ES2545533T3 - Composiciones y métodos para modificación de biomoléculas - Google Patents

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Nicholas J. Agard
Jennifer A. Prescher
Jeremy Michael Baskin
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Abstract

Un compuesto de fórmula: **Fórmula** en el que: cada uno de X y X' es independientemente: (a) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo); (b) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno; (c) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición 15 de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o (d) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno; Y es H; un grupo reactivo seleccionado entre un carboxilo, una amina, un éster, un tioéster, un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida y una hidrazina; o una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro; o cada uno de X y X' es independientemente: (a) H; (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo); (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno; (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición 35 de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno; Y es un carboxilo, una amina, un tioéster, un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida o una hidrazina; o una marca fluorescente, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modificación de biomoléculas.
Campo de la invención 5
La invención se refiere generalmente a la modificación covalente de moléculas útiles, por ejemplo, en la modificación de superficies (incluyendo superficies celulares), y modificación de moléculas en condiciones fisiológicas (por ejemplo, en un entorno celular).
10
Antecedentes de la invención
Las reacciones químicas selectivas que son ortogonales para los diversos grupos funcionales de sistemas biológicos ahora se reconocen como herramientas importantes en biología química. Como relativamente recién llegadas al repertorio de la química sintética, estas reacciones bioortogonales han inspirado nuevas estrategias para la síntesis 15 de bibliotecas de compuestos, ingeniería de proteínas, proteómica funcional, química y remodelación de superficies celulares. La azida se ha asegurado un papel destacado como un asa química única para bioconjugación. La ligación de Staudinger se ha usado con fosfinas para marcar azidoazúcares introducidos metabólicamente en glicoconjugados celulares. La ligación de Staudinger se puede realizar en animales vivos sin daño fisiológico; sin embargo, la reacción de Staudinger no está exenta de responsabilidades. Las fosfinas necesarias son susceptibles 20 de oxidación del aire y su optimización para el aumento de solubilidad en agua y el aumento de la tasa de reacción ha demostrado que es sintéticamente problemática.
El grupo azida tiene un modo alternativo de reactividad bioortogonal: la cicloadición [3+2] con alquinos que se describen en Huisgen. En su forma clásica, esta reacción tiene una aplicabilidad limitada en sistemas biológicos 25 debido al requisito de temperaturas (o presiones) elevadas para tasas de reacción razonables. Sharpless y colaboradores superaron este obstáculo con el desarrollo de una versión catalizada con cobre (I), denominada "química click", que evoluciona rápidamente a temperaturas fisiológicas y en entornos biológicos muy funcionalizados. Este descubrimiento ha permitido la modificación selectiva de partículas de virus, ácidos nucleicos, y proteínas de lisados tisulares complejos. Desafortunadamente, el catalizador de cobre obligatorio es tóxico para 30 células tanto bacterianas como de mamífero, y por lo tanto se excluye en las aplicaciones en las que las células deben permanecer viables. Se ha informado que las cicloadiciones de Huisgen sin catalizador de alquinos activadas con sustituyentes aceptores de electrones se producen a temperaturas ambientales. Sin embargo, estos compuestos experimentan reacción de Michael con nucleófilos biológicos.
35
En el campo existe una necesidad de mecanismos adicionales para modificar moléculas biológicas a través de una reacción biocompatible, en particular en un entorno biológico. La presente invención aborda esta necesidad.
Bibliografía
40
Huisgen (1963) Angew. Chem. Int. Ed. 2:565-598; Shea y Kim. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4846-4855; Reese y Shaw (1970) Chem. Comm. 1172-1173; Wilbur et al., Bioconj. Chem. 1996, 7, 689-702; Bistrup et al., J. Cell Biol. 1999, 145, 899-910; Saxon et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14893-14902; Hang y Bertozzi. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 727-736; Link et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 603-609; Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588-9589; Wang et al., J. Am. Chem. Soc, 2003, 125, 3192-3193; Kiick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 45 99, 19-24; Speers y Cravatt. Chem. Biol. 2004, 11, 535-546; Saxon y Bertozzi Science 2000, 287, 2007-2010; Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1164-1165; Dube y Bertozzi. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7, 616-625; Vocadlo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 9116-9121; Prescher et al.. Nature 2004, 430, 873-877; Seo et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612; Li et al., Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3143-3146; Wittig y Krebs. Chem. Ber. 1961, 94, 3260-3275; Meier et al., Chem. Ber. 1980, 113, 2398-2409; Turner et al.. J. Am. Chem. Soc. 1972, 95, 50 790-792.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona compuestos de cicloalquino modificado como se establece en la reivindicación 1; 55 y métodos de uso de tales compuestos en la modificación de biomoléculas cómo se establecen las reivindicaciones 15 y 23 La presente invención presenta una reacción de cicloadición que se puede realizar en condiciones fisiológicas. En general, la invención implica la reacción de un cicloalquino modificado con un resto de azida o una biomolécula diana, generando una molécula modificada de forma covalente. La selectividad de la reacción y su compatibilidad con entornos acuosos mantienen su aplicación in vivo (por ejemplo, en la superficie celular o por vía 60 intracelular) e in vitro (por ejemplo, síntesis de péptidos y otros polímeros, producción de aminoácidos modificados (por ejemplo, marcados)).
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B representan reacciones de cicloadición. La Figura 1A representa cicloadición de Huisgen catalizada con Cu (I) ("química click"). La Figura 1B representa cicloadición [3+2] estimulada con cepa de azidas y ciclooctinos. 5
La Figura 2 representa el marcado de GlyCAM-Ig modificada con azida con sondas de alquino.
Las Figuras 3A-C representan el marcado de superficie celular con un compuesto de ciclooctino modificado.
La Figura 4A representa de forma esquemática el marcado de azidas de superficie celular con sondas de ciclooctino. La Figura 4B representa el marcado con sonda de ciclooctino de células Jurkat que contienen azidas de superficie celular. 10
La Figura 5 representa el marcado de esplenocitos con ciclooctino-FLAG.
La Figura 6 representa el marcado in vivo de ratones con compuestos de ciclooctino-FLAG.
DEFINICIONES
15
Por "compañero reactivo" se hace referencia a una molécula o resto molecular que reacciona de forma específica con otro compañero reactivo. Algunos compañeros reactivos a modo de ejemplo son los de la reacción de la invención, es decir, un grupo azida de una molécula diana modificada con azida y el grupo cicloalquino de un resto cicloalquino modificado.
20
Como se usa en el presente documento el término "aislado" hace referencia a la descripción de un compuesto de interés que está en un entorno diferente a aquel en el que se produce el compuesto de forma natural. "Aislado" pretende incluir compuestos que están dentro de muestras que están enriquecidas básicamente para el compuesto de interés y/o en las que el compuesto de interés está parcial o sustancialmente modificados.
25
Como se usa en el presente documento, la expresión "básicamente purificado" se refiere a un compuesto que se retira de su entorno natural o su entorno sintético y está libre en al menos un 60 %, libre en al menos un 75 %, libre en al menos un 90 %, libre en al menos un 95 %, libre en al menos un 98 %, o libre en al menos un 99 % de otros componentes con los que se asocia de forma natural, o libre en al menos un 60 %, libre en al menos un 75 %, libre en al menos un 90 %, libre en al menos un 95 %, libre en al menos un 98 %, o libre en al menos un 99 % de 30 contaminantes asociados con la síntesis del compuesto.
Como se usa en el presente documento, el término "célula" en el contexto de las aplicaciones in vivo de la invención hace referencia a que incluye células eucariotas y procariotas de cualquier género o especie, con las células de mamíferos siendo de particular interés. "Célula" también pretende incluir tanto células normales como células 35 enfermas, por ejemplo, células cancerígenas. En muchas realizaciones, las células son células vivas.
Los términos "polipéptido" y "proteína", usados indistintamente en el presente documento, hacen referencia a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos codificados y no codificados, modificados química o bioquímicamente o aminoácidos derivatizados, y polipéptidos que tienen estructuras 40 principales peptídicas modificadas. Los términos incluyen proteínas de fusión, que incluyen a proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias directoras heterólogas y homólogas, con o sin restos de metionina N-terminal; proteínas marcadas de forma inmunológica.
La expresión "condiciones fisiológicas" pretende incluir las condiciones compatibles con las células vivas, por 45 ejemplo, condiciones predominantemente acuosas de una temperatura, pH, salinidad, etc. que son compatibles con las células vivas.
El término "arilo" como se usa en el presente documento se refiere a radicales aromáticos individuales de 5 y 6 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos. Algunos arilos representativos incluyen fenilo, tienilo, 50 furanilo, piridinilo, (is)oxazolilo.
La expresión "alquilo inferior", sola buen combinación, por lo general se refiere a un radical de alquilo acíclico que contiene de 1 a aproximadamente 10, por ejemplo, de 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, o de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Algunos ejemplos de tales radicales incluyen metilo, etilo, n-propilo, 55 isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, iso-amilo, hexilo, octilo.
La expresión "grupo alifático" se refiere a un grupo hidrocarburo lineal o ramificado saturado o insaturado e incluye grupos alquilo, alquenilo, y alquinilo, por ejemplo. La expresión "grupo alquilo" se refiere a un grupo o cadena de hidrocarburo lineal o ramificado saturado, sustituido o sin sustituir (por ejemplo, C1 a C8 ) que incluye, por ejemplo, 60 metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, heptilo, iso-propilo, n-octilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-octilhexilo. Algunos sustituyentes adecuados incluyen carboxi, carboxi protegido, amino, amino protegido, halo, hidroxi, hidroxi protegido, nitro, ciano, amino monosustituido, amino monosustituido protegido, amino disustituido, alcoxi de C1 a C7, acilo de C1 a C7, aciloxi de C1 a C7. La expresión "alquilo sustituido" se refiere al grupo alquilo sustituido definido anteriormente de una a tres veces con un hidroxi, hidroxi protegido, amino, amino protegido, ciano, halo, trifluorometilo, amino 65 monosustituido, amino disustituido, alcoxi inferior, alquiltio inferior, carboxi, carboxi protegido, o una sal de carboxi,
amino, y/o hidroxi. Tal como se usa en conjunto con los sustituyentes para los anillos de heteroarilo, las expresiones "(cicloalquil)alquilo sustituido" y "cicloalquilo sustituido" son como se definen a continuación sustituidos con los mismos grupos como se enumera para un grupo "alquilo sustituido". La expresión "grupo alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo lineal o ramificado, insaturado con uno o más dobles enlaces carbono-carbono, tales como un grupo vinilo. La expresión "grupo alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo lineal o ramificado, insaturado con uno 5 o más triples enlaces carbono-carbono. La expresión "grupo cíclico" se refiere a un grupo hidrocarburo de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático, o grupo heterocíclico. La expresión "grupo alicíclico" se refiere a un grupo hidrocarburo cíclico que tiene propiedades que se parecen a las de los grupos alifáticos. La expresión "grupo aromático" o "grupo arilo" se refiere a un grupo hidrocarburo aromático mono o policíclico, y puede incluir uno o más heteroátomos, y se definen adicionalmente a continuación. La expresión "grupo 10 heterocíclico" se refiere a un hidrocarburo de anillo cerrado en el que uno o más de los átomos en el anillo son un elemento distinto del carbono (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.), y se definen adicionalmente a continuación.
Los términos "halo" y "halógeno" se refieren a los grupos flúor, cloro, bromo o yodo. Puede haber uno o más 15 halógenos, que son los mismos o diferentes.
El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más átomos de halógeno. Los átomos de halógeno pueden ser iguales o diferentes. El término "dihaloalquilo" se refiere a un grupo alquilo como se ha descrito anteriormente que está sustituido con dos grupos halo, que pueden 20 ser iguales o diferentes. El término "trihaloalquilo" se refiere a un grupo alquilo como se ha descrito anteriormente que está sustituido con tres grupos halo, que pueden ser iguales o diferentes. El término "perhaloalquilo" se refiere a un grupo haloalquilo como se ha definido anteriormente en el que cada átomo de hidrógeno en el grupo alquilo se ha reemplazado con un átomo de halógeno. El término "perfluoroalquilo" se refiere a un grupo haloalquilo como se ha definido anteriormente en el que cada átomo de hidrógeno en el grupo alquilo se ha reemplazado con un grupo 25 fluoro.
El término "cicloalquilo" se refiere a un anillo saturado a mono, bi, o tricíclico que está totalmente saturado o parcialmente insaturado. Algunos ejemplos de dicho grupo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo, ciclooctilo, cis- o trans decalina, biciclo[2.2.1]hept-2-eno, ciclohex-1-enilo, ciclopent-1-enilo, 30 1,4-ciclooctadienilo.
El término "(cicloalquil)alquilo" se refiere al grupo alquilo definido anteriormente sustituido para uno de los anillos de cicloalquilo mencionados anteriormente. Algunos ejemplos de dicho grupo incluyen (ciclohexil)metilo, 3-(ciclopropil)-n-propilo, 5-(ciclopentil)hexilo, 6-(adamantil)hexilo. 35
La expresión "fenilo sustituido" específica un grupo fenilo sustituido con uno o más restos, y en algunos casos uno, dos, o tres restos, elegidos entre los grupos que consisten en halógeno, hidroxi, hidroxi protegido, ciano, nitro, trifluorometilo, alquilo de C1 a C7, alcoxi de C1 a C7, acilo de C1 a C7, aciloxi de C1 a C7, carboxi, oxicarboxi, carboxi protegido, carboximetilo, carboximetilo protegido, hidroximetilo, hidroximetilo protegido, amino, amino protegido, 40 (monosustituido)amino, (monosustituido)amino protegido, (disustituido)amino, carboxamida, carboxamida protegida, N-(alquil de C1 a C6)carboxamida, N-(alquil de C1 a C6)carboxamida protegida, N,N-di(alquil de C1 a C6)carboxamida, trifluorometilo, N-((alquil de C1 a C6)sulfonil)amino, N-(fenilsulfonil)amino o fenilo, sustituidos o sin sustituir, de modo que, por ejemplo, resulta un grupo bifenilo o naftilo.
45
Algunos ejemplos de la expresión "fenilo sustituido" incluyen un grupo mono o di(halo)fenilo tal como 2, 3 o 4-clorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 2, 3 o 4-bromofenilo, 3,4-dibromofenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo, 2, 3 o 4-fluorofenilo; un grupo mono o di(hidroxi)fenilo tal como 2, 3 o 4-hidroxifenilo, 2,4-dihidroxifenilo, los derivados hidroxi protegidos de los mismos; un grupo nitrofenilo tal como 2, 3 o 4-nitrofenilo; un grupo cianofenilo, por ejemplo, 2, 3 o 4-cianofenilo; un grupo mono o di(alquil)fenilo tal como 2, 3 o 4-metilfenilo, 2,4-50 dimetilfenilo, 2, 3 o 4-(iso-propil)fenilo, 2, 3 o 4-etilfenilo, 2, 3 o 4-(n-propil)fenilo; un grupo mono o di(alcoxi)fenil, por ejemplo, 2,6-dimetoxifenilo, 2, 3 o 4-(isopropoxi)fenilo, 2, 3 o 4-(t-butoxi)fenilo, 3-etoxi-4-metoxifenilo; 2, 3 o 4-trifluorometilfenilo; un grupo mono- o dicarboxifenilo o un grupo (carboxi protegido)fenilo tal como 2, 3 o 4-carboxifenilo o 2,4-di(carboxi protegido)fenilo; a mono- o di(hidroximetil)fenilo o (hidroximetil protegido)fenilo tal como 2, 3 o 4-(hidroximetil protegido)fenilo o 3,4-di(hidroximetil)fenilo; un grupo mono o di(aminometil)fenilo o (aminometil 55 protegido)fenilo tal como 2, 3 o 4-(aminometil)fenilo o 2,4-( aminometil protegido)fenilo; o un grupo mono o di(N-(metilsulfonilamino))fenilo tal como 2, 3 o 4-(N-(metilsulfonilamino))fenilo. Además, la expresión "fenilo sustituido" representa grupos fenilo disustituidos en los que los sustituyente son diferentes, por ejemplo, 3-metil-4-hidroxifenilo, 3-cloro-4-hidroxifenilo, 2-metoxi-4-bromofenilo, 4-etil-2-hidroxifenilo, 3-hidroxi-4-nitrofenilo, 2-hidroxi-4-clorofenilo.
60
La expresión "(fenil sustituido)alquilo" se refiere a uno de los grupos fenilo sustituidos mencionados anteriormente unidos a uno de los grupos alquilo descritos anteriormente. Algunos ejemplos de los mismos incluyen grupos tales como 2-fenil-1-cloroetilo, 2-(4’-metoxifenil)etilo, 4-(2’,6’-dihidroxifenil)n-hexilo, 2-(5’-ciano-3’-metoxifenil)n-pentilo, 3-(2’,6’-dimetilfenil)n-propilo, 4-cloro-3-aminobencilo, 6-(4’-metoxifenil)-3-carboxi(n-hexilo), 5-(4’-aminometilfenil)-3-(aminometil)n-pentilo, 5-fenil-3-oxo-n-pent-1-ilo, (4-hidroxinaft-2-il)metilo. 65
Como se ha indicado anteriormente, el término "aromático" o "arilo" se refiere a anillos carbocíclicos de seis miembros. También como se ha indicado anteriormente, el término "heteroarilo" representa anillos de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituidos que tienen de 1 a 4 heteroátomos, tales como átomos de oxígeno, azufre y/o nitrógeno, en particular nitrógeno, solos o en conjunto con átomos de azufre u oxígeno en el anillo. 5
Además, los anillos de cinco miembros o seis miembros mencionados anteriormente opcionalmente sustituidos se pueden fusionar opcionalmente con un sistema de anillos aromáticos de 5 miembros o 6 miembros. Por ejemplo, los anillos se pueden fusionar opcionalmente con un sistema de anillos aromáticos de 5 miembros o 6 miembros tal como piridina o un sistema de triazol, por ejemplo, con un anillo de benceno. 10
Los siguientes sistemas de anillos son ejemplos de los radicales heterocíclicos (sustituidos o sin sustituir) indicados con el término "heteroarilo": tienilo, furilo, pirrolilo, pirrolidinilo, imidazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, tiatriazolilo, oxatriazolilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, oxazinilo, triazinilo, tiadiazinil tetrazolo, 1,5-[b]piridazinilo y purinilo, así como derivados benzo-fusionados, por ejemplo, benzoxazolilo, 15 benzotiazolilo, bencimidazolilo e indolilo.
