CN117337299A - 葡萄糖响应性胰岛素类似物葡萄糖传感器的分子设计 - Google Patents

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Abstract

提供了双链胰岛素类似物，其包括(a)通过添加C‑末端二醇元件修饰的B链与(b)附接至A链的N‑末端处或附近，任选地连接至D‑氨基酸的葡萄糖结合元件相组合。还提供了一组“翻转”的胰岛素类似物，其中A链通过添加N‑末端二醇元件进行修饰，而葡萄糖结合元件被附接至B链的C末端处或附近。包括此类胰岛素类似物的组合物用于治疗患有糖尿病的患者的方法中。

Description

葡萄糖响应性胰岛素类似物葡萄糖传感器的分子设计
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月3日提交的美国临时专利申请号63/183325的优先权，其公开内容明确并入本文。
政府权利
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的DK127761和DK040949下的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。通过援引并入以电子方式提交的材料
与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过援引以其全文并入，并标识如下：65KB ACII(文本)文件，命名为“354919_ST25.txt”，创建于2022年5月3日。
背景技术
非标准蛋白(包括治疗剂和疫苗)的工程化，可能具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白——如通常在人类、其他哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中编码的——可能已经进化到在细胞环境中发挥最佳功能，但对于治疗应用而言可能不是理想的。此类蛋白的类似物可以表现出改善的生物物理、生物化学或生物学特性。蛋白类似物的益处将是实现活性增强(诸如导致高血糖条件下血糖浓度降低的代谢的代谢调节)，以及减少不利影响(例如诱导低血糖或其恶化)。
治疗性蛋白的实例由胰岛素提供。野生型人胰岛素和其他哺乳动物的基因组中编码的胰岛素分子与多个器官和不同类型细胞中的胰岛素受体结合，无论受体亚型是通过RNA剪接的选择性模式或通过翻译后糖基化的选择性模式产生的。医学获益的实例将是可溶性胰岛素类似物的非标准设计，其对靶细胞表面上的胰岛素受体具有固有亲和力，因此其生物效力将取决于血流中葡萄糖的浓度。这样的类似物可以具有随葡萄糖浓度而改变的三维构象和/或可以具有与抑制性分子实体的共价键，其在高葡萄糖浓度下脱离。尽管本领域目前尚不知如何设计此类假定的类似物，但这类长期寻找的蛋白类似物或蛋白衍生物统称为“葡萄糖响应性胰岛素”(GRI)。
胰岛素分子包含两条链，包含21个残基的A链，以及包含30个残基的B链。成熟激素源自较长的单链前体，称为胰岛素原，如图1A所示。图1B描绘了胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序连接肽(C-结构域)组成。同时，图1C是人胰岛素序列的示意图，包括A链和B链的二硫键连接。胰岛素分子中的特定残基由氨基酸类型(通常以标准三字母代码表示；例如，Lys和Ala表示赖氨酸和丙氨酸)和上标链(A或B)以及在该链中的位置表示；或以单字母代码；例如，A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y分别表示丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，人胰岛素B链的位置14处的丙氨酸由AlaB14或A B14表示，以及同样地，赖脯胰岛素(的活性成分；Eli Lillyand Co.)的位置B28处的赖氨酸由LysB28或K B28表示。氨基酸(除了甘氨酸)是手性的，并且构型指定为L或D；除非另有说明，否则假定是L。D-氨基酸以三字母代码表示为“D-Cys”或“D-Ala”(等)；使用小体大写字母“D”(d)是为了避免与作为Asp代码的“D”产生歧义。可选地，D-氨基酸以单字母代码表示为“dC”或“dA”(等)，通常在序列串的括号内。
尽管胰岛素激素以Zn2+稳定的六聚体形式储存在胰腺β细胞中，但它在血液中作为不含Zn2+的单体发挥作用。胰岛素单体的三维结构如图2所示为带状模型。与本发明的逻辑相关的是B链的C末端(B30)与A链的N末端(A1)接近，通常接合成盐桥(图3A)。B链C-末端(来自B30或来自邻近残基B28、B29、B31或B32)与A链B末端的共价栓系阻断激素与胰岛素受体的结合(图3B)；这种栓系阻断受体接合的构象转换。将四个或更多个残基插入缩短的C结构域恢复受体结合和激动剂活性。因此，本文认识到，通过使用可逆的共价键合控制C-末端B链在其闭合(无活性)和开放(活性)形式下的一个或多个构像的，为配体控制的葡萄糖响应性提供了机会(图3C；Chen,Y.S.,等人，Proceedings of the National Academy ofSciences,118(30)(2021))。
本发明的一方面涉及氨基酸的手性。虽然甘氨酸是非手性的，但生物合成蛋白通常由L-氨基酸组成，其中手性中心是氨基酸的α-碳。本发明的特征是葡萄糖调节的构象转换的元件—即，附接至一条链的葡萄糖结合元件和附接至另一条链的二醇或一组二醇—可以附接至D-氨基酸，使得转换元件空间中的位置被优化，并且在结合葡萄糖时，对受体结合亲和力的干扰最小。本领域已知的扰乱受体结合的D-氨基酸置换的实例通过用D-Ala置换GlyB8来提供(Nakagawa,S.等人，Biochemistry 44(13),4984-99(2005))。本领域已知的增强受体结合的D-氨基酸置换的实例通过用D-Phe置换PheB24提供(Mirmira,R.,and Tager,H.S.J.Biol.Chem.264(11),6349-54(1989))。与转换元件的位置相关，用D-氨基酸置换GlyA1通常保留受体结合亲和力，而用L-氨基酸置换GlyA1通常损害受体结合亲和力(Wan,Z.L.and Liang,D.C.Scientia Sinica 31(12),1426-38(1988)；Wan,Z.L.and Liang,D.C.Scientia Sinica 33(7),810-20(1990))。
长期以来，胰岛素的给药已被证实为糖尿病的治疗方法。糖尿病患者的常规胰岛素替代疗法的主要目标是严格控制血糖浓度，以防止其超出或低于健康人受试者的正常范围特征。超出正常范围的偏移与微血管疾病的长期风险增加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、目盲和肾衰竭。糖尿病患者的低血糖是胰岛素替代疗法的常见并发症，重度时可以导致显著发病率(包括精神状态改变、意识丧失、惊厥和死亡)。事实上，对此类并发症的恐惧对患者(和医生)获得严格控制血糖浓度(即在正常范围内或略高于正常范围的偏移)的努力造成主要障碍，以及在长期患有2型糖尿病的患者中，此类努力(“严格控制”)可能导致死亡率增加。除了以上重度低血糖(称为神经低血糖效应)后果外，轻度低血糖可能活化反调节机制，包括交感神经系统过度活化，导致焦虑和颤抖(称为肾上腺素能的症状)。然而，糖尿病患者可能不表现出此类警告体征，这被称为低血糖性意识障碍(hypoglycemicunawareness)的病症。轻度低血糖症的无症状增加严重低血糖及其相关的发病率和死亡率的风险。
低血糖的多次和反复发作还与慢性认知能力下降有关，这是长期糖尿病患者痴呆患病率增加的潜在机制。因此，迫切需要新的糖尿病治疗技术，以降低低血糖风险，同时防止血糖浓度上升至超出正常范围。
为了减轻使用胰岛素治疗的患者的低血糖威胁，已开发多种技术。所有此类努力的基础是建立于对患者(及其家人)进行关于低血糖症状的教育，并且在认识此类症状后，即刻摄取富含葡萄糖、蔗糖或其他快速消化形式的碳水化合物；添加有蔗糖(甘蔗糖)的橙汁就是一种实例。这种基线方法已经通过开发特定的糖尿病导向型产品而得到扩展，所述产品诸如包含包含葡萄糖的乳液的可挤压管，其可以通过口腔、咽喉、胃和小肠的粘膜的形式快速吸收。反调节激素胰高血糖素制剂以粉末形式提供，同样已开发成适合快速溶解和皮下注射的形式，作为重度低血糖的紧急治疗。胰岛素泵已与连续葡萄糖监视器相连，使得在遇到间质葡萄糖浓度的低血糖读数时停止皮下注射胰岛素并发出警报。这种基于装置的方法导致闭环系统的实验测试，其中泵和监视器与基于计算机的算法相结合，成为“人工胰腺”。
三十多年来，人们一直对开发与胰岛素类似物或经修饰的胰岛素分子共同给药的葡萄糖响应性材料感兴趣，其能使皮下储库释放激素的速率取决于间质葡萄糖浓度。此类系统通常包含葡萄糖响应性聚合物、凝胶或其他封装材料；并且可能还需要胰岛素衍生物，其包含能够使激素与上述材料结合的修饰。皮下注射部位处的间质液中环境葡萄糖浓度的增加可以通过激素的竞争性替代或通过聚合物、凝胶或其他封装材料的物理-化学性质的变化来替代结合的胰岛素或胰岛素衍生物。此类系统的目标是为封装的或凝胶包衣的皮下储库提供内在的自动调节特征，使得当环境葡萄糖浓度在正常范围内或低于正常范围时，通过延迟释放胰岛素来减轻低血糖风险。迄今为止，尚无此类葡萄糖反应系统在临床使用。
最近的技术利用修饰的胰岛素分子的结构，任选地与载体分子结合，使得修饰的胰岛素分子和载体之间的复合物是可溶的并且可以进入血流。该概念不同于葡萄糖响应性储库，在其中当游离激素进入血流时，聚合物、凝胶或其他封装材料保留在皮下储库中。该方法的实施方案是本领域已知的，其中A链在其N-末端处或附近经修饰(利用残基A1的α-氨基或经由在位置A2、A3、A4或A5处置换的赖氨酸的ε-氨基基团)以包含“亲和配体”(定义为糖部分或包含二醇的部分)，B链在其N-末端或附近经修饰(利用残基B1的α-氨基或经由在位置B2、B3、B4或B5处置换的赖氨酸的ε-氨基)以包含“单价葡萄糖结合剂”。在本说明书中，示例性或设想的葡萄糖结合剂(单体凝集素结构域、DNA适体或肽适体)的大尺寸限制了它们在如上定义的B链的N-末端区段的放置。在缺乏外源葡萄糖或其他外源糖的情况下，A1连接的亲和配体和B1连接的葡萄糖结合剂之间的分子内相互作用被设想为“封闭”激素的结构，从而损害其活性。仅报道了此类分子设计的适度葡萄糖反应特性。在此类类似物中，B1连接的试剂通常与胰岛素本身一样大或更大。
通过亲和配体在残基A1处或附近修饰并同时通过大葡萄糖结合剂(即大小类似于或大于胰岛素A或B链)在残基B1处或附近修饰的胰岛素类似物的次优特性是可能是此类分子设计所固有的。在以上类别的胰岛素类似物中，被忽视的是可选类型的葡萄糖调节的转换的潜在优势，其专门在B链内经工程化，而其氨基末端未经修饰，并且也无需结构或组成与胰岛素无关的大结构域。因此，本发明的胰岛素类似物符合四种设计方案中的一种，其共有以下特性：(a)在不存在葡萄糖的情况下，修饰的胰岛素在与胰岛素受体的结合方面表现出明显损害，而(b)在存在高浓度葡萄糖的情况下，与经二醇修饰的B链共价键的断裂导致活性的激素构象或释放活性激素类似物(图4)。值得注意的是，目前公开的胰岛素分子的设计修饰在每种情况下均小于天然A链或B链。
出乎意料的是，申请人发现这种根本不同类别的分子设计可以最佳地提供胰岛素分子的非活性和活性状态之间的葡萄糖依赖性构象转换，而没有上述缺点。B链在其C末端或附近的新型二醇修饰先前已公开于美国临时申请63/104,196，名称为“葡萄糖响应性和葡萄糖可切割的胰岛素类似物的分子设计”；其通过援引并入本文。通过葡萄糖将胰岛素二醇从A链连接的葡萄糖结合元件上置换，将导致栓系的分子实体分离，从而实现高亲和力受体结合；如图4和图5所示，并且在分子水平上，其中3-氟苯基硼酸(3fPBA)与二羟基苯甲酸(DHBA)和其他包含1,2-二醇的化合物可逆结合(图6A-6D)。
本公开涉及包含葡萄糖调节的分子结构或葡萄糖可脱离的分子部分的多肽激素类似物，其分别被设计成(a)赋予对同源细胞受体的葡萄糖响应性结合和/或(b)实现葡萄糖介导的活性胰岛素类似物的释放。更具体地，在一个实施方案中，本公开侧重于通过掺入含双硼的葡萄糖结合元件(GBE)的经修饰的A链的新组合，其通过两个硼酸部分结合到一个葡萄糖分子的一种或多种相互作用提供用于选择性结合葡萄糖的增加的机会(图6B)，从而实现设计和发现新型葡萄糖响应性胰岛素(GRI)。
在一个实施方案中，本公开涉及本文公开的胰岛素类似物通过皮下、腹腔或静脉内注射用于治疗患有1型或2型糖尿病的患者和非人哺乳动物的用途。
本发明的胰岛素类似物还可以表现出其他增强的药物特性，例如增加的热力学稳定性、增强的对高于室温的热纤颤的抗性、降低的促有丝分裂性和/或改变的药代动力学和药效学特性。更具体地，本发明涉及可以赋予快速作用(相对于其常规可溶制剂形式的野生型胰岛素)、中等作用(与本领域已知的NPH胰岛素制剂相当)或持久作用(与本领域已知的基础胰岛素相当，例如地特胰岛素和甘精胰岛素)，使得与以低于生理范围的浓度(<80mg/dL；低血糖)溶解于包含葡萄糖的溶液中时相比，当以高于生理范围的浓度(>140mg/dL；高血糖)溶解于包含葡萄糖的溶液中时，所述类似物对胰岛素受体的亲和力更高。
发明内容
因此，本发明的一方面提供了胰岛素类似物，其在低血糖条件下无活性或表现出降低的、延长的活性，但在高葡萄糖浓度下被活化，因此可以以高亲和力与胰岛素受体结合。本发明的类似物包含两个基本元件。第一元件是在B链C-末端区段(残基B27-B30或如附接至延伸的B链残基B31或B32)中的包含二醇的侧链和/或在B链中的C-末端主链二醇；第二元件是附接在A链的N-末端处或附近的葡萄糖结合元件(GBE)。该总体方案如图3C、4、5和6A-6D所示。可选地，在可选的实施方案(称为“翻转的”)中，包含二醇的侧链位于A链的N-末端处或附近，并且GBE附接至位于B链的C末端处或附近的氨基酸，如图6D所示。
本公开的一个实施方案涉及设计和合成包含修饰的A链的葡萄糖响应性胰岛素(GRI)，使得成对的含硼部分(BCM)被栓系在N-末端残基(位置A1)处或附近；B链经修饰以在其C末端或附近包含任意化学组成的二醇加合物。本文公开了用于合成包含成对的BCM的A链类似物的特定连接策略和化学方法。BCM可以包括基于苯基-硼酸(PBA)的单体二醇结合子(如图7所示)，其包含羧酸根基团(顶行)、氨基基团(中行)和醛基基团(底行)柄，用作单体文库输入。BCM还可以包括硼酸酯，例如苯并氧杂硼杂环戊烯(Bxb)，或PBA和Bxb元件的组合。此类输入将与双官能支架反应，以产生成对的BCM，从而提供双硼酸GBE(图6B-6D、8)，所述双官能支架单独构建或使用基于接头的化学物质通过固相肽合成制备。GBE特别地位于A链的N末端处或附近，任选地包括位置A1处氨基酸侧链的D构型修饰和/或A链的一个残基、两个残基或三个残基的N-末端延伸(分别指定位置A0、A-1和A-2)处侧链的修饰。
因此，本发明的A链可以是标准的21个残基长度或包含一个残基(A0)、两个残基(A-1-A0)或三个残基(A-2-A-1-A0)的N-末端延伸，如图5所示；或包含(如胰岛素样生长因子；IGF)1-5个残基的C-末端延伸，可能增强胰岛素类似物的生物物理或生化特性。本发明的B链同样可以是标准的30个残基长度或可以包含残基B30、B29-B30、B28-B30或B27-B30的缺失；或可以包含延伸以包含另外的残基B31或另外的残基B31-B32，如本领域已知的。这些B链的C-末端可以携带羧酸酯(如在常规肽中)或经修饰以包含主链二醇。
根据一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其包括胰岛素A链和胰岛素B链，其中该胰岛素A链包含在位置A1或A0处的D-氨基酸和葡萄糖结合元件，所述葡萄糖结合元件共价连接到胰岛素A链N末端处或附近，任选地附接至在位置A1或A0处的氨基酸的侧链；该胰岛素B链包含在胰岛素B链的C末端处或附近的二醇基团，任选地其中带有二醇的部分连接至在位置B28、B29或B30处的氨基酸的侧链，或其中二醇基团是修饰的C-末端氨基酸，其(a)带有侧链羟基基团和(b)其C-末端羧基基团被CH2OH替代，使得两个羟基基团可以一起与A链连接的结合。
在一个实施方案中，葡萄糖结合元件共价连接至A链的氨基酸的侧链，任选地其中带有葡萄糖结合元件的氨基酸是D-氨基酸。在一个实施方案中，葡萄糖结合元件包含两个或更多个含硼部分。在一个实施方案中，葡萄糖结合元件包含两个含硼部分，其中两个含硼部分彼此连接(在多肽的外部)，其中成对的含硼部分相同或不同。根据一个实施方案，含硼的二醇结合元件选自图7中公开的那些中的任一种，并且在一个实施方案中，含硼部分选自苯基硼酸(BCM1)元件和苯并硼杂环戊烯(Bxb)，如在BCM 2-4中。虽然不希望受到理论的束缚，但我们设想了含硼的二醇结合部分(各自包含一个或多个硼原子)的成对和高阶组合将增强(a)含硼部分与葡萄糖分子的这种组合的亲合力(avidity)和亲和力(affinity)，和(b)作为环境葡萄糖浓度函数的激素活性的葡萄糖依赖性活化的协同性。增强的协同性反过来将赋予血糖作为血糖浓度函数的更有效的转换样调节，这是减轻糖尿病患者低血糖风险的有利特性。作为分离的小分子，单独的含硼的二醇结合部分是本领域已知的(有关综述，参见Williams,G.T.,Kedge,J.L.,and Fossey,J.S.Molecular Boronic Acid-BasedSaccharide Sensors.ACS Sens.6(4),1508-28(2021))。
在另一个实施方案中，本公开的带有葡萄糖结合元件的胰岛素A链包括位于N-末端的单个氨基酸，其经由肽键与带有葡萄糖结合元件的氨基酸的α-氨基连接，如图5和6A中公开的。在一个实施方案中，位于带有葡萄糖结合元件的A链的N-末端处的氨基酸是L或D构型标准20个氨基酸中的任一种，在另一个实施方案中，N-末端氨基酸是脂肪族氨基酸，其选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸，并且在又一个实施方案中，带有葡萄糖结合元件的A链的N-末端氨基酸是甘氨酸。在还一个实施方案中，带有葡萄糖结合元件的A链的N-末端氨基酸是D-构型，如图10B、11A和12C中所描述的。
在又一个实施方案中，本公开的胰岛素类似物包含截短的B链，缺失残基B30、残基B29-B30、残基B28-B30、残基B27-B30或残基B26-B30，其中二醇基团位于截短的B链的C末端。在另一个实施方案中，天然B链延伸一个或两个氨基酸，其中二醇基团位于延伸的B链的C末端，任选地与经二醇修饰的侧链结合。
根据一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其中
胰岛素A链是选自由以下组成的组的多肽：
X-1X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:4)
X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)，和
X70IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:83)其中
X-1是任意氨基酸，任选地其中X-1是Gly；
X0是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
X1是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
X6和X11各自是Cys或硒代半胱氨酸；和
X8是Thr、His、Lys、Arg或Glu；
X70是D-氨基酸，所述D-氨基酸包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
进一步地，其中X-1、X0和X1中的至少一个处于D构象；和
胰岛素B链是选自由以下组成的组的多肽：
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，和
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX51(SEQ ID NO:7)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是Orn、Glu Asp、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。
在一个实施方案中，胰岛素B链是包括以下序列的多肽
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys或Pro；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。在进一步的实施方案中，X49和X51均是包含二醇的经修饰的氨基酸。
附图说明
图1A是人胰岛素原序列(SEQ ID NO:1)的示意图，包括A链和B链以及显示有侧翼二碱基切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)的连接区。
图1B是胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。
图1C是人胰岛素序列的示意图，包括A链(SEQ ID NO:2)和B链(SEQ ID NO:3)，并指示B链中残基B27和B30的位置。
图2是胰岛素的柱状模型，其中显示了TyrB16、PheB25和TyrB26的侧链。A链带和B链带分别以浅灰色和深灰色显示。
图3A提供了带状/柱状图，突出显示了在野生型胰岛素晶体学原聚体的子集中观察到的B链(在B30处，其负电荷被描绘为圆圈内的负号-)的C-末端羧酸酯和A链(其正电荷被描绘为圆圈内的加号+)的α-氨基基团之间的潜在盐桥。
图3B提供了带状/柱状图，突出显示了B链的C-末端羧酸酯和A链的α-氨基之间的肽酰胺键(框)，如在无活性的单链胰岛素类似物中观察到的。
图3C提供了通用方案，其中包含与相邻羟基基团(其可以在侧链上或经由一个或多个插入原子附接至主链氮)组合的主链羟基基团(框内)的经二醇修饰的B链与A链(马蹄形)的N-末端处或附近的葡萄糖结合元件组合。
图4提供了单糖响应性胰岛素的设计方案。显示了闭合无活性胰岛素(T状态单体，左)的带状模型(其旁边有游离葡萄糖分子)；灰色框突出显示修饰位点(马蹄形表示葡萄糖结合元件；菱形表示内部二醇)。设想的葡萄糖调节构象循环，其中单糖充当竞争性配体，以调节闭合状态(在不存在配体的情况下无活性)和开放状态(在存在配体的情况下有活性)之间的构象转换。
图5示出了胰岛素的序列，显示了A链(浅色；SEQ ID NO:2)和B链(深色；SEQ IDNO:3)，其中化学修饰位点(下划线)包括A链N-末端残基A-1、A0和GlyA1以及B链残基Y B26-TB30以影响单糖响应性。氨基酸残基使用其标准单字母代码进行标记。葡萄糖结合元件(马蹄形)被设置在A链N-末端(位置A0、A1)以及A8处。多元醇结合基团(菱形)被设置在B链C-末端(位置B26-B30)，通过侧链位置或主链酰胺氮原子进行修饰。
