BR122024000898A2 - Composto, composição, e, uso do composto - Google Patents

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Lin Yan
Pei Huo
Dmitri Pissarnitski
Danqing Feng
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Ahmet Kekec
Christina B. Madsen-Duggan
Zhi-Cai Shi
Zhicai Wu
Yingjun Mu
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Abstract

COMPOSTO, COMPOSIÇÃO, E, USO DO COMPOSTO São descritos dímeros de insulina e dímeros de análogos de insulina que atuam como agonistas parciais no receptor de insulina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO (1) Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a dímeros de insulina e dímeros de análogos de insulina que atuam como agonistas parciais no receptor de insulina.
(2) Descrição da Técnica Relacionada
[002] A insulina é uma terapia essencial para os pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) e muitos diabéticos mellitus tipo 2 (T2DMs), prescrita para próximo a um terço dos pacientes nos Estados Unidos entre todos os usuários de droga antidiabética na década passada. O mercado mundial para as insulinas foi de US$20,4 bilhões em 2013 e está crescendo em uma taxa mais rápida do que todos os outros agentes antidiabéticos combinados. Entretanto, contestações das terapias com insulina correntes, incluindo TI estreito para hipoglicemia e ganho de peso corporal, limitam a sua adoção mais ampla e potencial para pacientes para alcançar controle glicêmico ideal.
[003] Além da secreção da insulina prandial em resposta às refeições, o pâncreas libera insulina em uma taxa “basal”, controlada amplamente pelos níveis de glicose plasmática para manter a regulagem da glicose no jejum apropriada. Isto é obtido principalmente controlando-se a liberação da glicose hepática, através da ação hepato-preferente da insulina endógena. Os análogos da insulina modernos incluem ação rápida e insulinas basais, assim como misturas destas duas. Os análogos de insulina de ação rápida (RAA) são desenvolvidos para controlar hiperglicemia pós-prandial enquanto que as insulinas com duração prolongada de ação regulam os níveis de glicose basal. As insulinas de longa ação são usadas por todos T1DM (em combinação com injeções prandiais) e a maioria dos pacientes com T2DM começam a sua terapia com insulina a partir de um produto basal. O consumo de insulina basal está crescendo rapidamente conforme a população mundial com diabetes (particularmente T2DM) se eleva.
[004] A despeito de esforços de desenvolvimento contínuos durante as várias décadas passadas, insulinas de longa ação disponíveis ainda não são otimizadas comparadas com a insulina basal fisiológica. Isto é parcialmente porque maior foco estava na melhora da platitude de PK destes análogos, mas não fixando a sobre-insulinização relativa de tecidos periféricos, que contribuem para o risco de hipoglicemia aumentada. Como um resultado, a hipoglicemia permanece um risco médico chave com carga imensa sobre os pacientes e causa morbidez e mortalidade significantes.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção fornece compostos compreendendo duas moléculas de insulina ligadas covalentemente para formar um dímero de molécula de insulina que pode ativar o receptor de insulina com potência igual à da insulina regular, mas com atividade máxima reduzida. Estes compostos são agonistas parciais de receptor de insulina (IPRAs): Eles se comportam como outros análogos da insulina para diminuir eficazmente a glicose, porém com risco mais baixo de hipoglicemia.
[006] São fornecidos dímeros de insulina covalentes agonistas parciais de receptor de insulina formulados como novas e transformativas insulinas basais (administração uma vez ao dia) que manifestam um índice terapêutico (TI) melhorado em relação ao padrão corrente de cuidado (SOC) das insulinas basais. Em uma modalidade, os IPRAs da presente invenção podem diminuir a glicose eficazmente com risco reduzido de hipoglicemia em miniporcos diabéticos e tem a propriedade de uma insulina basal de uma vez ao dia (QD). O TI melhorado pode permitir que os médicos dosem mais agressivamente os IRPAs da presente invenção para alcançar metas alvo para o controle da glicose no jejum. O controle firme da glicose no jejum e HbA1c por um IRPA pode possibilitar que o mesmo sirva como 1) uma insulina de longa ação autônoma com um perfil de eficácia e segurança realçado em T2DM e 2) uma insulina basal fundamental melhorada na T1DM (e alguma T2DM) para o uso com doses de análogos de insulina de ação rápida (RAA) prandial adicionais. Assim, a presente invenção fornece as seguintes modalidades.
[007] A presente invenção fornece um agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina compreendendo um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo ao terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; e em que pelo menos um terminal amino dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B é ligado covalentemente a um substituinte, com a condição de que a porção de ligação não inclua uma ligação de dissulfeto. Em aspectos particulares, pelo menos o terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B da primeira insulina ou análogo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte.
[008] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o terminal amino de cada polipeptídeo de cadeia A e de cada polipeptídeo de cadeia B é ligado covalentemente a um substituinte. Em aspectos particulares, o terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B da primeira insulina ou análogo de insulina e do terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e polipeptídeo de cadeia B da segunda insulina ou análogo de insulina são cada um ligados covalentemente a um substituinte. Em modalidades em que os terminais amino da primeira e da segunda insulinas ou análogos de insulina são ligados covalentemente a um substituinte, o substituinte nos terminais amino da cadeia A e polipeptídeos de cadeia B da primeira insulina ou análogo de insulina podem ser os mesmos como o substituinte nos terminais amino da cadeia A e polipeptídeos de cadeia B da segunda insulina ou análogo de insulina. Em modalidades em que os terminais amino da primeira e da segunda insulinas ou análogos de insulina são ligados covalentemente a um substituinte, o substituinte nos terminais amino da cadeia A e polipeptídeos de cadeia B da primeira insulina ou análogo de insulina podem ser diferentes do substituinte nos terminais amino da cadeia A e polipeptídeos de cadeia B da segunda insulina ou análogo de insulina.
[009] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina que são os mesmos ou em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são diferentes.
[0010] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação liga covalentemente ao primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e ao segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina via o grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi dos seus respectivos polipeptídeos de cadeia B.
[0011] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ podem ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0012] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, cada polipeptídeo de cadeia A independentemente compreende a sequência de aminoácidos GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e cada polipeptídeo de cadeia B independentemente compreende a sequência de aminoácidos X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) ou X22VNQX25X26CGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32X33X34 X35 (SEQ ID NO: 5) em que X2 é isoleucina ou treonina; X3 é valina, glicina ou leucina; X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, alanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X22 é ou fenilalanina e desamino- fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X26 é leucina ou glicina; X27 é fenilalanina ou ácido aspártico; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
[0013] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a primeira e a segunda insulinas ou análogos de insulina são independentemente insulina humana nativa, insulina lispro, insulina aspart, insulina desB30, ou insulina glargine.
[0014] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímeros de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, - S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0015] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, - C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0016] Em um outro aspecto, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0017] A presente invenção fornece ainda um agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina compreendendo a fórmula D1-L-D2 em que D1e D2são cada um independentemente um polipeptídeo de insulina ou de análogo de insulina, em que cada polipeptídeo de insulina é um heterodímero compreendendo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; L é uma porção de ligação em que uma extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido no ou próximo do grupo carboxila de D1e a outra extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido na ou próximo da extremidade de carboxila de D2com a condição de que este L não inclua uma ligação de dissulfeto; e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos de insulina ou análogo de insulina incluem um substituinte ligado ao terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B.
[0018] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, D1e D2são os mesmos ou em que D1e D2são diferentes.
[0019] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação liga covalentemente D1e D2via o grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi de D1e D2.
[0020] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ podem ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0021] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, cada polipeptídeo de cadeia A independentemente compreende a sequência de aminoácidos GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e cada polipeptídeo de cadeia B independentemente compreende a sequência de aminoácidos X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) ou X22VNQX25X26CGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32X33X34 X35 (SEQ ID NO: 5) em que X2 é isoleucina ou treonina; X3 é valina, glicina ou leucina; X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, alanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X22 é ou fenilalanina e desamino- fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X26 é leucina ou glicina; X27 é fenilalanina ou ácido aspártico; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
[0022] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, em que D1e D2são independentemente insulina humana nativa, insulina lispro, insulina aspart, insulina desB30, ou insulina glargine.
[0023] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímeros de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, - S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0024] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, - C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0025] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma alquildioíla, - C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0026] São fornecidas ainda composições compreendendo qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímero de insulina anteriormente mencionados e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0027] A presente invenção fornece ainda um agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina compreendendo um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; e opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte, com a condição de que (1) a porção de ligação não inclua uma ligação de dissulfeto e (2) quando a insulina ou análogo de insulina não é uma insulina ou análogo de insulina humanos e o terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B não inclui um substituinte então a porção de ligação não é uma porção oxalila (C2), uma porção suberoíla (C8), ou uma porção dodecanodioíla (C12).
[0028] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina que são os mesmos ou em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são diferentes.
[0029] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação liga covalentemente ao primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e ao segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina por intermédio do grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi dos seus respectivos polipeptídeos de cadeia B.
[0030] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0031] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a primeira e a segunda insulinas ou análogos de insulina são independentemente insulina humana nativa, insulina lispro, insulina aspart, insulina desB30, ou insulina glargine.
[0032] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, cada polipeptídeo de cadeia A independentemente compreende a sequência de aminoácidos GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e cada polipeptídeo de cadeia B independentemente compreende a sequência de aminoácidos X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) ou X22VNQX25X26CGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32X33X34 X35 (SEQ ID NO: 5) em que X2 é isoleucina ou treonina; X3 é valina, glicina ou leucina; X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, alanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X22 é ou fenilalanina e desamino- fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X26 é leucina ou glicina; X27 é fenilalanina ou ácido aspártico; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
[0033] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímeros de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, - S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0034] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, - C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0035] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção de acila C2-C20.
[0036] Em aspectos particulares, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0037] São fornecidas ainda composições compreendendo qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímeros de insulina anteriormente mencionados e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0038] A presente invenção fornece ainda um agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina compreendendo a fórmula D1-L-D2 em que D1e D2são cada um independentemente um polipeptídeo de insulina ou de análogo de insulina, em que cada polipeptídeo de insulina é um heterodímero compreendendo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; L é uma porção de ligação em que uma extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido no ou próximo do grupo carboxila de D1e a outra extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido na ou próximo da extremidade de carboxila de D2com a condição de que L não inclua uma ligação de dissulfeto; e opcionalmente, em que pelo menos um de D1ou D2inclui um substituinte ligado ao terminal amino do polipeptídeo de cadeia A ou o polipeptídeo de cadeia B de D1ou D2; com as condições de que (1) a porção de ligação não inclua uma ligação de dissulfeto e (2) quando o terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B não inclui um substituinte então a porção de ligação não seja uma porção oxalila (C2), uma porção suberoíla (C8), ou uma porção dodecanodioíla (C12).
[0039] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, D1e D2são os mesmos ou em que D1e D2são diferentes.
[0040] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação liga covalentemente D1e D2por intermédio do grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi de D1e D2.
[0041] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0042] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, D1e D2são independentemente insulina humana nativa, insulina lispro, insulina aspart, insulina desB30, ou insulina glargine.
[0043] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, cada polipeptídeo de cadeia A independentemente compreende a sequência de aminoácidos GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e cada polipeptídeo de cadeia B independentemente compreende a sequência de aminoácidos X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) ou X22VNQX25X26CGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32X33X34 X35 (SEQ ID NO: 5) em que X2 é isoleucina ou treonina; X3 é valina, glicina ou leucina; X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, alanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X22 é ou fenilalanina e desamino- fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X26 é leucina ou glicina; X27 é fenilalanina ou ácido aspártico; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
[0044] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina ou dímeros de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, - S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0045] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, - C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0046] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina ou dímero de insulina, a porção de ligação é uma porção de acila C2-C20.
[0047] Em aspectos particulares, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0048] A presente invenção fornece ainda um dímero de análogo de insulina compreendendo: um primeiro heterodímero de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; em que o análogo de insulina é selecionado de insulina lispro, insulina aspart, e insulina glargine; e opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte, com a condição de que a porção de ligação não inclua uma ligação de dissulfeto.
[0049] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina que são os mesmos ou em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são diferentes.
[0050] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação liga covalentemente ao primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e ao segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina por intermédio do grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi dos seus respectivos polipeptídeos de cadeia B.
[0051] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0052] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, pelo menos uma da primeira e da segunda insulinas ou análogo de insulina é conjugado ainda ao polietileno glicol, uma porção de açúcar, ou um heterociclo.
[0053] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0054] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, -C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0055] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção de acila C2-C20.
[0056] Em aspectos particulares, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitada a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0057] A presente invenção fornece ainda um dímero de análogo de insulina compreendendo a fórmula D1-L-D2 em que D1e D2são cada um independentemente um polipeptídeo de insulina ou de análogo de insulina, em que cada polipeptídeo de insulina é um heterodímero compreendendo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; L é uma porção de ligação em que uma extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido no ou próximo do grupo carboxila de D1e a outra extremidade da porção ligadora é ligada a um resíduo de aminoácido na ou próximo da extremidade de carboxila de D2com a condição de que L não inclua uma ligação de dissulfeto; em que o análogo de insulina é selecionado de insulina lispro, insulina aspart, e insulina glargine; e opcionalmente, em que pelo menos um de D1ou D2inclui um substituinte ligado ao terminal amino do polipeptídeo de cadeia A ou o polipeptídeo de cadeia B de D1ou D2; com a condição de que a porção de ligação não inclua uma ligação de dissulfeto.
[0058] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, D1e D2são os mesmos ou em que D1e D2são diferentes.
[0059] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação liga covalentemente D1e D2por intermédio do grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi de D1e D2.
[0060] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0061] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0062] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, -C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0063] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção de acila C2-C20.
[0064] Em aspectos particulares, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0065] A presente invenção fornece um agonista parcial de receptor de insulina, compreendendo um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte; e em que o agonista parcial de receptor de insulina tem uma resposta máxima para o receptor de insulina (IR) humana que é de cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, ou 70% da resposta máxima da insulina humana nativa para o IR como determinado por um ensaio de fosforilação funcional; ou um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte; e em que o agonista parcial de receptor de insulina tem uma resposta máxima para o receptor de insulina (IR) humana que está entre 20% e 70%, 40% e 70%, 50% e 70%, 40% e 60%, ou 20% e 40% da resposta máxima da insulina humana nativa para o IR como determinado por um ensaio de fosforilação funcional; ou um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte; e em que o agonista parcial de receptor de insulina tem uma resposta máxima para o receptor de insulina (IR) humana que é pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, ou 70% da resposta máxima da insulina humana nativa para o IR como determinado por um ensaio de fosforilação funcional; ou um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte; e em que o agonista parcial de receptor de insulina tem uma resposta máxima para o receptor de insulina (IR) humana que é menor do que 70% da resposta máxima da insulina humana nativa para o IR como determinado por um ensaio de fosforilação funcional; ou um primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e um segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina cada heterodímero incluindo um polipeptídeo de cadeia A e um polipeptídeo de cadeia B, em que o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B são ligados juntos através de ligações de dissulfeto intercadeia; em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são ligados covalentemente juntos através de uma porção de ligação unindo a cadeia lateral de um aminoácido no ou próximo do terminal carbóxi dos dois respectivos polipeptídeos de cadeia B; opcionalmente em que o terminal amino de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e os polipeptídeos de cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina ou segundo polipeptídeo de insulina são ligados covalentemente a um substituinte; e em que o agonista parcial de receptor de insulina tem uma resposta máxima para o receptor de insulina (IR) humana que é cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, ou 70% da resposta máxima da insulina humana nativa para o IR como determinado por um ensaio de fosforilação funcional.
[0066] Nas modalidades acima, o ensaio de fosforilação funcional pode ser um Ensaio de Fosforilação de AKT do Receptor de insulina (IR).
[0067] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação não inclui uma ligação de dissulfeto e quando o terminal amino do polipeptídeo de cadeia A e do polipeptídeo de cadeia B não incluem um substituinte a porção de ligação não é uma porção oxalila (C2), uma porção suberoíla (C8), ou uma porção dodecanodioíla (C12).
[0068] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina que são os mesmos ou em que o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina ou de análogo de insulina são diferentes.
[0069] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, em que a porção de ligação liga covalentemente ao primeiro heterodímero de insulina ou de análogo de insulina e ao segundo heterodímero de insulina ou de análogo de insulina por intermédio do grupo amino épsilon de um resíduo de lisina no ou próximo do terminal carbóxi dos seus respectivos polipeptídeos de cadeia B.
[0070] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, o substituinte tem uma fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, PEG, sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é selecionado do grupo que consiste em acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, isobutila, metoxi acetila, glicina, aminoetilglicose (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-dimetila e alcoxicarbonila.
[0071] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a primeira e a segunda insulinas ou análogos de insulina são independentemente insulina humana nativa, insulina lispro, insulina aspart, insulina desB30, ou insulina glargine.
[0072] Em aspectos particulares do agonista parcial de receptor de insulina, cada polipeptídeo de cadeia A independentemente compreende a sequência de aminoácidos GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e cada polipeptídeo de cadeia B independentemente compreende a sequência de aminoácidos X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) ou X22VNQX25X26CGX29X30LVEALILVCGERGFX27YTX31X32X33X34 X35 (SEQ ID NO: 5) em que X2 é isoleucina ou treonina; X3 é valina, glicina ou leucina; X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, alanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X22 é ou fenilalanina e desamino- fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X26 é leucina ou glicina; X27 é fenilalanina ou ácido aspártico; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
[0073] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[0074] Ainda em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção acila, -C(O)RC(O)-, onde R é cadeia de alquila, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG), cadeia contendo amida, cadeia contendo triazol(óis), porção contendo ciclooctina, uma cadeia de acila substituída, ou uma cadeia de polietileno glicol (PEG).
[0075] Em um outro aspecto do agonista parcial de receptor de insulina, a porção de ligação é uma porção de acila C2-C20.
[0076] Em aspectos particulares, a porção de ligação é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, incluindo mas não limitado a uma porção oxalila (C2), porção succinila (C4), uma porção adipoíla (C6), uma porção suberoíla (C8), uma porção decanodioíla (C10), uma porção dodecanodioíla (C12), uma porção tetradecanodioíla (C14), ou uma porção hexadecanodioíla (C16).
[0077] A presente invenção fornece ainda um dímero de insulina compreendendo um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B conjugados juntos por um ligador bifuncional selecionado do grupo que consiste em Ligador 1, Ligador 2, Ligador 3, Ligador 10, Ligador 11, Ligador 12, Ligador 13, Ligador 14, Ligador 15, Ligador 16, Ligador 17, Ligador 18, Ligador 19, Ligador 20, Ligador 21, Ligador 22, Ligador 23, Ligador 24, Ligador 25, Ligador 26, Ligador 27, Ligador 28, Ligador 29, Ligador 30, Ligador 31, Ligador 32, Ligador 33, Ligador 34, Ligador 35, Ligador 36, Ligador 37, Ligador 38, Ligador 39, Ligador 40, Ligador 41, Ligador 42, Ligador 43, Ligador 44, Ligador 45, Ligador 46, Ligador 47, Ligador 48, Ligador 49, e Ligador 50 com a condição de que quando o ligador bifuncional é o Ligador 10, Ligador 11, Ligador 12, Ligador 13, ou Ligador 14, pelo menos um do primeiro ou segundo polipeptídeos de cadeia A ou cadeia B é conjugado no seu aminoácido de terminal N a um substituinte ou pelo menos os aminoácidos de terminal N da primeira molécula de heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte ou os aminoácidos de terminal N tanto do primeiro heterodímero de insulina e segundo heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte.
[0078] Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos. Em modalidades particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[0079] A presente invenção fornece ainda um dímero de insulina compreendendo um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e o primeiro polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B conjugados a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9 conjugados juntos via o primeiro ligador e o segundo ligador.
[0080] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um dímero de análogo de insulina, compreendendo um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B conjugados a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B conjugados a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7, em que o primeiro e segundo ligadores são conjugados juntos via um ligador em ponte tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG25.
[0081] Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos. Em modalidades particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[0082] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um dímero de análogo de insulina, compreendendo um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B conjugados a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B conjugados a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9, em que o primeiro e segundo ligadores são conjugados juntos via um ligador em ponte tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG 25.
[0083] Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos. Em modalidades particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[0084] A presente invenção fornece ainda composições compreendendo qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina aqui descritos e um sal farmaceuticamente aceitável.
[0085] A presente invenção fornece um método para tratar diabetes compreendendo administrar a um indivíduo com diabetes uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina anteriormente mencionados. Em aspectos particulares a diabetes é diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2 ou diabetes gestacional.
