WO2022196694A1 - 化合物、その製造方法、複合体および短波赤外蛍光剤 - Google Patents

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infrared fluorescent
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隆 神
マデゴウダ マハデバ スワミィ マカナハリ
健次 門出
勇太 村井
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells

Definitions

  • the present invention relates to compounds, methods for producing the same, composites, and short-wave infrared fluorescent agents.
  • ICG Indocyanine green
  • An object of one aspect of the present invention is to provide a novel technique that enables bioimaging with short-wave infrared.
  • n represents an integer of 3 to 5
  • X represents a salt of a sulfonic acid group or a reactive cross-linking group for the molecular identifier.
  • a complex according to one aspect of the present invention is a compound in which a molecular identifier and the compound are bound via a reactive cross-linking group residue in the compound of the present invention.
  • a short-wave infrared fluorescent agent according to one aspect of the present invention contains one or both of the compound of the present invention and the complex of the present invention.
  • a method for producing a compound represented by the following formula (1) comprises synthesizing a first compound represented by the following formula (1a) A first step, a second step of replacing the anilino group in formula (1a) with a structure represented by the following formula (1b), and a phenylimino group in the formula (1a) represented by the following formula (1c) and a third step of replacing the structure with
  • n represents an integer of 3 to 5
  • X represents a salt of a sulfonic acid group or a reactive cross-linking group for a molecular identifier.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of Compound 4 and cell viability in Examples of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the concentration of Compound 10 and cell viability in Examples of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescent image of the leg and abdomen of a hairless mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 1 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of the leg and abdomen of a hairless mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 2 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 3 is a diagram showing a photograph representing an image
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescent image of the leg and abdomen of a hairless mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 3 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescent image of the leg and abdomen of a hairless mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 3 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 10 is a photograph showing a visual field image and a short-wave infrared fluorescent image of the leg and abdomen of a hairless mouse using short-wave infrared fluorescent agent 4 as an optical contrast agent in an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a photograph representing an image
  • FIG. 3 is a diagram showing fluorescence spectra of Complex 1 and Complex 2 in Examples of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using short-wave infrared fluorescent agent 5 in an example of the present invention as an optical contrast agent. Photographs showing bright-field images and short-wave infrared fluorescence images of cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver of cancer-bearing mice using the short-wave infrared fluorescent agent 5 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a diagram showing; FIG.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 6 in the example of the present invention as an optical contrast agent. Photographs showing bright-field images and short-wave infrared fluorescence images of cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver of cancer-bearing mice using the short-wave infrared fluorescent agent 6 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a diagram showing; FIG.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 7 in the example of the present invention as an optical contrast agent. Photographs showing bright-field images and short-wave infrared fluorescence images of cancer tumor, heart, kidney, spleen, and liver of cancer-bearing mice using the short-wave infrared fluorescent agent 7 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using the short-wave infrared fluorescent agent 7 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a diagram showing; A photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using each of the short-wave infrared fluorescent agent 8 and the short-wave infrared fluorescent agent 9 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a diagram showing; A photograph showing a bright field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using each of the short-wave infrared fluorescent agent 10 and the short-wave infrared fluorescent agent 11 in the example of the present invention as an optical contrast agent.
  • FIG. 4 is a diagram showing; A photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of a tumor site of a cancer-bearing mouse using each of the short-wave infrared fluorescent agent 10 and the short-wave infrared fluorescent agent 11 in the example of the present invention as an
  • FIG. 4 is a diagram showing; Tumor areas of cancer-bearing mice injected with Kadcyla or not injected with Kadcyla, photographed using the short-wave infrared fluorescent agent 12 and the short-wave infrared fluorescent agent 13 in the example of the present invention as optical contrast agents.
  • FIG. 2 is a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescence image of .
  • the short-wave infrared fluorescent agent 13 in the example of the present invention as an optical contrast agent, a bright-field image and a short-wave infrared fluorescent image of the tumor site of a tumor-bearing mouse injected with Kadcyla were taken after a specific period of time.
  • FIG. 3 is a diagram showing a representative photograph;
  • n represents an integer of 3-5. n can be appropriately determined from the viewpoint that the compound of formula (1) emits short-wave infrared fluorescence and develops sufficient water solubility. In view of the above, n is preferably 3 or 4.
  • short-wave infrared means electromagnetic waves having a wavelength of 900 nm or more and 1400 nm or less.