图6A描绘了位于A链N-末端处或附近的3-氟苯基硼酸(3fPBA)与位于B链C末端中的二羟基苯甲酸(DHBA)之间的可逆相互作用。硼酸和二醇部分之间的这种可逆相互作用有助于闭合“无活性”和开放“活性”胰岛素构象之间的构象转换。
图6B描绘了当通过适当放置的接头附接时双硼酸优先葡萄糖结合的基础(曲线)(Norrlid,1995)。
图6C提供了GRI-1及其在闭合状态(左)和开放状态(右)之间的构象转换的分子示意图。
图6D示出了“翻转的”实施方案，其中GBE附接在B链的C末端处或附近，而一个或多个二醇部分附接在A链的N末端处或附近。
图7示出了基于苯基-硼酸(PBA)的单体结构，其包含羧酸根基团(顶行，BCM1-4)、氨基基团(中行，BCM5-8)和醛基基团(底行，BCM9-12)柄用作单体文库输入。此类输入将与双官能接头和基于接头的化学物质反应，产生成对的含硼单体(BCM)，从而提供双硼酸葡萄糖结合元件(GBE)。
图8示出了用于葡萄糖结合元件优化和框架的两种不同且新颖的策略，其结合了基于分支聚体的接头支架方法或串联主链设计构型。
图9示出了将含醛BCM(9-12)掺入胰岛素A链中A-1、A0、A1位置的主链酰胺氮上，作为串联主链修饰的可选方法，其直接修饰这些优选位置的主链酰胺键。
图10A描绘了在固相树脂(参见图12A)上制备的潜在葡萄糖传感器，其包含通过分别具有四(4)、六(6)和六(6)个原子间隔子的接头附接的对称的成对的含硼单体(BCM2)。每个成对的BCM具有基于硫醇的柄，用于化学选择性缀合反应到胰岛素框架上专门设计和定位的SH反应基团上，如图12B、13、14所示，并应用于GRI 1-4的合成。每个成对的BCM包含针对硼酸对单糖的固有选择性的结构设计，以及两个苯基硼酸如何通过空间配置和分子互补性提供葡萄糖选择性的途径。这种布置的一般结构采用通过二氨基丙酰-半胱氨酰接头结合的对称苯并硼杂环戊烯(BCM2)单元，有或没有表示为(GBE1-C、GBE2-C和GBE3-C)的插入氨基酸，以增强葡萄糖结合。
图10B提供了成对的BCM组合设计的一般方案，示出了携带C-末端Cys残基的三(3)个不同分支聚体构型，其提供“硫醇柄”(经由基于硝基吡啶基-硫基的活化，图12B)以在A链N-末端处或附近产生与DL-Cys(A0)(上行)或D-Cys(A1)(下行)的单链氨基基团的二硫键。左上图和下图示出了Dap(n＝1)或Dab(N＝2)接头支架的使用，其氨基基团可以用包含BCM 1-4的羧酸酯选择性且明确地修饰，以制备对称或不对称的成对BCM。中间和右侧两幅图示出了类似的设计策略，但还包括N-末端氨基酸插入(中右侧)或侧链氨基酸插入(最右侧)，其中R代表任意蛋白原性L-氨基酸或D-氨基酸的单链。此类变化有助于将GBE优化成特定目标多元醇基团(即葡萄糖或果糖选择性)。右侧两幅图示出了用BCM 1-4修饰的A链N-端，同时A0或A1处的单链氨基通过包含任意蛋白原性L-氨基酸或D-氨基酸的单个残基在B链N-端上延伸。在所有情况下，BCM 1至5均可以选择性且明确地偶联至任意指示的位置。
图11A提供了成对的BCM的组合设计的一般方案，示出了三(3)种不同的分支聚体构型，使得GBE通过酰胺键连接至碱性氨基酸(例如，Dap、Dab、Orn或Lys；左图，分别n＝1-4)的侧链氨基基团。左图示出了N-末端氨基酸插入(最左侧)或侧链氨基酸插入(左侧第二个)，其中R代表任意蛋白原性L-氨基酸或D-氨基酸或非天然氨基酸的单链。此类变化有助于将GBE优化成特定目标多元醇基团(即葡萄糖或果糖选择性)。中间两幅图示出了用BCM1-4修饰A链N-端进行的修饰，同时A0或A1处的侧链氨基基团通过任意蛋白原性L-氨基酸或D-氨基酸延伸一个残基。最右侧结构示出了用碱性氨基酸对A0和A1位置进行精密加工(elaboration)，以将GBE1-4设置在两个位置上，其中A-1是任意L-氨基酸。在所有情况下，BCM 1-4均可以选择性且明确地偶联至这五个氨基位置中的任意一个。
图11B提供了葡萄糖结合元件(GBE)的明确结构，其被定义为GBE1、GBE2、GBE3、GBE4、GBE5和GBE6,包含附接至分支聚体(Dap和Dab)的成对的BCM2基团。在GBE 1和4中，BCM直接连接至Dap或Dab氨基基团的两个氨基基团，如左图所示。GBE 2和5(中图)与GBE 1和4的不同之处在于，Dap(n＝1)或Dab(n＝2)的α氨基基团在与成对的BCM2偶联之前用氨基酸甘氨酸进行修饰，分别表示为BCM2-Xxx-Dap(BCM2)-OH(GBE2)和BCM2-Dab(BCM2-Xxx)-OH(GBE5)，其中Xxx＝Gly。GBE 3和6(左图)与GBE 1和4的不同之处在于，在与成对的BCM2偶联之前，Dap(n＝1)或Dab(n＝2)的侧链氨基基团用氨基酸修饰，分别表示为BCM2-Xxx-Dab(BCM2)-OH(GBE3)和BCM2-Dab(BCM2-Xxx)-OH(GBE6)，其中Xxx＝甘氨酸。Xxx的使用表明任意其他L-AA、D-AA或非天然AA的置换将产生独特的GBE，从而使得调节每个GBE与葡萄糖、其他单糖或多糖的亲和力和选择性的结合特性成为可能。
图11C提供了成对将的BCM2对称置于Dap(n＝1)或Dab(n＝2)的氨基基团上，以在胰岛素A链的胰岛素序列的位置A0(被Dap替代)或A1(被D-Dap替代)处产生侧链酰胺连接的GBEl至GBE6的六个具体实例。
图12A描绘了用于固相合成葡萄糖结合元件(GBE)的反应方案，本文明确构建GBE1-6以将(1)GBE 4、5、6连接至胰岛素序列上的A0和A1位置处的Dab A0和D-Dab的侧链氨基基团上(另见图15和16)，(2)到八肽序列，GFFYTX(GBE1-6)PT(SEQ ID NO:41)上，其代表赖脯胰岛素(KP)残基B23-B30的八肽(8P)序列，其中X＝Lys、Orn、Dab和Dap，以及(3)任意“酸”(即Wang、Cl-Trtyl)或“酰胺”(即Rink、RAM、氨甲基)官能化固体支持物。使用Dap或D-Dap的类似方法将GBE 1、2和3设置在胰岛素类似物的A0和A1位置上。
图12B描绘了采用图12A所示的反应方案，但在最左列中使用Fmoc-Dap(Fmoc)-OH代替Fmoc-Dab(Fmoc)-OH，在H-Cys(Trt)-O-Wang或H-Cys(Trt)-O-Cl-Trt-树脂上制备的所得分子GBE1-Cys(SH)-OH。使用DBNP(2,2-二硫代双(5-硝基吡啶))的TFA溶液活化GBE1-Cys(SH)-OH的游离SH基团，生成GBE1-C(Npys)-OH，然后使其与Cys(SH)A0或dCys(SH)A1合成的胰岛素前体缀合，以产生二硫键连接的GBE-胰岛素中间体。
图13描绘了制备GA-1、Cys(SH)A0或GA0、dCys(SH)A1修饰的DesDi-胰岛素的合成反应方案以及将GBE1-C(Npys)-OH偶联至各自的框架上以形成二硫键连接的GBE中间体。具体实例包括四个单链胰岛素(B1-B28-A1A21)框架，其携带天然二硫键对和硒代半胱氨酸(SecA6-SecA11)桥置换，作为GRI 1-4的前体。
图14描绘了GlyA-1、Cys(GBE-1)A0、SecA6、SecA11、Lys(DHBA)B29-赖脯胰岛素和GA0、dC(GBE-1)A1、SecA6-SecA11、Lys(DHBA)B29-赖脯胰岛素合成方案，以在包含硒代半胱氨酸(SecA6-SecA11)二硒化物桥置换的L-CysA0或D-CysA1修饰的DesDi-胰岛素框架(单链胰岛素(B1-B28-A1A21)上制备二硫键连接的(GBE1C)GBE。脱八肽(DOI)前体用于胰蛋白酶介导的偶联反应，使用Lys(DHBA)B28修饰的八肽(SEQ ID NO:10)，在位置A0处包含GBE-1的N-末端修饰的A链(SEQ ID NO:8)经由二硫键连接至C-末端截短的B链(SEQ ID NO:9)。类似的方案用于包含类似物的天然二硫桥以及用GBE2-C和GBE3-C二硫键连接修饰的框架。
图15描绘了制备和设置酰胺键连接的葡萄糖结合元件(GBE 1-6)的通用固相合成方案。此处示出了GlyA0、[D-Dap(GBE4)]A1和GlyA0、[D-Dap(GBE5)]A1、-DesDI单链胰岛素中间体。相同的方案还用于制备携带GBE 1-6的另外的DesDi单链类似物。
图16描绘了制备和设置酰胺键连接的葡萄糖结合元件(GBE 1-6)的通用固相合成方案，如GlyA-1、[Dap(GBE1)]A1、HisA8和GA-1、[Dap(GBE3)]A1、HisA8 DesDi单链胰岛素中间体(SEQ ID NO:11)。相同的方案还用于制备携带GBE 1-6的另外的DesDi单链类似物。
图17提供了赖脯胰岛素(插图图例中的“KP”)的对照研究，证明不存在葡萄糖依赖性(±50mM葡萄糖；上)和不存在果糖依赖性(±50mM果糖；下)。在每个图中，显示了pIR/IR磷酸化程度(纵轴；在不存在激素的情况下，归一化为初始pIR/IR比)作为胰岛素类似物浓度(以纳摩尔单位表示)的函数(横轴)。在不存在(或存在)单糖的情况下获得的数据以蓝色菱形(或橙色方块)显示。缩略语：IR和pIR分别是胰岛素受体和磷酸化胰岛素受体。
图18表明赖脯胰岛素衍生物(GRI-2，插图中)的单糖依赖性生物活性，其中GRI-2被定义为类似物GlyA-1,Cys(GBE1-C)A0、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素。A链包含两个残基N-末端延伸(位置A-1处的Gly和位置A0处的半胱氨酸)，以及通过GBE1-C形式的成对的BCM2对CysA0侧链硫醇基团的修饰(见图14)。B链在LysB28的ε-氨基处经2,3-二羟基苯甲酸(DHBA)修饰。两图格式如图17所示，分别测试葡萄糖依赖性(±50mM葡萄糖；上)和不存在果糖依赖性(±50mM果糖；下)。在每个图中，显示了pIR/IR磷酸化程度(纵轴；在不存在激素的情况下，归一化为初始pIR/IR比)作为胰岛素类似物浓度(以纳摩尔单位表示)的函数(横轴)。在不存在(或存在)单糖的情况下获得的数据以蓝色菱形(或橙色方块)显示。缩略语：IR和pIR分别是胰岛素受体和磷酸化胰岛素受体。
图19表明赖脯胰岛素衍生物(GRI-3，插图中)的单糖依赖性生物活性，其中GRI-3被定义为类似物GlyA-1、Cys(GBE1-C)A0、SecA6、SecA11、Lys(DHBA)B28-赖脯氨酸。A链包含两个残基N-末端延伸(位置A-1处的Gly和位置A0处的半胱氨酸)，以及通过GBE1-C形式的成对的BCM2 2对CysA0侧链硫醇基团的修饰(见图14)。B链在LysB28的ε-氨基处经2,3-二羟基苯甲酸(DHBA)修饰。两图格式如图17所示，分别测试葡萄糖依赖性(±50mM葡萄糖；上)和不存在果糖依赖性(±50mM果糖；下)。在每个图中，显示了pIR/IR磷酸化程度(纵轴；在不存在激素的情况下，归一化为初始pIR/IR比)作为胰岛素类似物浓度(以纳摩尔单位表示)的函数(横轴)。在不存在(或存在)单糖的情况下获得的数据以蓝色菱形(或橙色方块)显示。缩略语：IR和pIR分别是胰岛素受体和磷酸化胰岛素受体。
图20表明赖脯胰岛素衍生物(插图中的GRI-4)的单糖依赖性生物活性，其中GRI-4被定义为胰岛素类似物GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、SecA6、SecA11、Lys(DHBA)B28Pro-赖脯胰岛素。A链包含一个残基N-末端延伸(位置A0处的Gly)，A1处的甘氨酸被D-半胱氨酸置换，以及D-CysA1侧链硫醇基团被GBE1-C形式的成对的BCM2修饰(见图14)。B链在LysB28的ε-氨基处经2,3-二羟基苯甲酸(DHBA)修饰。两图格式如图17所示，分别测试葡萄糖依赖性(±50mM葡萄糖；上)和不存在果糖依赖性(±50mM果糖；下)。在每个图中，显示了pIR/IR磷酸化程度(纵轴；在不存在激素的情况下，归一化为初始pIR/IR比)作为胰岛素类似物浓度(以纳摩尔单位表示)的函数(横轴)。在不存在(或存在)单糖的情况下获得的数据以菱形(或正方形)显示。缩略语：IR和pIR分别是胰岛素受体和磷酸化胰岛素受体。
图21A-21C描绘了GRI-3的细胞信号传导测定，GRI-3被定义为胰岛素类似物GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、SecA6、SecA11、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素，以及葡萄糖依赖性IR磷酸化(图21A)和培养的HepG2细胞中与代表性糖原生成基因(PEPCK；图21B)和调节脂质生物合成的基因(ChREBP和SREBP；图21C)相关的葡萄糖依赖性基因调节。(图21A)中的数据对于时间范围(TIR)而言是显著的，并且葡萄糖单位(mg/dL和mM)的相互转换以右侧的示意图形式显示。
图22示出了在链脲佐菌素诱导的(STZ)糖尿病大鼠中静脉内注射赖脯胰岛素与GRI-1(组合GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素)后的效价比较。小图A.糖尿病大鼠在t＝0时静脉注射9nmol/kg的赖脯胰岛素(n＝7)、GRI-1(n＝7)或稀释剂(n＝29)，并监测血糖浓度的变化。赖脯胰岛素以实心红色方块显示，GRI-1以实心蓝色圆圈显示，以及稀释剂以X显示。小图B.计算曲线上面积(AOC)。平均值±SEM；*表示P<0.05。这些数据显示，GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素效力约为赖脯胰岛素效力的一半。
图23描绘了STZ-糖尿病大鼠皮下注射赖脯胰岛素、GRI-1＝GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素(GRI-1)和稀释剂。糖尿病大鼠在t＝0时分别皮下注射6nmol/kg的赖脯胰岛素(红色方块(n＝16))，12nmol/kg的赖脯胰岛素(绿色三角形(n＝16))，使用6(蓝色圆圈，n＝12)、12(紫色菱形，n＝12)和24(黑色X，n＝11)nmol/kg的GRI-1或稀释剂(橙色X，n＝17)的GRI-1，并监测血糖浓度的变化。小图B.计算曲线上面积(AOC)。平均值±SEM；*表示p<0.05。
图24A-24C示出了使用赖脯胰岛素、GRI-1和稀释剂的葡萄糖钳夹方案(clampprotocol)和图表结果。图24A示出了整个葡萄糖钳夹方案的施用时间和测量方案。大鼠被剥夺食物12h。在t＝-20min时皮下注射生长抑素(40μg)，并在t＝0min时再次静脉注射，此后继续以2μg/min静脉输注生长抑素。向大鼠皮下注射(在5min时)2.8nmol/kg的赖脯胰岛素、7.0nmol/kg的GRI-1＝GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素或稀释剂。调整葡萄糖输注速率，以在t＝15min时达到期望的血糖水平；葡萄糖输注持续至多90min以维持期望的血糖水平。图24B提供了使用2.8nmol/kg的赖脯胰岛素或稀释剂的葡萄糖输注速率(GIR)方案的实例，目的在于血糖目标浓度为250mg/dL。赖脯胰岛素(紫色波浪线)和稀释液(蓝线)的葡萄糖输注速率(GIR)之间的差异代表胰岛素作用引起的GIR。图24C描绘了赖脯胰岛素(左)和GRI-1(右)引起的GIR结果。柱状图和图25中总结了钳夹在不同的葡萄糖水平下，使用赖脯胰岛素、GRI-1和稀释剂的60项独立实验的数据。在不同葡萄糖水平下使用赖脯胰岛素的GIR值彼此之间没有显著差异，而在升高的葡萄糖水平下使用GRI-1的GIR值显著更高。平均值±SEM；NS表示不显著。
图25列出了来自图24C的正常血糖和高血糖钳夹方案中的数据计算。A.在不存在任意胰岛素注射(注射稀释剂)的情况下，显示了将血糖浓度维持在几个预先选定的目标所需的葡萄糖输注速率(GIR)(mg葡萄糖/kg/h)。B.显示了皮下注射5.0μg赖脯胰岛素(2.8nmol/kg)后将血糖浓度维持在几个预先选定的目标水平所需的GIR。赖脯胰岛素作用引起的GIR计算为使用赖脯胰岛素和稀释剂的GIR的差异。C.显示了皮下注射12.5μg的GRI-1(7.0nmol/kg)后，将血糖浓度维持在几个预选目标水平所需的GIR；GRI-1作用引起的GIR计算为使用GRI-1胰岛素和稀释剂之间的GIR差异(来自小图A)。数据显示为平均值±SEM。
图26A和26B示出了使用GRI-1＝GlyA0、D-Cys(GBE1-C)A1、Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素和稀释剂的双相葡萄糖钳夹方案和图表结果。图26A示出了整个葡萄糖钳夹方案的施用时间和测量方案。大鼠被剥夺食物12h。在t＝-20min时皮下注射生长抑素(40μg)，并在t＝0min时静脉内注射，此后继续以2μg/min的速度静脉输注。在5min时，向大鼠皮下注射GRI-1(7.0nmol/kg，或稀释剂)。在A阶段(5-30min)期间，将葡萄糖输注速率调整至目标血糖浓度85mg/dL。B阶段(40-70min)：在30min时，增加葡萄糖输注量以在40min时达到200mg/dL的目标；然后继续输注葡萄糖以维持200mg/dL的血糖浓度。图26B：显示了在85和200mg/dL的血糖浓度下GRI-1引起的GIR结果。柱状图(图27)中总结了使用稀释剂或GRI-1的16项单独实验的数据。平均值±SEM；*表示p<0.05。
图27列出了来自图26B的双相葡萄糖钳夹方案的数据计算以及使用GRI-1和稀释剂的结果。小图A.大鼠被剥夺食物12h。在t＝-20min时皮下注射生长抑素(40μg)，并在t＝0min时静脉注射，此后继续以2μg/min静脉输注生长抑素。在5min时，向大鼠皮下注射GRI-1(7.0nmol/kg)或稀释剂。在A阶段(5-30min)期间，调整葡萄糖输注速率以维持85mg/dL的目标血糖浓度。然后在30min时，增加葡萄糖输注量以在40min时达到200mg/dL的目标；然后在B阶段(40-70min)继续输注葡萄糖以维持200mg/dL的血糖浓度。图B.显示了在85和200mg/dL的血糖浓度下GRI-1引起的GIR结果。总结了使用稀释剂或GRI-1的16项独立实验的数据。与85mg/dL相比，血糖浓度为200时，GRI-1引起的GIR显著更高。绘图提供了平均值±SEM。
具体实施方式
缩略语
BCMs含硼部分
Bxb苯并氧硼杂环戊烯
CM化学矩阵
6-Cl-HOBt6-氯-1-羟基苯并三唑
DHBA二羟基苯甲酸
DICN,N'-二异丙基碳二亚胺
DOI脱八肽胰岛素
FRI果糖响应性胰岛素
GBE葡萄糖结合元件
GRI葡萄糖响应性胰岛素
HMBA 4-{3-甲氧基-4-[(L-苯丙氨酰氧基)甲基]苯氧基}丁酸
PBA苯基硼酸
TFA三氟乙酸
SCI单链胰岛素
STZ链脲佐菌素
TIS三异丙基硅烷
KP赖脯胰岛素
定义
在描述和要求保护本发明时，将根据以下阐述的定义使用以下术语。
如本文所用，术语“约”意指大于或小于规定的值或值范围10％，但并非旨在将任意值或值范围仅限于该更广泛的定义。以术语“约”开头的每个值或值范围还旨在涵盖所述绝对值或值范围的实施方案。
如本文所用，术语“纯化的”和类似术语涉及以基本上不含通常与天然或自然环境中的分子或化合物相关的污染物的形式分离分子或化合物。如本文所用，术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对定义。
术语“分离的”要求将引用的材料从其原始环境(例如，天然环境，如果它是天然存在的)中移除。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸不是分离的，但与天然系统中的一些或所有共存材料相分离的相同多核苷酸是分离的。
如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”包括任意标准药用运载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖任意经美国联邦政府监管机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的药剂。
如本文所用，术语“治疗”包括减轻与特定病症或病况相关的症状和/或预防或消除所述症状。
如本文所用，药物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒但足以提供期望效果的药物的量。根据个体的年龄和一般状况、施用方式等，“有效”量将因受试者而异或甚至在受试者内随时间而异。因此，并不总是可以指定确切的“有效量”。然而，任意个体情况下的适当“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。
如本文所用，没有进一步指定的术语“患者”旨在涵盖任意温血脊椎动物驯养动物(包括但不限于家畜、马、猫、犬和其他宠物)和人，其在有或没有医生监督的情况下接受治疗性治疗。
术语“抑制”定义为活性、反应、病况、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于活性、反应、病况或疾病的完全消除。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病况或疾病降低10％。因此，与天然或对照水平相比，降低可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％，或介于两者之间的任意量的降低。
如本文所用，术语“带有二醇的氨基酸”包含天然或非天然氨基酸，其侧链通过二醇部分与位于氨基酸侧链上的附接点的连接而被修饰。侧链附接点的实例由硫醇官能团、氨基官能团或羧酸酯官能团提供。例如，含氨基侧链可以由天然氨基酸赖氨酸或非天然氨基酸鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)和二氨基丙酸(Dap)提供，其各自为L构型或D构型。作为进一步的实例，含硫醇氨基酸可以是天然氨基酸半胱氨酸或非天然氨基酸高半胱氨酸，其各自为L构型或D构型。带有二醇的氨基酸代表(a)上述氨基酸和(b)二醇部分的共价组合，该二醇部分示例于(但不限于)表2中列出的那些。
如本文所用，在没有任何进一步阐述的情况下，术语“苏氨醇”涵盖L-别-苏氨醇、D-苏氨醇和D-别-苏氨醇。
如本文所用，术语“主链”定义了多肽的主链部分，并将包含主链的原子与包含从主链伸出的氨基酸侧链的原子相区分。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指可用于药物中的具有抗衡离子的那些盐。通常，参见S.M.Berge,et al.,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是那些药理学上有效且适合与受试者的组织接触而没有过度毒性、刺激或过敏反应的盐。本文所述的化合物可以具有足够的酸性基团、足够的碱性基团、两种类型的官能团、或每种类型中的多于一个，并且相应地与多种无机或有机碱以及无机和有机酸反应，以形成药学上可接受的盐。此类盐包括：