[0086] A presente invenção fornece o uso de uma composição para o tratamento de diabetes compreendendo qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina anteriormente mencionados. Em aspectos particulares a diabetes é diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2 ou diabetes gestacional.
[0087] A presente invenção fornece o uso de qualquer um dos agonistas parciais de receptor de insulina aqui descritos para a fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes. Em aspectos particulares a diabetes é diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2 ou diabetes gestacional.
Definições
[0088] Insulina - como aqui usado, o termo significa o princípio ativo do pâncreas que afeta o metabolismo de carboidratos no corpo animal e que é de valor no tratamento de diabetes mellitus. O termo inclui produtos sintéticos e biotecnologicamente derivados que são os mesmos como, ou similares às, insulinas que ocorrem naturalmente em estrutura, uso, e efeito pretendido e são de valor no tratamento de diabetes mellitus. O termo é um termo genérico que designa o heterodímero de 51 aminoácidos compreendendo o peptídeo de cadeia A tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e o peptídeo de cadeia B tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, em que os resíduos de cisteína nas posições 6 e 11 da cadeia A estão ligados em uma ligação de dissulfeto, os resíduos de cisteína na posição 7 da cadeia A e posição 7 da cadeia B estão ligados em uma ligação de dissulfeto, e os resíduos de cisteína na posição 20 da cadeia A e 19 da cadeia B são ligados em uma ligação de dissulfeto.
[0089] Análogo de insulina - o termo como aqui usado inclui qualquer análogo heterodimérico ou análogo de cadeia única que compreende uma ou mais modificação(ões) do peptídeo de cadeia A e/ou peptídeo de cadeia B nativos. As modificações incluem, mas não são limitadas a substituir um aminoácido no lugar do aminoácido nativo em uma posição selecionada de A4, A5, A8, A9, A10, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29, e B30; deletar qualquer uma ou todas das posições B1-4 e B26-30; ou conjugar diretamente ou por um ligador polimérico ou não polimérico uma ou mais porções de acila, polietilglicina (PEG), ou sacarídeo; ou qualquer combinação das mesmas. Como exemplificado pelos análogos de insulina glicosilados ligados em N aqui descritos, o termo inclui ainda qualquer heterodímero de insulina e análogos de cadeia única que foi modificada para ter pelo menos um sítio de glicosilação ligado em N e em particular, modalidades em que o sítio de glicosilação ligado em Né ligado a ou ocupado por um N-glicano. Os exemplos de análogos de insulina incluem, mas não são limitados aos análogos heterodiméricos e de cadeia única descritos no pedido internacional publicado WO20100080606, WO2009/099763, e WO2010080609, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência. Os exemplos de análogos de insulina de cadeia única também incluem, mas não são limitados a aqueles descritos nos Pedidos Internacionais publicados WO9634882, WO95516708, WO2005054291, WO2006097521, WO2007104734, WO2007104736, WO2007104737, WO2007104738, WO2007096332, WO2009132129; Patentes U.S. Nos. 5.304.473 e 6.630.348; e Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), as descrições dos quais são cada uma aqui incorporada por referência.
[0090] O termo inclui ainda moléculas de polipeptídeo de cadeia única e heterodiméricas que têm pouca ou nenhuma atividade detectável no receptor de insulina mas que foram modificadas para incluir uma ou mais modificações ou substituições de aminoácido para ter uma atividade no receptor de insulina que tem pelo menos 1%, 10%, 50%, 75%, ou 90% da atividade no receptor de insulina quando comparada com a insulina nativa e que inclui ainda pelo menos um sítio de glicosilação ligado em N. Em aspectos particulares, o análogo de insulina é um agonista parcial que tem menos do que 80% (ou 70%) de atividade no receptor de insulina como a insulina nativa. Estes análogos de insulina, que têm atividade reduzida no receptor do hormônio do crescimento de insulina e atividade realçada no receptor de insulina, incluem análogos tanto heterodiméricos quanto de cadeia única.
[0091] Insulina de cadeia única ou análogo de insulina de cadeia única - como aqui usados, os termos abrangem um grupo de proteínas estruturalmente relacionadas em que o peptídeo de cadeia A ou análogo funcional e o peptídeo de cadeia B ou análogo funcional são ligados covalentemente por um peptídeo ou polipeptídeo de 2 a 35 aminoácidos ou ligador polimérico não peptídico ou não polimérico e que tem pelo menos 1%, 10%, 50%, 75%, ou 90% da atividade da insulina no receptor de insulina quando comparado com a insulina nativa. A insulina ou análogo de insulina de cadeia única incluem ainda três ligações de dissulfeto: a primeira ligação de dissulfeto está entre os resíduos de cisteína nas posições 6 e 11 da cadeia A ou análogo funcional da mesma, a segunda ligação de dissulfeto está entre os resíduos de cisteína na posição 7 da cadeia A ou análogo funcional da mesma e na posição 7 da cadeia B ou análogo funcional da mesma, e a terceira ligação de dissulfeto está entre os resíduos de cisteína na posição 20 da cadeia A ou análogo funcional da mesma e posição 19 da cadeia B ou análogo funcional da mesma.
[0092] Peptídeo de conexão ou peptídeo C - como aqui usados, os termos se referem à porção de conexão “C” da sequência de polipeptídeo B- C-A de uma molécula equivalente à preproinsulina de cadeia única. Especificamente, na cadeia de insulina natural, o peptídeo C se conecta com o aminoácido na posição 30 da cadeia B e o aminoácido na posição 1 da cadeia A. O termo pode se referir tanto ao peptídeo C da insulina nativa, ao peptídeo C de macaco, quanto a qualquer outro peptídeo de 3 a 35 aminoácidos que conecte a cadeia B à cadeia A assim é intencionado a abranger qualquer peptídeo que ligue o peptídeo de cadeia B ao peptídeo de cadeia A em um análogo de insulina de cadeia única (Ver por exemplo, os Pedidos Publicados U.S. Nos. 20090170750 e 20080057004 e WO9634882) e nas moléculas precursoras de insulina tais como descritas na WO9516708 e Patente U.S. No. 7.105.314.
[0093] Modificação de aminoácido - como aqui usado, o termo se refere a uma substituição de um aminoácido, ou a derivação de um aminoácido pela adição e/ou remoção de grupos químicos ao/do aminoácido, e inclui a substituição com qualquer um dos 20 aminoácidos habitualmente encontrados em proteínas humanas, assim como aminoácidos de ocorrência atípica ou não natural. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL), e Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Os aminoácidos atípicos podem ser adquiridos de fornecedores comerciais, sintetizados de novo, ou quimicamente modificados ou derivatizados a partir dos aminoácidos que ocorrem naturalmente.
[0094] Substituição de aminoácido - como aqui usado se refere à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente.
[0095] Substituição de aminoácido conservativa - como aqui usado, o termo é aqui definido como trocas dentro de um dos seguintes cinco grupos: I. Resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico e ácido homocisteico; III. Resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn) IV. Resíduos grandes, alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína V. Resíduos grandes, aromáticos: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina
[0096] Tratar - Como aqui usado, o termo “tratar” (ou “tratando”, “tratado”, “tratamento”, etc.) se refere à administração de um IRPA da presente descrição a um sujeito em necessidade do mesmo com o propósito para aliviar, remediar, alterar, melhorar, restabelecer ou afetar uma condição (por exemplo, diabete), um sintoma ou sintomas de uma condição (por exemplo, hiperglicemia), ou a predisposição para um condição. Por exemplo, como aqui usado o termo “tratando a diabete” referir-se-á no geral à manutenção dos níveis sanguíneos de glicose próximo aos níveis normais e pode incluir aumentar ou diminuir os níveis de glicose sanguínea dependendo de uma dada situação.
[0097] Carreador farmaceuticamente aceitável - como aqui usado, o termo inclui qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes de umectação adequados para a administração a ou em um indivíduo em necessidade. O termo também abrange qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do governo federal dos Estados Unidos ou listados na Farmacopéia dos Estados Unidos para o uso em animais, incluindo seres humanos.
[0098] Sal farmaceuticamente aceitável - como aqui usado, o termo se refere aos sais de compostos que retém a atividade biológica do composto precursor, e que não são biologicamente ou de outro modo indesejável. Muitos dos compostos aqui descritos são capazes de formar sais de ácido e/ou base em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxila ou grupos similares a estes.
[0099] Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de bases inorgânicas e orgânicas. Os sais derivados de bases inorgânicas, incluem apenas por via de exemplo, os sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, zinco e magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não são limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias.
[00100] Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos. Os sais derivados de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e os semelhantes. Os sais derivados de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico, e os semelhantes.
[00101] Quantidade eficaz ou terapeuticamente eficaz - como aqui usado se refere a uma quantidade não tóxica, mas suficiente de um análogo de insulina para fornecer o efeito desejado. Por exemplo um efeito desejado seria a prevenção ou tratamento da hiperglicemia. A quantidade que é “eficaz” variará de sujeito para sujeito, dependendo da idade e condição geral do indivíduo, modo de administração, e os semelhantes. Assim, não é sempre possível especificar uma “quantidade eficaz” exata. Não é sempre possível determinar a quantidade eficaz ótima antes da administração ao ou em um indivíduo em necessidade da mesma. Entretanto, uma quantidade “eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica usando experimentação de rotina.
[00102] Parenteral - como aqui usado, o termo significa não através do canal alimentar, mas por alguma outra via tal como intranasal, inalação, subcutânea, intramuscular, intraespinhal, ou intravenosa.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00103] A Figura 1 mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 24, 18, e 40 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00104] A Figura 2A mostra os resultados de um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos comparando o composto A com RHI (Humulin). O composto A foi administrado em uma dose de 72 U/kg e uma dose de 300 U/kg e o Humulin foi administrado em uma dose de 18 U/kg e uma dose de 72 U/kg.
[00105] A Figura 2B mostra os resultados de um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos comparando o composto B com RHI (Humulin). O composto B foi administrado em uma dose de 72 U/kg e uma dose de 300 U/kg e o Humulin foi administrado em uma dose de 18 U/kg e uma dose de 72 U/kg.
[00106] A Figura 2C mostra os resultados de um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos comparando o Dímero 24 com RHI (Humulin). O Dímero 24 foi administrado em uma dose de 72 U/kg e uma dose de 300 U/kg e o Humulin foi administrado em uma dose de 18 U/kg e uma dose de 72 U/kg.
[00107] A Figura 2D mostra os resultados do Dímero 55 em um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos. O Dímero 55 foi administrado em uma dose de 120 nmol/kg e uma dose de 300 nmol/kg.
[00108] A Figura 2E mostra os resultados do Dímero 58 em um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos. O Dímero 58 foi administrado em uma dose de 60 nmol/kg e uma dose de 300 nmol/kg.
[00109] A Figura 2F mostra os resultados do Dímero 60 em um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos. O Dímero 60 foi administrado em uma dose de 72 nmol/kg e uma dose de 300 nmol/kg.
[00110] A Figura 2G mostra os resultados do Dímero 67 em um Teste de Tolerância à Insulina (ITT) em camundongos. O Dímero 67 foi administrado em uma dose de 120 nmol/kg e uma dose de 300 nmol/kg.
[00111] A Figura 3 mostra que o dímero de insulina do Composto A foi degradado para os monômeros de insulina pela incubação de 2 horas com membranas de célula renal de rato (RKCMs) sem glutationa (GSH). A % de valores precursores são semiquantitativos apenas devido às diferenças potenciais nas eficiências de ionização.
[00112] A Figura 4 mostra que o dímero de insulina do Composto A foi degradado para monômeros de insulina pela incubação de 2 horas com membranas de célula renal de rato (RKCMs) com glutationa (GSH). A % de valores precursores é semiquantitativas apenas devido às diferenças potenciais na eficiência de ionização.
[00113] A Figura 5 mostra que o Dímero 24 perde algum polipeptídeo de cadeia A, mas não degradou para monômeros pela incubação de 2 horas com membranas de célula renal de rato (RKCMs) sem glutationa (GSH). A % de valores precursores é apenas semiquantitativa devido às diferenças potenciais na eficiência de ionização.
[00114] A Figura 6 mostra que o Dímero 24 perde algum polipeptídeo de cadeia A, mas não degradou para monômeros pela incubação de 2 horas com membranas de célula renal de rato (RKCMs) com glutationa (GSH). A % de valores precursores é apenas semiquantitativa devido às diferenças potenciais na eficiência de ionização.
[00115] A Figura 7A mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 4, 5, 7, 8, e 9 comparados com RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00116] A Figura 7B mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 18, 19, 20, 21, e 22 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00117] A Figura 7C mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 23, 24, 26, 27, e 28 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00118] A Figura 7D mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 29, 32, 37, 38, e 39 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00119] A Figura 7E mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 40, 41, 43, 44, e 48 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00120] A Figura 7F mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 55, 57, 58, 60, e 61 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00121] A Figura 7G mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 62, 64, 67, 69, e 71 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
[00122] A Figura 7H mostra o efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 72, 77, e 78 comparados com a RHI quando administrados aos miniporcos diabéticos a 0,69 nmol/kg.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00123] A presente invenção fornece compostos compreendendo duas moléculas de insulina ligadas covalentemente para formar um dímero de insulina ligado covalentemente que pode ativar o receptor de insulina com potência igual à da insulina regular e atividade máxima reduzida. Estes compostos são agonistas parciais de receptor de insulina (IRPA): eles se comportam como outros análogos de insulina para diminuir eficazmente a glicose, mas com risco mais baixo de hipoglicemia.
[00124] Os dímeros de insulina foram descritos em Brandenburg et al. na Patente U.S. No. 3.907.763 (1973); Tatnell et al., Biochem J. 216: 687694 (1983); Shüttler e Brandenburg, Hoppe-Seiler’s Z. Physiol. Chem, 363, 317-330, 1982; Weiland et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1154-1158 (1990); Deppe et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol (1994) 350: 213-217; Brandenburg e Havenith na Patente U.S. No. 6.908.897 (B2) (2005); Knudsen et al., PLOS ONE 7: e51972 (2012); DiMarchi et al na WO2011/159895; DiMarchi et al. na WO 2014/052451; e Herrera et al., WO2014141165. Mais recentemente, os dímeros de insulina foram descritos em Brant- Synthesis and Characterization of Insulin Receptor Partial Agonists as a Route to Improved Diabetes Therapy, Ph.D. Dissertation, Indiana University (Abril 2015) e Zaykov e DiMarchi, Poster P212- Exploration of the structural and mechanistic basis for partial agonism of insulin dimers, American Peptide Symposium, Orlando FL (20 a 25 de junho de 2015). Entretanto, os inventores da presente invenção descobriram que o nível de atividade da insulina e atividade do agonista parcial dos dímeros são uma função da estrutura dimérica, a sequência do análogo de insulina, o comprimento do ligador de dimerização, e o sítio de dimerização que conecta os dois polipeptídeos de insulina. Os inventores descobriram que os dímeros de insulina da presente invenção têm risco reduzido de promover a hipoglicemia quando administrados em altas doses quando comparados com a insulina nativa ou outros análogos de insulina quando administrados em altas doses.
[00125] A presente invenção fornece dímeros de insulina ligados covalentemente a agonistas parciais formulados como uma insulina basal nova e transformativa (administração uma vez ao dia) que manifesta índice terapêutico (TI) melhorado em relação às insulinas basais do padrão de cuidado (SOC) corrente. Estas moléculas podem abaixar a glicose eficazmente com risco reduzido de hipoglicemia em miniporco diabético e têm a propriedade de uma insulina basal uma vez ao dia (QD). O TI melhorado pode permitir que os médicos dosem mais agressivamente o dímero de IRPA para alcançar metas alvo para controle da glicose no jejum. O controle firme da glicose no jejum e HbA1c pode permitir que estas moléculas sirvam como 1) uma insulina de longa ação autônoma com uma eficácia e perfil de segurança realçados na diabetes mellitus Tipo 2 (T2DM) e 2) uma insulina basal fundamental melhorada na diabetes mellitus Tipo 1 (T1DM) (e alguma T2DM) para o uso com doses de análogos de insulina de ação rápida (RAA) prandial adicionais.
[00126] Uma insulina de longa ação ideal fornece controle contínuo da glicose no jejum em diabéticos com PK / PD altamente estável e reprodutível. Entretanto, as insulinas basais correntemente disponíveis, mesmo aquelas com estabilidade e reprodutibilidade melhoradas de PK/PD continuam a ter um índice terapêutico estreito e incidentes de hipoglicemia aumentam conforme os níveis de glicose se aproximam do alvo de euglicemia. Isto pode frequentemente levar à subdosagem para evitar a hipoglicemia. O tratamento com um IRPA da presente invenção é esperado alterar esta relação de eficácia:hipoglicemia pela atenuação da taxa de mudança na diminuição da glicose conforme a dosagem é aumentada.
Cadeias A e B da Insulina
[00127] São aqui descritos dímeros de insulina ou de análogos de insulina que têm atividade agonista de receptor de insulina. O nível de atividade de insulina dos dímeros é uma função da estrutura dimérica, da sequência do análogo de insulina, do comprimento do ligador de dimerização, e do sítio de dimerização que conecta os dois polipeptídeos de insulina. Os polipeptídeos de insulina da presente invenção podem compreender as sequências das cadeias B e A nativas da insulina humana (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente) ou qualquer um dos análogos conhecidos ou derivados dos mesmos que exibam atividade agonista de insulina quando ligados a um ao outro em um heteroduplex. Tais análogos incluem, por exemplo, proteínas que tenham uma cadeia A e uma cadeia B que difiram da cadeia A e cadeia B da insulina humana por ter uma ou mais deleções de aminoácido, uma ou mais substituições de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido que não destruam a atividade de insulina do análogo de insulina.
[00128] Um tipo de análogo de insulina, o “análogo de insulina monomérico”, é bem conhecido na técnica. Estes são análogos de ação rápida de insulina humana, incluindo, por exemplo, análogos de insulina em que: (a) o resíduo de amino acila na posição B28 é substituído com Asp, Lys, Leu, Val, ou Ala, e o resíduo de amino acila na posição B29 é Lys ou Pro; (b) os resíduos de amino acila em qualquer uma das posições B27 e B30 são deletados ou substituídos com um aminoácido não nativo.
[00129] Em uma modalidade um análogo de insulina é fornecido compreendendo um Asp substituído na posição B28 (por exemplo, insulina aspart (NOVOLOG); ver a SEQ ID NO: 9) ou um Lys substituído na posição 28 e uma prolina substituída na posição B29 (por exemplo, insulina lispro (HUMALOG); ver a SEQ ID NO: 6). Análogos de insulina monoméricos adicionais são descritos em Chance, et al., Pat. U.S. No. 5.514.646; Chance, et al., Pedido de Patente U.S. Ser. No. 08/255.297; Brems, et al., Protein Engineering, 5: 527-533 (1992); Brange, et al., Publicação EPO No. 214.826 (publicada em 18 de Mar. de 1987); e Brange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1: 934-940 (1991). Estas descrições são aqui expressamente incorporadas por referência para descrever análogos de insulina monoméricos.
[00130] Análogos de insulina também podem ter substituições dos aminoácidos amidados com formas ácidas. Por exemplo, Asn pode ser substituído com Asp ou Glu. Igualmente, Gln pode ser substituído com Asp ou Glu. Em particular, AsN(A18), AsN(A21), ou Asp(B3), ou qualquer combinação destes resíduos, podem ser substituídos com Asp ou Glu. Também, GlN(A15) ou GlN(B4), ou ambos, podem ser substituídos com Asp ou Glu.
[00131] Como aqui descritos análogos de insulina de cadeia única são fornecidos compreendendo uma cadeia B e uma cadeia A de insulina humana, ou análogos ou derivados da mesma, em que o terminal carbóxi da cadeia B é ligado ao terminal amino da cadeia A via uma porção de ligação. Em uma modalidade a cadeia A é a sequência de aminoácidos GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) e a cadeia B compreende a sequência de aminoácidos FVNQHLCGSH LVEALILVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) ou uma sequência das mesmas encurtadas no carbóxi tendo B30 deletado, e análogos destas sequências em que cada sequência é modificada para compreender de um a cinco substituições de aminoácido nas posições correspondendo às posições de insulina nativa selecionadas de A5, A8, A9, A10, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30, com a condição de que pelo menos um de B28 ou B29 é lisina. Em uma modalidade as substituições de aminoácido são substituições de aminoácido conservativas. As substituições de aminoácido adequadas nestas posições que não impactam adversamente as atividades desejadas da insulina são conhecidas por aqueles habilitados na técnica, como demonstrado, por exemplo, em Mayer, et al., Insuline Structure and Function, Biopolymers. 2007; 88(5): 687-713, a descrição da qual é aqui incorporada por referência.
