/kg皮下维持剂量。如果需要，为了保持大鼠始终轻度麻醉，提供1-2 ml/kg皮下的进一步剂量。在大鼠容纳室进行称重和初始麻醉以避免将动物从一个房间移到另一房间使它们紧张。
实施例104，大鼠药代动力学，肠内注射后的大鼠PK：
将胰岛素类似物肠内(到空肠)给药于麻醉的大鼠。给药后以4小时或更长的特定间隔测定所用化合物的血浆浓度及血糖变化。随后用WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)计算药代动力学参数。
使用Hypnorm-多美康皮下(0.079 mg/ml枸橼酸芬太尼，2.5 mg/ml氟阿尼酮，和1.25 mg/ml咪达唑仑)将雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic)(称重250-350 g，禁食~18 h)麻醉，2 ml/kg作为初次剂量(测试物质给药前-60 min的时间点)，20 min之后给予1 ml/kg，随后每40 min给予1 ml/kg。
如对于上述填喂模型所配制地来配制在肠内注射模型中待测试的胰岛素。
将麻醉的大鼠置于稳定在37℃恒温垫上。用胰岛素制剂或媒介物充满安装1 ml注射器的20 cm聚乙烯导管。在腹壁进行一个4-5 cm中线切口。通过穿过肠壁将导管从盲肠轻轻插入空肠中间~ 50 cm处。如果存在肠内内容物，将施用部位移动± 10 cm。将导管尖头置于肠段的腔内约2 cm处并在不使用结扎的情况下将其固定。将肠小心地再次放入腹腔内并在各层中用自动夹封闭腹壁和皮肤。在时间0时，通过导管将0.4 ml/kg测试化合物或媒介物给药于大鼠。
为了确定全血血糖浓度，通过将尾尖的毛细血管进行穿刺，将血液样品收集在肝素化的10 μl 毛细管中。在500 μl分析缓冲液中稀释之后，通过葡萄糖氧化酶方法，采用Biosen自动分析仪(EKF Diagnostic Gmbh, Germany)测定血糖浓度。对于每种化合物，得到平均血糖浓度进程(平均值±SEM)。
收集样品以确定血浆胰岛素浓度。将100 μl血液样品吸入包含EDTA的冷管内。将样品保持在冰上直到离心 (7000 rpm, 4℃, 5 min)，将血浆移液到Micronic管中并在20℃冷冻直到测定。在认为对个别类似物合适或有效的免疫测定中测量胰岛素类似物的血浆浓度。
在t=-10(仅对血糖)、t=-1(临给药前)和给药后以4小时或更长的特定间隔收集血液样品。
实施例105，相对于人胰岛素的本发明的酰化的胰岛素类似物的效力
将称重为238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠在实验的当天用于夹钳实验。在可控的环境条件下，使大鼠自由接触饲料，并且禁食过夜(从下午3点)，之后进行夹钳实验。
实验方案：
在进行外科手术之前，使大鼠在动物装置中适应至少1周。在夹钳实验之前约1周，在氟烷麻醉下，将Tygon导管插入到颈静脉(用于输注)和颈动脉(用于采血)中，并且在颈部背后外置并固定。外科手术后将Streptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；0.15 ml/大鼠，肌内(i.m.)) 给予大鼠，在恢复期间将大鼠置于动物护理单元(25℃)中。为了获得镇痛，在麻醉期间施用Anorphin(0.06 mg/大鼠，皮下)，从麻醉中完全恢复(2-3小时)之后，施用Rimadyl(1.5 mg/kg，皮下)，并再次每日施用一次，持续2天。
在实验当天的上午7点，将禁食过夜(从前一天的下午3点开始)的大鼠称重，并与取样注射器和输注系统(Harvard 22 Basic泵，Harvard，和Perfectum Hypodermic玻璃注射器，Aldrich)连接，然后放入独立的夹钳笼中，其中使它们休息约45 min，而后开始实验。在整个实验期间，大鼠能够自由地在其常见的寝具上移动，并且可以自由地接触饮用水。30 min基本时间(在此期间，以10 min间隔测量血浆葡萄糖水平)之后，将待测的N末端修饰的胰岛素和人胰岛素(每只大鼠一个剂量水平，每剂量水平n=6-7)以恒速输注(静脉内)300 min。为了达到血浆的快速稳态水平，任选地施用待测的N末端修饰的胰岛素的初次大剂量输注。基于从静脉内大剂量药代动力学所获得的清除数据，本领域的药代动力学技术人员可以计算初次大剂量输注的剂量。为了保持血糖正常(euglyceamia)，以10 min间隔全程测量血浆葡萄糖水平，并且相应地调节20%葡萄糖水溶液的输注。合并来自每只大鼠的重悬的红细胞样品，并且通过颈动脉导管返还约½ ml体积。