(1)酸加成盐，其可以由亲本化合物的游离碱与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸、高氯酸等)，或与有机酸(例如乙酸、草酸、(D)-或(L)-苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等)反应获得；或
(2)当亲本化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代时；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。
可接受的盐是本领域技术人员熟知的，并且任何此类可接受的盐可以与本文描述的实施方案结合考虑。可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、1,4-丁炔二酸酯、己炔-1,6-二酸酯、苯甲酸酯、氯苯甲酸酯、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸酯、羟基苯甲酸酯、甲氧基苯甲酸酯、邻苯二甲酸酯、磺酸酯、甲基磺酸酯、磺酸丙酯、苯磺酸酯、二甲苯磺酸酯、萘-1-磺酸酯、萘-2-磺酸酯、乙酸苯酯、丙酸苯酯、丁酸苯酯、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐和扁桃酸盐。其他合适的可接受的盐的列表可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,17th Edition,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985。
如本文所用，术语“天然胰岛素肽”旨在指明包含SEQ ID NO:2的A链和SEQ ID NO:3的B链的51个氨基酸异二聚体，以及包含SEQ ID NO:2和3的单链胰岛素类似物。如本文所用，在没有进一步描述性语言的情况下，术语“胰岛素肽”旨在涵盖包含SEQ ID NO:2的A链和SEQ ID NO:3的B链的51个氨基酸的异二聚体，以及异二聚体并且包含天然A链和/或B链的修饰衍生物。“胰岛素A链”被定义为SEQ ID NO:2的21个氨基酸序列以及天然A链的任何修饰衍生物，并且胰岛素B链被定义为SEQ ID NO:3的30个氨基酸序列以及天然B链的任何修饰衍生物。“胰岛素肽”、“胰岛素A链”和“胰岛素B链”的修饰衍生物包括在选自以下位置处的一个或多个氨基酸置换：A1、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或位置B1-4和B26-30中任意或所有位置的缺失，或向A链的N-末端或在B链的C-末端处添加1-3个氨基酸。在N-末端处与胰岛素A链肽连接的另外的氨基酸从0开始编号，并随着它们从天然胰岛素A链序列中进一步去除，以负整数值递增。例如，A链的N-末端延伸内的氨基酸位置指定为A-1或A0，其中A0代表通过使用标准酰胺键连接直接添加至胰岛素A链的天然N-末端氨基酸的氨基酸位置，并且A-1代表具有介于胰岛素A链的A-1氨基酸和天然N-末端A1氨基酸之间的单个氨基酸的氨基酸的位置。
如本文所用，氨基酸“修饰”是指通过酰胺键偶联或其他酰胺键等排模拟键连接性对氨基酸进行置换、添加或缺失，或通过向氨基酸添加化学基团和/或从氨基酸去除化学基团来衍生氨基酸，并且包括用人蛋白中常见的20种氨基酸以及非典型或非天然存在的氨基酸中的任意氨基酸进行置换或添加。非典型氨基酸的市售来源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)、ChemPep Inc.(Miami,FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge,MA)。非典型氨基酸可以从商业供应商购买、从头合成、或从天然存在的氨基酸化学修饰或衍生。
如本文所用，氨基酸“置换”是指一个氨基酸残基被不同氨基酸残基替代。在整个申请中，所有通过字母和数字提及的特定氨基酸位置(例如位置A5)是指在相应的天然人胰岛素A链(SEQ ID NO:2)或B链(SEQ ID NO:3)中，在A链(例如位置A5)或B链(例如位置B5)该位置上的氨基酸，或其任意类似物相应氨基酸位置处的氨基酸。例如，本文中提及的“位置B28”在没有任何进一步阐述的情况下将意指其中SEQ ID NO:3的第一个氨基酸已缺失的胰岛素类似物的B链的相应位置B27。
如本文所用，术语“保守氨基酸置换”在本文中定义为以下五组中在一组之内的交换：
I.小脂肪族、非极性或弱极性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性、带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III.极性、带正电的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV.大的脂肪族非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、同型半胱氨酸
V.大芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸
如本文所用，“接头”是将两个单独的实体彼此结合的键、分子或分子组。在一个实施方案中，接头提供两个实体的最佳间隔。
如本文所用，“葡萄糖结合元件(GBE)”是包含两个或更多个含硼部分(BCM)的分子结构。双硼酸GBE是包含两个含硼部分的GBE，其中两个含硼部分彼此直接连接或通过接头连接。
如本文所用，“含硼部分(BCM)”是包含与两个氧原子共价连接的硼分子的化学结构，其中含硼部分能够与含二醇实体相互作用以在二醇和硼原子之间形成可逆的共价连接(见图6A-6D)。
如本文所用，“葡萄糖响应性胰岛素(GRI)”是包含葡萄糖结合元件(GBE)的胰岛素类似物。此类GRI在低血糖条件下相对于天然胰岛素而言是无活性的或表现出降低的活性，但在葡萄糖浓度升高时(任选地，禁食8小时后血糖浓度大于150mg/dL)被活化，并以高亲和力结合胰岛素受体。
代表性实施方案
如本文所公开，已制备的天然胰岛素的类似物，其是仅在高血糖条件下活化的生物传感器。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含通过在其N末端处或附近连接葡萄糖结合元件修饰的胰岛素A链肽和通过在其C末端处或附近连接一种或多种二醇加合物修饰的B链，其中葡萄糖结合元件包含图4、图5、图6A、图6C中公开的两个或更多个含硼的二醇结合元件。在另一个实施方案中，胰岛素类似物包含通过在其C末端处或附近连接葡萄糖结合元件修饰的胰岛素B链肽，其包含两个或更多个含硼的二醇结合元件并且包含通过以下连接修饰的A链：(i)在其N末端处或附近的一种或多种二醇加合物和/或(ii)在其N末端处或附近的一个或多个葡萄糖结合元件(连同两个或更多个硼原子或单独包含两个或更多个硼原子)，如图6D中公开的。根据一个实施方案，含硼的二醇结合元件选自图7中公开的那些中的任一种。在一个实施方案中，葡萄糖结合元件的含硼的二醇结合元件选自苯基硼酸和苯并硼杂环戊烯。在一个实施方案中，胰岛素A链肽的N-末端经修饰以包含两个葡萄糖结合元件，其中包含葡萄糖结合元件的含硼部分相同或不同。
此外，修饰的A链还可以包含成对BCM的广泛分子多样性，或作为附接在修饰的A链的一个位点处(例如，在单个氨基酸侧链处)的支链加合物，或作为附接在两个或更多个肽位点处(例如，在两个单独的氨基酸的侧链处)的单独的加合物，如图11A(最右侧小图)所示。因此，本发明的成对的含硼部分可以包含通过支架连接的各个BCM(例如苯基硼酸(BCM1)元件和苯并硼杂环戊烯(BCM2、BCM3)元件)的组合，该支架相对于胰岛素本身的尺寸较小(<50个原子)，如图8(支链聚合(Branch-mer)设计)所示。BCM元件可以包含卤素置换，以优化其在中性pH下的单糖结合特性。在A链在两个或更多个位点处经修饰的情况下，该支架将包括肽的插入残基，如图8(串联主链设计)所示。因此，本发明涵盖以下的新型组合：(i)修饰的A链肽序列，(ii)残基A1处或附近的一个或多个附接点和(iii)一组含硼部分(BCM，其中PBA和/或BXB是实例)，使得此类组合提供了胰岛素特异性葡萄糖响应性或葡萄糖可切割的“转换”。具体地，成对的含硼A链修饰的分子目的是提供能够与B链附接的二醇加合物形成一个或多个分子内键的葡萄糖结合元件，使得胰岛素的构象是“闭合的”，因此与胰岛素受体的结合受损。因此，成对的含硼元件的内部链间栓系概括了单链胰岛素类似物的无活性结构。根据本发明，在高葡萄糖浓度下，GBE和二醇加合物之间形成的键由于葡萄糖与GBE的成对的BCM的竞争性结合而被破坏(图6B)。优选的实施方案包含所述成对的BCM和两个或更多个二醇基团两者，以尝试引入协同性。
与本发明相关的GRI设计考虑了三个关联的设计元件，它们需要相互配合以实现葡萄糖响应性构象转换的功能：元件1由GBE的组成和化学性质(例如，单硼酸、双硼酸[具有对称和不对称子类，各自合并各种BCM，如图8-11C所示)以及中间分子连接性来定义，无论是支链、附接至A链肽类似物中的串联主链位点，还是栓系两个或更多个含硼部分的其他方法，包括使用含醛BCM(BCM9-BCM12；如图9所示)对肽酰胺主链氮原子进行还原烷基化。根据本发明，此类GBE具有双重作用：(i)竞争性结合葡萄糖，同时结合B链栓系的二醇或多元醇(设计元件2)，从而(ii)限制分子内转换(设计元件3)。GBE与葡萄糖的结合与GBE与内部二醇组分的结合竞争(图4和5)。
设计元件2由B链栓系的二醇部分的组成和化学性质定义。该元件起到葡萄糖竞争性“锁”的作用，以稳定激素类似物的无活性构象。本发明的修饰的A链可以与B链在其C末端处或附近的侧链和主链的二醇修饰的组合相结合，如先前所公开(USPTO临时申请63/104,196，标题为“葡萄糖响应性和葡萄糖可切割的胰岛素类似物的分子设计”；其通过援引并入本文)。
设计元件3指定了分子内转换的位置，其影响活性和无活性状态之间的葡萄糖依赖性构象转变。A链修饰的最佳位置取决于B链二醇的位置，反之亦然。本发明侧重于(a)在其N末端处或附近被成对的含硼部分(BCM)修饰的A链类似物和(b)在其C末端处或附近被二醇部分修饰的B链类似物的组合。此类共修饰允许在胰岛素的活性和无活性状态之间进行配体调节的可逆构象循环，其中配体优选是葡萄糖(图5和6B)。该方案符合通过X射线晶体学和单粒子冷冻电子显微图像重建确定的胰岛素和胰岛素受体之间复合物的结构模型。
尽管类似的葡萄糖可替代的桥可以置于胰岛素分子中的其他位点，但本方案及其翻转方案(即，在其N末端处或附近对A链进行二醇修饰，并通过成对的含硼部分对B链进行同源修饰)，SEQ ID提供了闭合状态的独特优势，反映了“微型胰岛素原”的超稳定结构，其中直接的肽键将C-末端B链残基(B28、B29或B30)连接至GlyA1或其中在残基B30和A1之间放置1-3个插入的残基作为缩短的连接结构域。B链的C末端与A链的N末端的这种栓系限制了与药物制剂中胰岛素的化学和物理降解相关的构象波动。因此，申请人预期，除了赋予体内葡萄糖调节转换所期望的功能特性之外，本类型的设计在溶液中不存在葡萄糖或竞争性二醇的情况下还赋予药物制剂延长的保质期。
根据一个实施方案，提供了新颖的设计方案，其减少在B链的C末端和A链的N末端之间葡萄糖可切割的栓系的实践，从而提供一类新型胰岛素类似物，其在低葡萄糖浓度下闭合且无活性，但在高葡萄糖浓度下开放且有活性。由此产生的构象状态的循环(图4)原则上将是可逆的(取决于患者的代谢状态)，并且其实施将与胰岛素-IR胞外域复合物的结构一致。在SEQ ID部分中，提供了特定且关键的GBE连接的DOI中间体和优选的包含GBE的K(DHBA)B28-KP GRI的序列ID、分子组成和蛋白序列。表1包含有价值的在树脂上合成的中间体，可用于与本发明的精神相称的进一步设计和阐述的纯化的单链胰岛素类似物，以及两组假定的GRI的列表，两组假定的GRI被指定为：A链GBE、B链(二醇)B28类似物(16个实施方案)和A链DHBA、B链(GBE)B28类似物(13个实施方案)。
根据另一个实施方案，提供了包含第一和第二葡萄糖结合元件的胰岛素类似物，其中第一和第二葡萄糖结合元件各自包含含硼的二醇结合部分。胰岛素类似物包含天然胰岛素A链和B链的任意已知类似物。在一个实施方案中，提供了胰岛素A链肽和胰岛素B链肽，其中所述胰岛素A链和B链肽通过二硫键彼此连接，进一步其中：
胰岛素A链肽包含与位于选自A-1、A0和A1的位置处的一个或多个N-末端氨基酸共价连接的第一和第二葡萄糖结合元件；和
胰岛素B链肽包含位于选自B23-B31的位置处的经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包含二醇加合物；或
胰岛素B链肽包含与位于选自B26-B32(包括潜在的两个残基的C-末端延伸)的位置处的一个或多个氨基酸共价连接的所述第一和第二葡萄糖结合元件；和
胰岛素A链肽包含位于选自A-1、A0和A1的位置处的经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包含二醇加合物。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件的含硼的二醇结合部分独立地选自选自由图7中所示的BCM1-BCM12组成的组的任何含硼的二醇结合部分。
在一个实施方案中，胰岛素类似物包含分别与胰岛素A链肽的第一和第二氨基酸连接的第一和第二葡萄糖结合元件，其中第一和第二氨基酸位于相对于彼此的位置i和i+1或位置i和i+2。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件经由接头彼此结合以形成复合物，其中该复合物共价连接至胰岛素A链肽的单个氨基酸。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件与胰岛素A链肽的一个或多个氨基酸的侧链连接。在另一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件与胰岛素A链肽的一个或多个氨基酸的主链酰胺氮连接。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件各自包含含硼的二醇结合元件，与选自由L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab组成的组的氨基酸的侧链共价连接。
本发明的类似物可以任选地包含附接至残基B1的另外的糖结合元件，作为旨在提供胰岛素类似物与皮下储库中的表面凝集素的葡萄糖敏感结合的机制。此外，本发明的类似物可以任选地包含本领域已知的置换以赋予快速作用(例如AspB288，在门冬胰岛素(的活性组分)中发现的置换；[LysB28、ProB29]，在赖脯胰岛素(/>的活性组分)中发现的成对置换；GluB29或组合[LysB3、GluB29]，后者在谷赖胰岛素(/>的活性组分)中发现，或与胰岛素六聚体加速分解相关的位置B24修饰(例如，PheB24被环己基丙氨酸或被芳香环内包含单个卤素替代的苯丙氨酸衍生物置换)。可选地，本发明的类似物可以任选地包含本领域已知的修饰以赋予持久作用，例如通过酰基链或酰基-谷氨酸加合物对PheB24的ε-氨基基团进行修饰，分别如地特胰岛素(/>的活性组分)和德谷胰岛素(/>的活性组分)；或包含碱性氨基酸置换或碱性链延伸，旨在将等电点(pI)移至接近中性，如甘精胰岛素(/>的活性组分)的ArgB31-ArgB32延伸所示例。被设计为表现出这种位移的pI的本发明类似物还可以包含AsnA21的置换，例如被甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换。本发明的类似物还可以任选地包含与增加的胰岛素受体亲和力和/或增加的热力学稳定性相关的ThrA8的非β-支链氨基酸置换，其可以被引入以减轻上述两个主要设计元件(在A链N-末端处或附近的苯基硼酸衍生物和在B链C-末端处或附近的一种或多种糖衍生物)对受体结合亲和力和/或热力学稳定性的有害作用。本领域已知的此类A8置换的实例是HisA8、LysA8、ArgA8和GluA8。
本发明的胰岛素类似物可以表现出4.0-6.0范围内的等电点(pI)，从而适合pH范围6.8-7.8的药物制剂；可选地，本发明的类似物可以表现出6.8-7.8范围内的等电点，从而适合于pH4.0-4.2范围内的药物制剂。本领域已知后一条件导致这种pI位移的胰岛素类似物在皮下储库中等电沉淀，作为持久作用的机制。这种pI位移的胰岛素类似物的实例是甘精胰岛素，其中B链的碱性两残基延伸(ArgB31-ArgB32)使pI位移至接近中性，从而能够延长皮下储库的药代动力学吸收。通常，可以通过添加碱性或酸性链延伸、通过中性或酸性残基置换碱性残基、以及通过中性或碱性残基置换酸性残基来修饰胰岛素类似物的pI；在这种情况下，我们将酸性残基定义为天冬氨酸和谷氨酸，并将碱性残基定义为精氨酸、赖氨酸，在一些情况下还定义为组氨酸。我们进一步定义了与中性pH下侧链净电荷相关的“中性”残基。
本发明的另一方面是，相对于野生型人胰岛素，胰岛素类似物对胰岛素受体(同种型IR-A和IR-B)的绝对体外亲和力在5-100％范围内，因此不可能在激素受体复合物中表现出延长的停留时间；这种延长的停留时间被认为与哺乳动物中致癌的风险增加或培养物中癌细胞系的更快生长有关。本发明的另一方面是，相对于野生型人胰岛素，胰岛素类似物对1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的绝对体外亲和力在5-100％范围内，因此不可能在激素/IGF-1R复合物中表现出延长的停留时间，也不可能介导IGF-1R相关的有丝分裂超过野生型人胰岛素介导的有丝分裂。
本发明的胰岛素类似物由两条多肽链组成，这两条多肽链在A链中包含新的成对的PBA-PBA、PBA-BXB、BXB-PBA和/或BXB-BXB修饰，使得在不存在葡萄糖或其他外源糖的情况下，该类似物在B链中包含成对的含硼元件和二醇加合物的共价键。尽管我们不希望受到理论的限制，但我们设想在不存在外源葡萄糖的情况下，这两个设计元件形成共价相互作用，使得激素的结构在活性较低的构象中稳定。设想了遵循相同原理的两种可选设计方案以提供葡萄糖响应性胰岛素。第一种转换葡萄糖结合元件和二醇修饰的位置，使得前者附接在B链的C末端处或附近，而后者附接在A链的N-末端处或附近。第二个实施方案用葡萄糖结合元件替代二醇修饰，使得两条链均被成对的含硼部分修饰。
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和置换。应当理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明实施方案的各种可选方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
我们设想此类胰岛素类似物制剂将与多种装置(例如胰岛素瓶、胰岛素笔和胰岛素泵)相容，并且可以与本领域已知的胰岛素分子的修饰整合以赋予快速、中等或延长的胰岛素作用。此外，胰岛素分子中该葡萄糖调节的构象转换在B链的C-末端和A链的N-末端之间工程化，其可以与其他葡萄糖响应性技术(例如闭环系统或葡萄糖响应性聚合物)相组合以优化其综合性能。因此，我们设想本发明的产品将使西方社会和发展中国家的1型或2型糖尿病患者获益。
在一个实施方案中，提供了治疗糖尿病患者同时降低低血糖风险的方法。根据本公开，该方法包括向患者施用生理有效量的本文公开的包含葡萄糖结合元件的任何胰岛素类似物，或其生理学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供了葡萄糖响应性胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物包含
第一和第二葡萄糖结合元件，所述第一和第二葡萄糖结合元件各自包含含硼的二醇结合部分；
胰岛素A链肽；
胰岛素B链肽；其中所述胰岛素A链肽和B链肽通过二硫键彼此连接；进一步其中
I.所述胰岛素A链肽包含共价连接至位于选自A-1、A0和A1的位置处的一个或多个N-末端氨基酸的所述第一和第二葡萄糖结合元件；所述胰岛素B链肽包含位于选自B23-B31的位置处的经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包含二醇加合物；或
II.所述胰岛素B链肽包含共价连接至位于选自B23-B31的位置处的一个或多个氨基酸的所述第一和第二葡萄糖结合元件；所述胰岛素A链肽包含位于选自A-1、A0和A1的位置处的经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包含二醇加合物。
在一个实施方案中，胰岛素类似物的所述第一和第二葡萄糖结合元件的含硼的二醇结合部分独立地选自由如图7所示的BCM1-BCM12组成的组，任选地其中含硼二醇的结合部分是苯基硼酸或苯并硼杂环戊烯。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件分别共价连接至所述胰岛素A链肽的第一和第二氨基酸，其中第一和第二氨基酸位于相对于彼此的位置i和i+1或i和i+2。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件经由接头彼此结合以形成复合物，其中该复合物共价连接至单个氨基酸。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件共价连接至位于选自A-1、A0和A1的位置处的氨基酸，并且一个或多个二醇加合物与位于选自B28或B29的位置处的氨基酸连接。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件共价连接至胰岛素A链肽的侧链或主链酰胺，任选地其中第一和第二葡萄糖结合元件共价连接至选自由L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab组成的组的氨基酸的侧链。在一个实施方案中，包含二醇加合物的氨基酸具有与胰岛素B链肽的侧链或主链酰胺连接的结构。在一个实施方案中，第一和第二葡萄糖结合元件经由接头彼此结合以形成具有以下通用结构的复合物
其中BCM1和BCM2是含硼部分；n和m独立地是选自1至3范围的整数；
R是本领域已知的标准20种蛋白原性氨基酸或非蛋白原性氨基酸的L或D构型的任意氨基酸侧链。在一个实施方案中，R选自由以下组成的组：H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自由N、S和O组成的组的杂原子。在一个实施方案中，R是H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)C(O)NH2、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)CH3OH、(C1-C4烷基)S、(C1-C4烷基)SCH3、(C1-C4烷基)COOH和(C1-C4烷基)NH2，
在一个实施方案中，提供了葡萄糖响应性胰岛素类似物，其中胰岛素A链肽
包含以下序列：