Algunos sustituyentes para los anillos de heteroarilo opcionalmente sustituido mencionados anteriormente son de uno a tres halo, trihalometilo, amino, amino protegido, sales de amino, amino monosustituido, amino disustituido, carboxi, carboxi protegido, sales de carboxilato, hidroxi, hidroxi protegido, sales de un grupo hidroxi, alcoxi inferior, 20 alquiltio inferior, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, (cicloalquil)alquilo, (cicloalquil)alquilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo, y (fenil sustituido)alquilo. Algunos sustituyentes para el grupo heteroarilo son como se han definido hasta el momento, o en el caso de trihalometilo, pueden ser trifluorometilo, triclorometilo, tribromometilo, o triyodometilo. Como se usa en conjunto con los sustituyentes mencionados anteriormente para anillos de heteroarilo, "alcoxi inferior" se refiere a un grupo alcoxi de C1 a C4, de forma similar, 25 "alquiltio inferior" se refiere a un grupo alquiltio de C1 a C4.
El término "(monosustituido)amino" se refiere a un grupo amino con un sustituyente elegido entre el grupo que consiste en grupos fenilo, fenilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, acilo de C, a C4, alquenilo de C2 a C7, alquenilo sustituido de C2 a C7, alquinilo de C2 a C7, alquilarilo de C7 a C16, alquilarilo sustituido de C7 a C16 y heteroarilo. El 30 (monosustituido) amino puede tener adicionalmente un grupo protector de amino tal como se incluye con el término "(monosustituido)amino protegido". El término "(disustituido)amino" se refiere a un grupo amino con dos sustituyentes elegidos entre el grupo que consiste en fenilo, fenilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, acilo de C1 a C7, alquenilo de C2 a C7, alquinilo de C2 a C7, alquilarilo de C7 a C16, alquilarilo sustituido de C7 a C16 y heteroarilo. Los dos sustituyentes pueden ser los mismos o diferentes. 35
El término "heteroaril(alquilo)" representa un grupo alquilo como se ha definido anteriormente, sustituido en cualquier posición con un grupo heteroarilo, como se ha definido anteriormente.
"Opcional" u "opcionalmente" se refiere a que el suceso, circunstancia, característica, o elemento que se describe 40 posteriormente se puede producir, pero no es necesario que sea así, y que la descripción incluye casos en los que el suceso o circunstancia se produce y casos en los que no se producen. Por ejemplo, "grupo heterociclo opcionalmente mono o disustituido con un grupo alquilo" se decía que el alquilo puede estar presente, pero no es necesario que sea así, y la descripción incluye situaciones en las que el grupo heterociclo está mono o disustituido con un grupo alquilo y situaciones en las que el grupo heterociclo no está sustituido con el grupo alquilo. 45
Algunos compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en la naturaleza consecuencia de enlace de sus átomos o la colocación de sus átomos en el espacio se denominan "isómeros". Los isómeros que difieren en la colocación de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diastereómeros" y los que no son imágenes especulares 50 superponibles entre sí se denominan "enantiómeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimétrico, por ejemplo, éste se une a cuatro grupos diferentes, un par de enantiómeros es posible. Por enantiómero se puede caracterizar mediante la configuración absoluta de su centro asimétrico y se describe mediante las reglas de secuenciación R y S de Cahn y Prelog, o mediante la forma en la que la molécula gira el plano de luz polarizada y se denominan dextrógiro o levógiro (es decir, como (+) o (-)-isómeros respectivamente). Un compuesto quiral puede existir como 55 cualquier enantiómero individual o como una mezcla de los mismos. Una mezcla que contiene proporciones iguales de los enantiómeros se denomina una "mezcla racémica".
Los compuestos de la presente invención pueden poseer uno o más centros asimétricos; por lo tanto, tales compuestos se pueden producir como estereoisómeros (R) o (S) individuales o como mezclas de los mismos. A 60 menos que se indique de otro modo, la descripción o nomenclatura de un compuesto en particular en la memoria descriptiva y las reivindicaciones pretende incluir tanto enantiómeros individuales como mezclas, racémica son de otro modo, de los mismos. Los métodos para la determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el análisis en el Capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4ª edición de J. March, John Wiley y Sons, New York, 1992). 65
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviene, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o que aparezca en el intervalo indicado, está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la invención, sujetos a cualquier límite excluido de 5 forma específica en el intervalo indicado. Cuando intervalo indicado incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como normalmente lo entiende un experto habitual en la materia a la que pertenece la 10 presente invención.
Se debe indicar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a la "un cicloalquino modificado" incluye una pluralidad de tales cicloalquinos 15 modificados y la referencia a "la molécula diana" incluye la referencia a una o más moléculas diana y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Se indica adicionalmente que se puede hacer un borrador de las reivindicaciones para que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base de antecedente para uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solamente" y similares en conexión con la lectura de los elementos de reivindicación, o uso de una limitación "negativa". 20
Descripción detallada de la invención
La presente invención presenta una reacción de cicloadición [3+2] estimulada con cepa que se puede realizar en condiciones fisiológicas. En general, la invención indica la reacción de un cicloalquino modificado con un resto de 25 azida en una biomolécula, generando una biomolécula modificada de forma covalente. La selectividad de la reacción y su compatibilidad con entornos acuosos proporciona su aplicación in vivo (por ejemplo, en la superficie celular o por vía intracelular) e in vitro (por ejemplo, síntesis de péptidos y otros polímeros, producción de aminoácidos modificados (por ejemplo, marcados)). La reacción es compatible con la modificación de células vivas.
30
La invención proporciona métodos y composiciones para modificar sintéticamente de forma específica y eficaz componentes celulares en un entorno acuoso, proporcionando de este modo la modificación de tales componentes celulares sobre o en células vivas. La invención usa compañeros reactivos son completamente abióticos y son químicamente ortogonales con respecto a los componentes celulares nativos, proporcionando de este modo una selectividad de la reacción extrema. Además, la reacción se puede realizar en condiciones fisiológicas, por ejemplo, 35 a pH de aproximadamente 7 dentro de un entorno acuoso, y a aproximadamente 37 ºC.
La invención se basa en parte en el descubrimiento de un medio para realizar una reacción de Huisgen modificada que se puede realizar en un entorno fisiológico, acuoso. Dado que la reacción de la invención es altamente selectiva y funciona en disolventes acuosos, la reacción se puede usar en diversas aplicaciones tanto in vitro como in vivo. La 40 reacción se consigue a través del uso de una primera molécula que comprende un resto de cicloalquino tensionado, y una segunda molécula que comprende un resto de azida. El resto de azida de la segunda molécula reacciona, en ausencia de un catalizador, con el resto de cicloalquino tensionado en la primera molécula, formando un producto conjugado final que comprende un anillo de azida/cicloalquino fusionado. La primera molécula que comprende el resto de cicloalquino tensionado puede comprender adicionalmente un resto que permite reacciones posteriores y/o 45 que proporciona el marcado detectable del producto de la reacción final. La reacción evoluciona sin la necesidad de un catalizador. En su lugar, la energía de activación para la reacción se proporciona con el grupo azida y el grupo cicloalquino tensionado. La invención aprovecha la deformación masiva del ángulo de enlace del grupo acetileno en el resto de cicloalquino, que proporciona una tensión del anillo. Por ejemplo, la deformación del ángulo de enlace del grupo acetileno de ciclooctino a 163º representa casi 18 kcal/mol de la tensión del anillo. Esta desestabilización del 50 estado fundamental frente al estado de transición de la reacción proporciona una tasa de aceleración espectacular en comparación con los alquinos sin tensionar.
COMPUESTOS DE CICLOALQUINO MODIFICADOS
55
La presente invención proporciona compuestos de cicloalquino modificado; y composiciones que comprenden los compuestos. El compuesto de la invención se expone en la reivindicación 1.
R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril 60 cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo, y un nitro. En algunas realizaciones, R1 es un grupo alifático sustituido o sin sustituir, por ejemplo, un alquilo sustituido o sin sustituir; un alquenilo sustituido o sin sustituir; o un alquinilo sustituido o sin sustituir. En algunas realizaciones, R1 es un fenilo sustituido o sin sustituir.
En algunas realizaciones, Y es un grupo reactivo seleccionado entre un carboxilo, una amina, un éster, un tioéster, 65 un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una
maleimida, y una hidrazina.
En algunas realizaciones, Y es una molécula de interés, seleccionada entre una marca detectable; una toxina (incluyendo citotoxinas); un conector; un péptido; un fármaco; un miembro de un par de unión específico; una marca de epítopo. Cuando Y es una molécula de interés distinta de un conector, la molécula de interés se une directamente 5 a R1, o se une a través de un conector.
El compuesto de la invención comprende un cicloalquino tensionado, por ejemplo, el cicloalquino aumenta la tasa de reacción de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 1000 veces, por ejemplo, el cicloalquino aumenta la tasa de reacción al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, en comparación con la tasa de reacción entre una azida y un alquino lineal que tiene el mismo número de átomos de carbono que el cicloalquino. El cicloalquino es un anillo de 8 miembros. La tensión en el cicloalquino puede aumentar en diversas formas, por ejemplo, a través del uso de heteroátomos; el grado de insaturación, o la tensión de torsión; el uso de grupos aceptores de electrones, etc. En 15 algunas realizaciones de interés en particular, el cicloalquino es un ciclooctino. En algunas realizaciones, el cicloalquino tensionado es un compuesto en el que uno o más de los átomos de carbono en el anillo de cicloalquino, distintos de los dos átomos de carbono unidos por un triple enlace, está sustituido con uno o más grupos aceptores de electrones, por ejemplo, un halo (bromo, cloro, flúor, yodo), un grupo nitro, un grupo ciano, o un grupo sulfona. Cuando el grupo aceptor de electrones es un grupo nitro, un grupo ciano, o un grupo sulfona, el grupo aceptor de 20 electrones no se une directamente al anillo de cicloalquino.
En algunas realizaciones, un cicloalquino modificado objeto tiene la Fórmula I:
25
en la que:
Y es H; un resto que comprende un grupo reactivo que facilita la unión covalente de una molécula de interés como se ha definido anteriormente; o una molécula de interés como se ha definido anteriormente; y 30
R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo, y un nitro. R1 puede estar en cualquier posición en el grupo ciclooctino distinta a la de los dos átomos de carbono unidos por el triple enlace.
35
En algunas realizaciones, un cicloalquino modificado objeto tiene la Fórmula III:
en la que: 40
Y es H; un resto que comprende un grupo reactivo que facilita la unión covalente de una molécula de interés como se ha definido anteriormente; o una molécula de interés como se ha definido anteriormente; y
R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una 45 aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo, y un nitro. R1 puede estar en cualquier posición en el grupo ciclooctino distinta a la de los dos átomos de carbono unidos por el triple enlace.
En algunas realizaciones, un cicloalquino modificado objeto tienen la Fórmula IV:
en la que: 5
Y es H; un resto que comprende un grupo reactivo que facilita la unión covalente de una molécula de interés como se ha definido anteriormente; o una molécula de interés como se ha definido anteriormente; y
R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una 10 aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo, y un nitro. R1 puede estar en cualquier posición en el grupo ciclooctino distinta a la de los dos carbonos unidos por el triple enlace.
algunos ejemplos usados modo de ejemplo de un compuesto de ciclooctino halogenado objeto incluyen:
15
y 20
Moléculas de interés
En algunas realizaciones, Y es una molécula de interés seleccionada entre una marca detectable; una toxina (incluyendo citotoxinas); un conector; un péptido; un fármaco; un miembro de un par de unión específico; una marca de epítopo. Cuando Y es una molécula de interés distinta de un conector, la molécula de interés se une directamente 5 a R1, o se une a través de un conector.
Cuando Y es una molécula de interés, el cicloalquino modificado comprende una molécula deseada para administración y conjugación con el sustrato de azido-diana (molécula diana que contiene azida), sustrato diana que puede se puede presentar en la superficie celular, puede encontrarse dentro de la membrana celular, o puede ser 10 intracelular. Algunas moléculas que pueden ser deseables para administración incluyen de marcas detectables (por ejemplo, marcadores de espín, colorantes de tipo transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), por ejemplo, para estudiar la estructura de las biomoléculas in vivo), fármacos de molécula pequeña, moléculas citotóxicas (por ejemplo, fármacos), ligandos para unión mediante un receptor debían (por ejemplo, para facilitar la unión viral, unión de una proteína diana presente en un liposoma, etc.), marcas para ayudar en la purificación, por 15 ejemplo, mediante cromatografía por afinidad (por ejemplo unión de un epítopo FLAG), y moléculas para facilitar la unión selectiva del polipéptido a una superficie. A continuación se proporcionan algunos ejemplos específicos.
Marcas detectables
20
Las composiciones y métodos de la invención se pueden usar para administrar una marca detectable a una molécula diana que tiene una azida. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un cicloalquino modificado objeto comprende una marca detectable, unido de forma covalente al cicloalquino modificado directamente o a través de un conector.
Algunas marcas detectables a modo de ejemplo incluyen moléculas fluorescentes (por ejemplo, moléculas 25 autofluorescentes, moléculas que son fluorescentes después del contacto con un reactivo, etc.), marcas radiactivas (por ejemplo, 111In, 125I, 131I, 212 B, 90Y, 186Rh); biotina (por ejemplo, para su detección a través de reacción de biotina y avidina); marcas fluorescentes; reactivos de formación de imágenes (por ejemplo, los que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.741.900 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.326.856). Algunas marcas detectables también incluyen péptidos o polipéptidos que se pueden detectar mediante unión a anticuerpo, por 30 ejemplo, mediante la unión de un anticuerpo marcado de forma detectable o mediante la detección de anticuerpo unido a través de un ensayo de tipo sándwich. Para su uso también son adecuados puntos cuánticos (por ejemplo, nanocristales semiconductores marcados de forma detectable, tales como puntos cuánticos marcados con fluorescencia, puntos cuánticos conjugados con anticuerpo). Véase, por ejemplo, Dubertret et al., 2002 Science 298: 759-1762; Chan et al., (1998) Science 281: 2016-2018; Patente de Estados Unidos Nº 6.855.551; Bruchez et al., 35 (1998) Science 281: 2013-2016.
Algunas moléculas fluorescentes adecuadas (fluoróforos) incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, ésteres de succinimidilo de carboxifluoresceína, ésteres de succinimidilo de fluoresceína, 5-isómero de diclorotriazina de fluoresceína, carboxi-fluoresceína-alanina-carboxamida enjaulada, Oregon Green 488, Oregon 40 Green 514; Amarillo Lucifer, Naranja de acridina, rodamina, tetrametilrodamina, Texas Red, yoduro de propidio, JC-1(5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzoimidazoilcarbocianina, yoduro), tetrabromorodamina 123, rodamina 6G, TMRM (tetrametilrodamina, éster de metilo), TMRE (tetrametilrodamina, éster de etilo), tetrametilrosamina, rodamina B y 4-dimetilaminotetrametilrosamina, proteína fluorescente de color verde, proteína fluorescente de color verde desplazado a azul, proteína fluorescente de color verde desplazado a turquesa, proteína fluorescente de color verde 45 desplazado a rojo, proteína fluorescente de color verde desplazado a amarillo, ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatoestilbeno-2,2’disulfónico; acridina y derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato; N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; ácido 4,4-difluoro-5-(2-tienil)-4-bora-3a,4a diaza-5-indaceno-3-propiónico BODIPY; azul cascada; Amarillo Brillante; cumarina y derivados: cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, 50 Cumarina 120),7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151); colorantes de cianina; cianosina; 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5’,5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Rojo de Bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentacetato de dietilentriamina; ácido 4,4’-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2-,2’-disulfónico; ácido 4,4’-diisotiocianatoestilbeno-2,2’-disulfónico; cloruro de 5-(dimetilamino)naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4-dimetilaminofenilazofenil-4’-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados: eosina, isotiocianato 55 de eosina, eritrosina y derivados: eritrosina B, isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados: 5-carboxifluoresceína (FAM),5-(4,6-diclorotriazin-2-il)amino-fluoresceína (DTAF), 2’,7’dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC, (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de Verde de Malaquita; 4-metilumbeliferonaorto cresol-ftaleína; nitrotirosina; pararrosanilina; Rojo Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados: pireno, butirato de pireno, succinimidilo 1-pireno; 60 puntos cuánticos de butirato; Rojo Reactivo 4 (Cibacron™ Rojo Brillante 3B-A) rodamina y derivados: 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), cloruro de sulfonilo de lisamina y rodamina B rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Texas Red); N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido 5-(2’-aminoetil) aminonaftaleno-1-sulfónico 65 (EDANS), ácido 4-(4’-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), ácido rosólico; CAL Fluor Orange 560; derivados de
quelato de terbio; Cy 3; Cy 5; Cy 5,5; Cy 7; IRD 700; IRD 800; La Jolla Blue; ftalo cianina; y naftalo cianina, cumarinas y colorantes relacionados, colorantes de xanteno tales como rodoles, resorufinas, bimanos, acridinas, isoindoles, colorantes de dansilo, hidrazidas aminoftálicas tales como luminol, y derivados de isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas, dicianohidroquinones, y complejos fluorescentes de europio y terbio; y similares. Algunos fluoróforos de interés se describen adicionalmente en el 5 documento de patente WO 01/42505 y en el documento de patente WO 01/86001.