在每个实验的当天，在夹钳实验之前和结束时，获取待测试的各N末端修饰的胰岛素溶液和人胰岛素溶液的样品，并通过HPLC确认肽的浓度。在该研究之前的相应时间点和结束时，测量大鼠胰岛素和C-肽以及待测试的N末端修饰的胰岛素和人胰岛素的血浆浓度。在实验结束时，使用过度剂量的戊巴比妥将大鼠处死。
实施例 106 ，相对于对照N末端修饰的胰岛素的本发明的酰化N末端修饰的胰岛素的效力，皮下施用于大鼠
雄性Sprague-Dawley大鼠(n = 6/组)接受单一皮下剂量的媒介物或胰岛素衍生物(对于具有中间作用持续时间或长期作用持续时间的衍生物分别为50或200 nmol/动物)。对于具有中间作用持续时间或长期作用持续时间的衍生物分别在给药后0、1、2、4、8、24 和 48 或 0、2、4、8、24、48、72、96小时的时间点采集(舌下)血液并收获血浆。测定血浆的葡萄糖。将葡萄糖降低作用计算为作为时间的函数的-Δ血浆葡萄糖的曲线下的面积并与对照N末端修饰的胰岛素比较。
实施例107，犬药代动力学，静脉犬PK：
雄性小猎犬(约12 kg)接受单一静脉内剂量的胰岛素衍生物(2 nmol/kg)。在给药后-0.17、0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、10、12、16、24、32、48、72、96、120、144 和168小时的时间点采集血液并收获血浆。通过夹心免疫测定法或LCMS分析血浆样品。使用WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)通过非房室药代动力学分析来分析血浆浓度-时间曲线。
实施例108，犬药代动力学，口服给药：
雄性小猎犬(约12 kg)接受单一口服剂量的配制在规格00的肠溶包衣胶囊中的胰岛素衍生物(120 nmol/kg)。在给药后0、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、270、300、360、480、600、720、1440分钟(24h)、30h、48h和72h的时间点采集血液并收集血浆。通过夹心免疫试验或LCMS分析血浆样品。使用WinNonlin Professional 5.2 (Phar-sight Inc., Mountain View, CA, USA)，通过非区室药代动力学分析对血浆浓度-时间曲线进行分析。
实施例 109 熔解温度测定
差示扫描量热法(DSC)。
使用VP-DSC差示扫描微量热仪(MicroCal, LLC, Northampton, MA)进行数据收集。在参照室中以1 ℃/min的扫描速率从15 ℃至120 ℃和0.21 MPa的超压用2 mM磷酸盐缓冲液进行所有的蛋白扫描(~200 μM N末端修饰的胰岛素)。在临使用前，将所有样品和参照脱气。在浓度归一化之前，从每次样品扫描中减去缓冲液-缓冲液参照扫描。
DSC数据如图3和4中所示。
实施例 110 ，原纤化趋势的测量
硫磺素T(ThT)原纤化测定的通用方法：
原理
肽的低物理稳定性可以导致淀粉样原纤维的形成，这被观察为样品中非常有序的、线状大分子结构，最终导致凝胶的形成。这在传统上通过目视检查样品而测定。然而，这种测定是非常主观的，取决于观察者。因此，小分子指示探针的应用要优选得多。硫磺素T(ThT)是这种探针，当结合原纤维时具有独特的荧光信号(signature)(Naiki 等人 Anal. Biochem. 177, 244-249, 1989; Le-Vine, Methods Enzymol. 309, 274-284, 1999)。原纤维形成的时程可以通过以下列表示的S形曲线来描述(Nielsen 等人 Biochemistry 40, 6036-6046, 2001)：
化学式VIII。
在这里，F是在时间t的ThT荧光。常数t0是达到最大荧光的50％所需要的时间。描述原纤维形成的两个重要参数是通过计算的滞后时间(lag-time)和表观速率常数。
提示肽的部分折叠中间体的形成是原纤化的一般开始机制。那些中间体中的一些成核(nucleate)而形成模板，在该模板上进一步的中间体可以装配，并且原纤化进行。滞后时间对应间隔，在该间隔中，建立核的临界质量(critical mass)，表观速率常数是原纤维本身形成的速率。
样品制备