GX0GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:13)；
X0GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:14)；
GX1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:15)；或
X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:16)，并且胰岛素B链肽包含FVX23QX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF-R23(SEQ ID NO:17)的序列，其中X0和X1独立地是选自D-Cys、L-Asp、D-Asp、D-Glu、L-Glu、D-同型半胱氨酸、L-同型半胱氨酸、L-Dap、D-Dap L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab的经修饰的氨基酸，其中经修饰的氨基酸包含第一和第二葡萄糖结合元件，其与经修饰的氨基酸的侧链或主链酰胺连接。在一个实施方案中，X0是修饰的L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其中经修饰的氨基酸包含与氨基酸的侧链连接的葡萄糖结合元件。X6和X11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；X8选自由苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的组；X21选自由天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸组成的组；X23是天冬酰胺或赖氨酸；X25选自由组氨酸和苏氨酸组成的组；X29选自由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸组成的组；X30选自由组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和半胱氨酸组成的组；以及R23选自由YTX28KT(SEQ ID NO:18)、YTX28KP(SEQ ID NO:19)、YTKPT(SEQ IDNO:20)、YTKPTR(SEQ ID NO:21)、YTKPTRR(SEQ ID NO:22)、YTX28K(SEQ ID NO:23)、YTKP(SEQ ID NO:24)、YTPK(SEQ ID NO:25)、YTX28、YT和Y组成的组；其中X28是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且在B链的C-末端处的氨基酸的侧链或主链酰胺经修饰以包含二醇加合物。
在一个实施方案中，胰岛素类似物包括胰岛素A链肽，其包含以下序列：GX0GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:13)；
X0GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:14)；
GX1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:15)；或
X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21(SEQ ID NO:16)，并且胰岛素B链肽包含FVX23QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX28KP(SEQ ID NO:26)的序列，其中X0和X1独立地是选自L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab的经修饰的氨基酸，其中经修饰的氨基酸包含第一和第二葡萄糖结合元件，其与经修饰的氨基酸的侧链或主链酰胺连接；X6和X11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；X8选自由苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的组；X21选自由天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸组成的组；X23是天冬酰胺或赖氨酸；以及X28是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且其中在B链的C-末端处的氨基酸的侧链或主链酰胺经修饰以包含二醇加合物。
在一个实施方案中，葡萄糖传感胰岛素类似物包括胰岛素A链肽，其包含GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21(SEQ ID NO:27)的序列；并且所述B链包含以下序列：序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(SEQ ID NO:28)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(SEQ ID NO:29)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO:30)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKKP(SEQ ID NO:31)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:32)，其中X8选自由苏氨酸和组氨酸组成的组；X21选自由天冬酰胺、甘氨酸和丙氨酸组成的组；X25选自由组氨酸和苏氨酸组成的组，并且所述B链的位置28或29处的赖氨酸已经被修饰以包含二醇加合物。
根据一个实施方案，本文公开的任何葡萄糖传感胰岛素类似物可以具有两个或更多个葡萄糖结合部分，所述葡萄糖结合部分包含相同的含硼二醇结合基序。在一个实施方案中，含硼二醇结合部分是苯基硼酸、卤素修饰的氟苯基硼酸或苯并硼杂环戊烯。本发明的葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子，因此这涵盖单个含硼部分(例如PBA和Bxb)的成对、三联体或高阶组合；它们可以分别附接至选自位置A-1、A0和/或A1的不同氨基酸；或它们可以是仅附接至这些肽位点中的一个的单个复合加合物内的部分(参见图11A，右)。
实施例1
制备本发明的葡萄糖响应性胰岛素类似物的代表性实例，用于在赖脯胰岛素背景下，在哺乳动物细胞培养物中进行功能测试，使得LysB28的ε-氨基基团经2,3-二羟基苯甲酸(DHBA)修饰，从而在B链的C末端或其附近提供二醇。A链在位置A1处经D-半胱氨酸修饰，通过本领域已知的一对对称的苯并硼杂环戊烯部分结合二醇，包括葡萄糖和不太有利的果糖。在培养的人肝源性HepG2细胞中测量生物活性的葡萄糖依赖性和果糖依赖性。尽管亲本类似物赖脯胰岛素在添加任一单糖后没有表现出生物活性的变化(图17)，但本发明的胰岛素类似物表现出目标葡萄糖依赖性(参见图19-21的上图)以及不太明显程度的果糖依赖性(参见图19-21的下图)。有效葡萄糖浓度的范围符合糖尿病治疗的治疗目标(图21)。
我们顺便注意到，临床胰岛素制剂的规格不是以摩尔浓度进行测量，而是以标准测试动物(通常是兔)的生物效力进行测量。例如，以摩尔单位计算，Levemir包含的激素浓度是其他临床胰岛素产品的四倍，但其强度却被标记为“U-100”。这是因为地特胰岛素(Levemir的活性组分)的每分子活性相对于人胰岛素降低了四倍。出于同样的原因，本发明的胰岛素类似物的每分子活性通常通过A链修饰或B链修饰而降低。尽管如此，类似于Levemir，U-100的强度仍可以通过增加类似物的蛋白浓度来实现。GRI-1的实例强调了其每分子效力的Levemir样降低，观察到其精确值取决于血糖浓度。因此，实验设计利用内在效力的先前基线研究来均衡活性而不是均衡摩尔浓度(参见图24A-24C)。
对“部分类似物”(即仅包含A链连接的GBE或仅包含B链连接的二醇部分)进行对照研究，以测试所设计的转换的两种组分是否需要(a)改变蛋白质构象或(b)生物活性的葡萄糖依赖性活化。在果糖响应性胰岛素(FRI)的情况下，这些对照与Chen,Y.-S等人(2021)描述的对照类似。通过1H-13CHSQC NMR谱监测蛋白质构象和葡萄糖结合。在正常大鼠与链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中评估葡萄糖依赖性活性。这些对照数据证实，如同FRI，GRI-1需要转换的两种组分位于同一蛋白分子中，正如我们设计方案中所设想的那样。两种“部分类似物”均没有表现出类似GRI的功能特性。
采用人胰岛素受体的分离的胞外域，通过冷冻电镜单粒子图像重建进一步验证本发明的GRI类似物的闭合-开放转变。在不存在葡萄糖或存在50mM葡萄糖的情况下制备复合物。然而，添加葡萄糖导致胞外域-激素结构在其信号传导构象方面与野生型复合物基本上相同(Weis,F等人，The signalling conformation of the insulin receptorectodomain.Nature Communications 9(1),4420(2018))，在不存在葡萄糖的情况下，结构分辨率较低，并且胰岛素类似物不与受体的“位点1”结合；整个胞外域构象未处于有活性的信号传导状态。因此，目前GRI类似物类别的预测机制在这些研究中得到了明确的可视化。
实施例2
制备了另一种相关的原型GRI(称为GRI-2)，其在一方面与GRI-1不同：将相同的含双硼的GBE(GBE1-C)附接至L-CysA0；保留B28处的经二醇修饰的赖氨酸。在培养的HepG2细胞中测试GRI-5(如Chen,Y.-S等，(2021)中所述)，并观察到表现出葡萄糖依赖性活性。
实施例3
制备了另一种相关的原型GRI(称为GRI-3)，其与GRI-1的不同之处仅在于用二硒化桥(SecA6和SecA11)置换胱氨酸A6-A11。这种修饰可以稳定胰岛素，如Weil-Ktorza,O.等人(Substitution of an Internal Disulfide Bridge with a Diselenide Enhancesboth Foldability and Stability of Human Insulin.Chemistry:a European Journal25(36),8513-21(2019))所述。在培养的HepG2细胞中测试了GRI-3(如Chen,Y.-S等人，(2021)中所述)，并观察到表现出葡萄糖依赖性活性。
实施例4
制备另一种相关的原型GRI(称为GRI-4)，其与GRI-2的不同之处仅在于用二硒化桥(SecA6和SecA11)置换胱氨酸A6-A11。这种修饰可以稳定胰岛素，如Weil-Ktorza,O.等人(Substitution of an Internal Disulfide Bridge with a Diselenide Enhances bothFoldability and Stability of Human Insulin.Chemistry:a European Journal 25(36),8513-21(2019))所述。在培养的HepG2细胞中测试了GRI-4(如Chen,Y.-S等人，(2021)中所述)，并观察到表现出葡萄糖依赖性活性。
实施例5
制备了相关的原型GRI(称为GRI-5)，其在两个方面与GRI-1不同：(i)芳香族二醇部分(DHBA)附接至位置B28的鸟氨酸侧链，置换赖脯胰岛素中的LysB28；和(ii)相同的含双硼部分(GBE1-C)附接至L-CysA0，而不是如同GRI-1中的D-CysA1。在STZ大鼠和正常大鼠中测试GRI-5，作为葡萄糖依赖性生物活性的初步筛选。它在这些动物模型中的功能特性与GRI-1相似。
实施例6
制备果糖响应性胰岛素(FRI)以证明描述于Chen,Y.-S.等人(2021)的原理，并通过援引并入本文。这为以上实施例1-5提供了模型。
可转换的胰岛素类似物(称为FRI；果糖响应性胰岛素)包含连接至GlyA1的α-氨基基团的间-氟-PBA*(间-fPBA或m-fPBA)作为二醇传感器，和附接至赖脯胰岛素的LysB28的e-氨基基团的芳香族二醇(3,4-二羟基苯甲酸；DHBA)。尽管果糖和葡萄糖均包含二醇，但传感器优先结合到β-D-呋喃果糖和α-D-呋喃葡萄糖中的排列的1,2-二醇基团。由于各自构象的显著差异，间-fPBA对果糖的亲和力高于对葡萄糖的亲和力；结合是共价的但可逆的。为了补偿通常与在GlyA1处的N连接的加合物相关的IR结合亲和力受损，ThrA8被His置换，这是在禽类胰岛素中发现的有利置换。对照类似物由以下提供：1)胰岛素KP，2)包含A1连接的间-fPBA但不含B28二醇的KP衍生物(无二醇对照；DFC)，和3)des-[B29、B30](“DOI”)模板中LysB28和GlyA1之间的肽键。后者[共价“闭合”状态]无活性。
Western印迹测定显示果糖依赖性信号传导。结构研究表明，胰岛素在二聚体相关的αCT/L1界面处的铰链打开与IR胞外域腿的闭合相偶联，导致TK介导的反磷酸化和受体活化。经由HepG2细胞中的细胞质激酶级联和代谢基因表达的变化来探测信号传播。对照研究表明，添加0至100mM果糖或葡萄糖
不触发信号传导输出的变化。单一激素剂量(50nM)下的IR自磷酸化(通过抗pTyrIR抗体探测)以及Ser-Thr蛋白激酶AKT(蛋白激酶B；p-AKT/AKT比)、叉头转录因子1(p-FOXO1/FOXO1)和糖原合成酶激酶3(p-GSK-3/GSK-3)的下游磷酸化的概况通过Western印迹(WB)提供。在每种情况下，WB均通过FRI证明了果糖依赖性信号传导，并通过KP和DFC证明果糖非依赖性信号传导。在不存在果糖的情况下，FRI的活性低。
板测定显示配体选择性信号传导。在96孔板测定中评价定量剂量依赖性和配体选择性IR自磷酸化。在添加50mM果糖时，FRI触发强信号，而在不存在果糖的情况下基线活性低。正如预期，KP和DFC分别在存在或不存在果糖的情况下表现出高信号传导活性。FRI的配体依赖性活化对果糖具有特异性，因为添加50mM葡萄糖不影响其活性(也不影响KP和DFC的活性)。这些数据表明，在50mM果糖中，FRI的活性几乎与KP一样。
PCR测定证明了配体选择性代谢基因调控。肝细胞中的胰岛素信号传导延伸至代谢转录调节，如HepG2细胞中所概括。在低血糖条件下，细胞在胰岛素刺激后表现出比高血糖条件下更强的糖异生相关反应。在此方案中，当FRI被果糖活化时，
调节编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK；糖异生的激素控制的标志物)的基因的下游表达。在血糖正常条件下，在FRI被果糖活化时，调节编码碳水化合物反应元件和甾醇反应元件结合蛋白(ChREBP和SREBP；脂质生物合成的激素控制的标志物)的基因。KP和DFC的对照研究中未观察到果糖依赖性；未观察到添加葡萄糖代替果糖的影响。在不存在胰岛素类似物的情况下进行对照研究，以评估添加0至100mM果糖或0至100mM葡萄糖时，代谢基因表达的潜在混杂变化。在这两种情况下均未观察到显著影响，这表明目前的短期果糖暴露(以活化FRI)与长期暴露的转录信号无关。
FRI的配体结合影响蛋白质结构。FRI和DFC的远紫外圆二色性(CD)光谱无法与亲本类似物赖脯胰岛素(KP)相区分，这表明二级结构不受A1和B28修饰的影响。添加100mM果糖或葡萄糖时计算的差异CD光谱在每种情况下均无特征。高分辨率NMR波谱[由单体KP模板启用]证实预期的果糖选择性转换的基本元件
19F-NMR光谱监测果糖传感器。间-fPBA中的氟原子提供NMR活性核。添加0至100mM果糖导致在NMR时间尺度上缓慢交换的19F-NMR化学位移发生高场变化。该高场位移大概反映了芳香族二醇被非芳香族配体替代。添加葡萄糖后未观察到FRI 19F化学位移发生变化。尽管在DFC的NMR光谱中观察到类似的19F共振，但其化学位移在添加葡萄糖或果糖时并未改变。有意思的是，在无配体的DFC中观察到19F信号变宽，这可能是由于构象交换或自缔合所致；添加配体(果糖或葡萄糖)后该信号变得尖锐。
双重19F-和1H NMR监测滴定和自然丰度1H-13C异核单量子相干(HSQC)光谱提供了FRI和果糖之间的特定相互作用的进一步证据。
1H-13C 2D HSQC光谱监测无配体FRI的“闭合”构象。DFC的一维(1D)1H和1H-13CHSQC光谱与亲本类似物赖脯胰岛素(KP)相类似，但IleA2和ValA3的甲基共振(与GlyA1附接的间-fPBA相邻)除外。FRI和DFC的1H-13C化学位移模式也相似。这些NMR特征提供了FRI和DFC保留天然样结构的证据。然而，在FRI中，IleA2、ValA3、LeuB11、ValB12和LeuB15的共振表现出比DFC更大的化学位移差异(相对于KP)。这些发现表明，FRI表现出构象和/或动力学的局部变化，这可能是由于预期的DHBA/间-fPBA栓系所致。我们设想，限制C-末端B链区段改变影响中央B链α螺旋(经由TyrB26-LeuB11、TyrB26-ValB12和PheB24-LeuB15堆积)和N-末端A链螺旋(经由天然样的yrB26-IleA2和TyrB26-ValA3堆积)的芳香环电流。
芳香族1H-13C的二维(2D)HSQC光谱监测铰链开放。1H-13C HSQC光谱提供了在不存在果糖和存在100mM果糖的情况下，FRI的DHBA/间-fPBA加合物中芳香族共振的探针。在1H/13C两个维度上观察到显著的化学位移变化。间-fPBA和DHBA修饰的肽的模型研究证实共振分配。无果糖FRI中的DHBA化学位移与模型肽复合物中的化学位移相似，而果糖结合FRI中的化学位移与游离DHBA修饰的八肽相似。此外，对添加果糖敏感的甲基共振表现出的化学位移的趋势与在赖脯胰岛素和无配体DFC的光谱中观察到的相对应。总之，这些NMR特征提供了证据，证明在FRI中，LysB28附接的DHBA在不存在果糖的情况下结合GlyA1连接的间-fPBA，但该栓系可被果糖置换。
甲基1H-13C 2D HSQC光谱监测蛋白核心。脂肪族1H-13C光谱反映了通过高场位移甲基共振探测的三级结构。叠加不添加单糖或添加100mM果糖的情况下获得的光谱，将在FRI中观察到交叉峰化学位移的变化。果糖结合增强高场场1H二次位移，13C化学位移变化较小。这些变化可能反映了胰岛素核心内芳香环电流的改变。DFC的对照研究表明，这种化学位移变化需要链间DHBA/间-fPBA栓系；在这些光谱中，变化仅限于紧邻传感器的IleA2。根据间-fPBA的果糖选择性，添加50mM葡萄糖基本上不导致FRI或DFC的1H-13C指纹发生变化。
实验程序
除了上述方法之外，与这些测定有关的方法如下所示。
单链胰岛素前体(SCI)和类似物的化学合成。我们采用固相肽合成来制备大量单链胰岛素前体(表1)。这些肽合成开始于预装Fmoc-Asn(Trt)-HMBA-CM树脂，使用传统Fmoc/tBu化学方法，使用DIC/6-Cl-HOBt活化(10当量)进行重复DIC/6-Cl-HOBt活化/偶联循环，并进行IR或感应加热，每个循环在60℃下持续10min，并在50℃下进行Fmoc脱保护(20％哌啶/DMF，2×5min)。使用Tribute或Chorus自动肽合成仪(Gyros Protein Technology，Tucson，AZ)。所有氨基酸、DIC和6-Cl-HOBt均购自Gyros Protein Technology(Tucson,AZ)或ChemImpex(Chicago,Ill)。从树脂上切割肽，并用包含2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％水、2.5％ DODT(亚乙基二氧基)-二乙烯硫醇)和2.5％苯甲醚的三氟乙酸(TFA)处理3-4小时来脱保护。
在预装H-Asn(Trt)-HMBP-化学基质树脂上使用Fmoc/OtBu固相化学化学合成SCI，并使用DIC/6-Cl-HOBt或DIC/Oxyma Pure(乙基氰基)羟基亚氨基)乙酸酯)活化(10当量)进行重复偶联循环，并进行IR或感应加热，每个循环在60℃下持续10min，并在50℃下进行Fmoc脱保护(20％哌啶/DMF，2×5min)。使用Tribute或Chorus自动肽合成仪(GyrosProtein Technology，Tucson，AZ)。使用预装Fmoc-Asn(Trt)-化学基质树脂。所有氨基酸、DIC和6-Cl-HOBt以及Oxyma Pure均购自Gyros Protein Technology(Tucson,AZ)。对肽进行切割并通过用包含2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％水、2.5％DODT(亚乙基二氧基)-二乙烯硫醇)和2.5％苯甲醚的三氟乙酸(TFA)处理脱保护。在存在2,2'-二硫代-双-(5-硝基吡啶)(DTNP，每秒2当量)的情况下，切割包含Sec(Mob)的肽；参见K.M.Harris,S.Flemer Jr,R.J.Hondal,J.Pept.Sci.2007,13,81-93)。用乙醚(相对于TFA的5-10倍)沉淀切割的混合物并通过离心分离固体。沉淀物进一步用乙醚洗涤两次并真空干燥。
单链胰岛素的氧化折叠。将沉淀并干燥(真空)的粗线性还原胰岛素悬浮并在折叠缓冲液(Cys，2.0mM，Gly 20mM，用NaOH(10M)调节pH至10.5)中以0.1mM空气氧化，同时在10℃下剧烈搅拌17-48h。通过RP-HPLC和LC-MS监测反应是否完成。使用C8柱进行制备型HPLC以用于纯化。将粗反应物酸化(HCl，5M至pH 3)，过滤(0.2μM)，然后通过LC-MS(FinniganLCQ Advantage，Thermo)在TARGA C8(4.6×250mm，5μm，Higgins Analytical)上确认SCI的纯化身份，其中使用0.1％ TFA/H2O(A)和0.1％TFA/CH3CN作为洗脱液。
为了生成脱八肽胰岛素(DOI)，将干燥的单链DesDI前体用胰蛋白酶-TPCK(10％w/w)在1M尿素和0.1M碳酸氢铵中在室温下处理24h。HPLC显示切割完成后，通过制备型RP-HPLC在C4或C8(20×250mm，5μm，Higgins Analytical)柱上纯化DOI，其中用0.1％ TFA/H2O(A)和0.1％TFA/CH3CN(B)作为洗脱缓冲液。