Algunas proteínas fluorescentes y proteínas cromogénicas adecuadas incluyen una proteína fluorescente de color verde (GFP), que incluye una GFP derivada de Aequoria victoria o un derivado de la misma, por ejemplo, un derivado "humanizado" tal como GFP Potenciado, que está disponible en el mercado, por ejemplo, en Clontech, Inc.; 10 una GFP de otra especie tal como Renilla reniformis, Renilla mulleri, o Ptilosarcus guernyi, como se describe, por ejemplo, en el documento de patente WO 99/49019 y en Peelle et al., (2001) J. Protein Chem. 20: 507-519; GFP recombinante "humanizada" (hrGFP) (Stratagene); cualquiera de diversas proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de Anthozoos, como se describe, por ejemplo, en Matz et al., (1999) Nature Biotechnol. 17: 969-973.
15
Algunas marcas de epítopo adecuadas incluyen hemaglutinina (HA; por ejemplo, CYPYDVPDYA; SEC ID Nº: 1), FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK; SEC ID Nº: 2), FLAG-C (por ejemplo, DYKDDDDKC; SEC ID Nº: 3, c-myc (por ejemplo, CEQKLISEEDL; SEC ID Nº: 4), una marca de afinidad de ión metálico tal como una marca de polihistidina (por ejemplo, His6).
20
Algunos agentes de formación de imágenes adecuados incluyen agentes de contraste positivo y agentes de contraste negativo. Algunos agentes de contraste positivo incluye ácido gadolinio tetraazaciclododecanotetraacético (Gd-DOTA); ácido Gadolinio-dietilentriaminapentaacético (Gd-DTPA); Gadolinio-1,4,7-tris(carbonilmetil)-10-(2’-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Gd-HP-DO3A); Manganeso (II)-difosfato de dipiridoxal (Mn-DPDP); Gd-dietilentriaminpentacetato-bis(metilamida) (Gd-DTPA-BMA). Algunos agentes de contraste negativo incluyen un 25 agente de formación de imágenes de óxido de hierro superparamagnético (SPIO); y un perfluorocarbono, en el que algunos perfluorocarbonos adecuados incluyen fluoroheptanos, fluorocicloheptanos, fluorometilcicloheptanos, fluorohexanos, fluorociclohexanos, fluoropentanos, fluorociclopentanos, fluorometilciclopentanos, fluorodimetilciclopentanos, fluorometilciclobutanos, fluorodimetilciclobutanos, fluorotrimetilciclobutanos, fluorobutanos, fluorociclobutanos, fluoropropanos, fluoroéteres, fluoropoliéteres, fluorotrietilaminas, 30 perfluorohexanos, perfluoropentanos, perfluorobutanos, perfluoropropanos, hexafluoruro de azufre.
Compañeros de unión específicos
En otra realización, un cicloalquino modificado objeto comprende un miembro de un par de compañeros de unión. En 35 el presente documento, un miembro de un par de compañeros de unión se denomina "compañero de unión específico".
Algunos compañeros de unión específicos adecuados incluyen un miembro de un par receptor/ligando; un miembro de un par anticuerpo/antígeno; un miembro de un par lectina/carbohidrato; un miembro de un par enzima/sustrato; 40 biotina/avidina; biotina/estreptavidina; digoxina/antidigoxina. Algunos compañeros de unión específicos adecuados incluyen un ligando receptor; un receptor para un ligando; una parte de unión a ligando de un receptor; un anticuerpo; un fragmento de unión antígeno de un anticuerpo; un antígeno; un hapteno; una lectina; un carbohidrato de unión a lectina; un sustrato enzimático; un inhibidor irreversible de una enzima (por ejemplo, un inhibidor irreversible que se une a un sitio de unión a sustrato de un enzima, por ejemplo, un sustrato "suicida"). 45
Algunos miembros ligandos adecuados de pares receptor/ligando incluyen neurotransmisores tales como compuestos opioides, acetilcolina; proteínas virales que se unen a un receptor de superficie celular, por ejemplo, virus gp120 de inmunodeficiencia humana; hormonas.
50
Algunos fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno adecuados incluyen F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv, y fragmentos de Fd, anticuerpos de una sola cadena, y proteínas de fusión que comprenden una parte de unión al antígeno de un anticuerpo y una proteína no anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo fusionado con una región constante de inmunoglobulina).
55
Algunos haptenos adecuados incluyen (4-hidroxi-3-nitrofenil) acetilo; ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) o uno de sus complejos metálicos; paranitrofenilo; biotina; isotiocianato de fluoresceína.
Fármacos
60
Algunos fármacos adecuados que se pueden unir a un resto de cicloalquino modificado incluyen compuestos citotóxicos (por ejemplo, compuestos quimioterapéuticos para el cáncer); compuestos antivirales; modificado desde la respuesta biológica (por ejemplo, hormonas, quimioquinas, citoquinas, interleuquinas, etc.); agentes que afectan a microtúbulos; procuradores de hormonas; compuestos esteroideos.
65
Algunos compuestos quimioterapéuticos para el cáncer incluyen compuestos no peptídicos (es decir, no proteicos)
que reducen la proliferación de células cancerígenas; compuestos peptídicos que reducen la proliferación de células cancerígenas; agentes antimetabolitos; agentes citotóxicos; y agentes citostáticos. Algunos ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación, nitrosoureas, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides vegetales (vinca), y hormonas esteroideas.
5
Algunos agentes adecuados que actúan para reducir la proliferación celular incluyen agentes de alquilación, tales como mostazas de hidrógeno, nitrosoureas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, y triazenos, que incluyen, pero no se limitan a, mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan™), melfalán (L-sarcolisina), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozocina, clorozotocina, mostaza de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina, trietilenotiofosforamina, busulfán, dacarbazina, y 10 temozolomida.
Algunos agentes antimetabolitos adecuados incluyen análogos del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, e inhibidores de la adenosina desaminasa, que incluyen citarabina (CYTOSAR-U), arabinósido de citosina, fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR), 6-tioguanina, 6-mercaptopurina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracil poco (5-15 FU), metotrexato, 10-propargil-5,8-didesazafolato (PDDF, CB3717), ácido 5,8-didesazatetrahidrofólico (DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, y gemcitabina.
Algunos productos naturales antiproliferativos y sus derivados, (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos anti tumorales, enzimas, linfoquinas, y epipodofilotoxinas), incluyen Ara-C, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), 20 desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, azatioprina; brequinar; alcaloides, por ejemplo vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por ejemplo etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por ejemplo antraciclina, clorhidrato de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina), idarrubicina, doxorrubicina, epirrubicina y derivados de morfolino, etc.; bisciclopéptidos de fenoxizona, por ejemplo dactinomicina; glicopéptidos básicos, por ejemplo bleomicina; glicósidos de antraquinona, por ejemplo plicamicina (mitramicina); 25 antracenodionas, por ejemplo mitoxantrona; azirinopirrolo indoldionas, por ejemplo mitomicina; inmunosupresores macrocíclicos, por ejemplo ciclosporina, FK-506 (tacrolimus, prograf), rapamicina.
Otros agentes citotóxicos antiproliferativos adecuados son navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, y droloxafina. 30
Algunos agentes que influyen en microtúbulos adecuados que tienen actividad antiproliferativa incluyen alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410), dolstatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®), derivados de Taxol®, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisteína, sulfato de vinblastina, sulfato 35 de vincristina, epotilonas naturales y sintéticas incluyen, epotilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina, nocodazol.
Algunos moduladores de hormonas y esteroides adecuados (incluyendo análogos sintéticos) incluyen adrenocorticosteroides, por ejemplo prednisona, dexametasona, etc.; estrógenos y pregestinas, por ejemplo 40 caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxifeno; etc.; y supresores adrenocorticales, por ejemplo aminoglutetimidla; 17α-etinilestradiol; dietilestilbestrol, testosterona, fluoximasterona, propionato de dromostanolona, testolactona, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolide, Flutamida (Drogenilo), Toremifeno (Fareston), y Zoladex®. Los estrógenos 45 estimulan la proliferación y diferenciación, por lo tanto los compuestos que se unen al receptor de estrógenos se usan para bloquear esta actividad. Algunos corticosteroides pueden inhibir la proliferación de los linfocitos T.
Otros agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen complejos metálicos, por ejemplo cisplatino (cis-DDP), carboplatino; ureas, por ejemplo hidroxiurea; y hidrazinas, por ejemplo N-metilhidrazina; epidofilotoxina; un inhibidor 50 de la topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur; etc.. Otros agentes antiproliferativa es de interés incluyen inmunosupresores, por ejemplo ácido micofenólico, talidoinida, desoxispergualina, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirana (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil)propoxi)quinazolina).
55
Algunos taxanos también son adecuados para unirse a un resto de cicloalquino. Algunos "taxanos" incluyen paclitaxel, así como cualquier derivado o profármaco de taxano activo. El "paclitaxel" (en el presente documento se entiende que incluye análogos, formulaciones, y derivados tales como, por ejemplo, docetaxel, TAXOL™, TAXOTERE™ (una formulación de docetaxel), algunos análogos de 10-desacetilo de paclitaxel y análogos de 3’N-desbenzoil-3’N-t-butoxicarbonilo de paclitaxel) se pueden preparar fácilmente usando técnicas conocidas por los 60 expertos en la materia (véanse también los documentos de patentes WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; las patentes de Estados Unidos Nºs 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; y documento de patente EP 590.267), o se pueden obtener a partir de diversas fuentes comerciales, que incluyen por ejemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia; o T-1912 de Taxus yannanensis). 65
Se debería entender que el paclitaxel hace referencia no solamente a la forma de paclitaxel químicamente disponible
habitual, sino también a análogos y derivados (por ejemplo, Taxotere™ docetaxel, como se ha indicado anteriormente) y conjugados de paclitaxel (por ejemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano, o paclitaxel-xilosa).
Dentro del término "taxano" también se incluyen diversos derivados conocidos, que incluyen tanto derivados hidrófilos, como derivados hidrófobos. Algunos derivados de taxano incluyen derivados de galactosa y manosa que 5 se describen en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 99/18113; piperazino y otros derivados que se describen en el documento de patente WO 99/14209; derivados de taxano que se describen en el documento de patente WO 99/09021, documento de patente WO 98/22451, y Patente de Estados Unidos Nº 5.869.680; derivados 6-tio que se describe en el documento de patente WO 98/28288; derivados de sulfenamida que se describen en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.821.263; y derivados de taxol que se describe en el documento de 10 Patente de Estados Unidos Nº 5.415.869. Además incluye profármacos de paclitaxel incluyen los que se describen en el documento de patente WO 98/58927; documento de patente WO 98/13059; y Patente de Estados Unidos Nº 5.824.701.
Algunos modificadores de la respuesta biológica que son adecuados para su unión a un resto de cicloalquino 15 incluyen (1) inhibidores de la actividad de tirosina quinasa (RTK); (2) inhibidores de la actividad de la serina/treonina quinasa; (3) antagonistas antigénicos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen de forma específica a un antígeno tumoral; (4) agonistas de receptores de la apoptosis; (5) interleuquina-2; (6) IFN-α; (7) IFN-γ (8) factores de estimulación de colonias; y (9) inhibidores de la angiogénesis.
20
Conectores
Algunos conectores adecuados incluyen un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, a halosulfonilo, a nitrilo, a nitro, y un conector peptídico. 25
En algunas realizaciones, los conectores específicos a modo de ejemplo para uso en la unión de una molécula de interés a un cicloalquino modificado tendrán una combinación de restos de glicina, alanina, prolina y metionina, en los que algunos conectores peptídicos adecuados incluyen, pero no se limitan a AAAGGM (SEC ID Nº: 5); AAAGGMPPAAAGGM (SEC ID Nº: 6); AAAGGM (SEC ID Nº: 7); y PPAAAGGMM (SEC ID Nº: 8). Cualquier 30 conector flexible, por lo general que tiene una longitud de aproximadamente 6 aminoácidos y aproximadamente 40 aminoácidos es adecuado para su uso. Algunos colectores pueden tener prácticamente cualquier secuencia que da como resultado un péptido generalmente flexible, incluyendo secuencias ricas en alanina-prolina.
Composiciones 35
La presente invención también proporciona composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un compuesto de cicloalquino modificado objeto. Una composición objeto por lo general comprende un compuesto de cicloalquino modificado objeto; y al menos un compuesto adicional. Algunos compuestos adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a: una sal, tal como una sal de magnesio, una sal sódica, etc., por ejemplo, 40 NaCl, MgCl, KCl, MgSO4, etc.; un agente de tamponamiento, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-Hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris[Hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasas. 45
En algunas realizaciones, una composición objeto comprende un compuesto de cicloalquino modificado objeto; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En la técnica se conoce una amplia diversidad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no es necesario analizarlos con detalle en el presente documento. Algunos excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito en diversas publicaciones, que incluyen, por ejemplo, A. 50 Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20ª edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7ª ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3ª ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
55
Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, excipientes o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Además, algunas sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes para el ajuste del pH y de taponamiento, agentes para el ajuste de la tonicidad, agentes estabilizantes, agentes humectantes, están fácilmente disponibles para el público.
60
MÉTODOS PARA MODIFICAR UNA BIOMOLÉCULA DIANA
La presente invención proporciona métodos in vitro a la modificación quimioselectiva de una molécula diana que comprende una azida. Los métodos implican generalmente hacer reaccionar una azida en una molécula diana que contiene azida con un cicloalquino modificado. El cicloalquino modificado tiene una estructura como se ha descrito 65 anteriormente. Por lo tanto, en muchas realizaciones como un método objeto para modificar de forma sintética un
componente celular implica por lo general: a) introducir un resto de azida en un componente celular, generando de este modo un componente celular modificado con azida; y poner en contacto la célula que comprende el componente celular modificado con azida con un compañero reactivo que comprende un cicloalquino modificado, realizándose el contacto en condiciones fisiológicas. La etapa de contacto da como resultado la reacción entre el grupo azida del componente celular modificado con azida y el cicloalquino del compañero reactivo, modificando de 5 este modo de forma sintética y covalente el componente celular. En algunas realizaciones, el método se realiza en células vivas in vitro. En otras realizaciones, el método se realiza en células vivas ex vivo.
En una realización, el ligamiento quimioselectivo se diseña para uso en, condiciones fisiológicas totalmente acuosa se implica la producción de un producto final estable que comprende un anillo de azida/cicloalquino fusionado. En 10 general, esta realización implica la reacción de un primer reactivo que comprende un resto de cicloalquino tensionado con un segundo reactivo que comprende una azida, de modo que se forma un enlace covalente entre el primer y segundo reactivos por reacción de el resto de cicloalquino tensionado con el grupo azida.
Primer reactivo 15
Un primer reactivo comprende un resto de cicloalquino tensionado como se describe en el presente documento que proporciona la energía para la reacción entre el primer y segundo reactivos. El primer reactivo es un compuesto de cicloalquino modificado como se establece en la reivindicación 15. Y es una molécula de interés como se describe a continuación; 20
R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo, y un nitro. En algunas realizaciones, el primer reactivo es un compuesto de cicloalquino modificado de cualquiera de las Fórmulas I-IV, como se ha descrito anteriormente. 25
La molécula de interés se puede hacer reaccionar directamente con el grupo reactivo o a través de un conector. Las moléculas de interés son una marca detectable, un fármaco, un péptido, un miembro de un par de unión específico. Tales moléculas de interés se han descrito con más detalle anteriormente.
30
En algunas realizaciones, el cicloalquino modificado tiene la Fórmula I:
en la que Y y R1 son como se han definido anteriormente. 35
En otras realizaciones, el cicloalquino modificado tiene cualquiera de las Fórmulas II-IV, mencionadas anteriormente.
Segundo reactivo
40
el segundo reactivo es un compuesto que comprende una azida de modo que se forma un enlace covalente entre el primer y segundo reactivos por reacción del resto de cicloalquino con el grupo azida. En general, el segundo reactivo tiene la fórmula:
R2-N3 45
en la que R2 es una molécula diana, por ejemplo, una biomolécula u otra molécula diana.
Moléculas diana
50
En la técnica se conocen bien algunas moléculas que comprenden una azida y que son adecuadas para su uso en la presente invención, así como métodos para producir moléculas que comprenden azida adecuadas para su uso en la presente invención. Algunas moléculas diana de interés en particular como el segundo reactivo incluyen aminoácidos y restos de aminoácido, polipéptidos (incluyendo péptidos y proteínas), azúcares o restos de azúcar, que contienen o que se modifican para que contengan al menos una azida. 55
Las moléculas diana pueden ser de origen natural, o se pueden producir de forma sintética o recombinante, y se pueden aislar, básicamente purificar, o estar presentes dentro del medio nativo de la molécula sin modificar en el que se basa la molécula diana que contiene azida (por ejemplo, en una superficie celular o dentro de una célula,
incluyendo dentro de un animal hospedador, por ejemplo, un animal mamífero, tal como un hospedador murino (por ejemplo, rata, ratón), hámster, canino, felino, bovino, porcino). En algunas realizaciones, la molécula diana está presente in vitro en una reacción libre de células. En otras realizaciones, la molécula diana está presente en una célula y/o se presenta en la superficie de una célula. En muchas realizaciones de interés, la molécula diana está en una célula viva; en la superficie de una célula viva; en un organismo vivo, por ejemplo, en un organismo pluricelular 5 vivo. Algunas células vivas adecuadas incluyen células que forman parte de un organismo pluricelular vivo; células aisladas de un organismo pluricelular; líneas celulares inmortalizadas.