[00132] De acordo com uma modalidade os peptídeos análogos de insulina podem compreender uma cadeia A da insulina e uma cadeia B da insulina ou análogos das mesmas, em que a cadeia A compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) em relação ao comprimento do peptídeo nativo, com GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) e a cadeia B compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) em relação ao comprimento do peptídeo nativo, com FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) ou uma sequência encurtada no carbóxi da mesma tendo B30 deletado.
[00133] As sequências de aminoácido adicionais podem ser adicionadas ao terminal amino da cadeia B ou ao terminal carbóxi da cadeia A dos polipeptídeos de insulina da presente invenção. Por exemplo, uma série de aminoácidos negativamente carregados podem ser adicionados ao terminal amino da cadeia B, incluindo por exemplo um peptídeo de 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8 ou 1 a 6 aminoácidos no comprimento e compreendendo um ou mais aminoácidos negativamente carregados incluindo por exemplo ácido glutâmico e ácido aspártico. Em uma modalidade a extensão de terminal amino da cadeia B compreende de 1 a 6 aminoácidos carregados. De acordo com uma modalidade os polipeptídeos de insulina descritos compreendem uma amida de terminal C ou éster no lugar de um carboxilato de terminal C na cadeia A.
[00134] Em várias modalidades, o análogo de insulina tem um ponto isoelétrico que foi mudado em relação à insulina humana. Em algumas modalidades, a mudança no ponto isoelétrico é obtida pela adição de um ou mais resíduos de arginina, lisina, ou histidina ao peptídeo do terminal N da cadeia A da insulina e/ou ao peptídeo do terminal C da cadeia B da insulina. Os exemplos de tais polipeptídeos de insulina incluem ArgA0-insulina humana, ArgB31ArgB32-insulina humana, GlyA21ArgB31ArgB32-insulina A0 B31 B32 A0 A21 B31 B32 humana, Arg Arg Arg -insulina humana, e Arg Gly Arg -Arg - insulina humana. Por via de exemplo adicional, a insulina glargine (LANTUS; ver as SEQ ID NOs: 7 e 8) é um análogo de insulina de longa ação exemplar em que AsnA21foi substituído por glicina, e dois resíduos de arginina foram ligados covalentemente ao terminal C do peptídeo B. O efeito destas mudanças de aminoácido foi mudar o ponto isoelétrico da molécula, produzindo deste modo uma molécula que é solúvel no pH ácido (por exemplo, pH 4 a 6,5) mas insolúvel no pH fisiológico. Quando uma solução de insulina glargine é injetada no músculo, o pH da solução é neutralizado e a insulina glargine forma microprecipitados que lentamente liberam a insulina glargine durante o período de 24 horas a seguir da injeção sem nenhum pico de insulina pronunciado e assim um risco reduzido de induzir a hipoglicemia. Este perfil permite uma dosagem de uma vez ao dia para fornecer uma insulina basal do paciente. Assim, em algumas modalidades, o análogo de insulina compreende um peptídeo de cadeia A em que o aminoácido na posição A21 é glicina e um peptídeo de cadeia B em que os aminoácidos na posição B31 e B32 são arginina. A presente descrição abrange todas as combinações únicas e múltiplas destas mutações e quaisquer outras mutações que são aqui descritas (por exemplo, GlyA21- insulina humana, GlyA21ArgB31-insulina humana, ArgB31ArgB32-insulina humana, ArgB31-insulina humana).
[00135] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, um ou mais aminoácidos amidados do análogo de insulina são substituídos com um aminoácido ácido, ou um outro aminoácido. Por exemplo, asparagina pode ser substituída com ácido aspártico ou ácido glutâmico, ou um outro resíduo. Igualmente, glutamina pode ser substituída com ácido aspártico ou ácido glutâmico, ou um outro resíduo. Em particular, AsnA18, AsnA21, ou AsnB3, ou qualquer combinação destes resíduos, podem ser substituídos por ácido aspártico ou ácido glutâmico, ou um outro resíduo. GlnA15ou GlnB4, ou ambos, podem ser substituídos por ácido aspártico ou ácido glutâmico, ou um outro resíduo. Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, os análogos de insulina têm um ácido aspártico, ou um outro resíduo, na posição A21 ou ácido aspártico, ou um outro resíduo, na posição B3, ou ambos.
[00136] Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que é possível substituir ainda outros aminoácidos no análogo de insulina com outros aminoácidos enquanto retém a atividade biológica da molécula. Por exemplo, sem limitação, as seguintes modificações também são amplamente aceitas na técnica: substituição do resíduo de histidina da posição B10 com ácido aspártico (HisB10para AspB10); substituição do resíduo de fenilalanina na posição B1 com ácido aspártico (PheB1para AspB1); substituição do resíduo de treonina na posição B30 com alanina (ThrB30para AlaB30); substituição do resíduo de tirosina na posição B26 com alanina (TyrB26para AlaB26); e substituição do resíduo de serina na posição B9 com ácido aspártico (SerB9 para AspB9).
[00137] Em várias modalidades, o análogo de insulina tem um perfil prolongado de ação. Assim, em certas modalidades, o análogo de insulina pode ser acilado com um ácido graxo. Isto é, uma ligação de amida é formada entre um grupo amino no análogo de insulina e o grupo do ácido carboxílico do ácido graxo. O grupo amino podem ser o grupo alfa-amino de um aminoácido de terminal N do análogo de insulina, ou pode ser o grupo épsilon-amino de um resíduo de lisina do análogo de insulina. O análogo de insulina pode ser acilado em um ou mais dos três grupos amino que estão presentes na insulina humana do tipo selvagem, pode ser acilado no resíduo de lisina que foi introduzido dentro da sequência da insulina humana do tipo selvagem. Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o análogo de insulina pode ser acilado na posição A1, B1, ou tanto A1 quanto B1. Em certas modalidades, o ácido graxo é selecionado de ácido mirístico (C14), ácido pentadecílico (C15), ácido palmítico (C16), ácido heptadecílico (C17) e ácido esteárico (C18).
[00138] Os exemplos de análogos de insulina podem ser encontrados por exemplo no Pedido Internacional publicado WO9634882, WO95516708; WO20100080606, WO2009/099763, e WO2010080609, Patente US No. 6.630.348, e Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência). Em modalidades adicionais, os análogos de insulina glicosilados in vitro ou N-glicosilados in vivo podem ser acilados e/ou peguilados.
[00139] De acordo com uma modalidade, um análogo de insulina é fornecido em que a cadeia A do peptídeo de insulina compreende a sequência GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3) e a cadeia B compreendendo a sequência X25LCGX29X30LVEALILVCGERGFFYTX31X32 (SEQ ID NO: 4) em que X8 é treonina ou histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metoxi-fenilalanina, ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X25 é histidina ou treonina; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é prolina ou lisina; e X32 é prolina ou lisina, com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 é lisina.
[00140] Em uma modalidade adicional, a cadeia B compreende a sequência X22VNQX25LCGX29X30LVEALILVCGERGFFYT- X31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5) em que X22 é ou fenilalanina e desamino-fenilalanina; X25 é histidina ou treonina; X29 é alanina, glicina ou serina; X30 é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocisteico ou ácido cisteico; X31 é ácido aspártico, prolina ou lisina; X32 é lisina ou prolina; X33 é treonina, alanina ou ausente; X34 é arginina ou ausente; e X35 é arginina ou ausente; Com a condição de que pelo menos um de X31 ou X32 seja lisina.
Porção de ligação
[00141] Os dímeros de insulina aqui descritos são formados entre um primeiro e segundo polipeptídeos de insulina em que cada polipeptídeo de insulina compreende uma cadeia A e uma cadeia B. O primeiro e segundo polipeptídeos de insulina podem ser dois análogos da cadeia de insulina (isto é, em que as cadeias A e B são ligadas apenas via ligação de dissulfetos inter-cadeia entre resíduos de cisteína internos) em que o primeiro e o segundo polipeptídeos de insulina são ligados um ao outro para formar o dímero por uma ligação covalente, ligador bifuncional, ou usando a química click de cicloadição de alcino-azida catalisada por cobre(I) (CuAAC) ou química click isenta de cobre para ligar porções de ligação nas respectivas cadeias B. De acordo com uma modalidade o primeiro e o segundo polipeptídeos de insulina são ligados um ao outro por um ligador bifuncional unindo a cadeia lateral da lisina B28 ou B29 da cadeia B do primeiro polipeptídeo de insulina à cadeia lateral do aminoácido B28 ou B29 da cadeia B do segundo polipeptídeo de insulina.
[00142] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação pode ser um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. A porção de ligação pode ser uma cadeia de hidrocarboneto C1-C20 bivalente, reta ou ramificada, saturada ou insaturada, opcionalmente substituída em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática.
[00143] Em uma modalidade, a porção de ligação compreende um PEG ligador, um polímero linear curto de cerca de 2 a 25 unidades de etileno glicol ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 25 unidades de etileno glicol e opcionalmente um ou mais aminoácidos. Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o ligador de PEG compreende a estrutura (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)25. O ligador de PEG pode ser um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon da posição B29 ou B28 dos resíduos de lisina do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina. A estrutura de um ligador de PEG bifuncional conjugado ao grupo amino épsilon dos grupos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina pode ser representada pela seguinte fórmula geral em que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 25 e a linha ondulada indica a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon. Os métodos para conjugar PEG ao grupo amino épsilon de lisina são bem conhecidos na técnica, ver por exemplo, Veronese, Biomaterials 22: 405-417 (2001).
[00144] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação de PEG conjugando o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro polipeptídeo de insulina ao aminoácido épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 do segundo polipeptídeo de insulina é em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00145] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende uma porção acila compreendendo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, ou 16 carbonos. Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de acila é uma porção succinila (4), adipoíla (C6), suberoíla (C8), ou hexadecanodioíla (C16). A porção de acila pode compreender um ligador bifuncional que possa ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina. A estrutura de um ligador de acila bifuncional conjugado ao grupo amino épsilon do grupo lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina podem ser representados pela seguinte fórmula geral em que n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 e as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00146] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, a porção de ligação de acil conjugando o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro polipeptídeo de insulina ao aminoácido épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 do segundo polipeptídeo de insulina é 0 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00147] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o ligador de acila bifuncional pode incluir ainda um ou dois aminoácidos em um ou ambos os terminais do ligador de acila. Por exemplo, em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o aminoácido em um ou ambos os terminais do ligador é ácido gama glutâmico (yE), que pode ser representado pela seguinte fórmula geral em que n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 e as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00148] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional de cadeia de alquila contendo amida que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados pela seguinte fórmula geral em que n = 1 ou 2, o = 1, 2, 3, 4, ou 5, e as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em uma modalidade particular, a porção de ligação pode ter a estrutura em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00149] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional de cadeia de alquila contendo amida que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados pela seguinte fórmula geral o o em que n = 1, 2, 3, 4, ou 5, o = 1 ou 2, p = 1, 2, 3, 4, ou 5, e as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em uma modalidade particular, a porção de ligação pode ter a estrutura em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00150] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional de cadeia de alquila contendo amida que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina e que podem ser representados pela seguinte fórmula geralem que n = 1 ou 2, o = 1, 2, ou 3, p = 1 ou 2, e as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em uma modalidade particular, a porção de ligação pode ter a estrutura em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00151] Em modalidades particulares, a porção de ligação compreende uma estrutura de anel, que fornece rigidez à porção de ligação. Em modalidades particulares, a estrutura de anel compreende um grupo benzila ou um grupo alicíclico saturado ou não saturado tendo 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 carbonos. Em modalidades particulares, o grupo alicíclico compreende um ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclopentila ou ciclooctila. Em modalidades particulares, o grupo alicíclico não saturado (cicloalcano) compreende um grupo ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclohexenila, cicloheptenila ou ciclooctenila. Em modalidades particulares, a estrutura de anel pode compreender ainda uma ou mais cadeias laterais alifáticas saturadas ou não saturadas. Em modalidades particulares, a estrutura de anel pode compreender ainda uma ou mais cadeias laterais alifáticas compreendendo um ou mais heteroátomos. Em modalidades particulares, o heteroátomo é O, S, ou N.
[00152] Em modalidades particulares, a estrutura de anel compreende um heteroátomo. Em modalidades particulares, o heteroátomo pode ser O, S, ou N. Em modalidades particulares, a estrutura de anel compreende um grupo benzila ou um grupo alicíclico saturado ou não saturado tendo 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 carbonos em que um ou mais carbonos são substituídos com um heteroátomo selecionado de N, O, e S. Os exemplos de estruturas de anel que incluem um heteroátomo incluem, mas não são limitadas a óxido de etileno, etilenimima, trimetilóxido, furano, tetraidrofurano, tifeno, pirrolidina, pirano, piperidina, imidazol, tiazol, dioxano, morfolina, pirimidina, triazol, tietano, 1,3-diazetina, 2,3-diidroazete, 1,2-oxatiolano, isoxazol, oxazol, silol, oxepano, tiepina, 3,4,5,6-tetraidro-2H-azepina, 1,4-tiazepina, azocane, e tiocane.
[00153] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por um benzeno-1,1 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes em que R1 e R2 são independentemente uma ligação, uma cadeia de alquila C1-C20 ou C1-C6 saturada ou não saturada em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG) PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)2 e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00154] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugada ou ligada ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por um benzeno-1,1 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que n e o são independentemente 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00155] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes em que R1 e R2 são independentemente uma ligação, uma cadeia de alquila C1-C20 ou C1-C6 saturada ou não saturada em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG) PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)2 e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00156] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que n e o são independentemente 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00157] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,4 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes em que R1 e R2 são independentemente uma ligação, uma cadeia de alquila C1-C20 ou C1-C6 em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG) PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)2 e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00158] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,4 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que n e o são independentemente 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00159] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geralKm X T em que m, n, e o são cada um independentemente 1 ou 2; R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes em que R1 e R2 são independentemente uma ligação, uma cadeia de alquila C1-C20 ou C1-C6 em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, - C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG) PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)2 e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00160] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que m, n, e o são cada um independentemente 1 ou 2; em que p e q são independentemente 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00161] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral . H \ ’xTz íí Hi o em que m, n, e o são cada um independentemente 1 ou 2; em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00162] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma ciclohexano-1,4 diacila tendo a seguinte fórmula geral e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00163] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por um ciclohexano-1,4 diacila tendo a seguinte fórmula geral e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00164] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geralem que m e n são cada um independentemente 0, 1, ou 2 com a condição de que tanto m quanto n não são 0; R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes em que R1 e R2 são independentemente uma ligação, uma cadeia de alquila C1-C20 ou C1-C6 em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, - N(R)SO2-, SO2N(R)-, um grupo heterocíclico, um grupo arila, ou um grupo heteroarila, em que cada ocorrência de R é independentemente hidrogênio, um grupo de proteção adequado, uma porção acila, porção aralquila, porção alifática, porção arila, porção heteroarila, ou porção heteroalifática, cadeia de poli(etileno glicol) (PEG) PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16, ou (PEG)2 e em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00165] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma benzeno-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que m e n são cada um independentemente 1 ou 2; em que p e q são independentemente 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00166] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma 1,1 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que n é 1, 2, 3, ou 4 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em modalidades específicas, a 1,1 diacila pode ter uma estrutura selecionada de e (1,1-diacil-C3; 1,2-diacil-C4; 1,1-diacil-C5; e 1,1-diacil-C6, respectivamente) em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00167] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma 1,2 diacila tendo a seguinte fórmula geral em que n é 1, 2, 3, ou 4 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em modalidades específicas, a 1,2 diacila pode ter uma estrutura selecionada de (1,2-diacil-C3; 1,2-diacil-C4; 1,2-diacil-C5; e 1,2-diacil-C6, respectivamente) em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00168] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma 1,3 diacila tendo a seguinte fórmula geral Cr4 V° em que n é 1, 2, ou 3 em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina. Em modalidades específicas, a 1,3 diacila pode ter uma estrutura selecionada de (1,3-diacil-C4; 1,3-diacil-C5; e 1,3-diacil-C6, respectivamente) em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00169] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugada ou ligada ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma 1,4 diacila tendo a seguinte fórmula geral (1,4-diacil-C6) em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00170] Em uma outra modalidade, a porção de ligação compreende um ligador bifuncional que pode ser covalentemente conjugado ou ligado ao grupo amino épsilon dos resíduos de lisina nas posições B29 ou B28 do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina que podem ser representados por uma ciclobutil-1,3 diacila tendo a seguinte fórmula gerale em que as linhas onduladas indicam a ligação entre o ligador e o grupo amino épsilon da lisina nas posições B29 ou B28 dos polipeptídeos de insulina.
[00171] Em um outro aspecto da presente invenção, o primeiro e o segundo polipeptídeos de insulina podem ser conjugados juntos usando a Cicloadição de Huisgen de Azida-Alcino catalisada por cobre (CuAAc), em particular a química click de CuAAC. Neste aspecto, o grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 do primeiro polipeptídeo de insulina é conjugado a uma porção ligadora tendo uma extremidade proximal e uma extremidade distal em que a extremidade proximal da porção ligadora é conjugada ao grupo amino épsilon e a distal compreende um grupo azida. Neste aspecto, o grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 do segundo polipeptídeo de insulina é conjugado a uma porção ligadora tendo uma extremidade proximal e uma extremidade distal em que a extremidade proximal da porção ligadora é conjugada ao grupo amino épsilon e a distal compreende um grupo alcino. Na presença de Cu2+ e um agente de redução, a azida e os grupos alcino formarão uma porção de ligação contígua compreendendo uma porção de triazol. Ver a Patente U.S. No. 8.129.542, que é aqui incorporada na sua totalidade, para uma descrição da química click de CuAAC.
[00172] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o primeiro polipeptídeo de insulina pode ter conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula e o segundo polipeptídeo de insulina pode ter conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula
[00173] Na presença de Cu2+ e um agente redutor, os ligadores combinam para fornecer uma porção de ligação tendo a estrutura
[00174] Em aspectos particulares dos agonistas parciais de receptor de insulina, o primeiro polipeptídeo de insulina pode ter conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula em que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 e o segundo polipeptídeo de insulina pode ter conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula em que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Na presença de Cu2+ e um agente redutor, os ligadores combinam para fornecer uma porção de ligação tendo a estrutura em que cada n independentemente é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.
[00175] Em um outro aspecto, tanto o primeiro polipeptídeo de insulina quanto o segundo polipeptídeo de insulina podem ter conjugado ao seu respectivo grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula em que cada n é independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. A conjugação dos ligadores para formar uma porção de ligação pode ser obtida fornecendo-se uma molécula (intermediário ou ligador em ponte) tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG25.
[00176] Em um outro aspecto, tanto o primeiro polipeptídeo de insulina quanto o segundo polipeptídeo de insulina podem ter conjugado ao seu respectivo grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 um ligador tendo a fórmula em que cada n é independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. A conjugação dos ligadores para formar uma porção de ligação pode ser obtida fornecendo-se uma molécula (intermediário ou ligador em ponte) tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG 25.
[00177] Em aspectos particulares, o primeiro polímero de insulina é conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 por um ligador terminado em azida como acima e o segundo polipeptídeo de insulina é conjugado ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B28 por um ligador terminado com uma porção e os ligadores são conjugados para formar uma porção ligadora usando a química click da cicloadição isenta de cobre. Ver por exemplo, a Patente U.S. No. 7.807.619, que é aqui incorporada em sua totalidade.
[00178] A seguinte tabela mostra ligadores exemplares, que podem ser usados para construir os dímeros da presente invenção. Os dímeros mostrados compreendem grupos 2,5-dioxopirrolidin-1-ila para conjugar ao grupo amino épsilon da lisina B29 ou B29.
[00179] Conjugação de um ligador bifuncional ao grupo amino épsilon do resíduo de lisina nas posições B29 ou B28 do polipeptídeo de cadeia B de duas moléculas de insulina ou análogo de insulina para formar o dímero de insulina ligado por uma porção de ligação podem ser esquematicamente mostradas como em que as moléculas de insulina 1 e insulina 2 podem ser as mesmas ou diferentes e o ligador bifuncional e resultante e a porção de ligação seguinte à conjugação podem ter a estrutura de qualquer ligador e porção de ligação resultante aqui descrita.