每次测定之前新鲜制备样品。每种类似物溶解在2 mM磷酸钠，pH=7.4中。将硫磺素T加入来自水中的储存溶液的样品中至1 µM的终浓度。将200 µl样品等份置于96孔微量滴定板(Packard Optiplate™-96, 白色聚苯乙烯)中。通常将每份样品的4份重复(对应于一个测试条件)置于一列孔中。用Scotch Pad (Qiagen)密封该板。
孵育和荧光测定
在Fluoroskan Ascent FL或Varioskan荧光板读数器(thermo Labsystems)中进行在给定温度的孵育，振荡和ThT荧光发射的测定。将温度调节至37℃。在所有提出的数据中，将轨道振荡调整至960 rpm，幅度为1 mm。使用通过444 nm过滤器的激发和通过485nm过滤器的发射测定进行荧光测定。
通过在测定温度将板孵育10分钟而开始每次运行。每20分钟测定板，通常持续45小时。每次测定之间，如上所述振荡并加热该板。
数据处理
以Microsoft Excel格式保存测定数据点用于进一步处理，使用GraphPad Prism进行曲线绘制及拟合。在原纤维不存在的情况下来自ThT的背景发射是可以忽略的。数据点通常是四份样品的平均值。只有在相同的实验(即在相同的板上的样品)中获得的数据表示在相同的图中，确保一次测定中各个样品之间的原纤化的相对量度，而不是不同的测定之间的比较。
可以将数据组拟合至方程(1)。然而，因为在测定时间期间通常没有获得完整的S形曲线，将原纤化的程度表示为在各个时间点计算为四份样品的平均值并以标准偏差显示的ThT荧光。
对于人胰岛素在上述实验中获得的结果：
对于现有技术的胰岛素衍生物获得的结果。作为两次20 h测定进行ThT测定。从前20 h部分的开始测量规定的时间点。
在与现有技术胰岛素衍生物相同的实验中对于本发明的胰岛素衍生物获得的结果
显而易见的是，在ThT测定中测试原纤化的本发明的胰岛素都没有显示作为时间的函数的增加的荧光(的不存在)所见的任何原纤化的迹象。这是非常不寻常的，这低估了本发明的衍生物的实用性。
实施例111，本发明的胰岛素衍生物的化学稳定性：
在2 mM磷酸盐, pH=7.5中在37℃孵育胰岛素衍生物最长达8周之后评价胰岛素衍生物的化学稳定性。在0、2、4和任选的8周后通过SEC HPLC分析测定高分子量产物(HMWP)的形成。SEC方法的结果表示为作为在215nm处的总吸光度的百分比的在37℃和5℃开始样品的HMWP形成之间的差异。在0、2、4和任选的8周后通过RP HPLC分析测定化学降解产物。RP方法的结果表示为作为在215nm处的总吸光度的百分比的在37℃和5℃开始样品的观察到的化学降解之间的差异。　
SEC-HPLC 方法：
溶剂： 500 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 5 mM H3PO4, 50% (v/v) 2-异丙醇
流速： 0.5 ml/min
运行时间： 30 min
UV检测： 215 nm
柱 来自Waters 的胰岛素HMWP柱 7.8x300mm
温度： 50℃
RP-HPLC 方法：
溶剂A： 0.09M 磷酸盐缓冲液 pH 3.6 (磷酸氢二铵),10% MeCN (v/v)
溶剂B： 80% MeCN (v/v%)
流速： 0.3 ml/min
运行时间： 33 min
UV检测： 215 nm
柱 Waters Acquity BEH130 C18 柱1.7 µm, 150x2.1mm
温度： 50℃
梯度：
可以得出结论，具有与B3的二硫键的s通常比具有与B2或B1的二硫键的s（其更不稳定）更稳定。
实施例 112，X-射线结构测定：
下面给出了结晶条件的实例，然而，对于不同衍生物的确切条件是不同的，可以通过筛选不同的条件发现最佳条件。通过坐滴气相扩散法(the sitting drop vapor diffusion method)从，例如，包含0.8 M K/Na酒石酸盐, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.5% PEG MME 5000的储存溶液获得晶体。使用配备MarCCD检测器的旋转阳极(Rigaku, MicroMax-007HF)收集数据并通过XDS (J Appl Crystallogr 26: 795–800)处理。使用具有作为搜索模型的内部结构(in house structure)的Molrep (J Appl Crystallogr 30: 1022–1025.)通过分子置换解析结构。使用程序Refmac (Acta Crystallogr D 53: 240–255.) 和 Coot (Acta Crystallogr D 60: 2126–2132.)进行数据精炼和模型建立。