Cuando la molécula diana es un polipéptido, el polipéptido puede estar formado por D-aminoácidos, L-aminoácidos, o ambos, y se puede modificar adicionalmente, de forma natural, de forma sintética, o de forma recombinante, para 10 que incluya otros restos. Por ejemplo, el polipéptido diana puede ser una lipoproteína, una glicoproteína, u otra proteína modificada.
En general, la molécula diana útil como el segundo reactivo comprende al menos una azida para la reacción con cicloalquino modificado de acuerdo con la invención, pero puede comprender 2 o más, 3 o más, 5 o más, 10 o más 15 azidas. El número de azidas que pueden estar presentes en una molécula diana variará de acuerdo con la aplicación pretendida del producto final de la reacción, la naturaleza de la molécula diana en sí misma, y otras consideraciones que serán fácilmente evidentes para un experto habitual en la materia en la práctica de la invención como se desvela en el presente documento.
20
Como se describe en el presente documento, el compuesto de la invención es útil en la modificación de una molécula diana in vivo. En esta realización, el sustrato diana se modifica para que comprenda un grupo azida hasta el punto en el que se desea la unión con el reactivo de cicloalquino modificado. Por ejemplo, cuando el sustrato diana es un polipéptido, el polipéptido se modifica para que contenga una azida N-terminal. Cuando el sustrato diana es una glicoproteína, se puede modificar un resto de azúcar de la glicoproteína para que contenga una azida. Una 25 molécula diana que está sin modificar con una azida, pero que se va a modificar con una azida, se denomina en el presente documento "sustrato diana". Una molécula diana que está modificada con una azida se denomina en el presente documento "una molécula diana modificada con azida" o "una molécula diana modificada con azida".
Modificación de azida de una molécula diana 30
El sustrato diana se puede generar in vitro y a continuación se puede introducir en la célula usando cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, microinyección, liposoma o administración mediana con lipofectina, electroporación, etc.), métodos que variarán de acuerdo con la naturaleza del sustrato al que dirigirse para modificación y un experto habitual en la materia no puede seleccionar de forma fácil y apropiada. El sustrato 35 diana final también se puede generar in vivo mediante la explotación de una maquinaria biosintética natural de la célula hospedadora. Por ejemplo, la célula se puede proporcionar con un derivado de azida biocompatible de un sustrato para síntesis de la molécula diana deseada, cuyo sustrato lo procesa la célula para proporcionar un derivado de azida del sustrato diana final deseado. Por ejemplo, cuando el sustrato diana es una glicoproteína de la superficie celular, la célula se puede proporcionar con un derivado de azida de un resto de azúcar encontrado dentro 40 de la glicoproteína, que a continuación lo procesa la célula a través de procesos biosintéticos naturales para producir una glicoproteína modificada que tiene al menos un resto de azúcar modificado que comprende un grupo azida accesible.
El sustrato día n se puede producir in vivo usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden 45 incorporar aminoácidos no naturales que tienen azidas en polipéptidos recombinantes expresados en E. coli (véase, por ejemplo, Kiick et al., (2000) Tetrahedron 56: 9487). Tales polipéptidos producidos de forma recombinante se pueden hacer reaccionar de forma selectiva con un reactivo de cicloalquino modificado de acuerdo con la invención.
En un ejemplo, se incorpora un grupo azida en la molécula diana proporcionando una célula (por ejemplo, una célula 50 eucariota que glicosila biopolímeros tales como proteínas) con un componente básico sintético para el sustrato diana de biopolímero deseado. Por ejemplo, la célula se puede proporcionar con una molécula de azúcar que comprende un grupo azida para proporcionar la incorporación del grupo azida en una glicoproteína. En algunas realizaciones, la glicoproteína se expresa en la superficie celular. Como alternativa, el grupo azida se puede incorporar en un aminoácido, que posteriormente se incorporan un péptido o polipéptido sintetizado por la célula. Existen varios 55 métodos disponibles para la incorporación de componentes básicos no naturales en biopolímeros; no es necesario quedar limitado a oligosacáridos de la superficie celular como molécula dianas. Véase, por ejemplo, van Hest et al., (1998) FEBS Lett. 428:68; y Nowak, et al., (1995) Science 268: 439.
En una realización, la molécula diana es una molécula que contiene carbohidrato (por ejemplo, una glicoproteína; un 60 polisacárido; etc.), y se introduce un grupo azida en la molécula diana usando un sustrato sintético. En algunas realizaciones, el sustrato sintético es un derivado de azida de un azúcar usado en la producción de una molécula glicosilada. En algunas realizaciones, el sustrato sintético es un derivado de azida de un azúcar usado en la producción de una molécula de superficie celular, por ejemplo, en la ruta de biosíntesis de glicoproteínas. Por ejemplo, la célula hospedadora se puede proporcionar con un derivado de azido sintético del ácido siálico, que se 65 incorpora en la ruta para la biosíntesis del ácido siálico, dando como resultado en ocasiones la incorporación del
resto de azúcar sintético en glicoproteínas. En algunas realizaciones, las glicoproteínas se presentan en la superficie celular.
En un ejemplo, el sustrato sintético es un derivado azido de la manosamina de fórmula general:
5
en la que n es de 1 a 6, generalmente de 1 a 4, más habitualmente de 1 a 2, y R1, R2, R3, y R4 son independientemente hidrógeno o acetilo. En algunas realizaciones, el sustrato es N-azidoacetilmanosamina (n = 1) o un derivado acetilado de la misma, o N-azidopropanoilmanosamina (n = 2) o una forma acetilada de la misma.
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En otra realización, el sustrato sintético es un derivado de azido azúcar de fórmula general, por ejemplo:
cualquiera de las cuales se puede incorporar en la ruta de biosíntesis del ácido siálico, y en las que n es de 1 a 6, 15 generalmente de 1 a 4, más habitualmente de 1 a 2, y R2, R3, y R4 son independientemente hidrógeno o acetilo.
En otra realización, el sustrato sintético es un derivado de azido azúcar de una fórmula general, por ejemplo:
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en las que R1, R2, R3, y R4 son independientemente hidrógeno o acetilo, y en las que el sustrato sintético se incorpora en las rutas biosintéticas que implican fucosa.
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En otra realización, el sustrato sintético es un derivado de azido azúcar de una fórmula general, por ejemplo:
en la que n es de 1 a 6, generalmente de 1 a 4, más habitualmente de 1 a 2, y R1, R2, R3, y R4 son independientemente hidrógeno o acetilo, y que se incorpora en rutas biosintéticas que implican galactosa. 5
Modificación de la superficie celular
En algunas realizaciones, el compuesto de la invención para uso en terapia o diagnóstico se usa para modificar la superficie de una célula. Por lo tanto, en el presente documento se describe un método para modificar la superficie 10 de la célula in vitro o in vivo. El método implica por lo general la reacción de un grupo azida en una molécula diana que comprende un grupo azida con un cicloalquino modificado para proporcionar un ligamiento quimioselectivo en la superficie celular. En muchas realizaciones, el método comprende la modificación de una molécula diana en una superficie celular con un grupo azida; y la reacción del grupo azida en la molécula diana con un cicloalquino modificado. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, se proporciona un azido azúcar a una célula viva, azido 15 azúcar que se incorpora en una glicoproteína que se presenta en la superficie celular.
Modificación de una molécula diana modificada con azida con marcas detectables; fármacos, y otras moléculas
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En algunas realizaciones, la presente invención proporciona la unión de una molécula de interés, por ejemplo, una molécula funcional, a una molécula diana modificada con azida. Los métodos implican por lo general la reacción de una molécula diana modificada con azida con un cicloalquino modificado objeto, en la que el cicloalquino modificado comprende una molécula de interés, como se ha descrito anteriormente. como sea descrito anteriormente, algunas moléculas de interés incluyen una marca detectable; una toxina (incluyendo citotoxinas); un conector; un péptido; un 25 fármaco; un miembro de un par de unión específico; una marca de epítopo.
Unión de moléculas dianas a un soporte
El cicloalquino modificado también puede comprender uno o más conectores de hidrocarburo (por ejemplo, un grupo 30 alquilo o derivado del mismo tal como un éster de alquilo) conjugado con un resto que proporciona la unión a un sustrato sólido (por ejemplo, para facilitar los ensayos), o a un resto que proporciona una separación fácil (por ejemplo, un hapteno reconocido por un anticuerpo unido a una perla magnética). En una realización, los métodos de la invención se usan para proporcionar la unión de una proteína (u otra molécula que contiene o que se puede modificar para que contenga una azida) a un chip en una orientación definida. Por ejemplo, se puede generar un 35 polipéptido que tiene una azida en un sitio seleccionado (por ejemplo, en o cerca del extremo N), y los métodos y composiciones de la invención usados para administrar una marca u otro resto a la azida del polipéptido. A continuación, la marca u otro resto se pueden usar como el sitio de unión para fijar el polipéptido a un soporte (por ejemplo, soporte sólido o semisólido, en particular un soporte adecuado para uso como un microchip en ensayos de alto rendimiento). 40
Unión de moléculas para administración a un sitio diana
En algunas realizaciones, el cicloalquino modificado comprenderá un fármaco de molécula pequeña, toxina, u otra molécula para su administración a una célula. En otras realizaciones, el fármaco de molécula pequeña, toxina u otra 45 molécula proporcionará una actividad farmacológica. En algunas realizaciones, el fármaco de molécula pequeña, toxina u otra molécula servirá como una diana para la administración de otras moléculas.
Algunos fármacos de molécula pequeña pueden ser compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños que tienen un peso molecular superior a 50 daltons e inferior a aproximadamente 2.500 daltons. Algunos fármacos de molécula 50 pequeña pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, en particular enlace de hidrógeno, y pueden incluir al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los fármacos pueden comprender carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas incluidas con uno o más de los grupos funcionales mencionados anteriormente. Algunos fármacos de molécula pequeña también se encuentran entre las 55 bio moléculas que incluyen péptidos, saca heridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
En otra realización, un cicloalquino modificado objeto comprende uno de un par de compañeros de unión (por ejemplo, un ligando; una parte de un receptor de unión a ligando; un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo de unión a antígeno; un antígeno; un hapteno; una lectina; un carbohidrato de unión a lectina; etc.). Por ejemplo, el cicloalquino modificado puede comprender un polipéptido que sirve como un receptor viral y, después de su unión con una proteína de envoltura viral o proteína de cápside viral, facilitar la unión del virus a la superficie celular en la 5 que se presenta el cicloalquino modificado. Como alternativa, el cicloalquino modificado comprende un antígeno que se une de forma específica con un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal), para facilitar la detección y/o separación de células hospedadoras que presentan el antígeno en la superficie celular. En otro ejemplo, el cicloalquino modificado comprende una parte de un receptor de unión a ligando, o una parte de un ligando de unión a receptor. 10
UTILIDAD
Algunos compuestos de cicloalquino modificado de objeto, y métodos de modificación objeto, son útiles en diversas aplicaciones, que incluyen aplicaciones en investigación y aplicaciones en diagnóstico. 15
Aplicaciones en investigación
En algunas realizaciones, algunos compuestos de cicloalquino modificado objeto, y métodos de modificación objeto, son útiles en aplicaciones en investigación. Algunas aplicaciones de interés incluyen aplicaciones en investigación, 20 por ejemplo, exploración de características funcionales y físicas de un receptor; proteómica; metabolómica. Algunas aplicaciones en investigación también incluyen descubrimiento de fármacos u otras aplicaciones en identificación sistemática.
La proteómica tiene como objeto detectar, identificar, y cuantificar proteínas para obtener información biológicamente 25 relevante. La metabolómica es la detección, identificación, y cuantificación de metabolitos ay otras moléculas pequeñas tales como lípidos y carbohidratos. Fiehn (2001) Comparative and Functional Genomics 2: 155-168; y Patente de Estados Unidos Nº 6.873.914.
Algunas aplicaciones en descubrimiento de fármacos incluyen la identificación de agentes que inhiben la viabilidad 30 y/o el crecimiento de células cancerígenas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar una gente que inhibe la viabilidad y/o el crecimiento de células cancerígenas. Los métodos implican generalmente la modificación de un componente de la célula para que comprenda un primer compañero reactivo que comprende una azida; poner en contacto la célula, en presencia de un agente de ensayo, con un segundo compañero reactivo que comprende un cicloalquino modificado, realizándose el contacto condiciones 35 fisiológicas; cuando la puesta en contacto da como resultado una reacción entre el grupo azida del primer compañero reactivo y el cicloalquino del segundo compañero reactivo, se modifica de este modo de forma sintética y covalente el componente celular; y determinar el efecto, si lo hubiera, de la gente de ensayo en el nivel de modificación de la célula con el segundo compañero reactivo.
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Cuando la célula cancerígena es una que produce una cantidad más elevada de un carbohidrato que una célula normal (no cancerígena) del mismo tipo, el método proporciona la identificación de un agente que reduce el crecimiento y/o viabilidad de la célula cancerígena.
Aplicaciones en diagnóstico y terapéuticas 45
Algunas aplicaciones de interés también incluyen aplicaciones en diagnóstico, por ejemplo, para detección de cáncer, en las que se usa un cicloalquino modificado objeto que comprende una marca detectable para marcar una molécula diana modificada con azida, por ejemplo, una molécula diana marcada con azida presente en una célula cancerígena. Algunas aplicaciones de interés también incluyen aplicaciones terapéuticas, en las que se administra 50 un fármaco u otro agente terapéutico a una molécula diana modificada con azida, usando un cicloalquino modificado objeto que comprende un fármaco unido coherentemente u otro agente terapéutico.
En algunas realizaciones, la presente invención se usa para formación de imágenes in vivo, por ejemplo, para determinar el estado metabólico u otro estado de una célula de un organismo, por ejemplo, un individuo. Como un 55 ejemplo, un método objeto se puede aplicar a la formación de imágenes in vivo de células cancerígenas en un individuo (por ejemplo, un mamífero, incluyendo roedores, lagomorfos, felinos, caninos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, primates no humanos, y seres humanos).
Una aplicación a modo de ejemplo de una cicloadición de azida-alquino objeto se encuentra en la detección de 60 cambios metabólicos en células que se produce a medida que alteran su fenotipo. Como un ejemplo, algunos patrones de glicosilación alterada son una evidencia del fenotipo tumoral, que consiste tanto en la sub como en la sobreexpresión de glicanos de origen natural así como la presentación de glicano que normalmente se limitan a la expresión durante el desarrollo embrionario. Algunos ejemplos de antígenos habituales asociados con células transformadas son sialil Lewis a, sialil Lewis x, sialil T, sialil Tn, y poliácido siálico (PSA). Jorgensen et al., (1995) 65 Cancer Res. 55, 1817-1819; Sell (1990) Hum. Pathology 21, 1003-1019; Taki et al., (1988) J. Biochem. 103, 998-
1003; Gabius (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1267-1276; Feizi (1991) Trends Biochem. Sci. 16, 84-86; Taylor-Papadimitriou y Epenetos (1994) Trends Biotech. 12, 227-233; Hakomori y Zhang (1997) Chem. Biol. 4, 97-104; Dohi et al., (1994) Cancer 73, 1552. Estos antígenos comparten una característica importante – cada uno de ellos contiene un ácido siálico terminal. El PSA es un homopolímero de restos de ácido siálico con una longitud de hasta 50 unidades. Los niveles elevados de ácido siálico se correlacionan en gran medida con el fenotipo 5 transformado en muchos cánceres, que incluyen cánceres gástrico (Dohi et al., (1994) Cancer 73, 1552; e Yamashita et al., (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87, 441-446), colon (Yamashita et al., (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87, 441-446; Hanski et al., (1995) Cancer Res. 55, 928-933; Hanski et al., (1993) Cancer Res. 53, 4082-4088; Yang et al., (1994) Glycobiology 4, 873-884; Saitoh et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 5700-5711), pancreático (Sawada et al., (1994) Int. J. Cancer 57, 901-907), hepático (Sawada et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 1425-1431), pulmón (Weibel 10 et al., (1988) Cancer Res. 48, 4318-4323), próstata (Jorgensen et al., (1995) Cancer Res. 55, 1817-1819), riñón (Roth et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2999-3000), y de mama (Cho et al., (1994) Cancer Res. 54, 6302-6305), así como varios tipos de leucemia (Joshi et al., (1987) Cancer Res. 47, 3551-3557; Altevogt et al., (1983) Cancer Res. 43, 5138-5144; Okada et al., (1994) Cancer 73, 1811-1816). También se observa una fuerte correlación entre el nivel de ácido siálico en la superficie celular y el potencial metastásico en varios tipos de tumores diferentes 15 (Kakeji et al., (1995) Brit. J. Cancer 71, 191-195; Takano et al., (1994) Glycobiology 4, 665-674). La presentación colectiva de múltiples antígenos sialilados en una sola célula cancerígena puede representar el hecho de que muchos tipos de tumores diferentes comparten el fenotipo elevado del ácido siálico expresar necesariamente un complemento idéntico de antígenos (Roth et al., (1988) mencionado anteriormente). En consecuencia, algunas estrategias de diagnóstico o terapéuticas que se dirigen a las células sobre la base de los niveles del ácido siálico 20 tienen una amplia aplicabilidad en muchos cánceres.
La introducción e incorporación de azidoazúcares no naturales (ManNAz, GalNAz) en animales vivos proporciona la detección de cambios en el estado metabólico. A través de la unión de la marca de epítopo apropiada, el ciclooctino modificado marca estas células en un organismo vivo, y en consecuencia detecta cambios en el estado metabólico. 25 La detección temprana de células tumorigénicas y la posterior intervención reduce la gravedad y aumenta las tasas de supervivencia para pacientes con cáncer.