Modificação de polipeptídeos de insulina
[00180] Em algumas modalidades, pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A ou polipeptídeos de cadeia B do agonista parcial de receptor de insulina é modificado para compreender um grupo acila. O grupo acila pode ser ligado covalentemente diretamente a um aminoácido do polipeptídeo de insulina, ou indiretamente a um aminoácido do polipeptídeo de insulina via um espaçador, em que o espaçador é posicionado entre o aminoácido do polipeptídeo de insulina e o grupo acila. O polipeptídeo de insulina pode ser acilado na mesma posição de aminoácido onde uma porção hidrofílica é ligada, ou em uma posição de aminoácido diferente. Por exemplo, a acilação pode ocorrer em qualquer posição incluindo qualquer aminoácido dos polipeptídeos de cadeia A ou B assim como uma posição dentro da porção de ligação, contanto que a atividade exibida pelo polipeptídeo de insulina não acilado seja retida na acilação. Os exemplos não limitantes incluem acilação na posição A1 da cadeia A e posição B1 da cadeia B.
[00181] Em um aspecto específico da invenção, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina (ou derivado ou conjugado dos mesmos) são modificados para compreender um grupo acila pela acilação direta de uma amina, hidroxila ou tiol de uma cadeia lateral de um aminoácido do polipeptídeo de insulina. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina são diretamente acilados através da cadeia lateral de amina, hidroxila ou tiol de um aminoácido. A este respeito, um polipeptídeo de insulina pode ser fornecido que tenha sido modificado por uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de polipeptídeo de cadeia A ou B, incluindo por exemplo nas posições A1, A14, A15, B1, B10, ou B22 ou em qualquer posição da porção de ligação com um aminoácido compreendendo uma amina de cadeia lateral, hidroxila ou tiol.
[00182] Em algumas modalidades, o espaçador entre o primeiro e/ou segundo polipeptídeo de insulina e o grupo acila é um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral de amina, hidroxila ou tiol (ou um dipeptídeo ou tripeptídeo compreendendo um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral de amina, hidroxila ou tiol). Em algumas modalidades, o espaçador compreende um espaçador bifuncional hidrofílico. Em uma modalidade específica, o espaçador compreende um poli(alquilóxi)carboxilato de amino. A este respeito, o espaçador pode compreender, por exemplo, NH2(CH2CH2O)N(CH2)mCOOH, em que m é qualquer número inteiro de 1 a 6 e n é qualquer número inteiro de 2 a 12, tal como, por exemplo, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, que é comercialmente disponível da Peptides International, Inc. (Louisville, KY). Em uma modalidade, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, uma amina, uma hidroxila, um tiol, e um grupo carboxila ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo tiol e um carboxilato.
[00183] Em algumas modalidades, o espaçador entre o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina e o grupo acila é um espaçador bifuncional hidrofóbico. Os espaçadores bifuncionais hidrofóbicos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), que é incorporada por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, uma amina, uma hidroxila, um tiol, e um grupo carboxila ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo tiol e um carboxilato. Os espaçadores bifuncionais hidrofóbicos adequados compreendendo um carboxilato e um grupo hidroxila ou um grupo tiol são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o ácido 8-hidroxioctanoico e ácido 8-mercaptooctanoico.
[00184] De acordo com certas modalidades o espaçador bifuncional pode ser um aminoácido sintético ou que ocorre naturalmente compreendendo uma cadeia principal de aminoácido que tenha de 3 a 10 átomos no comprimento (por exemplo, ácido 6-amino hexanoico, ácido 5- aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico, e ácido 8-aminooctanoico). Alternativamente, o espaçador pode ser um espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo tendo uma cadeia principal peptídica que tenha de 3 a 10 átomos (por exemplo, de 6 a 10 átomos) no comprimento. Cada aminoácido do espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo ligado ao polipeptídeo de insulina pode ser independentemente selecionado do grupo que consiste em: aminoácidos que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente, incluindo, por exemplo, qualquer um dos isômeros D ou L dos aminoácidos que ocorrem naturalmente (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), ou qualquer um dos isômeros D ou L dos aminoácidos que não ocorrem naturalmente selecionados do grupo consistindo de: β-alanina (β-Ala), N-α-metil-alanina (Me-Ala), ácido aminobutírico (Abu), ácido a-aminobutírico (y-Abu), ácido aminohexanoico (ε-Ahx), ácido aminoisobutírico (Aib), ácido aminometilpirrol carboxílico, ácido aminopiperidinocarboxílico, aminosserina (Ams), ácido aminotetraidropiran-4-carboxílico, arginina N-metoxi-N-metil amida, ácido β-aspártico (β-Asp), ácido azetidina carboxílico, 3-(2-benzotiazolil)alanina, α-terc-butilglicina, ácido 2-amino-5-ureido-n-valérico (citrulina, Cit), β- Ciclohexilalanina (Cha), acetamidometil-cisteína, ácido diaminobutanoico (Dab), ácido diaminopropiônico (Dpr), diidroxifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), Ácido y-glutâmico (y-Glu), homosserina (Hse), hidroxiprolina (Hyp), isoleucina N-metoxi-N-metil amida, metil-isoleucina (MeIle), ácido isonipecótico (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lisina, dimetil-lisina, trimetil-lisina, metano-prolina, metionina-sulfóxido (Met(O)), metionina-sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), ácido para-aminobenzoico (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-Clorofenilalanina (Phe(4- Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4- cianofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-desidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar), selenocisteína (Sec), U-Benzil-fosfosserina, ácido 4-amino-3-hidróxi-6- metilheptanoico (Sta), ácido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA), ácido 4-amino-3-hidróxi-5-fenilpentanoico (AHPPA), ácido 1,2,3,4-tetraidro-isoquinolina-3-carboxílico (Tic), tetraidropiranglicina, tienilalanina (Thi), U-Benzil-fosfotirosina, O-Fosfotirosina, metoxitirosina, etoxitirosina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirosina, tirosina sulfato tetrabutilamina, metil-valina (MeVal), ácido 1-amino-1-ciclohexano carboxílico (Acx), ácido aminovalérico, beta-ciclopropil-alanina (Cpa), propargilglicina (Prg), alilglicina (Alg), ácido 2-amino-2-ciclohexil- propanoico (2-Cha), terc-butilglicina (Tbg), vinilglicina (Vg), ácido 1-amino- 1-ciclopropano carboxílico (Acp), ácido 1-amino-1-ciclopentano carboxílico (Acpe), ácido 3-mercaptopropiônico alquilado, ácido 1-amino-1-ciclobutano carboxílico (Acb). Em algumas modalidades o espaçador de dipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro- Pro, ácido y-aminobutírico-ácido y-aminobutírico, e y-Glu-y-Glu.
[00185] O primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina podem ser modificados para compreender um grupo acila pela acilação de um alcano de cadeia longa. Em aspectos específicos, o alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila ou tiol (por exemplo octadecilamina, tetradecanol, e hexadecanotiol) que reage com um grupo carboxila, ou forma ativada do mesmo, do polipeptídeo de insulina. O grupo carboxila, ou forma ativada do mesmo, do polipeptídeo de insulina pode ser parte de uma cadeia lateral de um aminoácido (por exemplo, ácido glutâmico, ácido aspártico) do polipeptídeo de insulina ou pode ser parte da cadeia principal de peptídeo.
[00186] Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina são modificados para compreender um grupo acila pela acilação do alcano de cadeia longa por um espaçador que é ligado ao polipeptídeo de insulina. Em aspectos específicos, o alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila ou tiol que reage com um grupo carboxila, ou forma ativada do mesmo, do espaçador. Os espaçadores adequados compreendendo um grupo carboxila, ou forma ativada do mesmo, são aqui descritos e incluem, por exemplo, espaçadores bifuncionais, por exemplo, aminoácidos, dipeptídeos, tripeptídeos, espaçadores bifuncionais hidrofílicos e espaçadores bifuncionais hidrofóbicos. Como aqui usado, o termo “forma ativada de um grupo carboxila” se refere a um grupo carboxila com a fórmula geral R(C=O)X, em que X é um grupo de partida e R é o polipeptídeo de insulina ou o espaçador. Por exemplo, as formas ativadas de um grupo carboxila podem incluir, mas não são limitadas a, cloretos de acila, anidridos, e ésteres. Em algumas modalidades, o grupo carboxila ativado é um éster com um grupo de partida de N-hidroxissuccinimida (NHS).
[00187] Com respeito a estes aspectos da invenção, em que um alcano de cadeia longa é acilado pelo peptídeo, o polipeptídeo de insulina ou o espaçador, o alcano de cadeia longa pode ser de qualquer tamanho e pode compreender qualquer comprimento de cadeia carbônica. O alcano de cadeia longa pode ser linear ou ramificada. Em certos aspectos, o alcano de cadeia longa é um alcano de C4 a C30. Por exemplo, o alcano de cadeia longa pode ser qualquer de um alcano C4, alcano C6, alcano C8, alcano C10, alcano C12, alcano C14, alcano C16, alcano C18, alcano C20, alcano C22, alcano C24, alcano C26, alcano C28, ou um alcano C30. Em algumas modalidades, o alcano de cadeia longa compreende um alcano de C8 a C20, por exemplo, um alcano C14, alcano C16, ou um alcano C18.
[00188] Em algumas modalidades, um grupo amina, hidroxila ou tiol do primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina é acilado com um ácido de colesterol. Em uma modalidade específica, o peptídeo é ligado ao ácido de colesterol através de um espaçador de desamino Cys alquilado, isto é, um espaçador de ácido 3-mercaptopropiônico alquilado. Os métodos adequados de acilação de peptídeo via aminas, hidroxilas, e tióis são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377382 (1996); Shimohigashi e Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); e Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (para os métodos de acilação através de uma hidroxila); e San e Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para os métodos de acilação através de um tiol); Bioconjugate Chem. “Chemical Modifications of Proteins: History and Applications” páginas 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacetical Res. “Synthesis of Palmitoil Derivatives of Insulin and their Biological Activity” Vol. 6, No: 2 pp. 171-176 (1989).
[00189] O grupo acila do peptídeo acilado o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina podem ser de qualquer tamanho, por exemplo, cadeia carbônica de qualquer comprimento, e podem ser lineares ou ramificados. Em algumas modalidades específicas da invenção, o grupo acila é um ácido graxo de C4 a C30. Por exemplo, o grupo acila pode ser qualquer um de um ácido graxo C4, ácido graxo C6, ácido graxo C8, ácido graxo C10, ácido graxo C12, ácido graxo C14, ácido graxo C16, ácido graxo C18, ácido graxo C20, ácido graxo C22, ácido graxo C24, ácido graxo C26, ácido graxo C28, ou um ácido graxo C30. Em algumas modalidades, o grupo acila é um ácido graxo de C8 a C20, por exemplo, um ácido graxo C14 ou um ácido graxo C16. Em algumas modalidades, o grupo acila é uréia.
[00190] Em uma modalidade alternativa, o grupo acila é um ácido biliar. O ácido biliar pode ser qualquer ácido biliar adequado, incluindo, mas não limitado a, ácido cólico, ácido chenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico, e ácido de colesterol.
[00191] O primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina acilados aqui descritos podem ser modificados ainda para compreender uma porção hidrofílico. Em algumas modalidades específicas a porção hidrofílica pode compreender uma cadeia de polietileno glicol (PEG). A incorporação de uma porção hidrofílica pode ser realizada através de qualquer meio adequado, tal como qualquer um dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades o análogo de cadeia única acilado compreende um aminoácido selecionado do grupo que consiste em um Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ou Ac-Phe, e a cadeia lateral do aminoácido é liga covalentementeda a uma porção hidrofílica (por exemplo, PEG). Em uma modalidade, o grupo acila é ligado na posição A1, A14, A15, B1, B2, B10 ou B22 (de acordo com a numeração de aminoácido das cadeias A e B da insulina nativa), opcionalmente via um espaçador compreendendo Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ou Ac-Phe.
[00192] Alternativamente, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos de insulina acilados compreendem um espaçador, em que o espaçador é tanto acilado quanto modificado para compreender a porção hidrofílica. Os exemplos não limitantes de espaçadores adequados incluem um espaçador compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de Cys, Lys, Orn, homo-Cys e Ac-Phe.
[00193] Em algumas modalidades, o terminal amino de pelo menos um aminoácido do terminal N de pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia A e dos polipeptídeos de cadeia B do agonista parcial de receptor de insulina é modificado para compreender um substituinte. O substituinte pode ser ligado covalentemente diretamente ao grupo amino do aminoácido do terminal N ou indiretamente ao grupo amino via um espaçador, em que o espaçador é posicionado entre o grupo amino do aminoácido do terminal N do polipeptídeo de insulina e o substituinte. O substituinte pode ser uma porção acila como debatida supra. O substituinte pode ter a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1 ou grupo PEG2 (ver os Exemplos aqui quanto às estruturas dos substituintes). A carbamoilação da insulina foi descrita por Oimoni et al., Nephron 46: 63-66 (1987) e os dímeros de insulina compreendendo um grupo carbamoíla no terminal N foram descritos no Pedido PCT No. WO2014052451 (Por exemplo, MIU-90).
[00194] Em modalidades particulares, pelo menos um aminoácido de terminal Né conjugado por intermédio do nitrogênio N2 a um substituinte compreendendo um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1 ou grupo PEG2.
[00195] Em modalidades particulares, o sacarídeo ligado covalentemente a um ou mais terminais de amino do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina pode ser um monossacarídeo, ver por exemplo Dímero 51. Em algumas modalidades, o sacarídeo compreende um ou mais grupos amina. Em certas modalidades os grupos sacarídeo e amina são separados por um grupo alquila C1-C6, por exemplo, um grupo alquila C1-C3. Em algumas modalidades, o sacarídeo é aminoetilglicose (AEG). Em certas modalidades, um ligante de sacarídeo é da configuração “D”. Em outras modalidades, um ligante de sacarídeo é da configuração “L”. Abaixo nós mostramos as estruturas destes sacarídeos exemplares. Outros sacarídeos exemplares serão reconhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00196] No geral, os sacarídeos podem ser direta ou indiretamente conjugados via um ligador ao terminal amino de um ou mais do primeiro e do segundo polipeptídeos de insulina. Em aspectos particulares, o ligador é uma alquildioíla, -C(O)(CH2)nC(O)-, em que n = 0-45, 0-20, 0-10, ou 0-5.
[00197] Os substituintes exemplares conjugados ao grupo amino do terminal Npodem ser em que a linha ondulada indica a ligação entre o substituinte e o grupo amino do terminal N. O substituinte também pode ser em que a linha ondulada indica a ligação entre Me2 e o carbono alfa do aminoácido de terminal N.
Dímeros de insulina exemplares
[00198] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece dímeros de insulina em que uma primeira B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B e um segundo Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B são conjugados juntos por um ligador bifuncional selecionado do grupo que consiste em Ligador 1, Ligador 2, Ligador 3, Ligador 10, Ligador 11, Ligador 12, Ligador 13, Ligador 14, Ligador 15, Ligador 16, Ligador 17, Ligador 18, Ligador 19, Ligador 20, Ligador 21, Ligador 22, Ligador 23, Ligador 24, Ligador 25, Ligador 26, Ligador 27, Ligador 28, Ligador 29, Ligador 30, Ligador 31, Ligador 32, Ligador 33, Ligador 34, Ligador 35, Ligador 36, Ligador 37, Ligador 38, Ligador 39, Ligador 40, Ligador 41, Ligador 42, Ligador 43, Ligador 44, Ligador 45, Ligador 46, Ligador 47, Ligador 48, Ligador 49, e Ligador 50 com a condição de que quando o ligador bifuncional é Ligador 10, Ligador 11, Ligador 12, Ligador 13, ou Ligador 14, pelo menos um do primeiro ou segundo polipeptídeos de cadeia A ou cadeia B é conjugado no seu aminoácido do terminal N a um substituinte como aqui descrito ou pelo menos os aminoácidos do terminal N da primeira molécula de heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte como aqui descritos ou os aminoácidos de terminal N tanto do primeiro heterodímero de insulina quanto do segundo heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte. Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[00199] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece dímeros de insulina em que um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9 são conjugados juntos via o primeiro ligador e o segundo ligador. Em modalidades particulares, pelo menos um do primeiro ou segundo polipeptídeos de cadeia A ou cadeia B é conjugado no seu aminoácido do terminal N a um substituinte como aqui descrito ou pelo menos os aminoácidos do terminal N da primeira molécula de heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte como aqui descrito ou os aminoácidos do terminal N tanto do primeiro heterodímero de insulina quanto do segundo heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte. Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[00200] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece dímeros de insulina em que um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 5 e Ligador 7, em que o primeiro e segundo ligadores são conjugados juntos via um ligador em ponte tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG25. Em modalidades particulares, pelo menos um do primeiro ou segundo polipeptídeos de cadeia A ou cadeia B é conjugado no seu aminoácido do terminal N a um substituinte como aqui descrito ou pelo menos os aminoácidos do terminal N da primeira molécula de heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte como aqui descrito ou os aminoácidos do terminal N tanto do primeiro heterodímero de insulina quanto do segundo heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte. Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[00201] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece dímeros de insulina em que um primeiro B29 ou B28 Lys de uma primeira molécula de heterodímero de insulina tendo um primeiro polipeptídeo de cadeia A e primeiro polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um primeiro ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9 e um segundo B29 ou B28 Lys de um segundo heterodímero de insulina tendo um segundo polipeptídeo de cadeia A e segundo polipeptídeo de cadeia B é conjugado a um segundo ligador selecionado do grupo que consiste em Ligador 4, Ligador 6, Ligador 8, e Ligador 9, em que o primeiro e segundo ligadores são conjugados juntos via um ligador em ponte tendo uma estrutura em que R é uma ligação covalente, um átomo de carbono, uma fenila, um heteroátomo, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado do grupo que consiste em acila, alifático, heteroalifático, arila, heteroarila e heterocíclico. Em aspectos particulares R é um grupo acila C2, C3, C4, C6, C7, C8, C9 ou C10 ou um PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 ou PEG25. Em modalidades particulares, pelo menos um do primeiro ou segundo polipeptídeos de cadeia A ou cadeia B é conjugado no seu aminoácido do terminal N a um substituinte como aqui descritos ou pelo menos os aminoácidos do terminal N da primeira molécula de heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte como aqui descrito ou os aminoácidos do terminal N tanto do primeiro heterodímero de insulina quanto do segundo heterodímero de insulina são conjugados a um substituinte. Em modalidades particulares, o substituinte compreende um éster de N-hidroxissuccinimida ligado a um grupo tendo a fórmula geral RC(O)-, onde R pode ser R’CH2, R’NH, R’O, e R’ pode ser H, cadeia de alquila linear, aminoácido, peptídeo, polietileno glicol (PEG), sacarídeos, que em aspectos particulares RC(O)- pode ser acetila, fenilacetila, carbamoíla, N-alquil carbamoíla, ou alcoxicarbonila. Em aspectos particulares, o substituinte é um grupo carbamoíla, grupo acetila, glicina, grupo metila, grupo metoxi, grupo dimetila, grupo isobutila, grupo PEG1, grupo AEG, grupo AEG-alquila C6 ou grupo PEG2.
[00202] Em modalidades adicionais o primeiro e o segundo heterodímeros de insulina podem compreender qualquer uma das moléculas de insulina ou análogo de insulina aqui descritas.
[00203] A presente invenção também fornece dímeros de insulina selecionados de
[00204] Em que a ligação de dissulfetos entre os resíduos Cys6 e Cys11 do polipeptídeo de cadeia A e a ligação de dissulfetos entre o Cys7 e Cys20 da cadeia A ao Cys7 e Cys19 do polipeptídeo de cadeia B, respectivamente, são representados pela linha sólida entre eles; em que as porções de ligação são ligadas covalentemente ao aminoácido épsilon do resíduo de lisina mostrado, em que o polipeptídeo de cadeia A para os Dímeros 1-40, 42-52, 54-86, e 88-94 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; o polipeptídeo de cadeia A para o Dímero 56 tem a sequência de aminoácidos mostrada para a SEQ ID NO: 11; o polipeptídeo de cadeia B para os Dímeros 1-17, 21-27, 36, 37, 39-40, e 4252, 54-82, 84-86, e 88-94 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; o polipeptídeo de cadeia B para os Dímeros 18 e 32-35 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6; o polipeptídeo de cadeia B para os Dímeros 19 e 83 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9; o polipeptídeo de cadeia B para os Dímeros 20, 28-31, e 38 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; e o polipeptídeo de cadeia A e o polipeptídeo de cadeia B para os Dímeros 53 e 87 são a SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.