  • the compound of formula (1) has a fluorescence intensity peak in the short-wave infrared wavelength region depending on its structure (for example, n). Therefore, the wavelength at which the fluorescence of the compound of formula (1) is detected may be appropriately determined within a range in which the compound of formula (1) emits sufficiently high intensity fluorescence in the short-wave infrared.
  • the wavelength of the excitation light in the fluorescence of the compound of formula (1) may be the wavelength of the light that excites the compound of formula (1).
  • the excitation wavelength can be appropriately determined in the range of 900 to 1100 nm, for example, according to the structure (eg, n) of the compound of formula (1) or the depth of the detection target site.
  • X represents a salt of a sulfonic acid group or a reactive cross-linking group for the molecular identifier.
  • the salt of the sulfonic acid group is not limited, and may be, for example, an alkali metal salt, more specifically a sodium salt.
  • a reactive cross-linking group is a functional group used for bonding with a molecular identifier.
  • the bond with the molecular identifier may be a bond suitable for the application of the compound of formula (1), and may be, for example, a covalent bond or a hydrogen bond.
  • the bonding of the reactive cross-linking group to the molecular identifier may be in the form of bonding of the molecular identifier to the reactive cross-linking group, or the reactive cross-linking may be carried out with partial detachment of the reactive cross-linking group.
  • a part of the group may be in a form that binds to the molecular identifier.
  • the reactive cross-linking group is preferably a functional group that is subjected to cross-linking with the molecular identifier under mild conditions such as mixing at room temperature.
  • the reactive cross-linking group is preferably one or more organic groups selected from the group consisting of N-hydroxysuccinimide ester groups, maleimide groups, alkynyl groups and azide groups.
  • alkynyl group is not limited, it preferably has 5 or less carbon atoms, for example, from the viewpoint of the water solubility of the compound of formula (1).
  • alkynyl groups include ethynyl and propynyl groups.
  • the ester structure of the N-hydroxysuccinimide ester group may be any structure that can be bonded to a straight-chain hydrocarbon group or derived from an organic group containing a straight-chain hydrocarbon group. It's okay.
  • the reactive cross-linking group may further have other molecular structures capable of constituting the compound of formula (1) within the range in which the effects of the present embodiment can be obtained.
  • other reactive cross-linking groups can also be bonded to straight-chain hydrocarbon groups, or can be derived from organic groups containing straight-chain hydrocarbon groups (e.g., alkyl groups and amide groups). groups, etc.).
  • the reactive cross-linking group described above can easily bond with a molecular identifier having an amino group, a sulfhydryl group, an azide group, or an alkynyl group. Therefore, it is preferable from the viewpoint of easily and accurately introducing a site that identifies a living tissue into the compound of formula (1).
  • the reactive cross-linking group may be introduced into the compound of formula (1) by attachment of a linker substance used to attach the fluorescent substance to the amino acid.
  • a reactive cross-linking group capable of binding to the amino group possessed by the molecular identifier can be introduced into the compound of formula (1).
  • linker substances include 6-aminocaproic acid, 2-aminoadipic acid, 3-aminoadipic acid, 4-aminobutyric acid, 5-aminovaleric acid, 7-aminoheptanoic acid, 8-aminooctanoic acid, 11-amino Included are undecanoic acid, 12-aminododecanoic acid, 2-aminobenzoic acid, 3-aminobenzoic acid and 4-aminobenzoic acid.
  • a molecular identifier is a component that has a molecular structure that can identify a specific molecule.
  • the molecular identifier may be a component containing a molecular structure capable of binding to a specific molecule, and may be of one type or more.
  • Molecular identifiers also have sites available for bonding with reactive cross-linking groups. Examples of such moieties include amino groups, sulfhydryl groups, azide groups and alkynyl groups. Examples of molecular identifiers include peptides, proteins, nucleic acid derivatives, antibodies, fragments of such antibodies having antigen-binding ability, and cells.
  • the compound of formula (1) is an organic dye that emits short-wave infrared fluorescence.
  • organic dyes are expected to be applied to bioimaging as described above, and for this reason, compounds with various molecular skeletons have been investigated as short-wave infrared fluorescent agents (for example, "Jin T, ECS J. Solid State Sci. Technol, 8, R9-R13 (2019)”).
  • short-wave infrared fluorescent agents for example, "Jin T, ECS J. Solid State Sci. Technol, 8, R9-R13 (2019)”.