实施例 113，盐酸胍变性：
为了测定解折叠的自由能，可以根据圆二色性(CD)光谱法进行选择的包含额外二硫键的N末端修饰的胰岛素的盐酸胍变性。蛋白变性后，远UV范围(240-218-nm)内的负CD逐渐减小，与伴随蛋白解折叠的有序的二级结构的损失一致。人胰岛素的远UV CD谱对蛋白解折叠和自结合(self-association)都敏感(Holladay 等人, 1977 Biochim. Biophys.Acta 494, 245-254.; Melberg & Johnson, 1990, Biochim. Biophys.Acta 494, 245-254.)。为了在pH 8下分开这些现象，在不同的蛋白浓度，例如，3、37和250μM进行GuHCl滴定。在这些浓度，胰岛素类似物主要作为单体，二聚体以及二聚体和更高的聚集体的混合物存在。在近UV范围(330-250-nm)内的胰岛素CD谱反映了具有来自二硫键的贡献的酪氨酸发色团的环境(Morris 等人, 1968, Biochim.Biophys. Acta. 160, 145-155.; Wood 等人, 1975, Biochim. Biophys. Acta. 160, 145-155.; Strickland & Mercola, 1976, Biochemistry 15,3875-3884.)。产生作为变性剂浓度的函数在近UV和远UV区的摩尔椭圆率(molar elipticity)的变化的图。以前从用两种状态模型拟合的这种胰岛素变性曲线计算了解折叠的自由能(Kaarsholm, N.C. 等人 1993 Biochemistry, 32, 10773-8)。
通过UV吸收和/或RP-HPLC和/或SEC-HPLC测定蛋白浓度。通过用10mM Tris/C104-缓冲液，pH8 0组合不同比例的蛋白和GuHCl储存溶液而制备变性样品。蛋白储存溶液通常为10 mM Tris/C104-, pH 8.0中的1.5mM。GuHCl储存溶液为10 mM Tris/C104-, pH 8.0中的8.25 M(通过折光法确定)。在25℃记录所有的CD谱。从250至218 nm扫描远UV CD变性样品。典型的室通路长度和蛋白浓度分别为0.2 cm和37 pM。使用l-cm通路长度和通常75 pM蛋白从330至250 nm扫描近UV CD变性样品。在减去适当的溶剂空白之前通过傅立叶变换算法平滑处理所有的谱。在远UV范围内，Ae基于肽键的摩尔浓度，而在近UV内，将△ε归一化至胰岛素单体的摩尔浓度。
通过假定折叠/解折叠转换是两种状态的而分析GuHCl变性曲线，在这种情况下，可以使用K= (ΔεN- Δε)/(Δε - ΔεU)在每个变性剂浓度获得平衡常数，其中△ε是CD的观察值，△εN和△εU分别代表在给定的GuHCl浓度下对于天然的和解折叠形式的CD值(Pace, C. N. (1975) CRC Crit. Rev. Biochem. 3, 1-43.)。通过将转换之前和之后的基线线性外推至转换区域而获得转换区域中在GuHCl 浓度的△εN和△εU值，即，ΔεN = Δεo N + mN[GuHCl] 和 ΔεU = Δεo U + mU[GuHCl]，其中△εo N和△εo U是截距，且mN和mU分别是转换之前和之后的基线的斜率。通过△G = -RT In K给出转换区中在给定的变性剂浓度的解折叠的自由能。我们假设△G对变性剂浓度的线性依赖：△G = △GH2O- m[GuHCl]，其中△GH2O是在变性剂不存在的情况下△G的值，m是△G对变性剂浓度的依赖的量度。因此，可以将在转换区中从K衍生的△G值回推至0 M变性剂以得到△GH2O。对于完全的解折叠曲线的△ε和[GuHCl]之间的关系如方程1中所示(Santoro, M. M., & Bolen, D. W. (1988) Biochemistry 27,8063-8068.)：