用包含二醇的八肽半合成。在10％w/w胰蛋白酶-TPCK存在下，将来自以上步骤的DOI与脱保护的八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys(DHBA)-Pro-Thr(作为粗品进行反应或预先HPLC纯化过)合并(K.Inouye,K.Watanabe,K.Morihara,Y.Tochino,T.Kanaya,J.Emura,S.Sakakibara,J.Am.Chem.Soc.1979,101,751-752.)。通常，胰蛋白酶介导的连接使用1:5分子比，通常将3-9mg的DOI与类似的3-9mg的八肽一起溶解于200μl的包含Tris-乙酸酯(pH8.5)、1,4-丁二醇和二甲基乙酰胺的混合溶剂系统中。用2μl的4-甲基吗啉调节pH至7.5，反应进行24-48h。通过制备型RP-HPLC在C8柱上纯化全长胰岛素产物蛋白，使用0.1％ TFA/H2O(A)和0.1％ TFA/CH3CN(B)作为洗脱缓冲液。通过LC-MS确认身份。DOI前体和所得GRI候选化合物在SEQ ID部分中给出。半合成后，如上所述通过RP-HPLC纯化反应混合物。一般二硫键缀合方法如下所示：GBE-1-C(NPYS)-OH(1.5当量)与包含游离硫醇基团(2-4mg/ml)的SCI反应。反应在由碳酸氢铵(0.1M)、尿素(1M)组成的pH 8.5的缓冲液中，并在室温下进行15-60min。通过RP-HPLC再次纯化反应混合物。
细胞培养。按照美国典型培养物保藏中心的建议，人肝癌细胞系HepG2在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。采用24-h血清饥饿方案，其中在70-75％汇合时施加FBS。饥饿后，在无血清培养基中用一组胰岛素类似物平行处理细胞。
实时qPCR测定。血清饥饿后，用包括胰岛素类似物(50nM)的培养基处理HepG2细胞8h。在与可能的葡萄糖响应性和脂质代谢相关的研究中，细胞在包含低或正常葡萄糖浓度的培养基中用类似物处理3或4h。通过下调PEPCK和G6P以及上调ChREBP和SREBP提供读数。通过定量聚合酶链反应(qPCR)测量mRNA(信使核糖核酸)丰度，重复三次。按照供应商的描述制备样品(一步法rt-PCR试剂盒；Bio-Rad)。使用以下引物组：(PEPCK)，GTTCAATGCCAGGTTCCCAG(SEQ ID NO:33)和TTGCAGGCCAGTTGTTGAC(SEQ ID NO:34)；(ChREBP)，AGAGACAAGATCCGCCTGAA(SEQ ID NO:35)和CTTCCAGTAGTTCCCTCCA(SEQ ID NO:36)；(SREBP)，CGACATCGAAGACATGCTTCAG(SEQ ID NO:37)和GGAAGGCTTCAAGAGAGGAGC(SEQID NO:38)；以及(GAPDH)，ATGGTTTACATGTTCCAATAT(SEQ ID NO:39)和ATGAGGTCCACCACCCTGGTTG(SEQ ID NO:40)。
细胞内pIR免疫印迹。这种基于细胞的测定经由荧光读数探测胰岛素依赖性IR活化。将HepG2细胞(～8000个细胞/孔)接种到底部透明的96孔黑色板中并进行培养(Fisher)。将血清在100μl纯Hanks平衡盐溶液(HBSS)中于37℃下饥饿2h后，将系列类似物稀释液(100μl)施加到每个孔；然后将细胞在37℃下孵育20min。除去培养基后，向每个孔中添加150μl的3.7％甲醛(Fisher)，并将板在37℃下孵育20min。然后，添加200μl的0.1％Triton-X-100(Sigma)以透化细胞，随后用100μl Odyssey封闭缓冲液(LI-COR)固定。在室温下在定轨摇床上进行封闭程序1h。然后，在4℃下，将固定的细胞暴露于一抗(10μL抗pTyr4G10(Sigma)加入20ml封闭缓冲液中)过夜。洗涤后添加二抗(25ml封闭缓冲液中的抗小鼠IgG-800-CW抗体(Sigma))。通过800nm发射检测pTyr。DRAQ5(Fisher)还用于通过700nm发射测量细胞数量。在LI-COR红外成像系统(Odyssey)上检测荧光信号，设置如下：偏移4mm，设置“强度-自动”。
哺乳动物细胞系中的信号传导测定。按照供应商的说明，HepG2细胞系(ATCC)在含10％ FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中培养。70-75％细胞汇合后，将细胞血清饥饿24h，然后暴露于包括胰岛素类似物(各自蛋白质浓度为50nM)的培养基。在RIPA缓冲液(包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；Roche)中裂解后，通过BCA测定(Thermo)测定裂解液中的总蛋白浓度。印迹实验方案根据先前的公开版本进行了修改。简言之，对于p-IR/IR印迹，通过以下探测样品：胰岛素受体β(4B8)抗体(CST抗体，除非另有说明)或抗磷酸化胰岛素受体β(Tyr1150/1151)；磷酸化胰岛素受体(Tyr1158)抗体(Thermo)；磷酸化胰岛素受体(Tyr1334)抗体(Thermo)；磷酸化胰岛素受体β(Tyr1345)单克隆抗血清；和抗磷酸化胰岛素受体(磷酸化Tyr972)抗体(Abcam)的等量混合物。这些抗体在5％牛血清白蛋白中的稀释度为1:5000。AKT印迹的抗体是p-AKT抗体(Ser473)(1:400)和AKT1/2/3抗血清(H-136)(1:1000)。对于p-FOXO/FOXO和p-GSK-3/GSK-3印迹，通过磷酸化FoxO1(Thr24)/FoxO3a(Thr32)抗体、FOXO1抗体、磷酸化GSK-3α/β(Ser21/9)和GSK-3α/β抗体(购自CST；稀释1:1000)探测样品。
序列ID总结
注：U定义硒代半胱氨酸氨基酸
GBE-1在图10A-10B中定义；GBE-2、GBE-3、GBE-4在图11A-11C中定义。
SEQ ID化合物名称序列/GBE和二醇结构
SEQ ID NO:1(人胰岛素原)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO:2(人A链)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO:3(人B链)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
1 GlyA-1,Cys(GBE1-C)A0,UA6,UA11-DOI(U＝Sec；DOI＝脱八肽[B23-B30]-胰岛素)
2 GlyA-1,Cys(GBE1-C)A0,UA6,UA11,Lys(DHBA)B28赖脯胰岛素(U＝Sec)
3 GlyA-1,Cys(GBE1-C)A0-DOI
4 GlyA-1,Cys(GBE1-C)A0,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
5 GlyA-1,D-Cys(GBE1-C)A0-DOI
6 GlyA-1,D-Cys(GBE1-C)A0,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
7 GlyA0,D-Cys(GBE1-C)A1,UA6,UA11-DOI
8 GlyA0,D-Cys(GBE1-C)A1,UA6,UA11,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
9 GlyA0,D-Cys(GBE1-C)A1-DOI
10 GlyA0,D-Cys(GBE1-C)A1,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
11 GlyA0,Cys(GBE1-C)A1-DOI
12 GlyA0,Cys(GBE1-C)A1,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
13 Cys(GBE1-C)A0-DOI
14.Cys(GBE1-C)A0,Ly(DHBA)B28赖脯胰岛素
14 Cys(GBE1-C)A1-DOI
15 Cys(GBE1-C)A1,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
16 D-Cys(GBE1-C)A0-DOI
17 D-Cys(GBE1-C)A0,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
18 D-Cys(GBE1-C)A1-DOI
19.D-Cys(GBE1-C)A1,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
19 GlyA-1,Dap(GBE1)A0-DOI
20 GlyA-1,Dap(GBE1)A0,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
21 GlyA-1,Dap(GBE3)A0-DOI
22 GlyA-1,Dap(GBE3)A0,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
23 GlyA0,D-Dap(GBE1)A1,HisA8-DOI
24 GlyA0,D-Dap(GBE1)A1-DOI
25 A0,D-Dap(GBE1)A1,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
26 GlyA0,D-Dap(GBE2)A1,HisA8-DOI
27 GlyA0,D-Dap(GBE-3)A1,HisA8,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
28 GlyA0,D-Dab(GBE-3)A1,HisA8-DOI
29 GlyA0,D-Dab(GBE-3)A1,HisA8,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
30 GlyA0,D-Orn(GBE-3)A1,HisA8-DOI
31 GlyA0,D-Orn(GBE-3)A1,HisA8,K(DHBA)B28-赖脯胰岛素
32 GlyA0,D-Lys(GBE-3)A1,HisA8-DOI
33 GlyA0,D-Lys(GBE-3)A1,HisA8,Lys(DHBA)B28-赖脯胰岛素
名称和序列总结于表1中，如下所示。在适当的行中标记GRI-1、2、3、4和5。“单链序列”和脱八肽[B23-B30]-胰岛素类似物片段(“DOI”)属于合成中间体，而不属于本发明的GRI。
表1
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本公开涉及包含葡萄糖调节的分子结构或葡萄糖可脱离的分子部分的多肽激素类似物，其分别被设计用于(a)赋予与同源细胞受体的葡萄糖响应性结合和/或(b)实现葡萄糖介导的活性胰岛素类似物的释放。更具体地，本公开涉及对血糖浓度响应的胰岛素类似物及其在通过皮下、腹腔或静脉内注射本文公开的胰岛素类似物在治疗患有1型或2型糖尿病的患者和非人哺乳动物中的用途。
本发明的胰岛素类似物还可以表现出其他增强的药物特性，例如增加的热力学稳定性、增强的对高于室温的热纤颤的抗性、降低的促有丝分裂性和/或改变的药代动力学和药效学特性。更具体地，本公开涉及可以赋予快速作用(相对于其常规可溶制剂形式的野生型胰岛素)、中等作用(与本领域已知的NPH胰岛素制剂相当)或持久作用(与本领域已知的基础胰岛素相当，例如地特胰岛素和甘精胰岛素)，使得与以低于生理范围的浓度(<80mg/dL；低血糖)溶解于包含葡萄糖的溶液中时相比，当以高于生理范围的浓度(>140mg/dL；高血糖)溶解于包含葡萄糖的溶液中时，所述类似物对胰岛素受体的亲和力更高。
根据一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其包含A链和变体B链，所述A链在其N末端处或附近经葡萄糖结合元件修饰，所述变体B链在B链的C末端处包含二醇基团使得多肽链末端具有羟基而不是具有羧酸酯基团。活性降低或缺失与B链中独特的二醇部分和位于A链的N-末端并包含葡萄糖结合元件的第二分子实体之间形成共价键有关。葡萄糖从A链连接的葡萄糖结合元件中置换B链二醇将导致栓系的分子实体脱离，从而实现高亲和力受体结合。在不存在葡萄糖的情况下，C-末端二醇保持与A链连接的葡萄糖结合元件结合，并且胰岛素类似物保持无活性。
根据一个实施方案，修饰的B链可以包含广泛的分子多样性的含二醇部分(或包含α-羟基羧酸基团的加合物，作为可选的结合基序，其可能与葡萄糖结合元件结合)，无论是糖类试剂还是非糖类试剂。可能性包括N-连接或O-连接糖或任意具有相似分子量的有机部分，其包含模拟单糖二醇官能团的二醇官能团，因此赋予可逆的PBA结合活性(或包含α-羟基羧酸酯基团作为可选的PBA结合官能团的加合物；本发明中的PBA可以等同地被本领域已知的其他含硼的二醇结合元件置换以结合葡萄糖)。这种包含非糖二醇的有机化合物涵盖广泛的化学类别，包括包含芳香族和非芳香族支架的酸、醇、硫醇试剂；包含α-羟基羧酸酯基团的加合物可以提供能够结合PBA或能够结合葡萄糖的其他含硼的二醇结合元件的可选官能团。除了上述N-连接和O-连接糖衍生物之外，附接至B链的方便模式还跨越广泛的连接；这些另外的附接方式包括(i)赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸(主链在手性上L或D)的侧链氨基官能团和(ii)半胱氨酸或同半胱氨酸的侧链硫醇官能团(主链在手性上L或D)。天然芳香酸位点(位置B16、B25和B26)的优选实施方案由L-多巴提供。
经二醇修饰的B链的分子目的是与A链附接的葡萄糖结合元件形成一个或多个分子内键，从而使胰岛素的构象“闭合”，并因此损害与胰岛素受体的结合。主链靶向二醇的使用概括了单链胰岛素类似物的无活性结构。我们设想，在高葡萄糖浓度下，由于葡萄糖与葡萄糖结合元件的竞争性结合，一个或多个二醇-葡萄糖结合元件键将断裂。优选的实施方案包含两个或更多个二醇基团以尝试引入协同性。主链元件可以通过用羟基连同适当位置的侧链羟基来置换C-末端羧酸酯和/或通过附接至主链氮原子的部分来实现。本发明的类似物可以任选地包含附接至残基B1的另外的糖结合元件，作为旨在提供胰岛素类似物与皮下储库中的表面凝集素的葡萄糖敏感结合的机制。此外，本发明的类似物可以任选地包含本领域已知的置换以赋予快速作用(例如AspB288，在门冬胰岛素(的活性组分)中发现的置换；[LysB28、ProB29]，在赖脯胰岛素(/>的活性组分)中发现的成对置换；GluB29或组合[LysB3、GluB29]，后者在谷赖胰岛素(/>的活性组分)中发现，或与胰岛素六聚体加速分解相关的位置B24修饰(例如，PheB24被环己基丙氨酸或被芳香环内包含单个卤素置换的苯丙氨酸衍生物置换)。可选地，本发明的类似物可以任选地包含本领域已知的修饰以赋予持久作用，例如通过酰基链或酰基-谷氨酸加合物对PheB24的ε-氨基基团进行修饰，分别如地特胰岛素(/>的活性组分)和德谷胰岛素(/>的活性组分)；或包含碱性氨基酸置换或碱性链延伸，旨在将等电点(pI)移至接近中性，如甘精胰岛素(的活性组分)的ArgB31-ArgB32延伸所示。旨在表现出这种位移的pI的本发明类似物还可以包含AsnA21的置换，例如被甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸置换。本发明的类似物还可以任选地包含与增加的胰岛素受体亲和力和/或增加的热力学稳定性相关的ThrA8的非β-支链氨基酸置换，其可以被引入以减轻上述主要两个设计元件(A链N-末端处或附近的苯基硼酸衍生物和B链C-末端处或附近的一种或多种糖衍生物)对受体结合亲和力和/或热力学稳定性的有害作用。本领域已知的此类A8置换的实例是HisA8、LysA8、ArgA8和GluA8。
本发明的胰岛素类似物可以表现出4.0-6.0范围内的等电点(pI)，从而适合pH范围6.8-7.8的药物制剂；可选地，本发明的类似物可以表现出6.8-7.8范围内的等电点，从而适合于pH范围4.0-4.2内的药物制剂。本领域已知后一条件导致这种pI位移的胰岛素类似物在皮下储库中等电沉淀，作为持久作用的机制。这种pI位移的胰岛素类似物的实例是甘精胰岛素，其中B链的碱性双残基延伸(ArgB31-ArgB32)使pI位移至接近中性，从而能够延长皮下储库的药代动力学吸收。通常可以通过添加碱性或酸性链延伸、通过中性或酸性残基置换碱性残基、以及通过中性或碱性残基置换酸性残基来修饰胰岛素类似物的pI；在这种情况下，我们将酸性残基定义为天冬氨酸和谷氨酸，并将碱性残基定义为精氨酸、赖氨酸，在一些情况下还定义为组氨酸。我们进一步定义了与中性pH下侧链净电荷相关的“中性”残基。
本发明的另一方面是，相对于野生型人胰岛素，胰岛素类似物对胰岛素受体(同种型IR-A和IR-B)的绝对体外亲和力在5-100％范围内，因此不可能在激素受体复合物中表现出延长的停留时间；这种延长的停留时间被认为与哺乳动物致癌的风险增加或培养物中癌细胞系的更快生长有关。本发明的另一方面是，相对于野生型人胰岛素，胰岛素类似物对1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的绝对体外亲和力在5-100％范围内，因此不可能在激素/IGF-1R复合物中表现出延长的停留时间，也不可能介导IGF-1R相关的有丝分裂超过野生型人胰岛素介导的有丝分裂。
本发明的胰岛素类似物由两条多肽链组成，其在B链中包含新修饰，使得在不存在葡萄糖或其他外源糖的情况下，该类似物包含在B链中的侧链二醇和分子实体之间的共价键，该分子实体包含PBA的、PBA的卤素衍生物或任意能够结合葡萄糖的含硼的二醇结合元件。后一个实体可以是B链的C-末端延伸或是在二醇-PBA键形成之前的单独分子。
表2列出了包含二醇或α-羟基羧酸酯的前体。
表2
尽管我们不希望受到理论的限制，但我们设想在不存在外源葡萄糖的情况下，这两个设计元件形成共价相互作用，使得激素的结构以活性较低的构象稳定。
根据第一实施方案1，提供了胰岛素类似物，其包含A链和变体B链，所述A链在其N末端处或附近经葡萄糖结合元件修饰，所述变体B链在B链的C末端处包含二醇基团使得多肽链末端具有羟基而不是具有羧酸酯基团。
根据第一实施方案2，提供了第一实施方案1的胰岛素类似物，其中A链在位置A8处包含增强胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的置换，任选地其中在位置A8处的置换是组氨酸。
根据第一实施方案3，提供了第一实施方案1或2的胰岛素类似物，其中A链在位置A8或位置A14处包含增强胰岛素类似物对胰岛素受体的热力学稳定性的置换，任选地其中在位置A8或A14处的置换独立地选自由HisA8、LysA8、ArgA8和GluA8组成的组。
根据第一实施方案4，提供了第一实施方案1-3中任一项的胰岛素类似物，其中A链在位置A21处包含保护胰岛素类似物免于化学降解的置换。
根据第一实施方案5，提供了第一实施方案1-4中任一项的胰岛素类似物，其中在B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,2)二醇。
根据第一实施方案6，提供了第一实施方案1-5中任一项的胰岛素类似物，其中在B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,3)二醇。
根据第一实施方案7，提供了第一实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其进一步包含在N-末端至C-末端氨基酸的位置1、2、3或4残基处的经修饰的氨基酸，其中所述经修饰的氨基酸是包含侧链二醇的L或D氨基酸。
根据第一实施方案8，提供了第一实施方案1-7中任一项的胰岛素类似物，其中经修饰的氨基酸是
含硫醇的L或D氨基酸。
根据第一实施方案9，提供了第一实施方案1-8中任一项的胰岛素类似物，其进一步包含在位置B26处的L多巴或位于N-末端至C-末端氨基酸的1-3个残基处的L或D多巴。
根据第一实施方案10，提供了第一实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中所述B链是缺失残基B30、残基B29-B30、残基B28-B30、残基B27-B30或残基B26-B30的截短的B链，二醇基团位于截短的B链的C末端。
根据第一实施方案11，提供了第一实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中所述B链延伸一个或两个氨基酸，二醇基团位于延伸的B链的C末端。
根据第一实施方案12，提供了第一实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中B链是选自由以下组成的组的多肽
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKX30(SEQ ID NO:62)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX30(SEQ ID NO:63)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPX30(SEQ ID NO:64)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKX30(SEQ ID NO:65)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKX30(SEQ ID NO:66)；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX29X30(SEQ ID NO:67)；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX30(SEQ ID NO:68)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX29X30(SEQ ID NO:69)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX30(SEQ ID NO:70)和
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYX30(SEQ ID NO:71)，其中
X29是鸟氨酸；和
X30是带有二醇的氨基酸衍生物，任选地是苏氨醇。在一个第一实施方案13中，提供了第一实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中B链是选自由以下组成的组的多肽
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[Sar][APD](SEQ ID NO:72)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[dA][APD](SEQ ID NO:73)，和
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYG[APD](SEQ ID NO:74)。
根据第一实施方案14，提供了第一实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中B链是选自由以下组成的组的多肽