Composições farmacêuticas
[00205] De acordo com uma modalidade uma composição farmacêutica é fornecida compreendendo qualquer um dos novos dímeros de insulina aqui descritos, preferivelmente em um nível de pureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem conter um dímero de insulina como aqui descrito em uma concentração de pelo menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml ou mais alta. Em uma modalidade as composições farmacêuticas compreendem soluções aquosas que são esterilizadas e opcionalmente armazenadas contidas dentro de vários recipientes embalados. Em outras modalidades as composições farmacêuticas compreendem um pó liofilizado. As composições farmacêuticas podem ser embaladas ainda como parte de um kit que inclui um dispositivo descartável para administrar a composição a um paciente. Os recipientes ou kits podem ser rotulados para a armazenagem em temperatura ambiente ou em temperatura refrigerada.
[00206] Os dímeros de insulina descritos são acreditados serem adequados para qualquer uso que tenha sido anteriormente descrito para os peptídeos de insulina. Consequentemente, os dímeros de insulina aqui descritos podem ser usados para tratar a hiperglicemia, ou tratar outras doenças metabólicas que resultam de níveis de glicose sanguínea altos. Consequentemente, a presente invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo um dímero de insulina como aqui descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável para o uso no tratamento de um paciente que sofre de níveis de glicose sanguínea altos. De acordo com uma modalidade o paciente a ser tratado usando um dímero de insulina aqui descrito é um animal domesticado, e em uma outra modalidade o paciente a ser tratado é um ser humano.
[00207] Um método de tratar a hiperglicemia de acordo com a presente descrição compreende as etapas de administrar os dímeros de insulina presentemente descritos a um paciente usando qualquer via padrão de administração, incluindo parenteralmente, tal como intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscularmente, intratecal, transdérmica, retal, oral, nasalmente ou por inalação. Em uma modalidade a composição é administrada subcutânea ou intramuscularmente. Em uma modalidade, a composição é administrada parenteralmente e o polipeptídeo de insulina, ou derivado prodroga do mesmo, é pré-embalado em uma seringa.
[00208] Os dímeros de insulina aqui descritos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes antidiabéticos. Os agentes antidiabéticos conhecidos na técnica ou sob investigação incluem insulina nativa, glucagon nativo e análogos funcionais dos mesmos, sulfoniluréias, tais como tolbutamida (Orinase), acetohexamida (Dymelor), tolazamida (Tolinase), clorpropamida (Diabinese), glipizide (Glucotrol), gliburide (Diabeta, Micronase, Glynase), glimepiride (Amaril), ou gliclazida (Diamicron); meglitinides, tais como repaglinide (Prandin) ou nateglinide (Starlix); biguanidas tais como metformina (Glucophage) ou fenformina; tiazolidinodionas tais como rosiglitazona (Avandia), pioglitazona (Actos), ou troglitazona (Rezulin), ou outros inibidores de PPARy; inibidores da alfa glicosidase que inibem a digestão de carboidrato, tal como miglitol (Glyset), acarbose (Precose/Glucobay); exenatide (Byetta) ou pramlintide; inibidores da Dipeptidil peptidase-4 (DPP-4) tal como vildagliptin ou sitagliptin; inibidores de SGLT (transportador de glicose dependente de sódio 1); ou inibidores da FBPase (frutose 1,6-bisfosfatase).
[00209] As composições farmacêuticas compreendendo os dímeros de insulina aqui descritos podem ser formuladas e administradas aos pacientes usando carreadores farmaceuticamente aceitáveis padrão e as vias de administração conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Consequentemente, a presente descrição também abrange composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos dímeros de insulina aqui descritos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições farmacêuticas compreendendo os dímeros de insulina aqui descritos podem opcionalmente conter íons zinco, preservantes (por exemplo, fenol, cresol, parabenos), agentes de isotonização (por exemplo, manitol, sorbitol, lactose, dextrose, trealose, cloreto de sódio, glicerol), substâncias tampão, sais, ácidos e álcalis e também excipientes adicionais. Estas substâncias em cada caso podem estar presentes individualmente ou de modo alternativo como misturas. Glicerol, dextrose, lactose, sorbitol e manitol estão habitualmente presentes na preparação farmacêutica em uma concentração de 100 a 250 mM, NaCl em uma concentração de até 150 mM. Substâncias tampão, tais como, por exemplo, fosfato, acetato, citrato, arginina, glicilglicina ou tampão TRIS (isto é 2-amino-2-hidroximetil-1,3- propanodiol) e sais correspondentes, estão presentes em uma concentração de 5 a 250 mM, habitualmente de cerca de 10 a 100 mM. Outros excipientes podem ser, inter alia, sais ou arginina.
[00210] Em uma modalidade a composição farmacêutica compreende uma concentração de 1 mg/ml do dímero de insulina em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0 em um sistema de tampão de fosfato. As composições farmacêuticas podem compreender o dímero de insulina como o único componente farmaceuticamente ativo, ou o dímero de insulina pode ser combinado com um ou mais agentes ativos adicionais.
[00211] Todos os métodos terapêuticos, composições farmacêuticas, kits e outras modalidades similares aqui descritas consideram que os dímeros de insulina incluem todos os sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis.
[00212] Em uma modalidade o kit é fornecido com um dispositivo para administrar a composição de dímeros de insulina a um paciente. O kit pode incluir ainda uma variedade de recipientes, por exemplo, frascos, tubos, garrafas, e os semelhantes. Preferivelmente, os kits também incluirão instruções para o uso. De acordo com uma modalidade o dispositivo do kit é um dispositivo de dispensa aerossol, em que a composição é pré-embalada dentro do dispositivo aerossol. Em uma outra modalidade o kit compreende uma seringa e uma agulha, e em uma modalidade a composição de dímero de insulina é pré-embalada dentro da seringa.
[00213] Os compostos desta invenção podem ser preparados pelos métodos sintéticos padrão, técnicas de DNA recombinante, ou quaisquer outros métodos de preparar peptídeos e proteínas de fusão. Embora certos aminoácidos não naturais não possam ser expressos pelas técnicas de DNA recombinante padrão, técnicas para a sua preparação são conhecidas na técnica. Os compostos desta invenção que abrangem porções não peptídicas podem ser sintetizados pelas reações da química orgânica padrão, além das reações da química de peptídeo padrão quando aplicáveis.
[00214] Os seguintes exemplos são intencionados a promover um entendimento adicional da presente invenção. EXEMPLOS Procedimentos Gerais
[00215] Todos os produtos químicos foram adquiridos de fontes comerciais, a menos que de outro modo mencionado. As reações foram usualmente realizadas na temperatura ambiente ou na temperatura da sala a menos que de outro modo mencionado. As reações sensíveis à umidade ou ar foram realizadas sob nitrogênio ou argônio usando solventes e reagentes anidros. O progresso das reações foi monitorado pela cromatografia de camada fina analítica (TLC), e cromatografia líquida de ultra desempenho - espectrometria de massa (UPLC-MS). A TLC foi realizada nas placas de TLC da E. Merck pré-revestidas com gel de sílica 60F-254, espessura de camada 0,25 mm. As placas foram visualizadas usando UV a 254 nm e/ou pela exposição ao amônio molibdato de cério (CAM) ou soluções de tingimento de p-anisaldeído seguido por carbonização. A cromatografia líquida de ultra desempenho (UPLC) foi realizada em um sistema Waters Acquity®UPLC®.
[00216] Método A UPLC-MS: Coluna Waters Acquity®UPLC® BEH C18 1,7 μm 1,0x50 mm com gradiente 10:90-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 2,0 min; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda de UV de 215 nm; UPLC-MS; Método B: Coluna Waters Acquity®UPLC® BEH C18 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 60:40-100:0 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 4,0 min e 100:0-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 40 segundos; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda de UV 200-300 nm; UPLC-MS; Método C: Coluna Waters Acquity®UPLC® BEH C18 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 20:80-90:10 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 4,0 min e 90:10-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 0,5 min; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda de UV 200-300 nm; UPLC-MS; Método D: Coluna Waters Acquity® UPLC® BEH C8 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 10:90-55:45 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 4,0 min e 55:45-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 40 segundos; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda UV 200-300 nm; UPLC-MS; Método E: Coluna Waters Acquity®UPLC® BEH300 C4 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 10:90-50:50 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 4,3 min e 50:50-70:30 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 0,5 min; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda UV 200-300 nm; UPLC-MS; Método F: Coluna Waters Acquity® UPLC® BEH C8 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 20:80-72,5:27,5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 4,3 min e 72,5:27,5-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,05% de TFA em 0,5 min; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda UV 200-300 nm, e UPLC-MS; Método G: Coluna Waters Acquity® UPLC® BEH C8 1,7 μm 2,1x100 mm com gradiente 20:80-90:10 v/v de CH3CN/H2O + v 0,1% de TFA em 4,0 min e 90:10-95:5 v/v de CH3CN/H2O + v 0,1% de TFA em 0,4 min; taxa de fluxo 0,3 ml/min, comprimento de onda UV 200-300 nm.
[00217] A análise de massa foi realizada em um Detector Waters SQ com ionização por eletropulverização no modo de detecção de íon positivo e a faixa de varredura da razão de massa para carga foi de 170-900 ou um Waters Micromass® LCT Premier®XE com ionização por eletropulverização no modo de detecção de íon positivo e a faixa de varredura da razão de massa para carga foi de 300-2000. A identificação dos conjugados de insulina produzidos ou IRPA foi confirmada comparando-se o peso molecular teórico com o valor experimental que foi medido usando UPLC-MS. Para a determinação das posições de ligação, especificamente, dímeros de insulina foram submetidos ao tratamento de DTT (para a cadeia a/b) ou digestão com Glu-C (com ou sem redução e alquilação), e depois os peptídeos resultantes foram analisados pela LC-MS. Com base nas massas medidas, as posições de ligação foram deduzidas.
[00218] A cromatografia cintilante foi realizada usando um aparelho de Cromatografia Cintilante Biotage (Dyax Corp.) ou um instrumento CombiFlash®Rf (Teledyne Isco). A cromatografia de fase normal foi realizada em gel de sílica (20-70 μm, tamanho de poro 60 Â) em cartuchos pré-empacotados do tamanho mencionado. A cromatografia de troca de íon foi realizada em um material com base em sílica com uma revestimento ligado de uma poli(2-sulfoetil aspartamida hidrofílica, aniônica) (Coluna PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, tamanho de poro de 1000 Â). A cromatografia de fase reversa foi realizada em gel de sílica unido C18 (20 a 60 μm, tamanho de poro de 60 a 100 Â) em cartuchos pré- empacotados do tamanho mencionado. A HPLC de escala preparativa foi realizada no sistema binário Gilson 333-334 usando a coluna Waters DELTA PAK C4 15 μm, 300 Â, 50x250 mm ou coluna KROMASIL® C8 10 μm, 100 Â, 50x250 mm, taxa de fluxo de 85 ml/min, com o gradiente mencionado. A concentração das soluções foi realizada em um evaporador rotativo sob pressão reduzida ou secada por congelamento em um Secador por Congelamento VirTis Freezemobile (SP Scientific).
[00219] Abreviações: acetonitrila (AcCN), aquoso (aq), N,N- diisopropiletilamina ou base de Hünig (DIPEA), N,N-dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetila (DMSO), acetato de etila (EtOAc), cloridreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida (EDC), grama(s) (g), 1- hidroxibenzotriazol hidratado (HOBt), hora(s) (h ou hr), espectro de massa (ms ou MS), micrograma(s) (μg), microlitro(s) (μL), micromol (μmol), miligrama(s) (mg), mililitro(s) (ml), milimol (mmol), minuto(s) (min), tempo de retenção (Rt), temperatura ambiente (rt), saturado (sat. ou sat’d), solução saturada aq de cloreto de sódio (salmoura), trietilamina (TEA), ácido trifluoroacético (TFA), e tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-tetrametil-O-(N- succinimidil)urônio (TSTU).
[00220] O termo “RHI” se refere à insulina humana recombinante e é usada para indicar que a insulina tem a sequência de aminoácidos característica da insulina humana nativa, do tipo selvagem. Como aqui usado nas tabelas, o termo indica que a sequência de aminoácidos da insulina compreendendo o dímero é aquela da insulina humana nativa, do tipo selvagem.
EXEMPLO 1
[00221] A síntese de 6-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-6- oxohexil)amino)-6- oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (Ligador 1; C6+NC6) é descrita.
Etapa 1 6-((6-(benzilóxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexanoato de benzila
[00222] A uma mistura de éster monobenzílico do ácido adípico (600 mg, 2,54 mmol) e 4-metilbenzenossulfonato de 6-(benzilóxi)-6-oxohexan-1- amínio (1,0 g, 2,54 mmol) em DMF (12,71 ml) foram adicionados HOBt (584 mg, 3,81 mmol), base de Hunig (888 μl, 5,08 mmol) e EDC (731 mg, 3,81 mmol). Depois de agitar durante a noite, a mistura de reação foi particionada entre NaHCO3 sat. e EtOAc. A fase orgânica foi separada, lavada com HCl 1,0 M e salmoura, secada em Na2SO4 e concentrada para dar o composto do título como um semissólido e usada na etapa seguinte sem outra purificação. Método A de UPLC-MS: Rt = 1,26 min, m/z = 440,3 [M + 1]
Etapa 2 Ácido 6-((5-Carboxipentil)amino)-6-oxohexanoico
[00223] Uma suspensão do produto da etapa 1 (1,08 g, 2,457 mmol) e Catalisador de Pearlman (20 % em peso em carbono, 173 mg, 0,246 mmol) em MeOH (50 ml) foi agitada sob 50 psi (345 kPa) de H2 durante a noite. O catalisador foi separado por filtração e o filtrado foi submetido à cromatografia de fase reversa na fase C8 (KROMASIL, C8 10 μm 100 Â, 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA), razão de fluxo = 85 ml/min, gradiente B A 5 a 30 % em 30 min. Método A de UPLC-MS: Rt = 0,40 min, m/z = 260,15 [M + 1].
Etapa 3 6-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-6-oxohexil)amino)-6- oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila
[00224] A uma solução do produto da etapa 2 (50 mg, 0,193 mmol) em DMF (964 μl) foi adicionado TSTU (116 mg, 0,386 mmol). Depois esfriado até 0 °C, à mistura foi adicionada trietilamina (53,8 μl, 0,386 mmol). Depois de agitar por 45 minutos, a formação do composto desejado foi observada: Método A de UPLC-MS: Rt = 0,71 min, m/z = 453,4 [M + 1]. O 6-((6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-6-oxohexil)amino)-6-oxo- hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila resultante foi usado como solução 0,2 M em DMF sem purificação.
EXEMPLO 2
[00225] A síntese de 6,6’-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de bis(2,5-dioxo- pirrolidin-1-il) (Ligador 2; C6N+C6+NC6) é descrita.
Etapa 1 6,6’-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de dibenzila
[00226] A uma solução de 4-metilbenzenossulfonato de 6-(benzilóxi) -6-oxohexan-1-amínio (2,693 g, 6,84 mmol) e ácido adípico (500 mg, 3,42 mmol) em DMF (17,1 ml) foram adicionados Base de Hunig (1,793 ml, 10,26 mmol), HOBt (1,572 g, 10,26 mmol) e EDC (1,968 g, 10,26 mmol). Depois de agitar durante a noite, a mistura de reação foi vertida em água (500 ml) e agitada por 30 minutos. O composto do título foi coletado através de filtração como um sólido e secado pela sucção de ar. Método A de UPLC- MS: Rt = 1,23 min, m/z = 553,5 [M + 1].
Etapa 2 6,6’-(adipoilbis(azanodiil))dihexanoato de Bis(2,5-dioxopirrolidin- 1-ila)
[00227] O composto do título foi preparado usando o procedimento análogo a aquele descrito para o EXEMPLO 1 substituindo 6,6’-(adipoilbis- (azanodiil))dihexanoato de dibenzila no lugar de 6-((6-(benzilóxi)-6-oxo- hexil)amino)-6-oxohexanoato benzila na Etapa 2. Método A de UPLC-MS: Rt = 0,74 min, m/z = 567,4 [M + 1].
EXEMPLO 3
[00228] A síntese do ácido (2S,2’S)-2,2’- (octanodioilbis(azanodiil))bis(5-((2,5-dioxo- pirrolidin-1-il)óxi)-5- oxopentanoico) (Ligador 3; gama-Glu-subérico-gama-Glu) é descrita.
Etapa 1 Ácido (S)-5-(benzilóxi)-4-(8-(((S)-1-(benzilóxi)-4-carbóxi-1- oxobutan-2-il)amino)-8-oxooctanamido)-5-oxopentanoico
[00229] A uma solução de H-GLU-OBZL (1,00 g, 4,21 mmol) em DMF (10,5 ml) foi adicionada trietilamina (5,875 ml, 42,1 mmol) seguida por suberato de dissuccinimidila (776 mg, 2,107 mmol). Depois de agitar por 1 hora, a mistura de reação foi concentrada e o resíduo resultante foi purificado em coluna C18 (ISCO 44 g), fluxo = 37 ml/min; gradiente AcCN em água com 0,05% de TFA: 2% a 20% em 20 min seguido por contenção. Depois da liofilização, o ácido bis-carboxílico intermediário foi obtido. Método B de UPLC-MS: Rt = 2,66 min, m/z = 613,3 [M + 1].
Etapa 2 Éster de Bis-N-hidroxissuccinimida do ácido (S)-5-(benzilóxi)-4-(8- (((S)-1-(benzilóxi)-4-carbóxi-1-oxobutan-2-il)amino)-8-oxooctanamido) -5- oxopentanoico
[00230] A uma suspensão do produto da etapa 1 (455 mg, 0,743 mmol) em acetonitrila (7,4 ml) foi adicionado TSTU (492 mg, 1,634 mmol) como um sólido seguido por trietilamina (228 μl, 1,634 mmol), ponto no qual a suspensão dissolveu. A mistura de reação foi agitada por 1,5 hora e concentrada no rotovap na temperatura ambiente. O produto foi purificado pela cromatografia de fase reversa na fase C-8 (Coluna KROMASIL, C8 10 μm 100A, tamanho 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA), Fluxo = 85 ml/min, gradiente B em A 10 a 80 % em 30 min. Depois da liofilização das frações, o éster bis-NHS foi obtido. Método B de UPLC-MS: Rt = 2,77 min, m/z = 807 [M + 1].
Etapa 3. Ácido (2S,2’S)-2,2’-(octanodioilbis(azanodiil))bis(5-((2,5-dioxo- pirrolidin-1-il)óxi)-5-oxopentanoico)
[00231] O produto da etapa 2 (250 mg, 0,310 mmol) foi hidrogenado usando paládio em carbono (66,0 mg, 0,031 mmol) como o catalisador e acetona contendo 0,1% de TFA como o solvente (6,2 ml) em 1 atm de Hidrogênio, durante a noite. O catalisador foi separado por filtração e o filtrado foi concentrado para dar o composto do título. Bombeado em alto vácuo durante a noite. Método C de UPLC-MS: Rt = 3,61 min, m/z = 627,3 [M + 1].
EXEMPLO 4 Método Geral A: Síntese de Conjugado de Insulina N6,B29(Análogos)
[00232] Em um recipiente de tamanho apropriado, insulina ou análogo de insulina foram dissolvidos, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto: 2:3 v/v Na2CO3 0,1 M:AcCN. Depois que a mistura clarificou, o pH foi ajustado para o valor de 10,5 a 10,8 usando solução alcalina, por exemplo, NaOH 0,1 N. Em um frasco separado, um intermediário do éster ativado (porção de ligação) foi dissolvido em um solvente orgânico, por exemplo, DMSO, na temperatura ambiente. As alíquotas da solução do éster ativado (Ligador) foi adicionadas em um período de tempo à solução contendo insulina até que o cromatograma de UPLC mostrasse que a maior parte da insulina não modificada reagiu e que uma porção substancial da mistura de reação foi convertida em insulina conjugada a B29. A reação foi extinta pela adição de nucleófilo de amina, por exemplo, 2-aminoetanol. A solução de reação foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A solução resultante foi cuidadosamente diluída com H2O fria (20 x) a 0 °C e o seu pH foi ajustado a um pH final de 2,5 usando HCl 1 N (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução foi primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com membrana MWCO de 1K, 3K ou 10K. A solução concentrada foi usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/ NaCl 0,5 M). As frações contendo conjugado B29 com pureza desejada foram combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra- 15 da Amicon. A solução resultante foi depois purificada ainda pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna de 1000 Â ou coluna KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, 100Â; Tampão A: 0,05 a 0,1% de TFA em água; Tampão B: 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo o conjugado do título foram combinadas e secadas por congelamento ou trocado no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar o produto do título.