  • studies have been made on compounds having short-wave infrared fluorescence as a fluorescence characteristic peculiar to the molecular skeleton.
  • the compound of formula (1) has a structure similar to that of ICG and a longer chain structure than ICG, its short-wave infrared fluorescence is similar to that of ICG in the near-infrared. It has an equivalent or higher luminous efficiency. Therefore, the compound of formula (1) is a unique compound that does not fit the above general trends, even though it has a larger molecular structure than ICG.
  • the compound of formula (1) can be produced by a production method including the following three steps of the first to third steps.
  • the meanings of the letters in the general formulas are the same as those of the compounds described above.
  • the first step is to synthesize the first compound represented by the following formula (1a).
  • n represents an integer of 3-5.
  • the compound of formula (1a) can be synthesized by reacting a linear diene aldehyde in the presence of a phosphorus compound to appropriately extend the linear diene structure, and then reacting with aniline.
  • the synthesis can proceed efficiently by appropriately adjusting the temperature.
  • the terminal aldehyde of the linear diene structure in the intermediate product is replaced with another structure such as a carboxylic acid ester or an alcohol. can be temporarily replaced by
  • the second step is to replace the anilino group in formula (1a) with a structure represented by formula (1b) below.
  • the anilino group in the formula (1a) is converted to the compound represented by the following formula (1b1) in the presence of acetic anhydride and sodium acetate to form the compound of the formula (1a) or the phenylimino group in the formula (1a).
  • Compounds of formula (1b1) are obtained by reacting 1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole with 1,4-butanesultone.
  • the third step is to replace the phenylimino group in formula (1a) with a structure represented by formula (1c) below.
  • the phenylimino group in formula (1a) can be replaced by the compound of formula (1a) or the formula A compound in which the phenylimino group in (1a) is replaced with the structure represented by formula (1b) can be used as a starting material to replace the structure represented by formula (1c).
  • the phenylimino group in formula (1a) is first replaced with a structure represented by formula (1c1) below, and then reacted with a terminal carboxyl group.
  • the structure of formula (1c) can be substituted by attaching a reactive bridging group or replacing the carboxyl group with a reactive bridging group.
  • the replacement of the phenylimino group in formula (1a) with the structure represented by formula (1c1) can be performed, for example, by using the bromine salt of the compound of formula (1b1) in which the sulfonic acid group is replaced with a carboxyl group, as described above. It is possible to carry out in the same manner as the replacement of the anilino group in formula (1a) described above.
  • the reaction of introducing a reactive cross-linking group to the carboxyl group after replacement with the structure represented by formula (1c1) may be performed by applying a known method according to the target reactive cross-linking group. .
  • the order of the second step and the third step is determined from the viewpoint of the solubility of the raw material or the product or the reactivity of the raw material within the range where the desired compound of formula (1) can be produced. can be determined as appropriate.
  • the second step and the third step are You can go all at once.
  • the above-mentioned second step and third step can be carried out at once, for example, by reacting the compound of formula (1a) with two or more equivalents of the compound of formula (1b1) under the conditions of the second step. is possible.
  • By performing the second step and the third step at once it is possible to more easily produce the compound of formula (1), and from the viewpoint of suppressing a decrease in yield due to an increase in the number of steps.
  • the third step is carried out after the second step. is preferred.
  • the target compound is the compound of formula (4), that is, when n in the above formula is 3 and X is a reactive cross-linking group
  • the third step is performed after the second step. is preferred. In these cases, the third step may be carried out using the product of the second step as a raw material. Carrying out the third step after the second step in the preparation of the compound of formula (3) or the compound of formula (4) increases the yield of replacement of the phenylimino group in formula (1a) in the third step is preferable from the viewpoint of increasing the
  • the third step is performed before the second step.
  • the second step may be carried out using the product of the third step as a raw material. Carrying out the third step before the second step in the production of the compound of formula (5) is preferable from the viewpoint of increasing the yield in each replacement of the anilino group and the phenylimino group in formula (1a). be.
  • the manufacturing method described above may further include steps other than the above-described first to third steps as long as the effects of the present embodiment can be obtained.
  • the above production method may further include a step of purifying the product in each step.
  • a purification step can be appropriately carried out by a known method such as washing with a solvent or column chromatography.
  • the compounds of each formula can be synthesized using known techniques, but from the viewpoint of reactivity and productivity, it is preferable to appropriately select synthesis conditions.