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX31X30(SEQ ID NO:75)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPX31X30(SEQ ID NO:76)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKX31X30(SEQ ID NO:77)，FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX31X32X30(SEQ ID NO:78)，FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPX31X32X30(SEQ IDNO:79)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKX31X32X30(SEQ ID NO:
80)，其中
X31和X32独立地是任意氨基酸；和
X30是带有二醇的氨基酸衍生物，任选地是苏氨醇。
根据第一实施方案15，提供了第一实施方案1-14中任一项的胰岛素类似物，其中A链是选自由以下组成的组的多肽
R-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:81)；和
R-GIVEQCCHSICSLYQLENYCN-R53(SEQ ID NO:82)，其中
R是
根据第一实施方案16，提供了通过胰蛋白酶介导的半合成制备第一实施方案1-15中任一项的类似物的方法，其中(a)将任意任选的A链修饰(即，通过单体葡萄糖结合部分)引入胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段，和(b)将包含二醇的B链修饰引入长度为5-10个氨基酸残基的N-末端残基是甘氨酸的合成肽内，其在修饰后其不含胰蛋白酶切割位点。
根据第一实施方案17，提供了第一实施方案16的方法，其中该胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化亲本胰岛素或胰岛素类似物获得。
根据第一实施方案18，提供了第一实施方案16的方法，其中该胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化如在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或用于重组蛋白表达的其他微生物系统中表达的单链多肽(例如胰岛素原、胰岛素原类似物或包含缩短的或缺失C结构域的相应微型胰岛素原)获得。
根据第一实施方案19，提供了第一实施方案16的方法，其中该胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化如通过固相化学肽合成制备的单链多肽(例如胰岛素原、胰岛素原类似物或包含缩短的或缺失C结构域的相应微型胰岛素原)获得，所述固相化学肽合成任选地包括天然片段连接步骤。
根据第一实施方案20，提供了治疗糖尿病患者的方法，其中通过任意标准给药途径向患者给药生理有效量的第一实施方案1-15中任一项的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐。
根据第二实施方案1，提供了胰岛素类似物，其包括胰岛素A链和胰岛素B链，其中，
所述胰岛素A链包含在位置A1或A0处的d-氨基酸和在胰岛素A链N末端处或附近，任选地在位置A1或A0处，共价连接的葡萄糖结合元件；和
所述胰岛素B链在胰岛素B链的C末端处或附近包含二醇基团。
根据第二实施方案2，提供了第二实施方案1的胰岛素类似物，其中所述葡萄糖结合元件共价连接至处于D-构型的氨基酸的侧链。
根据第二实施方案3，提供了第二实施方案1或2的胰岛素类似物，其进一步包含添加至胰岛素A链的N-末端的氨基酸，其中所述N-末端氨基酸位于位置A0或A-1处。
根据第二实施方案4，提供了第二实施方案1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述N-末端氨基酸是甘氨酸。
根据第二实施方案5，提供了第二实施方案1-4中任一项的胰岛素类似物，其中所述二醇基团连接至胰岛素B链的三个最C-末端氨基酸中的一个的侧链，任选地在位置B26、B27、B30或在C-末端延伸的B链的B31、B32或B33中的任意位置处，任选地在B28、B29或B30处，任选地在B28处。
根据第二实施方案6，提供了第二实施方案1-5中任一项的胰岛素类似物，其中所述二醇基团是主链二醇，使得C-末端氨基酸的-COOH基团被-CH2OH和带有羟基的侧链替代。
根据第二实施方案7，提供了第二实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其中A链在位置A8处包括增强胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的置换，任选地其中在位置A8处的置换是组氨酸。
根据第二实施方案8，提供了第二实施方案1-7中任一项的胰岛素类似物，其中A链在位置A8或位置A14处包括增强胰岛素类似物对胰岛素受体的热力学稳定性的置换，任选地其中在位置A8或A14处的置换独立地选自由His、Lys、Arg和Glu组成的组。
根据第二实施方案9，提供了第二实施方案1-6中任一项的胰岛素类似物，其中A链在位置A21处包含保护胰岛素类似物免于化学降解的置换。
根据第二实施方案10，提供了第二实施方案1-9中任一项的胰岛素类似物，其中在B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,2)二醇。
根据第二实施方案11，提供了第二实施方案1-10中任一项的胰岛素类似物，其中在B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,3)二醇。
根据第二实施方案12，提供了第二实施方案1-11中任一项的胰岛素类似物，其进一步包含在B链的N-末端至C-末端氨基酸的位置1、2、3或4残基处的经修饰的氨基酸，其中所述经修饰的氨基酸是包含侧链二醇的L或D氨基酸。
根据第二实施方案13，提供了第二实施方案1-12中任一项的胰岛素类似物，其中经修饰的氨基酸是含硫醇的L或D氨基酸。
根据第二实施方案14，提供了第二实施方案1-13中任一项的胰岛素类似物，其进一步包含在位置B26处的L多巴或位于B链的N-末端至C-末端氨基酸的1-3个残基处的L或D多巴。
根据第二实施方案15，提供了第二实施方案1-14中任一项的胰岛素类似物，其中所述B链是缺失残基B30、残基B29-B30、残基B28-B30、残基B27-B30或残基B26-B30的截短的B链，二醇基团位于截短的B链的C末端。
根据第二实施方案16，提供了第二实施方案1-15中任一项的胰岛素类似物，其中所述B链延伸一个或两个氨基酸，二醇基团位于延伸的B链的C末端。
根据第二实施方案17，提供了第二实施方案1-16中任一项的胰岛素类似物，其中
胰岛素A链是选自由以下组成的组的多肽
X-1X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:4)和
X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)，其中
X-1是任意氨基酸，任选地X-1是Gly；
X0是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件；和
X1是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
X6和X11各自是Cys或硒代半胱氨酸；和
X8是Thr、His、Lys、Arg或Glu；
进一步地，其中X-1、X0和X1中的至少一个处于D构象；和
胰岛素B链是选自由以下组成的组的多肽
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，和
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX51(SEQ ID NO:7)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是Glu Asp、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。
根据第二实施方案18，提供了第二实施方案1-17中任一项的胰岛素类似物，其中
该胰岛素B链是包括以下序列的多肽
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys或Pro；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。
根据第二实施方案19，提供了第二实施方案1-18中任一项的胰岛素类似物，其中
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys或Pro；和
X51是带有二醇的氨基酸，任选地其中带有二醇的氨基酸包含连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分或带有二醇的氨基酸是主链。
根据第二实施方案20，提供了第二实施方案1-19中任一项的胰岛素类似物，其中
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Pro；和
X51是Thr。
根据第二实施方案21，提供了第二实施方案1-20中任一项的胰岛素类似物，其中
该胰岛素A链是包括以下序列的多肽
X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)，其中
X0是任意氨基酸，任选Gly；和
X1是包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件的修饰的D-氨基酸；
X6和X11各自是Cys或硒代半胱氨酸；和
X8是Thr、His、Lys、Arg或Glu。
根据第二实施方案22，提供了第二实施方案1-21中任一项的胰岛素类似物，其中带有二醇的氨基酸选自L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其经进一步修饰以包含连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分或经进一步修饰以用CH2OH替代羧基基团。
根据第二实施方案23，提供了第二实施方案1-22中任一项的胰岛素类似物，其中带有二醇的氨基酸包含具有与胰岛素B链肽的侧链或主链酰胺连接的结构的二醇部分。
根据第二实施方案24，提供了第二实施方案1-23中任一项的胰岛素类似物，其中葡萄糖结合元件连接至A链并且包含具有以下通用结构的复合物
/>
其中BCM1和BCM2是含硼部分；n和m独立地是选自1至3范围内的整数；和
R是L或D构型的标准20种必需氨基酸的任意氨基酸侧链。在一个实施方案中，R选自由以下组成的组：H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自由N、S和O组成的组的杂原子。在一个实施方案中，R是H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)C(O)NH2、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)CH3OH、(C1-C4烷基)S、(C1-C4烷基)SCH3、(C1-C4烷基)COOH和(C1-C4烷基)NH2。
根据第二实施方案25，提供了第二实施方案1-22中任一项的胰岛素类似物，其中胰岛素B链是选自由以下组成的组的多肽
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKX51(SEQ ID NO:62)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX51(SEQ ID NO:63)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPX51(SEQ ID NO:64)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKX51(SEQ ID NO:65)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPX51(SEQ ID NO:66)；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX50X51(SEQ ID NO:67)；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX51(SEQ ID NO:68)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX50X51(SEQ ID NO:69)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX51(SEQ ID NO:70)和
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYX51(SEQ ID NO:71)，其中
X50是Orn或Lys；和
X51是带有二醇的氨基酸衍生物，任选地是苏氨醇或3-氨基-1,2-丙二醇。
根据第二实施方案24，提供了第二实施方案1-23中任一项的胰岛素类似物，其中B链是选自由以下组成的组的多肽
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[Sar][APD](SEQ ID NO:72)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[dA][APD](SEQ ID NO:73)，和
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYG[APD](SEQ ID NO:74)，其中APD是3-氨基-1,2-丙二醇。
根据第二实施方案25，提供了第二实施方案1-24中任一项的胰岛素类似物，其中带有二醇的氨基酸包含天然或非天然氨基酸，其侧链通过将二醇部分连接至位于氨基酸侧链上的附接点进行修饰，任选地其中氨基酸选自由半胱氨酸、同半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、二氨基丁酸(Dab)和二氨基丙酸(Dap)组成的组，其各自为L构型或D构型，具有与氨基酸侧链共价连接的二醇部分，例如(但不限于)表2中列出的那些；葡萄糖结合元件是选自图10A-11C中所列的化合物。
序列表
<110> 印地安纳大学理事会（THE TRUSTEES OF INDIANA UNIVERSITY）
<120> 葡萄糖响应性胰岛素类似物葡萄糖传感器的分子设计
<130> PPI23171884US
<150> 63/183,325
<151> 2021-05-03
<160> 140
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是任何氨基酸或包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是任何氨基酸或包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是任何氨基酸或包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是任何氨基酸或包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<400> 5
Xaa Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Lys或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Orn、Glu-Asp、Lys、Pro或包含连接至氨基酸侧链的含二醇部分的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是Orn、Lys、Pro或包含连接至氨基酸侧链的含二醇部分的经修饰的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Thr或带有二醇的氨基酸
<400> 6
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Lys或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是带有二醇的氨基酸
<400> 7
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa
20 25
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 8
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 9
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg
20
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是经修饰的Lys，其包含连接至氨基酸侧链的带有二醇的部分
<400> 10
Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
1 5
<210> 11
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是D-Dap(Pr)
<400> 11
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Gly Xaa Ile Val
20 25 30
Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
35 40 45
Cys Asn
50
<210> 12
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是D-Dap(Pr)
<400> 12
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Gly Xaa Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是经修饰的D-Cys、L-Cys、D-homoCys、L-homoCys，D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、L-赖氨酸、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab、D-Dap和L-Dap，其中经修饰的氨基酸包含连接至侧链的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> 位置23处的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸
<400> 13
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
20
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是经修饰的L-homoCys、D-homoCys，L-Asp、D-Asp、L-Glu、D-Glu、LDap、D-Dap、L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其中经修饰的氨基酸包含连接至侧链的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 位置22处的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸
<400> 14
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是经修饰的L-homoCys、D-homoCys，L-Asp、D-Asp、L-Glu、D-Glu、LDap、D-Dap、L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其中经修饰的氨基酸包含连接至侧链的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 位置22处的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸
<400> 15
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
20
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是经修饰的L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其中经修饰的氨基酸包含与氨基酸的侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置11处的Xaa是Cys或硒代半胱氨酸
<400> 16
Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Xaa Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Lys或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置9处的Xaa是丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<400> 17
Phe Val Xaa Gln Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
20 25
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<400> 18
Tyr Thr Xaa Lys Thr
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<400> 19
Tyr Thr Xaa Lys Pro
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 20
Tyr Thr Lys Pro Thr
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 21
Tyr Thr Lys Pro Thr Arg