以△ε作为响应，[GuHCl]作为独立变量，使用，例如，PC SAS(SAS Inc., Cary, NC)的NLIN程序将这个方程进行非线性最小二乘方分析(nonlinear least-squares analysis)。然后六参数描述了变性曲线：Δεo N、Δεo U、mN、mU、m、和 ΔGH2O。此外，通过△GH2O/m给出变性曲线的中点的GuHCl浓度Cmid。然后可以从△△GH2O = △GH2O(突变体) - △GH2O(野生型)计算人胰岛素和突变体胰岛素之间解折叠的自由能的差异。
实施例 114 ，精确的完整质量测定：
LC-MS仪器由Acquity UPLC系统(Waters, Milford, MA)和Synapt G2质谱仪(Waters, Milford, MA)组成。将胰岛素衍生物应用到C18反相HPLC柱，并使用0.05％三氟乙酸中乙腈的线性梯度进行分析。将来自HPLC的流直接应用于以正MS的唯一模式(in the positive MS only mode)操作的Synapt G2的电喷雾界面，毛细管电位为2500 V，源温度为110℃，去溶剂化温度为250℃，圆锥气流速(N2)为50 L/h。每秒两次获得m/z=100至m/z=3000的MS谱。分析之前通过NaI的标准混合物校准仪器，在LC-MS分析期间应用亮氨酸脑啡肽的锁定喷雾(lock spray)。使用MaxEnt3算法通过BioPharmaLynx 1.2 (Waters, Milford, MA)重构完整的胰岛素质量。可以使用Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher)代替Synapt G2。以正MS模式操作Orbitrap仪器，源电压为4 kV，源电流为100μA，鞘气流为40，辅助气流为10，扫除气流(sweep gas flow)为5，毛细管电压为20 V。在调整仪器的最佳性能期间调整所有MS参数，这些参数可能与上面给出的那些有轻微偏离。通过这种方法获得的质量准确度优于10 ppm。　
柱 Acquity BEH C18 1x150 mm, 1.7 µm (Waters)
流速： 0.1 ml/min
缓冲液A： 0.02% (v/v) 或 0.05% (v/v) TFA
缓冲液B： 乙腈中0.02% (v/v) 或 0.04% (v/v) TFA
梯度： 5% B，持续2 min; 在12 min内，5%B至50%B，在1 min内，50%B至90%B
UV检测： 215 nm。

Claims (15)

1.N末端修饰的胰岛素，其由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成，其中所述肽部分具有至少一个不存在于人胰岛素中的二硫键。
2.N末端修饰的胰岛素，其由肽部分、N末端修饰基团和白蛋白结合部分组成，其中所述肽部分具有两个或更多个半胱氨酸取代，且保留了人胰岛素的三个二硫键。
3.根据权利要求1或2的N末端修饰的胰岛素，其中以这样的方式选择半胱氨酸取代的位点，所述方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的N末端修饰的胰岛素的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，并且其中所述N末端修饰的胰岛素具有具有相同肽部分、相同N末端修饰基团和相同白蛋白结合部分、但不具有不存在于人胰岛素中的任何二硫键的胰岛素肽的胰岛素受体亲和力的至少5%。
4.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中，所述修饰基团是一个或两个有机取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量(MW)，且缀合于亲本胰岛素的N末端。
5.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中修饰基团在化学式V (针对A链N末端图示)中指定为Y’和Z：
且其中Y’和Z连接至胰岛素肽的N末端氨基酸。
6.根据权利要求5的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二甲基铵、二乙基铵或二丙基铵、CO2H或-OCH2CO2H取代的直链或支链的C2-C4烷基，C5-C6环烷基，取代的C5-C6环烷基，5或6元饱和杂环基，取代的5或6元饱和杂环基，且
X是O或S。
7.根据权利要求5或6的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是不同的，且
Y’是R-C(=X)-，