Ejemplos
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Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la materia una completa divulgación y descripción de cómo preparar y usar la presente invención. Se ha hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deberían tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio en peso, la temperatura está en grados Celsius, y la presión es 35 la atmosférica o próxima a la misma. Se pueden usar abreviaturas convencionales, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s o seg, segundo(s); min, minuto(s); h o hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m., intramuscular(por vía); i.p., intraperitoneal(por vía); s.c., subcutánea(por vía).
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Ejemplo 1: Modificación de biomoléculas usando un ciclooctino modificado
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los reactivos químicos se adquirieron en Aldrich y se usaron sin purificación adicional. Todos los disolventes 45 se destilaron en una atmósfera de N2. CH2Cl2, tolueno, y piridina se secaron sobre CaH2. La cromatografía en capa fina se realizó en placas de gel de sílice Uniplate® de Analtech. La cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice de 230-400 de malla de 60 Å de Merck. Todos los espectros de RMN 1H y 13C se registraron en AVB-400® o DRX-500® de Bruker como se ha indicado. Los desplazamientos químicos de 1H se informan como δ haciendo referencia al disolvente y las constantes del acoplamiento (J) se informan en Hz. Los compuestos 1 y 4 se han 50 informado anteriormente. Skattebol y Solomon (1973) Organic Syntheses 5/Coll. Volúmenes: 306-310; y Wilbur et al., (1996) Bioconj. Chem. 7: 689-702.
Los medios de RPMI 1640 y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirieron en Invitrogen Life Technologies. El suero bovino fetal (FCS) era de Hyclone. La avidina conjugada con FITC y la albúmina de suero 55 bovino (BSA) se adquirieron en Sigma, y la anti-biotina de ratón conjugada con peroxidasa (HRP-α-biotina) y la Ig anti-humana de burro conjugada con peroxidasa (HRP-α-Ig) eran de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Los geles de poliacrilamida con Tris·HCl al 4-15 % fundidos previamente, nitrocelulosa, y Tween 20 (detergente no iónico) se adquirieron en BioRad. El tampón de separación Restore™ para transferencia de Western y el sustrato quimioluminiscente potenciado se obtuvieron en Pierce. Para experimentos de marcado celular, se usó un aparato 60 de recuento celular Coulter Z2 para determinar las densidades celulares. Los datos de citometría de flujo se registraron en un citómetro de flujo FACSCalibur de BD Biosciences equipado con un láser de argón de 488 nm, y las células vivas se analizaron tal como se determina mediante granularidad y tamaño. Para todos los experimentos de citometría de flujo, los puntos de datos se recogieron por triplicado.
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Síntesis de Compuestos:
Compuesto 2. AgCIO4 (1,16 g, 5,61 mmol) se añadió a una solución del compuesto 1 (500 mg, 1,87 mmol) y se 5 disolvió 4-hidroximetilbenzoato de metilo (4,66 g, 28,1 mmol) en tolueno (8 ml) en un matraz envuelto con un papel de aluminio, secado a la llama. La reacción se agitó durante 2 h, se diluyó con pentano (20 ml), y se filtró para retirar las sales de plata insolubles. La solución se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 4-8 %: éter de pet; Rf (EtOAc al 8 %: éter de pet) = 0,32) para producir 2 en forma de un aceite incoloro (660 mg 1,86 mmol, 99 %). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,02 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,47 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 6,21-(dd, 1 H, J = 4,0, 10 11,5 Hz), 4,72 (d, 1 H, J = 12,5 Hz), 4,39 (d, 1 H, J = 12,5 Hz), 3,95-3,91 (m, 4 H), 2,81 (dc ap, 1 H, J = 5,5, 12,.0), 2,32 (m, 1 H), 2,05-1,88 (m, 4 H), 1,75 (m, 1 H), 1,49 (dc ap, 1 H, J = 5,0, 8,0), 1,35 (m, 1 H), 0,79 (m, 1 H); RMN 13C (125 MHz, CDCl3) δ 166,93, 143,20, 132,60, 132,09, 129,66, 129,34, 127,65, 84,22, 69,61, 52,04, 39,48, 36,46, 33,31, 28,09, 26,29; IR (cm-1) 2931, 2856, 1724, 1614, 1434, 1279, 1109; FAB HRMS calculado para C17H23O3Br [M+H]+ 353,0752, encontrado 353,0744. 15
Compuesto 3. Una suspensión de NaOMe (119 mg, 2,20 mmol) en DMSO anhidro (8 ml) se añadió al compuesto 2 (650 mg, 1,84 mmol) disuelto en DMSO anhidro (16 ml). La reacción se agitó 20 min y se añadió NaOMe (110 mg, 20 1,10 mmol en 1,5 ml de DMSO) adicional. La reacción se agitó hasta que el material de partida se había consumido totalmente como se determina por TLC (20 min). La reacción se acidificó con HCl 1 M (100 ml) y se extrajo dos veces con EtOAc (40 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (40 ml) y se concentraron. La película resultante se disolvió en H2O al 20 %/dioxano (15 ml), se añadió LiOH (220 mg, 9,0 mmol), y la reacción se agitó durante 24 h. La reacción se acidificó con HCl 1 M (100 ml) y se extrajo dos veces con EtOAc (40 ml). Los 25 extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice (de EtOAc a 10:90:1: éter de pet: AcOH – a EtOAc: éter de pet: AcOH a 25:75:1; Rf (25:75:1) = 0,38) para producir 3 (350 mg, 1,36 mmol, 74 %) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 8,09 (d, 1 H, J = 8,50 Hz), 7,47 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,77 (d, 1 H, J = 12,5 Hz), 4,49 (d, 1 H, J = 13 Hz), 4,26 (m, 1 H), 2,32-2,26 (m, 1 H), 2,22-2,13 (m, 2 H), 2,08-2,03 (m, 1 H), 1,97-1,92 (m, 1 H), 1,89-1,83 (m, 2 H), 1,73-1,62 (m, 2 H) 1,52-1,44 30 (m, 1 H); RMN 13C (125 MHz, CDCl3) δ 171,52, 144,50, 130,27, 128,29, 127,46, 100,69, 92,40, 72,11, 70,39, 42,31, 34,26, 29,68, 26,31, 20,70; IR (cm-1) 2924, 2852, 2672, 2561, 1685, 1429, 1323, 1294, 1086; FAB HRMS calculado para C16H18O3Li [M+Li]+ 265,1416, encontrado 265,1422.
35
Compuesto 5. Se añadió trifluoroacetato pentafluorofenilo (Pfp-TFA) (40 µl, 0,23 mmol) al compuesto 3 en piridina anhidra (1 ml). La reacción se agitó durante 4 h, se diluyó con CH2Cl2 (30 ml), y se extrajo con HCl 1 M (3 x 20 ml) y solución sat. de NaHCO3 (2 x 20 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El éster en bruto se disolvió en CH2Cl2 (2 ml). Trietilamina (67 µl, 0,46 mmol) y el compuesto 4 (104 mg 0,23 mmol) se 40 añadieron y la solución se agitó durante 1 h. La solución se concentró y el producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc:MeOH:H2O a 80:15:5, Rf = 0,40) para producir 5 (68 mg, 0,099 mmol, 51 %) en forma de un aceite transparente. RMN 1H (400 MHz, CD3CN) δ 7,80 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,42 (m, 3 H), 6,62 (s a, 1 H), 5,51 (s, 1 H), 5,19 (s, 1 H), 4,66 (d, 1 H, J = 12,0 Hz), 4,45-4,40 (m, 2 H), 4,29-4,26 (m, 2 H), 3,62-3,56
(m, 8 H), 3,52-3,49 (m, 2 H), 3,47-3,42 (m, 4 H), 3,22-3,13 (m, 3 H), 2,91-2,87 (m, 2 H), 2,66 (d, 1 H, J = 12,8 Hz), 2,32-2,19 (m, 6 H), 1,89-1,79 (m, 4 H), 1,75-1,34 (m, 10 H); RMN 13C (125 MHz, CD3CN) δ 172,64, 166,56, 162,93, 141,82, 134,15, 127,47, 127,05, 100,31,92,63, 71,94, 70,12, 69,94, 69,83, 69,16, 68,75, 61,37, 59,80, 55,36, 42,14, 40,18, 37,53, 36,56, 35,45, 34,12, 29,56, 29,32, 29,26, 28,02, 27,98, 26,18, 25,46, 20,13; FAB HRMS calculado para C36H55N4O7S [M+H]+ 687,3791, encontrado 687,3798. 5
Compuesto 6. El compuesto 4 (46 mg, 0,10 mmol), ácido pentinoico (15 mg, 0,15 mmol) y HATU (59 mg, 0,15 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (1 ml). Se añadió trietilamina (22 µl, 0,15 mmol) a la solución y la reacción 10 se agitó durante 14 h. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (de EtOAc:MeOH:H2O a 15:2:1 a EtOAc:Me-OH:H2O a 9:2:1 Rf (9:2:1) = 0,30) proporcionó 6 (25 mg, 0,047 mmol, 46 %) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CD3CN) δ 6,77 (s a, 2 H), 5,74 (s, 1 H), 5,38 (s, 1 H), 4,44 (t ap, 1 H, J = 7,6 Hz), 4,27 (m, 1 H), 3,61-3,54 (m, 8 H), 3,51 (t, 4 H, J = 6,4 Hz), 3,25-3,16 (m, 5 H), 2,91 (dd, 1 H, J = 4,8, 12,4 Hz), 2,68 (d, 1 H, J = 12,8 Hz), 2,47 (m, 2 H), 2,35-2,30 (m, 6 H), 2,22 (t, 1 H, J = 2,8 Hz), 2,17 (t, 2 H, J = 7,2 Hz), 1,75-1,53 15 (m, 8 H), 1,44-1,37 (m, 2 H); RMN 13C (100 MHz, CD3CN) δ 172,79, 170,74, 163,21, 83,53, 70,10, 69,82, 69,10, 68,71, 68,60, 61,46, 59,87, 55,41, 40,18, 36,49, 35,47, 34,69, 29,32, 29,29, 28:07, 28,01, 25,48, 14,32; FAB LRMS calculado para C25H43N4O6S [M+H]+ 527,4, encontrado 527,4.
Análisis de transferencia de Western de una GlyCAM-Ig marcada con azida 20
Para el análisis de transferencia de Western de GlyCAM-Ig marcada con azida y sin marcar, las muestras se incubaron con 5 (concentración final 250 µM en PBS, pH 7,4 que contiene DMF al 0,7 %), 6 (concentración final 250 µM en PBS, pH 7,4 que contiene DMF al 0,7 %) o se dejó sin tratar durante 12 h. Para verificar que 6 podía reaccionar con GlyCAM-Ig marcada con azida mediante cicloadición mediada con cobre [3+2], los inventores usaron 25 una versión modificada del método informado por Speers y Cravatt. Speers y Cravatt (2004) Chem. Biol. 11: 535-46. En resumen, las muestras de GlyCAM-Ig (en PBS, pH 7,4 que contiene DMF al 0,7 %) se incubaron con el compuesto 6 250 µM, TCEP 2,5 mM, ligando de tris-triazolilo 250 µM (de una solución de reserva 1,7 mM en DMSO:terc-butanol a 1:4), y CuSO4 2,5 mM. Las muestras se sometieron a agitación vorticial y se permitió que reaccionaran a ta durante 12 h. Antes de la electroforesis, las nuestras incubaron con un volumen igual de 2-30 azidoetanol 100 mM en 2 X de tampón de carga SDS-PAGE durante 8 h a ta (para inactivar los compuestos 5 o 6 sin reaccionar). Las muestras en activadas se hirvieron durante 3 min y se cargaron en geles de poliacrilamida fundidos previamente. Después de la electroforesis, las muestras se electrotransfirieron a membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó usando BSA al 5 % en PBS (pH 7,4, que contiene Tween 20 al 0,05 % (tampón de bloqueo A) durante 1 h a ta, a continuación se inactivaron con una solución de tampón de bloqueo A que contiene HRP-α-35 biotina (dilución a 1:250.000, 1 h a ta). La membrane se lavó, y la detección de anti-biotina-HRP se consiguió por quimioluminiscencia. Después de la detección, la membrana se aclaró con PBS (pH 7,4) que contenía Tween al 0,05 % (PBS-T) y se colocó en tampón de separación (15 min a TA) para retirar la Ig anti-biotina unida. La membrana se aclaró minuciosamente con PBS-T y se investigó la señal anti-biotina residual por quimioluminiscencia.
40
La membrana se lavó y se volvió a bloquear con leche en polvo seca con bajo contenido de grasa al 5 % (tampón del bloqueo B) durante 1 h a ta. A continuación, la membrana se incubó con HRP-α-Ig (1:5000 en tampón de bloqueo B) durante 1 h a ta. La membrana se lavó de nuevo con PBS-T, y la detección de Ig anti-humana unida a la membrana se consiguió como para la anti-biotina conjugada con peroxidasa. Las muestras de control se trataron de una manera idéntica, excepto en que los reactivos específicos se sustituyeron por el tampón cuando era apropiado. 45
Condiciones de cultivo celular
Las células Jurkat (linfoma de linfocitos T humano) se mantuvieron en una atmósfera de CO2 al 5 %, saturada con agua y se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con FCS al 10 %, penicilina (100 unidades/ml) y 50 estreptomicina (0,1 mg/ml). Las densidades celulares se mantuvieron entre 1 x 105 y 1,6 x 106 células/ml para todos los experimentos.
Marcado y detección de azida de superficie celular
55
Las células Jurkat cells se sembraron a una densidad de 1,5-2,0 x 105 células/ml y se incubaron durante 3 d en medios sin tratar o medios que contenían diversas concentraciones de Ac4ManNAz. Después del crecimiento en presencia de Ac4ManNAz, las células se distribuyeron en una placa de cultivo tisular con fondo de V de 96 pocillos. Las células se sedimentaron (3500 rpm, 3 min) y se lavaron dos veces con 200 µl de tampón de marcado (PBS, pH 7,4 que contiene FCS al 1 %). A continuación, las células se incubaron con el compuesto 5 o una sonda de 60 fosfina biotinilada (Vocadlo et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 9116-21) en tampón demarcado que
contiene DMF al 2,8 % o tampón de marcado más DMF al 2,8 % solo. Después de la incubación, las células se sedimentaron, se lavaron dos veces con tampón de marcado y se volvieron a suspender en el mismo tampón que contenía FITC-avidina (dilución a 1:500 de la solución de reserva de Sigma). Después de un periodo de incubación de 10 min en hielo (en la oscuridad), las células se lavaron con 200 µl de tampón de marcado frío y el procedimiento de tinción con FITC-avidina se repitió. Las células se lavaron dos veces con tampón de marcado frío, a continuación 5 se diluyeron hasta un volumen de 400 µl para análisis de citometría de flujo.
Resultados
El ciclooctino biotinilado 5 tal como se sintetiza se muestra en el Esquema 1. 10
La construcción del núcleo de ciclooctino sustituido se consiguió básicamente como se describe en Reese y Shaw. Reese y Shaw (1970) Chem. Comm. 1172-1173. En resumen, el compuesto 1 (Skattebol y Solomon, mencionado 15 anteriormente) se trató con perclorato de plata para realizar la apertura electrocíclica del anillo para el catión trans-alílico, que se capturó con hidroximetilbenzoato de metilo para proporcionar el bromo-trans-cicloocteno 2. La eliminación mediada con base del bromuro de vinilo seguido de saco ni a que un proporcionó el compuesto intermedio 3 versátil, al que se puede acoplar cualquier sonda biológica. Por último, el compuesto 3 se acopló al análogo de biotina 4 (Wilbur et al., (1996) Bioconj. Chem. 7: 689-702) que porta un conector de PEG, 20 proporcionando la diana 5. El ciclooctino 3 era estable en ácido suave (HCl 0,5 N durante 30 min), base (NaOMe 0,8 M durante 30 min), y exposición prolongada a nucleófilos biológicos tales como tioles (2-mercaptoetanol 120 mM durante 12 h).
Las reacciones modelo se realizaron con el compuesto 3 y 2-azidoetanol, bencilazida o N-butil α-azidoacetamida. En 25 todos los casos, los únicos productos observados eran los dos triazoles regioisoméricos formados en cantidades aproximadamente iguales. A continuación, la reacción se aplicó para marcado covalente de biomoléculas. La glicoproteína recombinante GlyCAM-Ig (Bistrup et al., (1999) J. Cell Biol. 145: 899-910) se expresó en células CHO en presencia de N-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz), conduciendo a la incorporación metabólica del ácido N-azidoacetil siálico correspondiente (SiaNAz) en sus glicanos. Las muestras de control de GlyCAM-Ig se 30 expresaron en ausencia de azúcar de azido. Las muestras de GlyCAM-Ig purificada se incubaron con el compuesto 5 250 µM durante una noche, el ciclooctino sin reaccionar se inactivó con exceso de 2-azidoetanol, y las muestras se analizaron mediante sondeo con transferencia de Western con HRP-α-biotina (Fig. 2). Se observó una biotinilación fuerte para GlyCAM-Ig modificada con SiaNAz. Las azidas que carecen de GlyCAM-Ig nativa no mostraron marcado de fondo, lo que enfatiza la exquisita selectividad de la cicloadición estimulada con cepa. 35
Como un punto de comparación, se realizaron reacciones similares con el alquino 6 terminal modificado con biotina (Esquema 1). En ausencia de reactivos para catálisis con cobre, no se observó marcado de glicoproteína (Fig. 2). Como se esperaba, basándose en los informes anteriores (Sharpless y Finn (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 3192-3193; y Speers y Cravatt ((2004) Chem. Biol. 11: 535-546), la adición de CuSO4, TCEP y un ligando de triazolilo dio 40 como resultado un marcador fácil de la glicoproteína marcada con azida. La transferencia se destiló y se volvió a sondear con anticuerpo anti-IgG marcado con HRP (HRP-α-IgG) para confirmar una carga de proteína igual. De forma interesante, se observó disminución de la inmunorreactividad de anti-IgG de forma incoherente para GlyCAM-Ig modificada con azida marcada con el compuesto con 6 en presencia de cobre. Es posible que la combinación de los productos de triazol y cobre dañe el epítopo reconocido por HRP-α-IgG. 45
Por último, se investigó la utilidad de la reacción estimulada con cepa para el marcado de células vivas. Las células Jurkat se incubaron con Ac4ManNAz 25 µM durante 3 d para introducir restos de SiaNAz en sus glicoproteínas de superficie celular. Saxon y Bertozzi (2000) Science 287: 2007-2010; y Saxon et al., 92002) J. Am. Chem. Soc. 124: 14893-14902. Las células se hicieron reaccionar con diversas concentraciones del compuesto 5 durante 1,5 h a ta, y a continuación se tiñeron con FITC-avidina y se analizaron mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la 5 Fig. 3A, las células que presentan azidas mostraban un aumento dependiente de la dosis con fluorescencia después del tratamiento con la sonda de ciclooctino. No se observó marcado detectable de las células que carecen de azidas. La reacción de la superficie celular también dependía de la duración de la incubación con el compuesto 5 (Fig. 3B) y la densidad de las azidas de la superficie celular. No se observaron efectos negativos en la viabilidad celular.