EXEMPLO 5
[00233] A síntese de N6,29B-5-azido-pentanoila insulina desB30 (A:Y19A) (Análogo 1) é descrita.
[00234] Em frasco de cintilação de 20 ml, insulina desB30 A:Y19A (112 mg, 0,020 mmol) foi dissolvida, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto e (2 ml, 2:3 v/v Na2CO3 0,1 M:AcCN). Depois que a mistura clarificou, o pH foi ajustado para o valor de 10,5 a 10,8 usando solução alcalina, por exemplo, NaOH 0,1 N. Em um frasco de cintilação de 8 ml agitado, 5-azidopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (Ligador 5; ver EXEMPLO 6) (4,79 mg, 0,020 mmol) foi dissolvido em DMSO (500 μl) na temperatura ambiente. As alíquotas da solução do éster ativado foram adicionadas em um período de tempo à solução contendo insulina até que o cromatograma de UPLC mostrasse que a maior parte da insulina não modificada reagiu e que uma porção substancial da mistura de reação foi convertida em insulina conjugada a B29. A reação foi extinta pela adição de nucleófilo de amina, por exemplo, 2-aminoetanol. A solução de reação foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A solução resultante foi cuidadosamente diluída com H2O fria (20 x) a 0 °C e o seu pH foi ajustado a um pH final de 2,5 usando N HCl 1,0 (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução foi primeiro concentrada pela ultrafiltração usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon com membrana MWCO de 3K ou 10K. A solução concentrada foi submetida à HPLC de fase reversa (coluna KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, 100Â, 25 a 35% de Tampão B no Tampão A em 20 min; Tampão A: 0,05% de TFA em água; Tampão B: 0,05% de TFA em AcCN). As frações contendo Análogo 1 foram combinadas e depois secadas por congelamento. Método D de UPLC-MS: Rt = 3,91 min, m/z = 1435,86 [(M + 4)/4].
EXEMPLO 6
[00235] O Análogo 2, Análogo 3 e Análogo 4 de RHI N6,29B-acilado foram preparados para o uso na construção de dímeros usando a química "click" e foram preparados usando Método Geral A ou o procedimento análogo a aquele descrito para o EXEMPLO 4 mas substituindo a insulina humana recombinante e pent-4-inoato de (2,5-dioxopirrolidin-1-ila; Ligador 4); (2,5-dioxopirrolidin-1-il-azidopentanoato; Ligador 5); ou (1-(biciclo[6,1,0]non-4-in-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16-penta- oxa-4-azanonadecan-19-oato de perfluorofenila) (Ligador 6) para fabricar Análogo 2, Análogo 3, ou Análogo 4, respectivamente. Os análogos foram distinguidos usando Método D de UPLC-MS exceto para o Análogo 5, que foi distinguido usando Método F de UPLC-MS.
EXEMPLO 7 Síntese de N2,1A,N2,1B-bis(carbamoil) Insulina humana (Análogo 5) é descrita.
[00236] A uma suspensão de RHI (1 g, 0,172 mmol) em água (50 ml) foi adicionada uma solução de fosfato de potássio, dibásico (0,249 g, 1,429 mmol) em água (5,0 ml). Depois de agitar na temperatura ambiente por 30 minutos, à mistura resultante foi adicionado cianato de potássio (0,279 g, 3,44 mmol). A mistura de reação foi deixada agitar por 16 horas. Para interromper a reação, cianato de potássio não reagido foi removido por TFF usando dispositivo diafiltração de MWCO 3K e o produto foi isolado como um sólido pela liofilização. O produto contendo cerca de 10 a 35% de A1/B1/B29-tris-uréia-RHI, que opcionalmente seria removido pela cromatografia de fase reversa na fase C8 (Coluna KROMASIL, C8 10 μm 100Â, 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA), razão de fluxo = 85 ml/min, gradiente B em A 26 a 34% em 30 min). Método D de UPLC-MS: Rt = 4,29 min, m/z = 1474,6 (z = 4). O substituinte do terminal N tem a estruturaem que a linha ondulada indica que a ligação entre o substituinte e o nitrogênio N2 do aminoácido do terminal N.
EXEMPLO 8
[00237] A síntese de N2,1A,N2,1B-bis(carbamoíla) desB30 Insulina humana (Análogo 6) é descrita.
[00238] O composto do título foi preparado usando o procedimento análogo a aquele descrito para o EXEMPLO 7 substituindo insulina desB30 pela RHI. Método D de UPLC-MS: Rt = 4,10 min, m/z = 1448,9 (z = 4). O substituinte do terminal N tem a estrutura em que a linha ondulada indica que a ligação entre o substituinte e o nitrogênio N2 do aminoácido do terminal N.
EXEMPLO 9
[00239] A síntese de N2,1A,N2,1B-bis(carbamoíla) Insulina lispro (Análogo 7) é descrita.
[00240] O composto do título foi preparado usando o procedimento análogo a aquele descrito para o EXEMPLO 7 substituindo insulina lispro pela RHI. Método D de UPLC-MS: Rt = 4,07 min, m/z = 1473,6 (z = 4). O substituinte do terminal N tem a estrutura em que a linha ondulada indica que a ligação entre o substituinte e o nitrogênio N2 do aminoácido do terminal N.
EXEMPLO 10
[00241] A síntese de N2,1A-acetila Insulina humana (Análogo 8) é descrita.
[00242] A uma solução de RHI (400 mg, 0,069 mmol) em DMSO (4,6 ml) foi adicionada às gotas uma solução de acetato 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (10,82 mg, 0,069 mmol) em 100 μl de DMSO. Depois de agitar por 3 horas, a mistura de reação foi diluída com água (95 ml), acidificada até o pH de cerca de 3 e depois diafiltrada através de Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon com membrana MWCO de 3 ou 10K para remover a maior parte de DMSO. A solução resultante foi primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â, razão de fluxo 15 ml/min; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M) usando gradiente 10 a 40 % do Tampão B no Tampão A em 24 minutos. As frações contendo o N2,1A-acetil-RHI desejado foi combinado e concentrado e depois submetido à cromatografia de fase reversa em (KROMASIL, C8 10 μm 100 Â, 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA, gradiente 26 a 30 % de B em A). A posição de modificação foi confirmada usando Análise de DTT. Método D de UPLC-MS: Rt = 3,5 min e m/z = 1463,5 (z = 4). O substituinte do terminal N tem a estrutura em que a linha ondulada indica que a ligação entre o subsliluinle e o nilrogênio N2 do aminoácido do lerminal N.
EXEMPLO 11
[00243] A sínlese de N2,1A,N2,1B-bis(carbamoíla) N6,29B-RHI acilada é descrila.
[00244] O Análogo 5 conjugado a 2,5-dioxopirrolidin-1-il-azido- penlanoalo (Ligador 5) para conslruir o Análogo 9 ou penl-4-inoalo de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (Ligador 4) para conslruir o Análogo 10 foram preparados usando o Mélodo Geral A ou o procedimenlo análogo a aquele descrilo para o EXEMPLO 4.
EXEMPLO 12
[00245] Os seguinles análogos de N6,29B-RHI acilada (Análogo 11, Análogo 12 e Análogo 13) foram preparados para o uso na construção de dímeros usando a química "click". Os análogos foram preparados usando o Método Geral A ou o procedimento análogo a aquele descrito para o EXEMPLO 4 mas substituindo a insulina humana recombinante (RHI) e a porção de ligação apropriada selecionado de , para fabricar o Análogo 11, Análogo 12, ou Análogo 13, respectivamente. Os análogos foram distinguidos usando o Método D de UPLC-MS exceto para o Análogo 12, que foi distinguido usando o Método F de UPLC-MS. Tabela 2 Análogo Porção de ligação Rt (min) (M + 4)/4 11 0 \l^0^N3 3,26 1488,11 12 0 3,97 1479,30 13 0 3,27 1502,26 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys da molécula de insulina.
EXEMPLO 13 Método Geral B: Síntese de Dímeros de N6,29B,N6,29B’-Insulina Usando Condição de Base Orgânica
[00246] Em um recipiente de tamanho apropriado, insulina ou análogo de insulina são colocados em suspensão na temperatura ambiente em um solvente orgânico ou solventes mistos aquosos (aq)/orgânicos, por exemplo, DMSO, na presença de um base, por exemplo, TEA. A mistura é deixada agitar suavemente até que a insulina seja completamente dissolvida. À solução resultante é adicionado um intermediário do éster ativado (ligador) em solução de solventes orgânicos, tais como DMSO ou DMF. Depois cromatógrafo de UPLC mostra que uma porção substancial da mistura de reação foi convertida no dímero de N6,29B,N6,B29B’-insulina (ou dímero de N6,28B,N6,28B’-insulina lispro). A mistura de reação pode ser submetida diretamente à purificação pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: 0,05 a 0,1% de TFA em água desionizada; Tampão B: 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN), ou a reação pode ser extinta pela diluição cuidadosa com H2O ácida fria (20 x, pH cerca de 3,0) a 0 °C e o seu pH é ajustado a um pH final de 2,5 usando HCl 1 N (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução pode ser primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com membrana MWCO de 1K, 3K ou 10K. A solução concentrada é usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo conjugado B29 com pureza desejada são combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra-15 da Amicon. A solução concentrada é depois submetida à purificação pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: 0,05 a 0,1% de TFA em água desionizada; Tampão B: 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo o dímero de insulina desejado são combinadas e secadas por congelamento ou trocadas no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar os dímeros de N6,29B,N6,29B’- insulina.
EXEMPLO 14 Método Geral C: Síntese de Dímeros de N6,29B,N6,29B’-Insulina Usando Condições de Base Aquosa.
[00247] Em um recipiente de tamanho apropriado, insulina ou análogo de insulina são dissolvidos, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto: 2:3 v/v Na2CO3 0,1 M:AcCN. Depois que a mistura clarificou, o pH é ajustado para o valor de 10,5 a 10,8 usando solução alcalina, por exemplo, NaOH 0,1 N. Em um frasco separado, um intermediário do éster ativado (ligador) é dissolvido em um solvente orgânico, por exemplo, DMSO, na temperatura ambiente. As alíquotas da solução do éster ativado são adicionadas em um período de tempo à solução contendo insulina até que o cromatograma de UPLC mostrasse que a maior parte da insulina não modificada reagiu e que uma porção substancial da mistura de reação foi convertida no dímero de N6,B29,N6,B29’-insulina (ou dímero de N6,28B,N6,28B-insulina lispro). A reação é extinta pela adição de nucleófilo de amina, por exemplo, 2-aminoetanol. A solução de reação é agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A solução resultante é cuidadosamente diluída com H2O fria (20 x) a 0 °C e o seu pH é ajustado a um pH final de 2,5 usando HCl 1 N (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução é primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com membrana MWCO de 1K, 3K ou 10K. A solução concentrada é usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo conjugado B29 com pureza desejada são combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra-15 da Amicon. A solução resultante é depois purificada ainda pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: 0,05 a 0,1% de TFA em água; Tampão B: 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo dímero de insulina do título são combinadas e secadas por congelamento ou trocadas no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar o dímero de N6,29B,N6,29B’-insulina.
EXEMPLO 15
[00248] Este exemplo ilustra a síntese de N6,B29, N6,B29’-(2,2’-(etano- 1,2-diilbis(óxi))diacetil)bis[insulina humana] (Dímero 1) (L-005232962).
[00249] A RHI foi dissolvida (2,6 g, 0,448 mmol) em uma mistura de Na2CO3 (0,1 M) (15,8 ml) e AcCN (10,5 ml) e adicionado 0,895 ml (0,179 mmol) de solução 0,2 M em DMF de 2,2’-(etano-1,2-diilbis(óxi))diacetato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (Ligador 8). A mistura de reação foi agitada por 30 min e a porção adicional adicionada de 0,895 ml (0,179 mmol) de solução 0,2 M em DMF de 2,2’-(etano-1,2-diilbis(óxi))diacetato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila) e a mistura de reação foi agitada por mais 30 min. A mistura de reação vertida em 60 ml de 20 % de AcCN/0,1% de TFA/água, o pH ajustado para 2,5 e diafiltrada usando Ultra-15 da Amicon com membrana MWCO de 10K para concentrar até que o volume resultante fosse de cerca de 10 ml. A solução resultante foi submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â, gradiente 10 a 80 % do Tampão B no Tampão A em 30 min; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo o composto do título foram combinadas e concentradas. A solução resultante foi depois submetida à cromatografia de fase reversa (KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100 Â; gradiente 27 a 35% de AcCN com 0,05% de TFA em água com 0,05% de TFA). Método E de UPLC-MS: Rt = 2,75 min, m/z = 1960,4 (z = 6), 1680,4(z = 7). Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; terminal N da insulina Rt (min ) (M + 6)/6 ou (M + 7)/7 1 0 RHI; A1,A1’, B1,B1’ = H 2,75 1960,4 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 16
[00250] Este exemplo ilustra a síntese de N2,1A,N2,1A’,N2,1B,N2,1B’- Tetracis(carbamoíla)-N6,B29, N6,B29’-(hexanodioíla)bis[insulina humana] (Dímero 2) (L-005405963).
[00251] N2,1A,N2,1B-bis(carbamoíla) RHI foi dissolvida (150 mg, 0,025 mmol) em DMSO (1 ml) e trietilamina adicionada (0,106 ml, 0,764 mmol) seguida pela adição às gotas de adipato de di(N-succinimidila) (Ligador 12) (4,33 mg, 0,013 mmol) dissolvido em 100 μl de DMSO. Agitado 1 hora e a mistura de reação vertida em 20 ml de água. Acidificado até o pH = 2 e diafiltrada usando Ultra 15 10K da Amicon. O produto foi purificado pela cromatografia de troca iônica usando gradiente de 10 a 40 % de Solvente B em Solvente A em 24 minutos e repurificado pela cromatografia de fase reversa na fase C-8 gradiente B em A de 26 a 36% em 30 minutos. Método E de UPLC-MS: Rt = 3,75 min, m/z = 1983,9, (z = 6). Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; terminal N da insulina Rt (min) (M + 6)/6 ou (M + 7)/7 2 0 O RHI; A1,A1’, B1,B1’ = carbamoíla 3,75 1983,9 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLOS 17
[00252] A Tabela 3 mostra dímeros que foram preparados usando intermediários apropriados (ligadores) seguindo o Método Geral B ou o Método Geral C como mencionado usando a RHI, DesB30 RHI, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargine, ou o análogo apropriado. Por exemplo, para dímeros com terminais N carbamoilados, Análogo 5 ou Análogo 6 (DesB30) foram usados; para dímeros com para dímeros terminais N A1 acetilados, Análogo 8 foi usado. Os dímeros foram distinguidos usando Método D de UPLC-MS ou Método E de UPLC-MS exibindo espécies com carga seis, isto é, [(M + 6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M + 7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt). As moléculas de insulina e insulina’ ligadas juntas pela porção de ligação são as mesmas para cada um dos dímeros mostrados na Tabela 3.
EXEMPLO 18 Método Geral D: Síntese de dímero de N6,29B,N6,29B’-insulina usando química click catalisada por Cu2+-.
[00253] Em um recipiente de tamanho apropriado, intermediário de insulina contendo acetileno apropriado (Análogo) foi dissolvido, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto de DMSO e tampão de acetato de trietilamônio aq. (pH 7,0, concentração final de 0,2 mM). Em um outro recipiente de tamanho apropriado, o intermediário da insulina contendo azido apropriado (Análogo) foi dissolvido, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto de DMSO e água. Ambas as soluções foram combinadas, completamente desgaseificadas borbulhando-se suavemente N2 através. À solução resultante foi adicionada solução recém preparada de ascorbato de sódio ou solução de ácido ascórbico (concentração final é de 0,5 mM) e, depois completamente misturadas, uma solução de 10 mM de CuSO4 e tris[(1-benzil-1H-1,2,3- triazol-4- il)metil]amina (isto é, ligante de TBA) em 55% de DMSO. Depois de desgaseificada borbulhando-se suavemente N2 através e misturada completamente, a mistura foi armazenada na temperatura ambiente, com mistura ocasional, durante a noite. A mistura de reação foi cuidadosamente diluída com um solvente misto (v/v 7:3 AcCN/água com 0,05% de TFA) a 0 °C e o pH foi ajustado até 2,50 usando 0,1, HCl N 1,0 (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução foi primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com 1K, 3K, ou membrana MWCO de 10K. A solução concentrada foi usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo produto desejado com pureza desejada foram combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra-15 da Amicon. A solução resultante foi depois purificada ainda pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: de 0,05 a 0,1% de TFA em água; Tampão B: de 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo o produto desejado com pureza desejada foram combinadas e secadas por congelamento ou trocadas no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar o dímeros de insulina.
[00254] A Tabela 4 lista os Dímeros 40, 41, 45, 46, 47, 59, 57, 79, 80, 82 e 84, que foram preparados usando os intermediários apropriados seguidos pelo Método Geral D. Estes dímeros foram distinguidos usando Método D de UPLC-MS ou Método E de UPLC-MS ou Método G de UPLC- MS exibindo espécies com carga seis, isto é, [(M + 6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M + 7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt).
EXEMPLO 19 Método Geral E: Síntese de dímero de N6,29B,N6,29B’-insulina usando química click duplamente catalisada por Cu2+-.
[00255] Em um recipiente de tamanho apropriado, o intermediário da insulina contendo azido apropriado (Análogo) foi dissolvido, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto de DMSO e tampão de acetato de trietilamônio aq. (pH 7,0, concentração final de 0,2 mM). Em um outro recipiente de tamanho apropriado, bis-acetileno apropriado contendo ligação em ponte ou ligador intermediário foi dissolvido, com agitação suave, na temperatura ambiente em um solvente misto de DMSO e água. Ambas as soluções foram combinadas, completamente desgaseificadas borbulhando-se suavemente N2 através. À solução resultante foi adicionada solução recém preparada de ascorbato de sódio ou solução de ácido ascórbico (concentração final é 0,5 mM) e, depois completamente misturadas, uma solução de 10 mM de CuSO4 e tris[(1-benzil-1H-1,2,3- triazol-4- il)metil]amina (isto é, ligante de TBA) em 55% de DMSO. Depois desgaseificada borbulhando-se suavemente N2 através e misturada completamente, a mistura foi armazenada na temperatura ambiente, com mistura ocasional, durante a noite. A mistura de reação foi cuidadosamente diluída com um solvente misto (v/v 7:3 AcCN/água com 0,05% de TFA) a 0 °C e pH foi ajustado até 2,50 usando 0,1, HCl N 1,0 (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução foi primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com 1K, 3K, ou membrana MWCO de 10K. A solução concentrada foi usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250 x 21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1%(v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo produto desejado com pureza desejada foram combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra-15 da Amicon. A solução resultante foi depois purificada ainda pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: de 0,05 a 0,1% de TFA em água; Tampão B: de 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo o produto desejado com pureza desejada foram combinadas e secadas por congelamento ou trocado no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar o dímeros de insulina.
[00256] A Tabela 5 lista os Dímeros 42 a 44 e 54 que foram preparados usando os intermediários apropriados seguindo o Método Geral E. ligador em ponte de bis-acetileno ou os ligadores intermediários foram
[00257] Estes dímeros foram distinguidos usando Método D de UPLC-MS ou Método E de UPLC-MS exibem espécies com carga seis, isto é, [(M + 6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M + 7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt).
EXEMPLO 20
[00258] Este exemplo ilustra a síntese de N2,1A,N2,1A’,N2,1B,N2,1B’-Tetracis(acetila ou PEG1 ou metoxi acetila)- Dímeros (Dímeros 48, 55, 56, 69 e 70) (L-005472485).
[00259] A uma solução de Dímero 40, 19, ou 4 (21 mg, 1,777 μmol) em DMSO (2 ml) na temperatura ambiente foi adicionado TEA (3,96 μl, 0,028 mmol) e depois um solução de acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (2,23 mg, 0,014 mmol) em DMSO (100 μl) ou outro éster ativado de N- hidroxissuccinimida apropriado (metoxi acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila ou PEG1 acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila) em DMSO (100 μl). Depois de 3 horas, a mistura de reação foi diluída com 12 ml de mistura de água/AcCN =7/3 com 0,1% de TFA e o pH foi ajustado até 2,5. A solução clara resultante foi concentrada pelos Filtros Centrífugos Ultra 15 da Amicon com membrana MWCO de 10K. A solução resultante foi primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (PoliSULFOETILA A, 250 x2 1 mm, 5 μm, 1000 Â, 15 ml/min, gradiente de 5% a 45% em 30 min; Tampão A: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de Acetonitrila em água; Tampão B: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de Acetonitrila/ NaCl 0,5 M em água). As frações contendo produto desejado com pureza desejada foram combinadas e concentradas usando Ultra-15 da Amicon com membrana MWCO de 10K. A solução resultante foi depois submetida à HPLC de fase reversa (coluna KROMASIL C8 250 x 50 mm, 10 μm, 100 Â; Tampão A: 0,05% de TFA em AcCN/H2O; Tampão B: 0,05% de AcCN; razão de fluxo 85 ml/min). As frações desejadas foram combinadas e secadas por congelamento para dar os Dímeros 48, 55, 56, 69, ou 70 como mostrado na Tabela 6. Método F de UPLC-MS ou G foi usado.