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 22
Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Arg
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<400> 23
Tyr Thr Xaa Lys
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 24
Tyr Thr Lys Pro
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 25
Tyr Thr Pro Lys
1
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Lys或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<400> 26
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Lys Pro
20 25 30
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是苏氨酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> 位置21处的Xaa是天冬酰胺、甘氨酸和丙氨酸
<400> 27
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Xaa
20
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<400> 28
Phe Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr
20 25 30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<400> 29
Phe Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<400> 30
Phe Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<400> 31
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Lys Pro
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<400> 32
Phe Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 33
gttcaatgcc aggttcccag 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 34
ttgcaggcca gttgttgac 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 35
agagacaaga tccgcctgaa 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 36
cttccagtag ttccctcca 19
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 37
cgacatcgaa gacatgcttc ag 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 38
ggaaggcttc aagagaggag c 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 39
atggtttaca tgttccaata t 21
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<400> 40
atgaggtcca ccaccctggt tg 22
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是Lys、Orn、Dab或具有侧链连接的GBE 1-6的Dap
<400> 41
Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
1 5
<210> 42
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是具有GBE连接的半胱氨酸
<400> 42
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 43
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是包含DHBA的修饰的赖氨酸
<400> 43
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 44
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 45
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 46
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 46
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 47
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 48
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 49
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是包含DHBA的修饰的赖氨酸
<400> 50
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 51
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 51
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 52
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 53
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 53
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 54
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 55
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 55
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 56
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 57
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 57
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 58
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dDap，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 58
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 59
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dDap，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 59
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 60
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dOrn，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 60
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 61
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dLys，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<400> 61
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 62
Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Xaa
20 25 30
<210> 63
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 63
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Xaa
20 25 30
<210> 64
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 64
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Xaa
20 25 30
<210> 65
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 65
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa
20 25 30
<210> 66
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 66
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Xaa
20 25
<210> 67
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 67
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa
20 25 30
<210> 68
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 68
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa
20 25
<210> 69
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 69
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa
20 25
<210> 70
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 70
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa
20 25
<210> 71
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 71
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Xaa
20 25
<210> 72
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> 位置26处的Xaa是肌氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是ADP
<400> 72
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa
20 25
<210> 73
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> 位置26处的Xaa是dAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是ADP
<400> 73
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa
20 25
<210> 74
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是ADP
<400> 74
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Gly Xaa
20 25
<210> 75
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> 位置31处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 75
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Xaa Xaa
20 25 30
<210> 76
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> 位置31处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 76
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Xaa Xaa
20 25 30
<210> 77
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> 位置31处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 77
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa Xaa
20 25 30
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> 位置32处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 78
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 79
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> 位置32处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 79
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 80
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> 位置32处的Xaa是带有二醇的氨基酸衍生物
<400> 80
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 82
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是D-氨基酸，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是半胱氨酸或硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是Thr、His、Lys、Arg或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置11处的Xaa是半胱氨酸或硒代半胱氨酸
<400> 83
Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 84
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Cys
<400> 84
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Gly Xaa Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210> 85
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Cys(GBE)
<400> 85
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Gly Xaa Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210> 86
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg
20
<210> 87
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
20
<210> 88
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
20 25 30
<210> 89
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是List(DHBA)
<400> 89
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 90
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys
20 25
<210> 91
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Orn(DHBA)
<400> 91
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 92
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys(GBE)
<400> 92
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 93
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys(GBE)
<400> 93
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 94
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys(GBE)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 94
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 95
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys(GBE)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 95
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 96
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Cys(GBE)
<400> 96
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 97
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys(GBE)
<400> 97
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 98
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(Mtt)
<400> 98
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 99
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(Fmoc-Dap(Fmoc))
<400> 99
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 100
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(H2N-Dap(NH2))
<400> 100
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(BCM2-Dap(BCM2))
<400> 101
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(NH2)
<400> 102
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 103
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(Fmoc-Dap(Mtt))
<400> 103
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 104
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(H2N-Dap(Mtt))
<400> 104
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 105
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(Gly-Dap(NH2))
<400> 105
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 106
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(H2N-Dap(FmocG))
<400> 106