10
Figura 2. Marcado de GlyCAM-Ig modificará con azida con sondas de alquino. La GlyCAM-Ig purificada se trató con tampón (-), compuesto 5 250 µM, o compuesto 6 250 µM solo o en presencia (cat) de CuSO4, TCEP, y un ligando de triazolilo, durante una noche a ta. Las mezclas de reacción se inactivaron con 2-azidoetanol y se analizaron mediante sondeo de transferencia de Western con HRP-α-biotina (panel superior). A continuación, la transferencia se separó y se volvió a sondear con HRP-α-Ig (panel inferior). 15
Figuras 3A y 3B. Marcado de superficie celular con el compuesto 5. Las células Jurkat se incubaron en presencia (+Az) o ausencia (-Az) de Ac4ManNAz 25 µM durante 3 d. Figura 3A. Las células se hicieron reaccionar con diversas concentraciones del compuesto 5 durante 1 h a ta y se trataron con FITC-avidina; la intensidad de fluorescencia media (MFI) se determinó mediante citometría de flujo. Figura 3B. Las células se incubaron con el compuesto 5 20 250 µM para diversas dotaciones a ta y se analizaron como en A. C. Las células se incubaron con sonda 100 µM durante 1 h a ta y se analizaron como en A. Las barras de error representan la desviación estándar de tres replicados. AU = unidades de fluorescencia arbitrarias.
El ejemplo mencionado anteriormente demuestra que la cicloadición [3+2] de azidas y derivados de ciclooctino 25 (ciclooctinos modificados) de acuerdo con un método objeto se produce fácilmente en condiciones fisiológicas en ausencia de reactivos auxiliares; y que la modificación química selectiva de células vivas usando un método objeto se produce sin ninguna toxicidad aparente.
Ejemplo 2: Síntesis de compuestos adicionales de ciclooctino y su uso en el marcado de células vivas 30
Este ejemplo presenta la síntesis de los compuestos 3a y 3b (se muestran a continuación), la evaluación de sus parámetros cinéticos en reacciones con azidas orgánicas pequeñas, y su uso en el marcado bioortogonal de células vivas.
35
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los reactivos químicos tenían calidad analítica, se obtuvieron en proveedores comerciales, y se usaron sin 40 purificación adicional a menos que se indique de otro modo. Con la excepción de las reacciones realizadas en medios acuosos, todos los recipientes de reacción se secaron a la llama antes de su uso. Las reacciones se realizaron en una atmósfera de N2, excepto en el caso de reacciones realizadas en medios acuosos, y los reactivos líquidos se añadieron con una jeringa a menos que se indique de otro modo. El tetrahidrofurano (THF) se destiló en atmósfera de N2 a partir de Na/benzofenona inmediatamente antes de su uso, y CH2Cl2 se destiló a partir de CaH2 45 inmediatamente antes de su uso. La cromatografía se realizó con gel de sílice de malla 230-400 Merck 60 de acuerdo con el procedimiento que se describe en Still. J. Org. Chem. (1978) 43: 2923-2925. Las reacciones y las fracciones de cromatografía se analizaron con placas G en gel de sílice de 250 micrómetros de Analtech, y se visualizaron mediante tinción con molibdato de cerio y amonio o mediante la absorbancia de la luz UV a 245 nm. Cuando se informa de un Rf para un compuesto, el disolvente que se usó era el disolvente de la cromatografía a 50 menos que se indique de otro modo. Los extractos orgánicos se secaron sobre MgSO4 y los disolventes se retiraron en un rotavapor a presión reducida (2,7 kPa), a menos que se indique de otro modo. Los espectros de IR eran de películas finas en placas de NaCl. A menos que se indique de otro modo, los espectros de RMN 1H, 13C, y 19F se obtuvieron con espectrómetros Bruker a 300 MHz o 400 MHz. Los desplazamientos químicos se informan en δ ppm haciendo referencia al pico del disolvente para 1H y 13C y con respecto a CFCl3 la 19F. las constantes de 55
acoplamiento (J) se informan en Hz. Los espectros de masas de bombardeo atómico rápido de resolución baja y alta (FAB) e impacto electrónico (EI) se obtuvieron en las Instalaciones de Espectrometría de Masas de UC Berkeley, y los análisis elementales se obtuvieron en las Instalaciones de Espectrometría de Masas de UC Berkeley. Los puntos de fusión se determinaron usando un aparato de punto de fusión Mel-Temp 3.0 y están sin corregir.
5
Procedimientos de Síntesis
(Ciclooct-1-eniloxi)-trimetilsilano (6). A una solución de ciclooctanona (40,0 g, 316 mmol) en 200 ml de DMF 10 anhidra se añadieron trietilamina (TEA, 93,0 ml, 666 mmol) y clorotrimetilsilano (84,0 ml, 666 mmol). La reacción se calentó a reflujo. Después de 15 h, la reacción se interrumpió con 20 ml de H2O y la DMF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con hexanos (300 ml), se lavó con H2O (3 x 100 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4. La destilación a presión reducida (2,7 kPa) proporcionó 58,1 g (93 %) del producto deseado en forma de un aceite incoloro, pe 108 ºC (2,7 kPa) (lit. 106 ºC a 3,3 kPa). Nakamura et al., J. Am. Chem. Soc. (1976) 98, 2346-15 2348. IR: 2926, 2851, 1661 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz): δ 0,20 (s, 9H), 1,39-1,58 (m, 8H), 2,02 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 4,75 (t, 1H, J = 9,0 Hz). (Lit: RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 0,16 (s, 9H), 1,46 (m, 4H), 1,49 (m, 2H), 1,55 (m, 2H), 1,97 (m, 2H), 2,14 (m, 2H), 4,70 (t, 1H, J = 8,0 Hz) (Frimer et al., J. Org. Chem. (2000) 65, 1807-1817.) RMN 13C (CDCl3, 75 MHz): δ 0,4, 25,5, 26,3, 26,4, 27,8, 30,9, 31,0, 105:41, 152,99, (Lit: RMN 13C (CDCl3, 150 MHz): δ 0,45, 25,52, 26,36, 26,40, 27,83, 30,98, 31,05, 105,45, 153,05) Frimer et al., (2000) mencionado anteriormente) 20 FAB-HRMS: Calculado para C11H23OSi+ [M+H]+: 199:1518, encontrado 199,1520.
2-Fluorociclooctanona (5b). A una solución de silil enol éter 6 (57,8 g, 291 mmol) en DMF (350 ml) se añadió una 25 solución de Selectfluor (124 g, 349 mmol) en DMF (150 ml) durante 1 h a ta. La solución se dejó en agitación durante 12 h. La reacción se interrumpió con 30 ml de H2O, y la DMF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con hexanos (500 ml), se lavó con H2O (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4. Después de cromatografía en columna (pentano/éter de 30:1 a 15:1), se aisló un sólido de color blanco (38,4 g, 91 %, Rf = 0,30 en pentano/éter a 9:1), p.f. 48,1-49,8 ºC. IR: 3429, 2932, 2859, 1721, 1709 cm-1. (Lit: 1710 cm-1) (Rozen y Menahem. 30 J. Fluorine Chem. (1980), 16, 19-31). RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 1,25 (m, 1H), 1,38-1,55 (m, 4H), 1,61 (m, 1H), 1,73 (m, 1H), 2,05 (m, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 4,86 (ddd, 1H, J = 49,6, 6,4, 2,8 Hz). (Lit: RMN 1H (CDCl3, 250 MHz): δ 1,36-2,7 (m, 12H), 4,9 (dm, 1H, J = 49,5 Hz) (Chambers y Hutchinson J. Fluorine Chem. (1998) 89, 229-232) RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 20,3 (d, J = 4,0 MHz), 24,4 (d, J = 6,0 Hz), 24,5, 26,9, 32,2 (d, J = 11,0 Hz), 39,3, 94,7 (d, J = 185,0 Hz), 213,4 (d, J = 21,0 Hz). (Lit: RMN 13C (CDCl3, 50 MHz): δ 20,5 (d, J = 3,6 Hz), 24,6 (d, 35 J = 3,7 Hz), 24,7, 27,2, 32,7 (d, J = 21,0 Hz), 39,6, 91,5 (d, J = 184,7 Hz), 213,9 (d, J = 20,9 Hz) (Chambers y Hutchinson (1998) mencionado anteriormente) RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ - 190,7 (m). (Lit: RMN 19F (CDCl3, 235 MHz): δ - 191,6 (m) (Chambers y Hutchinson (1998) mencionado anteriormente)
Éster de metilo del ácido 4-(1-fluoro-2-oxo-ciclooctilmetil)benzoico (4b). A una solución de LDA (34 ml, 61 mmol, solución 1,8 M en heptano/THF/etilbenceno) en THF (50 ml) a -78 ºC se añadió una solución de 2-fluorociclooctanona (5b) (7,38 g, 51,2 mmol) en THF (50 ml) durante 2 h usando una bomba de jeringa. Después de 5 1 h, se añadió una solución de 4-bromometil-benzoato de metilo (17,6 g, 76,8 mmol) en THF (50 ml) y la reacción se dejó calentar a ta. Después de 1 h, la mezcla de reacción se inactivó con H2O (50 ml) y the THF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con H2O (3 x 100 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4. Después de cromatografía en columna (hexanos/EtOAc de 50:1 a 15:1), se aisló un sólido de color blanco (6,45 g, 43 %, Rf = 0,35 en hexanos/EtOAc a 9:1), p.f. 53,5-55,2 ºC. IR: 2931, 2858,1721 cm-1. RMN 1H 10 (CDCl3, 400 MHz): δ 1,08 (m, 1H), 1,35-1,65 (m, 7H), 1,86 (m, 2H), 2,04 (d ap, 2H, J = 9,0 Hz), 2,90 (dd, 1H, J = 20,1, 14,1 Hz), 3,14 (dd, 1H, J = 28,2, 14,1 Hz), 3,78 (s, 3H), 7,15 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 7,83 (d, 2H, J = 8,4 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 21,1, 24,7, 25,3, 27,6, 38,7 (d, J = 22,0 Hz), 40,0, 43,4 (d, J = 21,0 Hz), 51,9, 102,3 (d, J = 189,0 Hz), 128,7, 129,3, 130,5, 140,3, 166,8, 216,0 (d, J = 26,0 Hz). RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ -166,0 (m). FAB-HRMS: Calculado para C17H22O3F+ [M+H]+: 293,1553, encontrado: 293,1560. 15
Éster de metilo del ácido 4-(1-fluoro-2-trifluorometanosulfoniloxi-ciclooct-2-enilmetil)-benzoico (7b). A una solución de cetona 4b (4,62 g, 15,8 mmol) en THF (50 ml) a - 78 ºC se añadió hexametildisilazida potásica (KHMDS, 20 35,0 ml, 17,5 mmol, solución 0,50 M en tolueno). Después de 1 h, se añadió una solución de N-Fenilbistrifluorometanosulfonimida (Tf2NPh, 6,18 g, 17,3 mmol) en THF (25 ml) y la reacción se dejó calentar a ta. Después de 30 min, la mezcla de reacción se concentró en un rotavapor y el producto se purificó por cromatografía en columna (hexanos/EtOAc de 20:1 a 12:1) para producir el producto deseado (4,90 g, 73 %, Rf = 0,30 en hexanos/EtOAc a 9:1) en forma de un aceite incoloro. IR: 3424, 2952, 1723, 1646 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 25 1,38-1,67 (m, 4H), 1,74-1,97 (m, 4H), 1,97-2,18 (m, 2H), 3,16 (d ap, 1H, J = 3,2 Hz), 3,20 (s, 1H), 3,91 (s, 3H), 5,86 (t, 1H, J = 9,6 Hz), 7,26 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,96 (d, 2H, J = 8,4 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 22,0, 22,1, 23,1, 25,2, 35,1 (d, J = 22,0 Hz), 44,3 (d, J = 26,0 Hz), 52,0, 95,7 (d, J = 177,0 Hz), 118,4 (c, J = 317,0 Hz), 123,8, 129,1, 129,4, 130,5, 139,7 (d, J = 8,0 Hz), 148,2 (d, J = 21,0 Hz), 166,8. RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ -73,7 (d ap, 3H, J = 3,8 Hz), -144,3 (d ap, 1H, J = 3,8 Hz). FAB-HRMS: Calculado para C18H21O5F4S+ [M+H]+: 425,1046, encontrado: 30 425,1046.
Éster de metilo del ácido 4-(1-fluoro-ciclooct-2-inilmetil)benzoico (8b). A una solución de triflato de vinilo 7b (14,3 g, 33,5 mmol) en THF (100 ml) a 0 ºC se añadió LDA (23,5 ml, 35,2 mmol, 1,8 M en heptano/THF/etil benceno) gota a gota, usando una bomba de jeringa, durante 3 h. LDA se añadió hasta que el material de partida se consumió. 5 La reacción se interrumpió con 20 ml de H2O y el THF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con EtOAc (300 ml), se lavó con H2O (3 x 100 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4, Después de cromatografía sobre gel de sílice (hexanos/EtOAc de 50:1 a 25:1), se aisló un aceite incoloro (5,41 g, 59 %, Rf = 0,40 en hexanos/EtOAc a 9:1). IR: 3421, 2930, 2854, 2223, 1721, 1613 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz): δ 1,35 (m, 1H), 1,66-1,76 (m, 2H), 1,76-2,07 (m, 4H), 2,07-2,33 (m, 3H), 3,03 (d ap, 1H, J = 2,1 Hz), 3,10 (s, 1H), 3,90 (s, 3H), 7,37 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 10 7,98 (d, 2H, J = 8,1 Hz). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz): δ 20,5, 26,0 (d, J = 1,5 Hz), 29,4, 34,0, 44,7 (d, J = 26,0 Hz), 48,8 (d, J = 25,0 Hz), 51,9, 90,5 (d, J = 32,0 Hz), 95,2 (d, J = 175,0 Hz), 104,5 (d, J = 11,0 Hz), 128,6, 129,3, 130,3, 141,2, 167,0. RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ -139,0 (m). FAB-HRMS: Calculado para C17H20O2F+ [M+H]+: 275,1447, encontrado: 275,1442.
15
Ácido 4-(1-fluoro-ciclooct-2-inilmetil)benzoico (3b). A una solución del ciclooctino 8b (1,8 g, 6,6 mmol) en dioxano (30 ml) y H2O (7,5 ml) se añadió LiOH finamente triturado (3,1 g, 130 mmol). La suspensión se calentó a 50 ºC y se agitó durante 3 h. El dioxano se retiró en un rotavapor y la mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 20 (100 ml). La fase orgánica se lavó con HCl 1 N (2 x 100 ml), H2O (3 x 100 ml), y salmuera (1 x 25 ml), y se secó sobre MgSO4, proporcionando un sólido de color blanco (1,7 g, 98 %, Rf = 0,30 en hexano/EtOAc/AcOH a 27:3:1), p.f. 132,0-132,5 ºC (desc.). IR: 3442, 2926, 2851, 2674, 2557, 2224, 1686, 1611 cm-1. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1,39 (quintuplete ap, 1H, J = 7,6 Hz), 1,64 (m, 2H), 1,76 (m, 2H), 2,10 (m, 5H), 3,07 (s, 1H), 3,11 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,38 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,87 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 12,9 (s a, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz): δ 25 19,8, 25,7, 29,0, 33,7, 43,7 (d, J = 25,0 Hz), 47,6 (d, J = 25,0 Hz), 90,7 (d, J = 32,0 Hz), 95,4 (d, J = 173,0 Hz), 104,5 (d, J = 10,0 Hz), 129,0, 129,2, 130,4, 141,2, 167,2, RMN 19F (CD3CN, 376 MHz): δ -139,4 (m). FAB-HRMS: Calculado para C16H18O2F+ [M+H]+: 261,1291, encontrado: 261,1291, Anál. calc. para C16H17O2F: C, 79,31; H, 7,49, Encontrado: C, 79,07; H, 7,26.