[00260] Os substituintes do terminal N têm a estrutura em que a linha ondulada indica que a ligação entre o substituinte e o nitrogênio N2 do aminoácido do terminal N. Tabela 6 Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N da Insulina Rt (min) (M + 6)/6 ou (M + 7)/7 48 (L- 005232 960) N'N o π e 0 RHI; A1,B1,A1’,B’ = acetila 4,71 1998,93 55 (L- 005341 356) O O RHI; A1,B1,A1’,B’ = acetila 3,61 1987,97 Tabela 6 56 (L- 005341 356) O O RHI; A1,B1,A1’,B’ = PEG1 3,53 1729,22 69 (L- 005389 001) O o RHI; A1,B1,A1’,B’ = acetila 3,55 1727,31 70 (L- 005389 001) o J RHI; A1,B1,A1’,B’ = metoxi acetila 3,67 1744,71 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 21
[00261] A Tabela 7 mostra os Dímeros 49, 50 e 51 e mostra os 2 1 2 1 2 1 2,B1 grupos acila ligados aos grupos amino de N ,A ,N ,B ,N ,A e N . Estes dímeros foram preparados a partir do Dímero 40 usando os procedimentos análogos a aqueles descritos para fabricar o Dímero 48 mas substituindo o éster ativado de N-hidroxissuccinimida apropriado no lugar d acetato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila PEG2 acetato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila e AEG-C6 acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila em que AEG é aminoetilglicose
[00262] Estes dímeros foram distinguidos usando o Método F de UPLC-MS (Dímeros 50 e 51) ou Método G de UPLC-MS (Dímero 49) exibindo com carga seis, isto é, espécies [(M+6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M+7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt). Os dímeros são mostrados na Tabela 7.
[00263] Os substituintes do terminal N têm a estrutura Tabela 7 Dímer o No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N de Insulina Rt (min) (M+6)/6 ou (M+7)/7 49 (L- 00547 4380) N^N 0 n o RHI; A1,A1’, B1,B1’ = glicina 3,62 1722,06 50 (L- 00547 4425) N=N 0 n o RHI; A1,A1’, B1,B1’ = PEG2 4,85 1764,16 51 (L- 00547 8713) z-z / " \ Z /° RHI; A1,A1’, B1,B1’ = AEM-C6 4,06 1880,19 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 22
[00264] Este exemplo ilustra a síntese de Dímero 52 usando a química click isenta de cobre (L-005350254).
[00265] A uma solução de Análogo 3 (10 mg, 1,686 μmol) em 1,0 ml de 3:2 v/v H2O/AcCN na temperatura ambiente foi adicionada uma solução de Análogo 4 (10,5 mg, 1,686 μmol) em 1,0 ml de 3:2 v/v H2O/ACCN. Depois de agitar na temperatura ambiente durante 2 horas, a mistura de reação foi primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (PoliSULFOETILA A, 250x21 mm, 5 μm, 1000 Â, 15 ml/min, gradiente de 5% a 45% em 30 min; Tampão A: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de Acetonitrila em água; Tampão B: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de Acetonitrila/ NaCl 0,5 M em água). As frações contendo produto desejado com pureza desejada foram combinadas e concentradas usando Ultra-15 da Amicon com membrana MWCO de 3K ou 10K. A solução resultante foi depois submetida à HPLC de fase reversa (coluna KROMASIL C8 250x50 mm, 10 μm, 100 Â; Tampão A: 0,05% de TFA em AcCN/H2O; Tampão B: 0,05% de AcCN; razão de fluxo 85 ml/min). As frações desejadas foram combinadas e secadas por congelamento para dar o Dímero 52. O Método F de UPLC-MS: Rt = 3,73 min, m/z = 1738,59 [(M+7)/7 +1]. Os resultados são mostrados na Tabela 8.
EXEMPLO 23
[00266] Este exemplo ilustra N2,1A,N2,1A’,N2,1B,N2,1B’-Tetracis(dimetila ou isobutila)-Dímeros (Dímeros 60, 58, 65 e 67) (L-005472485).
[00267] O Dímero 40, 19, ou 4 (100 mg, 8,46 μmol) foi dissolvido (suspensão) em água (10 ml) e ajustado para pH = 4,0 pela solução de ácido acético, depois formaldeído (0,013 ml, 0,169 mmol) ou isobutiraldeído (0,025 ml, 0,272 mmol) foram adicionados, seguidos pela adição de uma solução recém preparada de cianoboroidreto de sódio (10,63 mg, 0,169 mmol) em água (500 μl). O precipitado foi formado. A mistura é suavemente agitada. Depois da conclusão da reação cerca de 1 hora, a mistura é cuidadosamente acidificada pela adição às gotas de HCl 1N ao pH 2,9. A suspensão tornou-se clara. A mistura foi purificada pela HPLC prep de fase reversa (coluna C-8, 50X250 cm, 85 ml/min, gradiente de 29% a 36% em 25 min).(Água com 0,1% de TFA e MeCN com 0,05% de TFA). As frações desejadas foram liofilizadas para dar os dímeros (19,9 mg, 1,506 μmol, 17,80 % de rendimento). Método D de UPLC-MS: Rt = 3,31 min, m/z = 1989,44 [(M+6)/6 +1].
[00268] Os substituintes do terminal N têm a estrutura (isobutila) em que a linha ondulada indica que a ligação entre o substituinte e o nitrogênio N2 do aminoácido do terminal N, ou I (N-dimetila; Me2) em que a linha ondulada indica que a ligação entre o nitrogênio N2 e o carbono C2 do aminoácido do terminal N.
[00269] Os dímeros são mostrados na Tabela 9. Tabela 9 Dímer o No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N da Insulina Rt (min ) (M+6)/6 ou (M+7)/7 Tabela 9 60 N=\ 0 n 0 RHI; A1,B1,A1’ ,B’ = Me2 3,31 1989,44 58 0 0 RHI; A1,B1,A1’ ,B’ = Me2 3,42 1978,48 65 0 0 RHI; A1,B1,A1’ ,B’ = isobutila 4,13 1997,04 67 < \ ° °? d ç 2 RHI; A1,B1,A1’ ,B’ = Me2 3,42 1719,39 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 24
[00270] A síntese dos Dímeros 61, 62, 63, 64 e 66 foi como segue.
[00271] A síntese de 6-((2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-2- oxoetil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (C6-glicina ligador; Ligador 24) é descrito.
Etapa 1 Adipato de Benzil(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00272] A uma solução de ácido 6-(benzilóxi)-6-oxohexanoico (5g, 21,16 mmol) em DMF (10 ml) a 0 °C foi adicionado N-etil-N- isopropilpropan-2-amina (4,44 ml, 25,4 mmol) seguida por TSTU (7,01g, 23,28 mmol). A reação foi agitada a 0 °C por 1 hora e temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi vertida em mistura de água gelada/éter etílico (1/1, 100 ml). A mistura foi extraída com éter etílico (3 x 50 ml), lavada com água (2x 10 ml) e salmoura (10 ml). A camada orgânica foi secada em MgSO4, filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para dar o composto do título como xarope incolor (5,2 g, 15,6 mmol, 74%). LC-MS 2min: Rt = 1,05 min, m/z = 334,1 [M + 1].
Etapa Ácido 2-((Carboximetil)amino)-6-oxohexanoico
[00273] A uma solução de glicina (225 mg, 3,0 mmol) em DMF (2,5 ml) foi adicionado o produto da etapa 1 (1,0 g, 3,0 mmol) em DMF (2,5 ml) às gotas seguido por TEA (418 μl, 3,0 mmol). A reação foi agitada na temperatura ambiente por 18 horas. DMF foi removido sob pressão reduzida. O bruto foi purificado pela cromatografia de fase reversa C18 (eluído com 040 % de AcCN/água em 16 volumes de coluna (CV)). As frações contendo o produto desejado foram combinadas, concentradas e liofilizadas para dar o intermediário (6-(benzilóxi)-6-oxohexanoil) glicina. Ao intermediário acima em água (3 ml), foi adicionado Pd/C (10 %, 160 mg, 0,15 mmol). A reação foi agitada na temperatura ambiente sob balão de hidrogênio por 18 horas. A mistura foi filtrada através de uma almofada de celite, lavada com MeOH/água (1/1, 10 ml). O filtrado foi concentrado e liofilizado para dar o composto do título (400 mg, 2,2 mmol, 66%). LC-MS 2 min: Rt = 0,28 min, m/z = 204,03 [M + 1].
Etapa 3. 6-((2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-2-oxoetil)amino)-6- oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila
[00274] Ao produto da etapa 2 (10 mg, 0,049 mmol) em DMF (0,5 ml) a 0 °C foi adicionado TEA (0,015 ml, 0,108 mmol) seguido por TSTU (31,1 mg, 0,103 mmol). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada nesta temperatura por 1 hora. A TLC (EtOAc/MeOH/Água/AcCN: 2:1:1:1 (v:v:v:v)) mostrou formação do produto desejado (Rf: 0,25) e nenhum material de partida deixado. O material bruto foi usado para construir dímeros sem purificação.
[00275] O Ligador 25 (C6-alanina), Ligador 26 (C6-isoleucina), Ligador 27 (C6-leucina) e Ligador 28 (C6-valina) em que o aminoácido compreendendo o ligador C6-aminoácido é alanina, isoleucina, leucina e valina, respectivamente, foram sintetizados similar ao processo mostrado acima. Os dímeros foram construídos usando os ligadores acima usando o Método de Prep. D. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
EXEMPLO 25
[00276] A síntese dos Dímeros 73, 89, 90, 91, 92 e 93 foi como segue.
[00277] A síntese de 3,3’-(1,3-fenileno)dipropionato de bis 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (dipropil fenila; Ligador 29) é descrita.
Etapa 1. 3,3’-(1,3-fenileno)dipropionato de bis 2,5-dioxopirrolidin-1-ila
[00278] A uma solução do ácido 3,3’-(1,3-fenileno)dipropionoico (21,8 mg, 0,098 mmol) em DMF (0,6 ml) a 0°C foi adicionado TEA (29 ml, 0,206 mmol) seguida por TSTU (62,0 mg, 0,206 mmol). A reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada nesta temperatura por 1 hora. A TLC (EtOAc/MeOH/Água/AcCN: 2/1/1/1) mostrou a formação do produto desejado (Rf: 0,25) e nenhum material de partida deixado. Método B de UPLC-MS: Rt = 3,47 min, m/z = 417,19 [M + 1]. O produto foi usado sem outra purificação para construir o Dímero 73 usando o Análogo 5 usando o Método D.
[00279] A síntese de benzeno-1,3-dicarboxilato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila) (tereftalato; Ligador 34) é descrita.
Etapa 1. Benzene-1,3-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00280] A 0°C, a uma solução de ácido tereftálico (100 mg, 0,602 mmol) em THF (2 ml) foi adicionado tetrafluoroborato de 2-(2,5- dioxopirrolidin-1-il)-1,1,3,3-tetrametilisourônio (371 mg, 1,234 mmol) seguido por N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (0,222 ml, 1,234 mmol)). Depois de 30 minutos, o banho gelado foi removido. A solução foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Um adicional de 25 ml THF de foi adicionado e a reação foi deixada durante a noite na temperatura ambiente. O produto foi concentrado para cerca de 5 ml e uma porção foi usada como tal sem outra purificação para construir o Dímero 89 usando RHI usando o Método D. O material remanescente foi diluído com acetato de etila (200 ml) e lavado com salmoura (10 ml), a camada orgânica foi secada com Na2SO4, filtrada e concentrada.
[00281] A síntese de isoftalato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (isoftalato; Ligador 35) é descrita.
Etapa 1. Isoftalato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ila)
[00282] Ao ácido isoftálico (54 mg, 0,325 mmol) em DMSO (1 ml) foi adicionado TSTU (215 mg, 0,715 mmol) seguida por TEA (0,137 ml, 0,975 mmol). LC-MS 2 min: Rt = 0,79 min, m/z = 721,28 [2M + 1]. O produto foi usado sem purificação para construir o Dímero 90 usando o Análogo 5 e Dímero 91 usando RHI no Método E.
[00283] A Síntese de 4-((terc-butoxicarbonil)amino) heptanodioato de bis (2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (heptanodioato; Ligador 36) é descrita.
Etapa 1. 4-((terc-butoxicarbonil)amino) heptanodioato de bis (2,5- dioxopirrolidin-1-ila)
[00284] Ao ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)heptanodioico (16,5 mg, 0,06 mmol) em DMSO (0,5 ml) foi adicionado TSTU (39,7 mg, 0,132 mmol) seguido por TEA (0,025 ml, 0,180 mmol). LC-MS 2 min: Rt = 0,90 min, m/z = 470,34 [M + 1]. O produto foi usado sem purificação para construir o Dímero 92 usando o Análogo 5 e o Dímero 93 usando RHI no Método E.
[00285] Os resultados são mostrados na Tabela 11. Tabela 11 Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N de Insulina Rt (min) (M+6)/6 ou (M+7)/7 737373 O^^^ Jv O RHI; A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,55 1711,57 89 0 /vθ^/ 0 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,43 1678,64 90 0 0 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,67 1703,20 91 0 0 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,52 1678,69 92 NH2 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,56 1704,64 93 NH2 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,33 1680,18 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 26
[00286] A síntese dos Dímeros 71, 72, 77, 78, 81 e 87 foi como segue. A síntese de (1S,4S)-ciclohexano-1,4-dicarboxilato de bis(2,5- dioxopirrolidin-1-ila) (Ligador 30; trans-ciclohexano 1,4-diácido) é descrita.
[00287] A uma solução do ácido (1S,4S)-ciclohexano-1,4-dicarboxílico (200 mg, 1,162 mmol) em DCM (11 ml) a 0 °C foi adicionado TSTU (734 mg, 2,439 mmol) e DIPEA (0,5 ml, 2,86 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. O produto foi triturado na solução de reação como sólido branco; filtrado e lavado com DCM (2 x 5 ml); e secado a vácuo para se obter o composto do título. UPLC- MS calculada para C16H18N2O8, 366,11, m\e observada: 367,16 (M+H)+, (Rt: 3,20 / 5,00 minutos). Método A de UPLC-MS. 1H RMN (500 MHz, DMSO): δ 2,81-2,89 (m; 2 H); 2,80 (s; 8 H); 2,02-2,10 (m; 4 H); 1,57-1,63 (m; 4 H).
[00288] A síntese de (1R,4R)-ciclohexano-1,4-dicarboxilato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (Ligador 31; cis-ciclohexano 1,4-diácido) é descrita.
[00289] A uma solução do ácido (1R,4R)-ciclohexano-1,4- dicarboxílico (200 mg, 1,162 mmol) em DCM (11 ml) a 0 °C foi adicionado TSTU (734 mg, 2,439 mmol) e DIPEA (0,5 ml, 2,86 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. O resíduo foi purificado pela cromatografia em gel de sílica (0 a 100 % EtOAc/Hexanos) para fornecer o composto do título. UPLC-MS calculada para C16H18N2O8, 366,11, m/z observada: 367,17 (M+H)+, (Rt: 3,17 / 5,00 minutos). Método A de UPLC-MS. 1H RMN (500 MHz, DMSO): δ 3,023,08 (m; 2 H); 2,80 (s; 8 H); 1,80-1,90 (m; 8 H).
[00290] A síntese de (3R,5S)-piperidino-1,3,5-tricarboxilato de 1- (terc-butil) 3,5-bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (Ligador 32) é descrita.
[00291] A uma solução do ácido (3R,5S)-1-(terc- butoxicarbonil)piperidino-3,5-dicarboxílico (200 mg, 0,734 mmol) em DMF (7 ml) a 0 °C foi adicionado TSTU ( 485 mg, 1,611 mmol) e DIPEA (0,3 ml, 1,718 mmol). A mistura de reação resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. O resíduo foi purificado pela cromatografia em sílica (0 a 100 % de EtOAc/Hexanos) para fornecer o composto do título. UPLC- MS calculada para C20H25N3O10, 467,15, m\e observada: 468,30(M+H)+, (Rt:0,98 / 2,00 minutos).
Método A de UPLC-MS. Método Geral F: Síntese de dímero de N6,29B,N6,29B’-insulina Usando Condição de Base Orgânica
[00292] Em um recipiente de tamanho apropriado, insulina ou análogo de insulina são colocados em suspensão na temperatura ambiente em um solvente orgânico ou solventes aq/orgânicos mistos, por exemplo, DMSO, na presença de uma base, por exemplo, TEA, ou 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG). A mistura é deixada agitar suavemente até que a insulina seja completamente dissolvida. À solução resultante é adicionado um intermediário do éster ativado em solução de solventes orgânicos, tais como DMSO ou DMF. Depois da UPLC, o cromatograma mostra que uma porção substancial da mistura de reação foi convertida no dímero N6,29B,N6,B29B’-insulina (ou dímero de N6,28B,N6,28B’-insulina lispro), a solução de reação foi transferida, via autopipeta, para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo IPAc/MTBE (v/v 4:1) (45 ml). A adição foi feita às gotas. A suspensão branca resultante foi centrifugada (3000 rpm, 15 minutos, a 4C) para gerar um sobrenadante claro e um grânulo branco. O sobrenadante foi drenado e o grânulo branco foi secado a vácuo. O grânulo branco contendo o intermediário bruto foi depois dissolvido em 2 ml de TFA a 0 C e agitados por 10 minutos na mesma temperatura. Na conclusão da reação de des-boc, a solução de reação foi transferida, via autopipeta, para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo MTBE (45 ml). A adição foi feita às gotas. A suspensão branca resultante foi centrifugada (3000 rpm, 15 minutos, a 4°C) para gerar um sobrenadante claro e um grânulo branco. O sobrenadante foi drenado e o grânulo branco foi secado a vácuo. e redissolvido em solução de CH3CN/H2O (v/v 1:4). A mistura de reação pode ser submetida diretamente à purificação pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250x50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250x50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: 0,05-0,1% de TFA em água desionizada; Tampão B: de 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN), ou a reação pode ser extinta pela diluição cuidadosa com H2O ácida fria (20x, pH ~ 3,0) a 0 °C e o seu pH é ajustado a um pH final de 2,5 usando HCl 1 N (e NaOH 0,1 N se necessário). A solução pode ser primeiro concentrada pela ultrafiltração, através de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) ou usando Unidades Centrífugas Ultra-15 da Amicon, com membrana MWCO de 1K, 3K ou 10K. A solução concentrada é usualmente primeiro submetida à cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de AcCN; Tampão B: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). As frações contendo o conjugado B29 com a pureza desejada são combinadas e concentradas usando o sistema TFF ou Ultra-15 da Amicon. A solução concentrada é depois submetida à purificação pela HPLC de fase reversa (coluna Waters C4 250x50 mm, 10 μm, coluna 1000 Â ou KROMASIL C8 250x50 mm, 10 μm, coluna 100Â; Tampão A: 0,05-0,1% de TFA em água desionizada; Tampão B: de 0,05 a 0,1% de TFA em AcCN). As frações contendo o dímero de insulina desejado são combinadas e secadas por congelamento ou trocadas no tampão usando o sistema TFF e/ou Ultra-15 da Amicon para dar o dímero de N6,29B,N6,29B’-insulina.
[00293] A Tabela 12 lista os Dímeros 71, 72, 77, 78, 81 e 87, que foram preparados usando o ligador apropriado seguindo o Método Geral B (Dímeros 77 e 78), Método Geral C (Dímeros 71 e 72) ou Método Geral F (Dímeros 81 e 87). Estes dímeros foram distinguidos usando o Método D de UPLC-MS ou Método E de UPLC-MS exibindo com espécies de carga seis, isto é, [(M+6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M+7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt). Tabela 12 Dímer o No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N da Insulina Rt (min) (M+6)/6 ou (M+7)/7 71 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,05 1959,33 1679,86 72 <3 / \ P RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,07 1959,33 1679,86 81 0 H 0 ■"V RHI; A1,B1,A1’, B1’ = H 3,37 1959,48 1679,74 77 RHI; A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,50 1988,07 1704,29 78 C) / \ P RHI; A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,52 1988,08 1704,35 86 o ^l\T H 0 RHI: A1,B1,A1’, B1’ = Carbamoíla 3,48 1988,18 1704,24 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 26
[00294] A síntese do Dímero 68 e Dímero 74 foi como segue.