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 107
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(BCM2-Gly-Dap(BCM2))
<400> 107
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 108
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Dap(GBE-Gly-Dap(GBE))
<400> 108
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 109
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(alloc)
<400> 109
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 110
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys
<400> 110
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 111
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 111
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 112
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 112
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 113
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Cys(Acm)
<400> 113
Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 114
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys(Npys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 114
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 115
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Cys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 115
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 116
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys(Npys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 116
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 117
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 117
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 118
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys(Acm)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置8处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 118
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 119
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dCys(GBE)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是硒代半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是硒代半胱氨酸
<400> 119
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Xaa Cys Thr Ser Ile Xaa Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 120
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(GBE)
<400> 120
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 121
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(GBE)
<400> 121
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 122
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是DOrn(GBE)
<400> 122
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 123
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Orn(GBE)
<400> 123
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 124
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Dap(GBE)
<400> 124
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 125
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是DDap(GBE)
<400> 125
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 126
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是Gly[APD]
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Gly[APD]
<400> 126
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Xaa Xaa
20 25
<210> 127
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是K(GBE1-CAc)
<400> 127
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 128
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Orn(GBE)
<400> 128
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25 30
<210> 129
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dDap(DHBA)
<400> 129
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 130
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(DHBA)
<400> 130
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 131
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Orn(DHBA)
<400> 131
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 132
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dOrn(DHBA)
<400> 132
Gly Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 133
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是DOPA
<400> 133
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 134
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是N(APD)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是DOPA
<400> 134
Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 135
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是DOPA
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是N(APD)
<400> 135
Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 136
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dab(GBE)
<400> 136
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 137
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(DHBA)
<400> 137
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 138
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Dap(DHBA)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Orn(DHBA)
<400> 138
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 139
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是D-Orn(DHBA)
<400> 139
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 140
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素肽类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是dDap(alloc)
<400> 140
Gly Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20

Claims (29)

1.一种胰岛素类似物，包括胰岛素A链和胰岛素B链，所述胰岛素A链包括与一个或多个葡萄糖结合元件共价连接的(a)在位置A1处的D-氨基酸，(b)在位置A0处的L-氨基酸或D氨基酸，或(c)在A-1处的L-氨基酸或D氨基酸，其中残基A0和A-1代表所述A链的任选N-末端延伸；并且所述胰岛素B链在所述胰岛素B链的C末端处或附近包含一个或多个二醇基团，任选地条件是位置A0和A1中的至少一个存在并且是D氨基酸。
2.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子并且共价连接至(a)在位置A-1、A0或A1处的氨基酸的侧链和/或(b)残基A-1、A0或A1的α-氨基基团。
3.权利要求1所述的胰岛素类似物，包括添加至天然胰岛素A链的N-末端的1个或2个氨基酸。
4.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述胰岛素A链的N-末端氨基酸是甘氨酸。
5.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述二醇基团连接至残基B26、B27、B28、B29、B30或C-末端延伸B31或B31-B32的侧链。
6.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述二醇基团是主链二醇，使得C-末端氨基酸的-COOH基团被-CH2OH替代，任选地与带有二醇的部分的残基B26、B27、B28、B29、B30或C-末端延伸B31或B31-B32残基的侧链修饰组合。
7.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A8处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的置换，任选地其中A8置换是选自赖氨酸、组氨酸或谷氨酰胺的含氮氨基酸。
8.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A8或位置A14处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的热力学稳定性的置换，任选地其中在位置A8或A14处的置换独立地选自由His、Lys、Arg和Glu组成的组。
9.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A21处包含保护所述胰岛素类似物免于化学降解的置换。
10.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,2)二醇。
11.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,3)二醇。
12.权利要求5所述的胰岛素类似物，其中，所述经二醇修饰的氨基酸的在手性上可以是L或D，并且其中，其侧链包含硫醇基团或氨基基团。
13.权利要求5所述的胰岛素类似物，其进一步包含在位置B26的L多巴或位于所述B链的N-末端至C-末端氨基酸的1-3残基处的L或D多巴。
14.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链是缺失残基B30、残基B29-B30、残基B28-B30、残基B27-B30或残基B26-B30的截短的B链，二醇基团位于所述截短的B链的C末端。
15.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链延伸一个或两个氨基酸，二醇基团位于延伸的B链的C末端。
16.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，
胰岛素A链是选自由以下组成的组的多肽：
X-1X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:4)，
X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)，和
X70IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:83)；其中
X-1是任意氨基酸，任选地其中X-1是Gly；
X0是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
X1是任意氨基酸或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括与其侧链连接的葡萄糖结合元件，任选地其中X-1是Gly；
X6和X11各自是Cys或硒代半胱氨酸；和
X8是Thr、His、Lys、Arg或Glu；
X70是D-氨基酸，所述D-氨基酸包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
进一步地，其中X-1、X0和X1中的至少一个为D构象和
胰岛素B链是选自由以下组成的组的多肽：
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，和
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX51(SEQ ID NO:7)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是Orn、Glu Asp、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys、Pro或经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。
17.权利要求16所述的胰岛素类似物，其中，
所述胰岛素B链是包括以下序列的多肽：
FVX24QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX49X50X51(SEQ ID NO:6)，其中
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys或Pro；和
X51是Thr或带有二醇的氨基酸。
18.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Orn、Lys或Pro；和
X51是带有二醇的氨基酸，任选地其中所述带有二醇的氨基酸包含连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分或者所述带有二醇的部分是主链的部分。
19.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
X24是Lys或Asn；
X49是经修饰的氨基酸，所述经修饰的氨基酸包括连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分；
X50是Pro；和
X51是Thr。
20.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
所述胰岛素A链是包括以下序列的多肽：
X0X1IVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)，其中
X0是任意氨基酸，任选Gly；和
X1是修饰的D-氨基酸，其包含与其侧链连接的葡萄糖结合元件；
X6和X11各自是Cys或各自是硒代半胱氨酸；和
X8是Thr、His、Lys、Arg或Glu。
21.权利要求16所述的胰岛素类似物，其中，所述带有二醇的氨基酸选自L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其经进一步修饰以包含连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分或经进一步修饰以用CH2OH替代羧基基团。
22.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链是选自由以下组成的组的多肽：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[Sar][APD](SEQ ID NO:37)，
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF[dA][APD](SEQ ID NO:38)，和
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYG[APD](SEQ ID NO:39)，其中APD是3-氨基-1,2-丙二醇。
23.权利要求1-22中任一项所述的胰岛素类似物，其中，所述葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子，任选地包含苯基硼酸或卤素修饰的苯基硼酸，使得一个或多个部分选自以下：
24.一种“翻转的”胰岛素类似物，其在其他方面符合权利要求1-5，其中，含硼的葡萄糖结合元件在所述B链的C末端或附近连接，而一个或多个二醇基团在被定义为残基A-1、A0或A1的所述A链的N末端或附近连接。
25.一种通过胰蛋白酶介导的半合成制备权利要求1-23中任一项所述的类似物的方法，其中，(a)将任意任选的A链修饰(即，通过单体葡萄糖结合部分)引入胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段，和(b)将包含二醇的B链修饰引入长度为5-10个氨基酸残基的N-末端残基是甘氨酸的合成肽内，其在修饰后其不含胰蛋白酶切割位点。
26.权利要求25所述的方法，其中，所述胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化亲本胰岛素或胰岛素类似物获得。
27.权利要求25所述的方法，其中，所述胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化如在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或用于重组蛋白表达的其他微生物系统中表达的单链多肽(例如胰岛素原、胰岛素原类似物或包含缩短的或缺失C结构域的相应微型胰岛素原)获得。
28.权利要求25所述的方法，其中，所述胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段通过胰蛋白酶消化如通过固相化学肽合成制备的单链多肽(例如胰岛素原、胰岛素原类似物或包含缩短的或缺失C结构域的相应微型胰岛素原)获得，所述固相化学肽合成任选地包括天然片段连接步骤。
29.一种治疗糖尿病患者的方法，其包括向所述患者给药生理有效量的权利要求1-24中任一项所述的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐。
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