30
Trifluoroacetato de 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propilamonio (13). A una solución de maleimida (3,12 g, 32,2 mmol) y PPh3 (8,29 g, 31,6 mmol) en THF (150 ml) se añadió N-(t-butoxicarbonil)propanolamina (5,00 ml, 29,3 mmol) y a continuación azodicarboxilato de diisopropilo (6,80 ml), 35,1 mmol). La solución se agitó a ta durante 48 h, se concentró en un rotavapor, y se purificó por cromatografía en columna (hexanos/EtOAc de 4:1 a 2:1) para producir 10,3 g de una mezcla del producto protegido con N-Boc y hidrazinadicarboxilato de diisopropilo. La mezcla 5 se disolvió en una solución de CH2Cl2 (60 ml) y H2O (5 ml), y a continuación se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 35 ml). La reacción se agitó durante 5 h a ta y a continuación se diluyó con CH2Cl2 (50 ml) y H2O (50 ml). La fase acuosa se lavó con CH2Cl2 (3 x 50 ml) y a continuación se concentró para producir el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo (7,51 g, 96 %). IR: 3435, 2959, 2917, 2849, 1707, 1683 cm-1. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1,76 (c ap, 2H, J = 7,2 Hz), 2,78 (m, 2H), 3,45 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 7,02 (s, 2H), 7,79 (s a, 3H). RMN 13C 10 (DMSO-d6, 100 MHz): δ 26,7, 34,6, 37,0, 116,0 (c, 289,0 Hz), 134,7, 158,9 (c, J = 36,0 Hz), 171,3, RMN 19F (DMSO-d6, 376 MHz): δ -72,9 (s). FAB-HRMS: Calculado para C7H11N2O2+[M+H]+: 155,0821, encontrado: 155,0824.
15
N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propil]-4-(1-fluorociclooct-2-inilmetil)benzamida (12b). TEA (0,508 ml, 3,65 mmol) se añadió a una solución del ciclooctino 3b (0,200 g, 0,768 mmol), amina 13 (0,235 g, 0,875 mmol), hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N-tetrametiluronio (HATU, 0,305 g, 0,802 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 0,123 g, 0,802 mmol) en CH2Cl2 (3 ml) a ta. La reacción se agitó durante 15 min a ta, se inactivó con H2O (10 ml), y se diluyó con CH2Cl2 (50 ml). La fase orgánica se lavó con HCl 1 N (3 x 50 ml), NaHCO3 20 saturado (3 x 50 ml), y salmuera (2 x 25 ml) y se secó sobre MgSO4. La cromatografía del producto en bruto (hexanos/EtOAc de 2:1 a 1:1) proporcionó el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (0,198 g, 65 %, Rf = 0,30 en hexanos/EtOAc a 1:1), p.f. 122,0-124,0 ºC (desc.). IR: 3413, 2931, 2854, 2222, 1705, 1640 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 1,39 (m, 1H), 1,74 (m, 2H), 1,81-2,06 (m, 6H), 2,14-2,32 (m, 3H), 3,05 (d, 1H, J = 2,8 Hz), 3,09 (s, 1H), 3,40 (c, 2H, J = 6,4 Hz), 3,67 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,75 (s, 2H), 6,93 (m, 1H), 7,41 (d, 2H, 25 J = 8,0 Hz), 7,81 (d, 2H, J = 8,0 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 20,5, 26,0, 28,1, 29,4, 34,0, 34,8, 36,2, 44,6 (d, J = 25,0 Hz), 47,8 (d, J = 24,0 Hz), 90,7 (d, J = 32,0 Hz), 95,3 (d, J = 174,0 Hz), 104,5 (d, J = 10,0 Hz), 126,7, 130,5, 132,9, 134,2, 139,6, 167,1, 171,1, RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ -139,0 (m). FAB-HRMS: Calculado para C21H26N2O3F+ [M+H]+: 397,1927, encontrado: 397,1920.
30
Éster de metilo del ácido 4-(2-oxo-ciclooctilmetil)benzoico (4a). A una solución en agitación de ciclooctanona (1,76 g, 14,0 mmol) en THF (30 ml) a -78 ºC se añadió LDA (8,54 ml, 15,4 mmol, 1,8 M en heptano/THF/etilbenceno). Después de 1 h, se añadió una solución de 4-bromometilbenzoato de metilo (3,53 g, 15,4 35 mmol) en THF (10 ml) y la mezcla de reacción se dejó calentar a ta. Después de 30 min, la reacción se interrumpió con H2O (10 ml) y el THF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con EtOAc (100 ml), se lavó con H2O (3 x 100 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4. La cromatografía del producto en bruto (hexanos/EtOAc de 50:1 a 9:1) proporcionó el producto deseado en forma de un aceite incoloro (3,08 g, 80 %, Rf = 0,30, hexanos/EtOAc a 9:1). IR: 3426, 2929, 2856, 1721, 1700, 1657, 1611 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz): δ 1,10-1,28 40 (m, 1H), 1,28-1,42 (m, 1H), 1,42-1,80 (m, 6H), 1,80-1,90 (m, 1H), 1,90-2,08 (m, 1H), 2,08-2,18 (m, 1H), 2,22-2,35 (m, 1H), 2,64 (dd, 1H, J = 12,6, 6,0 Hz), 3,01 (m, 2H), 3,89 (s, 3H), 7,20 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,93 (d, 2H, J = 8,4 Hz).
RMN 13C (CDCl3, 75 MHz): δ 24,5, 24,6, 25,1, 27,7, 32,9, 38,1, 43,2, 51,5, 52,0, 128,1, 129,0, 129,7, 145,6, 167,0, 218,9. FAB-HRMS: Calculado para C17H23O3+ [M+H]+: 275,1647, encontrado: 275,1648.
5
Éster de metilo del ácido 4-(2-trifluorometanosulfoniloxi-ciclooct-2-enilmetil)-benzoico (7a). A una solución de cetona 4a (2,17 g, 7,91 mmol) en THF (50 ml) a -78 ºC se añadió KHMDS (17,4 ml, 8,70 mmol, 0,50 M solución en tolueno). Después de 1 h, se añadió una solución de Tf2NPh (3,11 g, 8,70 mmol) en THF (25 ml) y se permitió que la reacción se calentara a ta. Después de 30 min, la mezcla de reacción se concentró en un rotavapor y el producto se purificó directamente por cromatografía en columna (hexanos/EtOAc de 20:1 a 12:1) para producir el producto 10 deseado (2,19 g, 68 %, Rf = 0,35 en hexanos/EtOAc a 9:1) en forma de un aceite incoloro. El producto se aisló como una mezcla de regioisómeros a 9:1. IR: 2932, 2856, 1723, 1410 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 1,25-1,38 (m, 1H), 1,38-1,52 (m, 1H), 1,52-1,71 (m, 4H), 1,71-1,85 (m, 2H), 1,98-2,11 (m, 1H), 2,15-2,25 (m, 1 H), 2,73 (dd, 1H, J = 14,0, 6,8 Hz), 2,99 (dd, 1 H, J = 13,6, 8,0 Hz), 3,13 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 5,76 (t, 1H, J = 8,8 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,98 (d, 2H, J = 8,0 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 25,2, 25,9,26,5,29,8, 33,3, 37,4, 39,8, 52,0, 118,5 (c, J = 15 318,0 Hz), 121,3, 128,4, 128,8, 129,8, 144,8, 151,0, 167,0, RMN 19F (CDCl3, 376 MHz): δ -73,8 (s). FAB-HRMS: Calculado para C18H22O5F3S+ [M+H]+: 407,1140, encontrado: 407,1133.
20
Éster de metilo del ácido 4-ciclooct-2-inilmetilbenzoico (8a). A una solución de triflato de vinilo 7a (2,14 g, 5,28 mmol) en THF (30 ml) a 0 ºC se añadió LDA (3,52 ml, 5,28 mmol, 1,8 M en heptano/THF/etil benceno) gota a gota mediante una bomba de jeringa, durante 3 h. Se añadió LDA hasta que se consumió el material de partida. La reacción se interrumpió con H2O (10 ml) y the THF se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con EtOAc (100 ml), se lavó con H2O (3 x 100 ml) y salmuera (1 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4. Después de cromatografía 25 sobre gel de sílice (hexanos/tolueno/EtOAc de 3:1:0 a 30:10:2), se aisló un aceite incoloro (0,310 g, 23 %, Rf = 0,20 en hexanos/tolueno/EtOAc a 30:10:1). IR: 2930, 2857, 1720 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz): δ 1,42 (m, 2H), 1,62 (m, 1H), 1,71-1,88 (m, 3H), 1,88-1,98 (m, 1H), 2,00-2,10 (m, 1H), 2,11-2,23 (m, 2H), 2,63-2,80 (m, 3H), 3,90 (s, 3H), 7,29 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,97 (d, 2H, J = 8,4 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 20,8, 28,4, 30,0, 34,8, 36,5, 40,3, 41,7, 51,9, 94,9, 96,1, 128,1, 128,9, 129,6, 145,7, 167,1. FAB-HRMS: Calculado para C17H21O2+. [M+H]+: 257,1542, 30 encontrado: 257,1536.
Ácido 4-ciclooct-2-inilmetilbenzoico (3a). A una solución de ciclooctino 8a (283 mg, 1,11 mmol) en dioxano (12 35 ml) y H2O (3 ml) se añadió LiOH finamente triturado (530 mg, 22,1 mmol). La suspensión se calentó a 50 ºC y se agitó durante 3 h. El dioxano se retiró en un rotavapor. El residuo se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con HCl 1 N (3 x 50 ml), H2O (3 x 50 ml), y salmuera (2 x 50 ml), y se secó sobre MgSO4 para producir un sólido de color blanco (254 mg, 95 %, Rf = 0,25 en 27:3:1 de hexano/EtOAc/AcOH), p.f. 112,0-113,9 ºC (desc.). IR: 3071, 2922, 2846, 1680 cm-1. RMN 1H (CD3CN, 400 MHz): δ 1,35-1,48 (m, 2H), 1,56-1,66 (m, 1H), 1,66-1,95 (m, 4H), 2,01-2,17 (m, 40
3H), 2,70 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 2,71 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 2,76 (m, 1H), 7,33 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,91 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 9,40 (s a, 1H). RMN 13C (CD3CN, 100 MHz): δ 21,2, 29,2, 30,8, 35,6, 37,3, 40,8, 42,5, 95,7, 97,1, 128,9, 130,1, 130,5, 147,4, 167,8. EI-HRMS: Calculado para C16H18O2 M+: 242,1307, encontrado: 242,1307. Anál. calc. para C16H18O2: C, 79,31; H, 7,49, Encontrado: C, 79,07; H, 7,26.
5
4-Ciclooct-2-inilmetil)-N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)propil]benzamida (12a). TEA (0,184 ml, 0,396 mmol) se añadió a una solución del ciclooctino 3a (64 mg, 0,26 mmol), amina 13 (106 mg, 0,396 mmol) y HATU (111 mg, 0,291 mmol) en CH2Cl2 (2 ml) a ta. La reacción se agitó durante 15 min a ta, se inactivó con H2O (10 ml), y se diluyó 10 con CH2Cl2 (50 ml). La fase orgánica se lavó con HCl 1 N (3 x 50 ml), NaHCO3 saturado(3 x 50 ml), y salmuera (2 x 25 ml), y se secó sobre MgSO4. La cromatografía del producto en bruto (hexanos/EtOAc de 2:1 a 1:1) proporcionó el producto deseado en forma de un aceite incoloro (69 mg, 69 %, Rf = 0,30 en hexanos/EtOAc a 1:1). IR: 3411, 3099, 2925, 2849, 1704, 1639 cm-1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 1,42 (m, 2H), 1,61 (m, 1H), 1,70-1,97 (m, 6H), 2,00-2,09 (m, 1H), 2,09-2,22 (m, 2H), 2,62-2,78 (m, 3H), 3,38 (c, 2H, J = 6,4 Hz), 3,65 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,74 (s, 2H), 6,93 (m, 15 1H), 7,29 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,78 (d, 2H, J = 8,0 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): δ 20,8, 28,2, 28,4, 29,9, 34,7, 34,8, 36,1, 36,5, 40,0, 41,6; 94,9, 96,2, 126,9, 129,0, 132,2, 134,2, 144,0, 167,1, 171,2. FAB-HRMS: Calculado para C23H27N2O3+ [M+H]+: 379,2022, encontrado: 379,2014.
20
Compuestos 11b y 11c. El ciclooctino 3b (0,20 g, 0,77 mmol) y 2-azidoetanol (N.J. Agard, resultados sin publicar, 461 µl, 3,84 mmol) se disolvieron en CH3CN (7,2 ml) y solución salina campanada con fosfato de Dulbecco (1X, pH 7,4, 5,9 ml). La reacción se agitó a ta durante 12 h y se concentró en un rotavapor. La cromatografía del producto en bruto (CH2Cl2/MeOH/AcOH de 95:4:1 a 90:9:1) proporcionó una mezcla a 20:1 de 11b:11a (99 mg, 37 %, Rf = 0,30 25 en CH2Cl2/MeOH/AcOH a 90:9:1) y 11c (144 mg, 54 %, Rf = 0,15 en CH2Cl2/MeOH/AcOH a 90:9:1) en forma de aceites incoloros.
Compuesto 11b: p.f. 175,0-178,0 ºC. IR: 3442, 2103, 1644 cm-1. RMN 1H (CD3OD, 400 MHz): δ 1,39 (m, 3H), 1,55 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,30 (m, 1H), 2,82 (ddd, 1H, J = 14,8, 4,4, 4,4 Hz), 3,38 (t ap, 1H, J 30 = 12,4 Hz), 3,48 (t ap, 1H, J = 14,4 Hz), 4,02 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,46 (dt, 1H, J = 14,0, 5,2 Hz), 4,62 (ddd, 1H, J = 14,0, 8,0, 5,6 Hz), 7,05 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,86 (d, 2H, J = 8,4 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz): δ 22,9, 25,4, 27,4, 28,4, 38,3 (d, J = 22,0 Hz), 48,1 (d, J = 26,0 Hz), 53,9 (d, J = 7,0 Hz), 62,1, 97,0 (d, J = 174,0 Hz), 130,7, 131,2, 132,0, 135,2 (d, J = 23,0 Hz), 141,6 (d, J = 8,0 Hz), 145,7 (d, J = 5,0 Hz), 169,8. RMN 19F (CD3OD, 376 MHz): δ -145,7 (m). FAB-HRMS: Calculado para C18H23FN3O3+[M+H]+: 348,1723, encontrado: 348,1722. 35
Compuesto 11c: p.f. 183,0-184,6 ºC. IR: 3423, 2068, 1643 cm-1. RMN 1H (CD3OD, 400 MHz): δ 1,31 (m, 1H), 1,40-1,68 (m, 4H), 1,74 (m, 1H), 1,92 (m, 2H), 2,39 (m, 1H), 2,95 (m, 1H), 3,32 (c ap, 2H, J = 12,8 Hz), 3,88 (t, 2H, J = 5,6 Hz), 4,34 (m, 2H), 7,05 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,82 (d, 2H, J = 8,0 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz): δ 21,7, 23,8, 25,9, 28,1, 38,9, 51,1, 51,2, 55,0, 62,2, 130,3, 130,9, 132,0, 135,7, 144,2, 149,9, 170,8. FAB-HRMS: Calculado para 40
C18H24N3O4+ [M+H]+: 346,1767, encontrado: 346,1764.
Evaluación cinética de sondas de ciclooctino
Se prepararon soluciones de reserva de los ciclooctinos 3a y 3b (50 mM), bencil azida (500 mM) y 2-azidoetanol 5 (500 mM) en cualquiera de CD3CN o una mezcla de CD3CN a 55:45 y solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco deuterada (pH 7,4, preparada con D2O). Para disolver totalmente 3a y 3b fue necesario un calentamiento y/o sonicación suave en un baño de H2O. Un tubo de RMN se cargó con 450 µl de cualquiera de 3a o 3b, y 50 µl de cualquiera de bencil azida o 2-azidoetanol, y la reacción se controló en el tiempo usando espectroscopía de RMN 1H.
10
En el caso de las reacciones de 3a y 3b con bencil azida, los datos genéticos se derivaron mediante el control del cambio en la integración de las resonancias correspondientes a los protones de bencílicos en la bencil azida (δ -4,2 ppm) en comparación con las resonancias correspondientes de los productos de triazol (δ de ~5,0 a 5,5 ppm). En el caso de las reacciones de 3a y 3b con 2-azidoetanol, los datos genéticos se derivaron de la integración de las resonancias que corresponden al par de protones aromáticos en el campo más bajo (δ ~7,9 ppm) en el material de 15 partida de ciclooctino en comparación con las resonancias correspondientes en los productos de triazol (δ de ~7,7 a 7,8 ppm).
Las constantes de tasa de segundo orden para la reacción se determinaron mediante la representación de 1/[bencil azida] frente al tiempo en el caso de las reacciones de 3a y 3b con bencil azida y mediante la representación de 20 1/[3a] frente al tiempo o 1/[3b] frente al tiempo en el caso de las reacciones de 3a y 3b con 2-azidoetanol, y análisis posterior mediante regresión lineal. Las constantes de tasa de segundo orden corresponden a una mitad de la pendiente determinada (Tabla 1). Las barras de error representan desviaciones estándar de tres experimentos por replicado.
25
Tabla 1. Comparación cinética de ligamientos azido".
Reactivo de marcado
Azida Disolvente k (x 10-3 M-1s-1)
3b
PhCH2N3 CD3CN 4,2
2
PhCH2N3 CD3CN 2,4b
3a
PhCH2N3 CD3CN 1,2
1 (R’ = H)
PhCH2N3 CD3CN 1,9c
3b
HOCH2CH2N3 CD3CN/PBS (55:45) 4,0
2
HOCH2CH2N3 CD3CN/PBS (55:45) 2,0b
3a
HOCH2CH2N3 CD3CN/PBS (55:45) 1,1
aLas constantes de tasa de segundo orden para la cicloadición [3+2] se determinaron a 22 ºC usando RMN 1H (véase la sección experimental para una descripción total de la preparación experimental). bAgard, N. J., Prescher, J.A., Bertozzi, C.R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047, cLin, F. L., Hoyt, H.M., van Halbeek, H., Bergman, 30 R.G., Bertozzi, C.R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2686-95.