[00295] A síntese de 6,6’-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4-diil)bis- (azanodiil))dihexanoato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) (Ligador 33; C6N- cloro-1,3,5-Triazina-NC6) é descrita.
[00296] A solução de 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (80 mg, 0,434 mmol) e 6-aminohexanoato de metila (129 mg, 0,889 mmol) sal de HCl em CH2CI2 (1 ml) foi resfriado a -30°C. Uma solução de DIPEA (0,379 ml, 2,169 mmol) em CH2Cl2 (1 ml) foi adicionada às gotas. A mistura foi agitada a -30°C-temperatura ambiente por 5 horas. Depois CH2CI2 adicionado (20 ml) e lavado com HCl aquoso (1 M) (2 X 10 ml), NaHCO3 aquoso (10 ml) e salmoura (10 ml). A camada orgânica secada em sulfato de sódio e filtrada, concentrada a vácuo para fornecer 6,6’-((6-cloro-1,3,5-triazino-2,4- diil)bis(azanodiil))dihexanoato de dimetila (135 mg, 0,336 mmol).
[00297] À solução de 6,6’-((6-cloro-1,3,5-triazino-2,4-diil)bis- (azanodiil))dihexanoato de dimetila (135 mg, 0,336 mmol) em THF (0,5 ml) e metanol (0,5 ml) foi adicionado LiOH aquoso (2M) (504 μl, 1,008 mmol). A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora e depois concentrada a vácuo para produzir um resíduo seco. O resíduo dissolvido em água e neutralizado com HCl aq. O precipitado coletado pela filtração e o mesmo lavado com água. O sólido secado a vácuo para fornecer o ácido 6,6’- ((6-cloro-1,3,5-triazino-2,4-diil)bis(azanodiil))dihexanoico.
[00298] A uma solução do ácido 6,6’-((6-cloro-1,3,5-triazino-2,4- diil)bis(azanodiil))dihexanoico (108 mg, 0,289 mmol) em DMF (2889 μl) foi adicionado TSTU (174 mg, 0,578 mmol) seguido por trietilamina (81 μl, 0,578 mmol). A reação agitada 1 hora. A UPLC indica a formação do material desejado Método C de UPLC-MS: Rt = 0,99 min, m/z = 568,2 [M + 1]. Este reagente (0,1 M/DMF) foi usado sem outra purificação.
[00299] Os dímeros foram preparados usando o Método Geral B (Dímero 74) ou Método Geral C (Dímero 68). Estes dímeros foram distinguidos usando o Método D de UPLC-MS ou Método E de UPLC-MS exibindo com espécies de carga seis, isto é, [(M+6)/6], (ou com carga sete, isto é, [(M+7)/7]) de composto precursor em certo tempo de retenção (Rt). O Dímero 68 foi construído usando o Ligador 33 e RHI. O Dímero 74 foi construído usando o Ligador 33 e Análogo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 13. Tabela 13 Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N de Insulina Rt (min) (M+6)/6 ou (M+7)/7 68 Cl A1,B1,A1’,B1’ = H 3,48 1993,09 74 Cl N^N N N N A1,B1,A1’,B1’ = Carbamoíla 3,56 1733,20 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 27
[00300] A síntese do Dímero 54 foi como segue.
[00301] A1-TFA-RHI foi dissolvida (D. Liu et al., Journal of Peptide Sci., 2012, 18, 336-341) (100 mg, 0,017 mmol) em uma pré-mistura contendo água (5 ml) e fosfato de potássio dibásico (24,49 mg, 0,141 mmol) (o pH da solução resultante é de cerca de 4). Cianato de potássio adicionado (27,5 mg, 0,339 mmol) e agitado durante a noite. O produto foi purificado pela cromatografia de fase reversa na fase C-8 (Coluna KROMASIL, C8 10 μM 100A, tamanho 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA), Fluxo = 85 ml/min, gradiente B em A 26 a 34% em 30 min. Método F de UPLC-MS: Rt = 4,48 min, m/z = 1486,9 [(M + 4)/4 +1].
[00302] O produto acima foi dissolvido (60 mg, 10,09 μmol) em DMSO (594 μl) e trietilamina adicionada (28,1 μl, 0,202 mmol) seguida por solução de ligador de suberato de dissuccinimidila (1,858 mg, 5,04 μmol) dissolvido em 100 μl de DMSO. Agitados por 3 horas. A UPLC indica reação completa. A mistura de reação inteira foi adicionada em hidróxido de amônio (2105 μl, 15,13 mmol) (às gotas exoterma esperada). Agitada suavemente por 2 horas e confirmada a desproteção do grupo TFA. A mistura foi diluída em 20 ml de água e removida a maior parte do hidróxido de amônio pela diafiltração usando tubos 10K Amicon. O pH ajustado para cerca de 3 e os sais removidos pela diafiltração. O produto foi purificado pela cromatografia de troca iônica (coluna de PoliSULFOETILA A, PoliLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000 Â; Tampão A: 0,1% (v/v) de H3PO|/25% de AcCN; Tampão B: 0,1% (v/v) de H3PO4/25% de AcCN/NaCl 0,5 M). O produto foi repurificado pela cromatografia de fase reversa na fase C-8 (Coluna KROMASIL, C8 10 μM 100A, tamanho 250 x 50 mm; solvente A = água/0,05% de TFA, solvente B = AcCN/0,05% de TFA). O resultado é mostrado abaixo. Os resultados são mostrados na Tabela 14. Tabela 14 Dímero No. Estrutura de Dímero mostrando a Porção de ligação entre os resíduos de lisina B29 e B29’ Tipo de Insulina; Terminais N de Insulina Rt (min) (M+6)/6 ou (M+7)/7 54 O O RHI; A1,A1’=H, B1,B1’ = Carbamoíla 4,57 1974,45 A linha ondulada indica a ligação entre o grupo amino épsilon do B29 Lys e B29’ Lys, respectivamente.
EXEMPLO 28
[00303] Os Ensaios de Ligação do Receptor de Insulina foram realizados como segue.
[00304] O ensaio de ligação de IR foi conduzido em um ensaio de proximidade de cintilação (SPA) no formato de 384 reservatórios usando membranas celulares preparadas a partir de células CHO superexpressando IR(B) humano cultivado em meio F12 contendo 10 % de FBS e antibióticos (G418, Penicilina/Estrepavidina). As membranas celulares foram preparados em 50 mM de tampão Tris, pH 7,8 contendo 5 mM de MgCl2. O tampão de ensaio conteve 50 mM de tampão Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2, 0,1% de BSA e inibidores de protease (Completo- Mini-Roche). As membranas celulares foram adicionadas aos grânulos WGA PVT PEI SPA (5 mg/ml concentração final) seguido pela adição de moléculas de dímero de insulina nas concentrações apropriadas. Depois de 5 a 15 min de incubação na temperatura ambiente, 125[I]-insulina foi adicionada a 0,015 nM concentração final para um volume total final de 50 μl. A mistura foi incubada com agitação na temperatura ambiente por 1 a 12 horas seguida pela contagem de cintilação para determinar a ligação da 125[I]-insulina ao IR e os efeitos da titulação de moléculas de dímero de insulina nesta interação.
EXEMPLO 29
[00305] Os Ensaios de Fosforilação de AKT do Receptor de Insulina (IR) foram realizados como segue.
[00306] Ensaio de Fosforilação de AKT do IR: a ativação do receptor de insulina pode ser avaliada medindo-se a fosforilação da proteína Akt, uma etapa chave na cascata de sinalização do receptor de insulina. As linhagens de célula CHO superexpressando o IR humano foram utilizadas no kit de ensaio ELISA intercalado com HTRF (Cisbio “Kits de Ensaio Celular Phospho-AKT(Ser473) e Phospho-AKT(Thr308)”). As células foram cultivadas em meio F12 suplementado com 10 % de FBS, 400 μg/ml de G418 e 10 mM de HEPES. Antes do ensaio, as células foram incubadas em meio isento de soro por 2 a 4 horas. Alternativamente, as células puderam ser congeladas e aliquotadas antes do tempo em meio contendo 20 % de DMSO e usado no ensaio no descongelamento, girado e recolocado em suspensão. As células foram plaqueadas em 10.000 células por reservatórios em 20 μl do meio F12 isento de soro em placas de 384 reservatórios. Os controles de humulin e insulina glargine foram conduzidos em cada placa de compostos de teste. Os compostos titulados foram adicionados às células (2 μl por reservatório, concentrações finais = 1000 nM titulados para 0,512 pM em diluições de 1:5 vezes) e incubados a 37 °C por 30 min. As células foram lisadas com 8 μl do tampão de lise preparado fornecido no kit CisBio e incubados a 25 °C por 1 hora. Os reagentes de anticorpo diluídos (anti-AKT- D2e anti-pAKT-Eu3/criptato) foram preparados de acordo com as instruções do kit e depois 10 μl foram adicionados a cada reservatório de lisado de célula seguidos pela incubação a 25 °C por 3,5 a 5 horas. A placa foi lida em uma leitora de placa Envision (Excitação = 320 nm; Emissão = 665 nm) para determinar a atividade agonista de pAkt de IR com respeito tanto à potência quanto à resposta máxima para cada composto. Alternativamente, os compostos foram testados da mesma maneira na presença de 1,6 nM de Humulin para determinar como cada composto foi capaz de competir contra a atividade agonista completa da insulina.
EXEMPLO 30
[00307] A Tabela 15 mostra a atividade biológica in vitro dos dímeros de insulina para o receptor de insulina (IR). As atividades foram medidas pelos ensaios de competição de ligante como descritos no EXEMPLO 28 ou ensaios de fosforilação de Akt funcional como descritos no EXEMPLO 29.
EXEMPLO 31
[00308] Neste exemplo, os efeitos in vivo de vários agonistas parciais de receptor de insulina da presente invenção foram comparados com o Composto A (dímero de insulina MIU-90 descrito no pedido PCT publicado No. WO2014052451) e composto B (B29,B29’-suberoil-(insulina)2) descrito em Deppe et al., Nauyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 350: 213-217 (1994) mas usando RHI ao invés de insulina bovina em um ensaio de Teste de Tolerância à Insulina Intraperitoneal (IP-ITT) realizado em camundongos C57BL/6NTac machos adultos, magros.
[00309] Grupos de N = 6 a 8 animais por grupo foram randomizados pelo peso (média de cerca de 30 gramas). Dois dias antes do estudo, os camundongos foram condicionados para dosagem com uma injeção intraperitoneal de solução a 0,9% de Cloreto de Sódio no volume de dosagem de 5 ml/kg. Na manhã do estudo, o alimento foi removido duas ou quatro horas antes do estudo. As concentrações de glicose sanguínea foram determinadas em T = 0 min (linha de base) usando um Glicosímetro. Os camundongos foram depois dosados com veículo, Dímero 24, Dímero 55, Dímero 58, Dímero 60, Dímero 67, Composto A, Composto B, ou Humulin (RHI) a 5 ml/kg via injeção intraperitoneal (ver a Tabela 16 quanto às doses usadas). Os níveis de glicose sanguínea foram determinados a partir de sangrias da cauda tiradas entre 30 e 360 minutos depois da dose.
[00310] Os resultados são mostrados nas Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F e 2G. Os resultados mostram que o perfil de glicose para o Dímero 24, Dímero 55, Dímero 58, Dímero 60 e Dímero 67 foram substancialmente os mesmos em ambas as doses testadas ao passo que aumentar a dosagem dos compostos A e B causou uma potência de diminuição da glicose aumentada, indicando um potencial menor para o risco hiperglicêmico para os dímeros comparados aa RHI ou compostos A e B.
EXEMPLO 32
[00311] O efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 24, 18 e 40 foram comparados com a RHI em porcos miniatura Yucatan diabéticos (miniporcos D) como segue.
[00312] Os miniporcos Yucatan foram tornados diabéticos Tipo 1 pelas injeções de Alloxan a seguir de um protocolo patenteado desenvolvido pela Sinclair Research Center (Auxvasse, MO). A indução é considerada bem sucedida se níveis de glicose basal excederem 150 mg/dL. Os miniporcos D com níveis de glicose plasmática de aproximadamente 300 mg/dl foram utilizados nestes experimentos.
[00313] Miniporcos Yucatan machos, instrumentados com dois orifícios de acesso vascular da veia Jugular (VAP), foram usados nestes estudos. No dia do estudo depois de um jejum durante a noite, os miniporcos foram colocados em tipoias e VAPs foram acessados para infusão e amostragem. Em t = 0 min e depois coletando duas amostras de sangue na linha de base para a medição da glicose plasmática (t = -30 minutos e t = 0 minutos), os miniporcos foram administrados com Humulin (Insulina humana recombinante, RHI) ou IRPA como um único bolo IV, a 0,69 nmol/kg. A Humulin e IRPA foram formulados a 69 nmol/ml em um tampão contendo Glicerina, 16 mg/ml; Metacresol, 1,6 mg/ml; Fenol, 0,65 mg/ml; Fosfato de Sódio Anidro, Dibásico, 3,8 mg/ml; o pH ajustado para 7,4 com HCl. Depois da dosagem, a amostragem continuou por 480 minutos; os pontos de tempo para a coleta de amostra foram de -30 min, 0 min, 8 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 210 min, 240 min, 270 min, 300 min, 330 min, 360 min, 420 min, 480 min. O sangue foi coletado em tubos K3-EDTA, suplementados com 10 μg/ml de aprotinina e mantidos em gelo até o processamento, que ocorreu dentro de 30 minutos da coleta. Depois da centrifugação a 3000 rpm, 4°C, por 8 min, o plasma foi coletado e aliquotado para a medição da glicose usando um analisador Beckman Coulter AU480 Chemistry e para a medição dos níveis de composto.
[00314] A Figura 1 mostra que a 0,69 nmol/kg de concentração, RHI reduziu os níveis de glicose sérica abaixo de 50 mg/dL ao passo que os dímeros de insulina não. Este resultado mostra que os dímeros de insulina apresentam menos risco de promover a hipoglicemia do que RHI.
EXEMPLO 33
[00315] O efeito de diminuir a glicose dos Dímeros 4, 5, 7, 8, 9, 18- 29, 32, 37-41, 43, 44, 48, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 67, 69, 71, 72, 77 e 78 foram comparados com a RHI em porcos miniatura Yucatan Diabéticos (miniporcos D) como segue.
[00316] Miniporcos Yucatan foram tornados diabéticos Tipo 1 pelas injeções de Alloxan seguindo um protocolo patenteado desenvolvido pela Sinclair Research Center (Auxvasse, MO). A indução é considerada bem sucedida se os níveis de glicose basal excedessem 150 mg/dl. Os miniporcos D com níveis de glicose plasmática de aproximadamente 300 a 400 mg/dl e instrumentados com dois orifícios de acesso vascular da veia Jugular (VAP), foram usados nestes estudos.
[00317] No dia do estudo, depois de um jejum durante a noite, os miniporcos foram colocados em tipoias e VAPs foram acessados para infusão e amostragem. Em t = 0 min e depois de coletar duas amostras de sangue da linha de base para a medição da glicose plasmática (t = -30 minutos e t = 0 minutos), os miniporcos foram administrados com Humulin (Insulina Humana Recombinante, RHI) ou outro dímero como um único bolo IV, a 0,69 nmol/Kg (0,35 nmol/kg para o composto #78). O Humulin e dímeros foram formulados a 69 nmol/ml em um tampão contendo Glicerina, 16 mg/ml; Metacresol, 1,6 mg/ml; Fenol, 0,65 mg/ml; Fosfato de Sódio Anidro, Dibásico, 3,8 mg/ml, o pH ajustado para 7,4 com HCl. Depois da dosagem, a amostragem continuou por 480 minutos; os pontos de tempo para a coleta de amostra foram de -30 minutos, 0 minutos, 8 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos, 180 minutos, 210 minutos, 240 minutos, 270 minutos, 300 minutos, 330 minutos, 360 minutos, 420 minutos e 480 minutos. O sangue foi coletado em tubos K3-EDTA, suplementados com 10 μg/ml de aprotinina e mantidos em gelo até o processamento, que ocorreu dentro de 30 minutos da coleta. Depois da centrifugação a 3000 rpm, 4°C, por 8 minutos, o plasma foi coletado e aliquotado para a medição da glicose usando um analisador Beckman Coulter AU480 Chemistry. Os resultados são mostrados nas Figuras 7A - 7H. As Figuras mostram que a 0,69 nmol/kg de concentração, a RHI reduziu os níveis de glicose sérica abaixo de 50 mg/dL ao passo que os dímeros de insulina não. Este resultado mostra que os dímeros de insulina apresentam menos risco de promover a hipoglicemia do que a RHI.
EXEMPLO 34
[00318] Este experimento comparou a estabilidade da porção de ligação de dissulfeto do Composto A com a porção de ligação de suberoíla (C8) do Dímero 24.
[00319] 1 μM do Composto A e Dímero 24 foram cada um separadamente incubados em Membranas de Célula de Rim de Rato (RKCM) com ou sem 5 mM de glutationa (GSH). Amostras no Tempo 0 e Tempo 2 horas foram obtidas e a reação extinta com 1 volume de 10% de MeOH em AcCN com 0,1% de Ácido Fórmico. As amostras extintas foram depois centrifugadas e congeladas antes da análise. As amostras foram depois descongeladas e analisadas usando o sistema Thermo Orbi Velos. A análise MetID alvejada foi realizada com Cromatogramas de Íon Extraídos (XICs) usando 3 isótopos de 2 estados de carga em janela de 10 ppm.
[00320] Os metabólitos do Composto A foram detectados em RKCM tanto sem GSH quanto com GSH. Como mostrado na Figura 3, o monômero foi de cerca de 1% do precursor (solução de estoque do Composto A) em 2 horas de incubação. Como mostrado na Figura 4, o monômero foi de cerca de 6,5% do precursor (solução de estoque do Composto A) em 2 horas de incubação. Os resultados mostram que a ligação de dissulfeto foi rompida com o tempo. Nenhum dos metabólitos observados nos controles de 0 hora para o Composto A ou nas soluções de estoque.
[00321] O Dímero 24 produziu metabólitos que foram detectados em RKCM entretanto, embora a perda do polipeptídeo da cadeia A devido à ruptura das ligações de dissulfeto entre o polipeptídeo da cadeia A e o polipeptídeo da cadeia B fosse observada, nenhum dos monômeros foi detectado. A Figure 5 mostra que sem GSH, a perda de polipeptídeo da cadeia A foi menos do que 1% do precursor (solução de estoque de Dímero 24). A Figure 6 mostra que com GSH, a perda de polipeptídeo da cadeia A foi menor do que 1% do precursor (solução de estoque do Dímero 24). Nenhum metabólito foi observado nos controles de 0 hora para o Dímero 24 ou nas soluções de estoque. O novo procedimento de extinção com condições ácidas apropriadamente parou a troca de dissulfeto.
[00322] Embora a presente invenção seja aqui descrita com referência às modalidades ilustradas, deve ser entendido que a invenção não é limitada a estas. Aqueles tendo habilidade comum na técnica e acesso às descrições aqui reconhecerão modificações e modalidades adicionais dentro do seu escopo. Portanto, a presente invenção é limitada apenas pelas reivindicações aqui anexas.

Claims (4)

1. Composto, caracterizadopelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em:Dímero 24; em que as ligações dissulfeto entre os resíduos Cys6 e Cys11 do polipeptídeo de cadeia A e as ligações dissulfeto entre Cys7 e Cys20 da cadeia A com Cys7 e Cys19 do polipeptídeo de cadeia B, respectivamente, são representadas pela linha sólida entre eles; em que as porções de ligação estão covalentemente ligadas ao aminoácido épsilon do resíduo de lisina mostrado, em que o polipeptídeo da cadeia A para o Dímero 24 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1; e o polipeptídeo da cadeia B para o Dímero 24 tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2.
2. Composição, caracterizadapelo fato de que compreende o composto da reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. Uso do composto como definido na reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratamento de diabetes.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que a diabetes é diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2 ou diabetes gestacional.
BR122024000898-0A 2014-11-21 2015-11-19 Composto, composição, e, uso do composto BR122024000898A2 (pt)

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