  • the synthesis reaction of the compound of formula (1a), the second step and the third step are accelerated by high temperature.
  • the reaction temperature is raised, the target compound having the desired chain structure and the by-product having a shorter chain structure may be produced at approximately the same ratio.
  • the target compound and by-products have similar physical properties such as polarity, and it can be easily expected that it would be difficult to separate the target compound from a mixture of these. are similar, and isolation of the target compound from the above mixture is difficult.
  • the reaction rate will also be lowered, but it is possible to synthesize the target compound at a higher rate.
  • the reaction rate is not high, but it is possible to efficiently obtain the target compound with high purity.
  • the target compound can be obtained by appropriately adjusting synthesis conditions such as reaction temperature as necessary from the viewpoint of reactivity and productivity while using known techniques. It is possible to obtain with high efficiency.
  • the carbon chain (straight polyene chain) in the compound of formula (1a) used is longer than in the synthesis of ICG.
  • the third step prior to the second step.
  • the preceding third step produces a product that is more soluble in the solvent, so that the subsequent second It becomes possible to carry out the process.
  • the production of by-products is suppressed, making it possible to obtain substantially only the desired compound.
  • a synthetic method with such a sequence of steps is preferable from the viewpoint of obtaining the target compound with high purity, although the reaction rate of the target compound is slightly low.
  • the molecular identifier and the compound are bound via the reactive cross-linking group residue in the compound of the present embodiment.
  • the meanings of the reactive cross-linking group and the molecular identifier are as described above in the description of the compounds of the embodiments of the present invention.
  • the molecular identification agent is preferably a component that can bind to a specific site in a living body.
  • the molecular identification agent is preferably an antibody or a fragment of the antibody having antigen-binding ability, among those exemplified above.
  • a complex formed by binding such an antibody or fragment is useful as a fluorescent marker for specific biological tissues such as tumors.
  • the complex can be used for detection of tumors and confirmation of pharmacological or therapeutic effects on tumors by short-wave infrared molecular imaging.
  • the short-wave infrared fluorescent agent of an embodiment of the present invention is one or a composition containing the compound of formula (1) above and the complex above.
  • one or more compounds of formula (1) may be used, and one or more complexes may be used.
  • the compound of formula (1) or the complex containing it has the property of emitting short-wave infrared light. It can be used for fluorescence imaging with infrared.
  • the short-wave infrared fluorescent agent of the present embodiment may further contain components other than the compound and complex of formula (1) described above within the range in which the effects of the present embodiment can be obtained.
  • a short-wave infrared fluorescent agent can be used as a phosphate-buffered saline solution because it is usually used in living organisms.
  • the stability of ICG and its conjugates in aqueous solution is enhanced in the presence of bovine serum albumin (BSA), and the fluorescence emission intensity of ICG and its conjugates is enhanced in the presence of BSA.
  • BSA bovine serum albumin
  • the short-wave infrared fluorescent agent in the embodiment of the present invention is from the viewpoint of increasing the stability of the compound and complex of the present embodiment in an aqueous solution, and the emission intensity of short-wave infrared fluorescence is preferable from the viewpoint of increasing
  • the concentration of the compound or complex of the present embodiment in the short-wave infrared fluorescent agent may be any concentration that achieves sufficient fluorescence emission intensity according to the application of the short-wave infrared fluorescent agent.
  • concentrations of compounds or conjugates of the present embodiments in short-wave infrared fluorescent agents form sufficiently distinct images in short-wave infrared biological or molecular imaging. From the viewpoint, it is preferably 0.1 ⁇ M or more, more preferably 1 ⁇ M or more, and even more preferably 10 ⁇ M or more.
  • the concentration of the compound or complex of the present embodiment in the short-wave infrared fluorescent agent may be 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M from the above viewpoint. may be:
  • the content of BSA in the short-wave infrared fluorescent agent may be appropriately determined within the range in which the above effect of increasing the emission intensity of fluorescence can be obtained. you can
  • any component that forms micelles with the short-wave infrared fluorescent agent is expected to have the same effect as the combined use of BSA.
  • examples of other ingredients as well besides BSA include human serum albumin (HSA), phospholipids such as lecithin, and long chain fatty acids.
  • the short-wave infrared fluorescent agent in the embodiment of the present invention functions as an excellent optical contrast agent in fluorescent imaging of a living body with short-wave infrared light having a wavelength region of 900 nm or more.