Z是H，
R是H，NH2，直链或支链的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO2H取代的C1-C4烷基，且
X是O。
8.根据权利要求5的N末端修饰的胰岛素，其中Y’和Z是相同的且是甲基。
9.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述N末端修饰基团选自：N,N-二甲基、N,N-二乙基、氨基甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊二酰基和二羟乙酰基。
10.根据权利要求2-9中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中半胱氨酸取代的位置是A10C和B3C。
11.根据权利要求2-10中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中除了两个或更多个半胱氨酸取代以外，所述肽部分包含选自以下的一个或多个取代的氨基酸：A14E、B16H、B25H、desB27和desB30。
12.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述肽部分选自：A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30人胰岛素; A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30人胰岛素; A10C, A14E, B3C, B25H, desB30人胰岛素; A10C, A14E, B3C, desB27, desB30人胰岛素; A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30人胰岛素; A10C, A14E, B16H, desB27, desB30人胰岛素。
13.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其中所述白蛋白结合部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (化学式IV)，
其中
n为0或1-3范围内的整数；
m为0或1-10范围内的整数；
p为0或1-10范围内的整数；
Acy是包含约14个-约20个碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸；
AA1是中性的线性或环状氨基酸残基；
AA2是酸性氨基酸残基；
AA3是中性的含烷撑二醇的氨基酸残基；
AA1、AA2和AA3在所述式中出现的顺序可以独立地互换；AA2可以沿所述式出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；AA2可以沿所述式独立地(=不同的)出现数次(例如，Acy-AA2-AA32-AA2-)；Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，所述酰胺(肽)键形式上可通过除去Acy、AA1、AA2 和AA3各自的氢原子或羟基(水)来获得；且与肽部分的连接可以来自化学式IV酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自化学式IV部分中存在的AA2残基的一个或多个侧链中的一个。
14.根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素，其选自：
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, desB27, B29K(N ε十八烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素
A1(N α,N α-二甲基), A10C, A14E, B1(N α,N α-二甲基), B3C, B25H, B29K(N ε二十烷二酰基-gGlu-2xOEG), desB30人胰岛素。
15.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的N末端修饰的胰岛素。
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