Marcado de superficie celular de células Jurkat con 12b-FLAG.
Las células Jurkat (linfoma de linfocitos T humanos) se mantuvieron en una atmósfera de CO2 al 5 %, saturada con 35 agua y se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con FCS al 10 %, penicilina (100 unidades/ml), y estreptomicina (0,1 mg/ml). Las densidades celulares se mantuvieron entre 1 x 105 y 1,6 x 106 células/ml. Las células se incubaron durante 3 d en medios sin tratar o medios que contenían Ac4ManNAz 25 µM. Después de crecimiento en presencia de Ac4ManNAz, las células se distribuyeron en una placa de cultivo celular con fondo de V de 96 pocillos. Las células se sedimentaron (3500 rpm, 3 min) y se lavaron dos veces con 200 µl de tampón de 40 marcado (PBS, pH 7,4 que contiene FCS al 1 %). A continuación, las células se incubaron con 12b-FLAG o 1-FLAG en tampón de marcado durante 1 h a ta. Después de la incubación, las células se sedimentaron, se lavaron dos veces con tampón de marcado, y se volvieron a suspender en el mismo tampón que contenía α-FLAG conjugado con FITC (dilución a 1:3000 de la solución de reserva de Sigma). Después de un periodo de incubación de 30 min en hielo (en la oscuridad), las células se lavaron dos veces con 200 µl de tampón de marcado frío y a continuación se 45 diluyeron hasta un volumen de 400 µl para análisis de citometría de flujo.
Resultados
Para someter a ensayo la especificidad de la reacción de cicloadición en un contexto biológico, 3a y 3b se derivatizaron adicionalmente con FLAG-C (SEC ID Nº: 3), un epítopo peptídico corto para el que está disponible en el mercado un anticuerpo marcado con fluorescencia (Esquema 6). Los derivados de maleimida 12a y 12b se 5 prepararon mediante el acoplamiento de 3a y 3b mediado con HATU con la amino-maleimida 13. Los péptidos FLAG terminados con cisteína se ligaron con las maleimidas 12a y 12b usando condiciones convencionales y las sondas resultantes (12a-FLAG y 12b-FLAG) se purificaron por HPLC para uso en experimentos de marcado celular.
10
Esquema 6: (a) Hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HATU), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), TEA, CH2Cl2, 69 % (12a), 65 % (12b); (b) H2N-DYKDDDDKC-CO2H (SEC ID Nº: 3), DMF/H2O.
15
Las azidas se instalaron en las superficies de las células Jurkat mediante el marcado metabólico de restos de ácido siálico10. En resumen, las células se alimentaron con N-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz), un análogo de la N-acetilmanosamina (ManNAc), convirtieron el azúcar azido en el correspondiente ácido azido siálico (SiaNAz) dentro de glicoproteínas de superficie celular. La reacción de las azidas de superficie celular con sondas de fosfina o ciclooctino que contienen el epítopo de FLAG se controló por citometría de flujo usando visualización con 20 un anticuerpo α-FLAG conjugado con FITC (Figura 4a).
Como se muestra en la Figura 4b, 12b-FLAG marca a las células Jurkat de una manera dependiente de azida, similar a una sonda de fosfina marcada con FLAG estudiada anteriormente capaz de experimentar la ligamiento de Staudinger (1-FLAG). Agard et al., (2004). J. Am. Chem. Soc. 126, 15046-15047. El compuesto 12b-FLAG marca 25 las células de una manera dependiente de la dosis. No se observó toxicidad en ninguno de estos experimentos.
Figuras 4A y 4B. Marcado de azidas de superficie celular con sondas de ciclooctino. (a) Las células Jurkat se incubaron con azúcares de azido durante 3 d y a continuación se marcaron con diversas concentraciones de 1-FLAG o 12b-FLAG. La detección del péptido FLAG se consiguió usando un anticuerpo α-FLAG conjugado con 30 FITC, seguido de análisis mediante citometría de flujo. (b) Azul oscuro: Células incubadas con Ac4ManNAz 25 µM durante 3 d. Azul claro: Células incubadas en ausencia de Ac4ManNAz. Las barras de error indican la desviación estándar de tres ensayos. aIntensidad de fluorescencia media.
Ejemplo 3: Síntesis de un compuesto de ciclooctino sin arilo y su uso en el marcado de células vivas 35
Este ejemplo describe la síntesis de un octino "sin arilo" (ALO; se muestra a continuación) y el uso de un ALO conjugado a células vivas marcadas in vivo. El octino sin arilo se sintetizó; a continuación se introdujo un grupo maleimida. El grupo funcional maleimida permite la conjugación específica del tiol de péptidos que contienen cisteína. A continuación se describen la síntesis del octino, las maleimidas unidas a octino, su conjugación a un 40 péptido FLAG, y el uso posterior de estos conjugados en superficies celulares en ratones vivos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Síntesis de ALO 5
Compuesto 14. Se añadió AgClO4 (2,40 g, 11,6 mmol) a una solución de dibromobiciclo 1 (1,00 g, 3,72 mmol) y glicolato de metilo (6,0 ml, 78,2 mmol) disuelto en tolueno (4 ml) en un matraz envuelto con papel de aluminio, 10 secado a la llama. La reacción se agitó durante 2 h, se diluyó con pentano (20 ml), y se filtró para retirar las sales de plata insolubles. La solución se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 5-10 %: éter de pet; Rf (EtOAc al 10 %: éter de pet) = 0,32) para producir 2 en forma de un aceite incoloro (330 mg, 1,19 mmol, 22 %). RMN 1H (300 MHz, CD3Cl) δ 6,20 (dd, 1H, J = 3,9, 11,7) 4,23 (d, 1H, J = 16,5), 4,11 (m, 1H) 3,96 (d, 1H, J = 16,5), 3,73 (s, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,25 (m, 1H), 0,8-2,1 (m, 8H). EI LRMS calculado para C11H18O3Br [M+H]+ 278,2, 15 encontrado 278,1.
Compuesto 15. Una suspensión de NaOMe (128 mg, 2,38 mmol) en DMSO anhidro (2 ml) se añadió al compuesto 20 2 (330 mg, 1,19 mmol) disuelto en DMSO anhidro (3 ml). La reacción se agitó 20 min y se añadió NaOMe (250 mg, 4,8 mmol en 1,5 ml de DMSO) adicional. La reacción se agitó hasta que el material de partida se consumió totalmente como se determina por TLC (20 min). Se añadió con (1 ml) a la reacción y ésta se agitó durante una noche. La reacción se acidificó con HCl 1 M (75 ml) y se extrajo dos veces con EtOAc (50 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y el disolvente se retiró al vacío. (La reacción se puede 25 purificar en este punto para producir el ácido libre, pero lo más a menudo se toma en forma en bruto para dar el éster de pentafluorofenilo activado) La mezcla de reacción se disolvió en 5 ml de CH2Cl2, y a esta solución se añadió Et3N (332 µl, 2,38 mmol) seguido de trifluoroacetato de pentafluorofenilo (409 µl, 2,38 mmol). La reacción se agitó 3 h a ta, el disolvente se retiró al vacío, y el producto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 1,5-3 %: éteres de petróleo; Rf (EtOAc al 3 %) = 0,30) para producir 3 en forma de un aceite transparente (274 mg, 30 0,78 mmol, 66 %). RMN 1H (400 MHz, CD3Cl) δ 4,42 (m, 1 H), 4,25 (d, 1 H, J = 15,2), 4,13 (d, 1 H, J = 15,2), 1,5-2,3 (m, 10 H). EI LRMS calculado para C16H14O3F5 [M+H]+ 349,3, encontrado 349,0.
Síntesis de maleimida octinos
Los compuestos 16 y 17 se sintetizaron como si a continuación. Se añadió TEA (1,5 equiv.) a una solución de 5 ciclooctino-PFP (1 equiv.), y amina 13 (1,5 equiv.), en CH2Cl2 a ta. La reacción se agitó durante 2 h a ta, se inactivó con H2O, y se diluyó con CH2Cl2. La fase orgánica se lavó con HCl 1 N (x 3), NaHCO3 saturado (x 3), y salmuera (x 2), y se secó sobre MgSO4. La cromatografía del producto en bruto (hexanos/EtOAc) proporcionó el producto deseado en forma de un aceite incoloro.
10
Síntesis de conjugados de oct-FLAG
Se añadió octino-maleimida (1 equiv.) a una solución de FLAG-C (DYKDDDDKC; SEC ID Nº: 3) preparada mediante síntesis convencional de péptidos en fase sólida) (1,2 equiv.) en DMF:H2O a 1:1 y se agitó durante una noche. La mezcla de reacción en bruto se concentró y se purificó mediante HPLC en fase inversa (sistema de HPLC Varian 15 Dynamax con detección a 254 nm, en una columna preparativa C-18 Microsorb a un caudal de 20 ml/min). Todas las realizaciones de HPLC usaron el siguiente gradiente: acetonitrilo al 5-25 % en agua durante 10 min, seguido de acetonitrilo al 35-50 % en agua durante 30 min.
Ratones 20
Los ratones B6D2F1 se obtuvieron en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). Todos los animales se alojaron y se controlaron en la Instalación para Animales de Northwest (Berkeley, CA), y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de California, Berkeley (número de protocolo R234-0504B). 25
Protocolo general para la administración de compuestos
Se administraron dosis diarias de Ac4ManNAz (0-300 mg/kg en ~200 µl de DMSO al 70 %, de una solución de reserva de 50 mg/ml) a los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) durante 7 días. Veinticuatro horas después de la 30 inyección final de final Ac4ManNAz, los ratones se inyectaron i.p. con oct-FLAG (0-40 µmol en ~200 µl de H2O), Phos-FLAG (20 µmol en ~200 µl de H2O), o vehículo solo (H2O). Después de 3 h, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron, y sus esplenocitos se aislaron usando un protocolo convencional.
Marcado de azidas de superficie celular que esplenocitos ex vivo 35
Los esplenocitos de un bazo se suspendieron en medio RPMI 1640 y se distribuyeron entre pocillos de una placa para cultivo tisular con fondo de V de 96 pocillos (3 pocillos por tratamiento, ~5 x 105 células/pocillo). Las células se sedimentaron (3500 rpm, 3 min), se aclararon tres veces con tampón de marcado (FBS al 1 % en PBS, pH 7,4), y se incubaron con oct-FLAG 0-500 µM en tampón de marcado, Phos-FLAG en tampón de marcado, o tampón de 40 marcado solo. Después de incubación a ta durante 1 h, las células se aclararon tres veces con tampón de marcado, se trataron con FITC-α-FLAG (dilución a 1:900) o control de isotipo de ratón conjugado con FITC (dilución a 1:200) en tampón de marcado durante 30 min en hielo, se aclararon y se analizaron mediante citometría de flujo.
Resultados 45
Marcado de esplenocitos de conjugados de FLAG: Esplenocitos cultivados en presencia de Ac4ManNAz se marcaron como se describe en los procedimientos. Los resultados se muestran en la Figura 5. La fosfina-FLAG ("Phos-FLAG" sirve como un control de ligamiento positivo, y los tres octinos sintetizados muestran bioortogonalidad como se demuestra mediante el aumento del marcado en el presente de células que portan azida. El grado de 50 marcado es coherente con los datos de cinética in vitro dentro de los octinos. Los octinos más hidrófobos (F-oct(MOFO) y Oct (el primer ciclooctino informado).

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula:
    5
    en el que:
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    10
    (a) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (b) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (c) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición 15 de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (d) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    Y es H; un grupo reactivo seleccionado entre un carboxilo, una amina, un éster, un tioéster, un haluro de 20 sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida y una hidrazina; o una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una 25 aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro;
    o
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    (a) H; 30
    (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición 35 de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    Y es un carboxilo, una amina, un tioéster, un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un 40 isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida o una hidrazina; o una marca fluorescente, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro. 45
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que:
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    50
    (a) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (b) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (c) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición 55 de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (d) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    Y es H; un grupo reactivo seleccionado entre un carboxilo, una amina, un éster, un tioéster, un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida y una hidrazina; o una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un 5 aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que:
    10
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    (a) H;
    (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el 15 que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un 20 halógeno;
    Y es un carboxilo, una amina, un tioéster, un haluro de sulfonilo, un alcohol, un tiol, un éster de succinimidilo, un isotiocianato, una yodoacetamida, una maleimida o una hidrazina; o una marca fluorescente, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y 25
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro.
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que X son dos átomos de flúor y X’ es H. 30
  5. 5. El compuesto de la reivindicación 3, en el que X y X’ son H.
  6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X y X’ son flúor.
    35
  7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que Y es un fluoróforo.
  8. 8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que Y es un miembro de un par de unión específico.
    40
  9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que Y es biotina.
  10. 10. El compuesto de la reivindicación 9, en el que el compuesto tiene la estructura:
    45
  11. 11. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que Y es una marca de epítopo.
  12. 12. Un compuesto para uso en un método de diagnóstico o un método de terapia, en donde el compuesto es un cicloalquino modificado de fórmula 50
    en la que:
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    5
    (a) H;
    (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o 10 sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    15
    Y es una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro. 20
  13. 13. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el método comprende las etapas de
    hacer reaccionar una azida de una molécula diana con el cicloalquino modificado, y dicha reacción produce un conjugado entre la azida de la molécula diana y el cicloalquino modificado.
    25
  14. 14. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el método es para modificar de forma sintética un componente celular, método que comprende:
    introducir un resto de azida en un componente celular, generando de este modo un componente celular modificado con azida; 30
    y
    poner en contacto la célula que comprende el componente celular modificado con azida con un compañero reactivo que comprende el cicloalquino modificado, realizándose dicho contacto en condiciones fisiológicas;
    y dicho contacto con dicho compañero reactivo da como resultado la reacción entre el grupo azida del componente celular modificado con azida y el cicloalquino del compañero reactivo, modificando de este modo de 35 forma sintética y covalente el componente celular.
  15. 15. Un método in vitro para ligamiento quimioselectivo de una molécula diana que comprende una azida, método que comprende:
    40
    hacer reaccionar una azida de una molécula diana con un cicloalquino modificado, y dicha reacción produce un conjugado entre la azida de la molécula diana y el cicloalquino modificado, en donde el cicloalquino modificado tiene la fórmula
    45
    en la que:
    cada uno de X y X’ es independientemente:
    (a) H; 50
    (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el
    que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno;
    (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un 5 halógeno;
    Y es una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un 10 aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro.
  16. 16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que dicha reacción se realiza en condiciones acuosas. 15
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que dicha reacción se realiza en condiciones fisiológicas.
  18. 18. El compuesto para uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 o los métodos de una cualquiera de las 20 reivindicaciones 15 a 17, en donde la molécula diana es un azúcar.
  19. 19. El compuesto para uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 o los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el azúcar es un sustrato de biosíntesis del ácido siálico.
    25
  20. 20. El compuesto para uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 o los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el azúcar es manosamina o manosamina acetilada.
  21. 21. El compuesto para uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 o los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la molécula diana es un aminoácido. 30
  22. 22. El compuesto para uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 o los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la molécula diana que comprende la azida se expresa en una superficie celular.
  23. 23. Un método in vitro para modificar de forma sintética un componente celular, método que comprende: 35
    introducir un resto de azida en un componente celular, generando de este modo un componente celular modificado con azida; y
    poner en contacto la célula que comprende el componente celular modificado con azida con un compañero reactivo que comprende un cicloalquino modificado, realizándose dicho contacto en condiciones fisiológicas; 40
    y dicho contacto con dicho compañero reactivo da como resultado la reacción entre el grupo azida del componente celular modificado con azida y el cicloalquino del compañero reactivo, modificando de este modo de forma sintética y covalente el componente celular,
    en donde el cicloalquino modificado tiene la fórmula
    45
    en la que:
    cada uno de X y X’ es independientemente: 50
    (a) H;
    (b) uno o dos átomos de halógeno (por ejemplo, bromo, cloro, flúor, yodo);
    (c) -W-(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; en el que W, si está presente, es O, N o S; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un halógeno; 55
    (d) -(CH2)n-W-(CH2)m-Z, en el que n y m son cada uno independientemente 1 o 2; en el que W es O, N, S o sulfonilo; con la condición de que si W es O, N o S, entonces Z es nitro, ciano o halógeno; y con la condición de que si W es sulfonilo, entonces Z es H; o
    (e) -(CH2)n-Z, en el que n es un número entero de 1-4; y en el que Z es nitro, ciano, ácido sulfónico o un
    halógeno;
    Y es una marca detectable, un fármaco, una toxina, un péptido, un polipéptido, una marca de epítopo o un miembro de un par de unión específico; y
    R1 se selecciona entre un ácido carboxílico, un éster de alquilo, un éster de arilo, un éster de arilo sustituido, un aldehído, una amida, una aril amida, un haluro de alquilo, un tioéster, un éster de sulfonilo, una alquil cetona, una 5 aril cetona, una aril cetona sustituida, un halosulfonilo, un nitrilo y un nitro.
  24. 24. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o el método de la reivindicación 23 en el que el componente celular es un polipéptido.
    10
  25. 25. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o el método de la reivindicación 23 en el que R1 es un éster de alquilo.
  26. 26. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o el método de la reivindicación 23 en el que el éster de alquilo es un éster de metilo. 15
  27. 27. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en donde el compuesto es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
    20
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