  • the wavelength of excitation light and the detection wavelength of fluorescence can be appropriately determined from the ranges described above in the explanation of the compound.
  • imaging of a plurality of biological tissues or biomolecules at different depths can be performed by a single administration of the short-wave infrared fluorescent agent to the living body. is possible.
  • short-wave infrared fluorescent agents containing complexes in embodiments of the present invention can be easily prepared and used as optical contrast agents for molecular imaging.
  • the short-wave infrared fluorescent agent in the embodiment of the present invention as an optical contrast agent, non-invasive imaging of blood vessels including intracerebral blood vessels, imaging of lymph nodes, and high sensitivity of cancer tumors using short-wave infrared light. detection is possible.
  • the short-wave infrared fluorescent agent in the embodiment of the present invention can also be used for drug evaluation using an antibody-drug conjugate (ADC), for example, by conjugating a drug component to the molecular identification agent in the above-described conjugate. It is possible to use
  • ADC antibody-drug conjugate
  • administration of the short-wave infrared fluorescent agent when used for bioimaging can be performed by a known method suitable for the subject of imaging.
  • administration of the short-wave infrared fluorescent agent may be direct administration to the part desired to be imaged, or administration into a blood vessel of a living body such as intravenous injection.
  • the compound of formula (1) in the embodiment of the present invention is an analogue of ICG whose molecular structure is similar to ICG in clinical application.
  • ICG is currently used as a pharmaceutical agent for human retinal angiography, liver function test (ICG test), and the like.
  • the compound of formula (1) of the present embodiment has a molecular structure similar to that of ICG, and, like ICG, has substantially no cytotoxicity as shown in the examples below, and can be dissolved in an aqueous solution. can be used in any condition.
  • the compound of formula (1) can be used in a form suitable for imaging with short-wave infrared, like conventionally used ICG, such as being able to bind to an antibody in the same manner as ICG. is possible.
  • the compounds of formula (1) of this embodiment also have sufficiently high renal clearance to be substantially excreted in vitro.
  • the compound of formula (1) which is an analogue of ICG, has high safety to living organisms.
  • the compound of formula (1) has a sulfone group. Therefore, it is highly water soluble and dissolves in physiological buffers. Moreover, since it is an organic molecule with high water solubility, it is easily excreted from the body when it is introduced into a living body.
  • the compound of formula (1) can be excited by light in the long wavelength region (900 nm or more) in the near infrared region. Moreover, in the state of an aqueous solution, it has sufficient short-wave infrared fluorescence intensity for fluorescence imaging of a living body. It is known that the short-wave infrared wavelength region is weakly absorbed and scattered by living tissue, and is weakly autofluorescent from living tissue. Therefore, the compound of formula (1) can realize fluorescence imaging at a deeper part than the part observable by fluorescence imaging of ICG in vivo.
  • the excitation wavelength of the compound of formula (1) is on the longer wavelength side than that of ICG, the absorption of excitation light into living tissue is weakened more than in fluorescence imaging of ICG in a living body. Therefore, by applying the compound of formula (1) to fluorescence imaging of a living body, the influence of fluorescence imaging on living tissue can be further reduced.
  • the compound of formula (1) when the compound of formula (1) has a reactive cross-linking group such as an N-hydroxysuccinimide ester group, it can be easily bound to a biomolecule such as an antibody, and can be used as a short-wave infrared fluorescent label. Complexes can be readily formed. Therefore, it is easy to develop optical contrast agents for molecular imaging, and noninvasive molecular imaging in the short-wave infrared region is possible.
  • a reactive cross-linking group such as an N-hydroxysuccinimide ester group
  • the compound of formula (1) can relatively shorten the exposure time of the excitation light. Therefore, by applying the compound of formula (1) to fluorescence imaging of a living body, the operation of detecting the fluorescence of the compound of formula (1) and the biological tissue thereby can be performed efficiently.
  • the reactive cross-linking group in formula (1) may contain one or more organic groups selected from the group consisting of N-hydroxysuccinimide ester groups, maleimide groups, alkynyl groups and azide groups. This configuration is more effective from the viewpoint of obtaining a stable and high-yield complex when the reactive cross-linking group binds to a bio-derived molecular identification agent such as an antibody to form a complex.
  • n in formula (1) may be 3 or 4. This configuration is much more effective from the viewpoint of exhibiting sufficient water solubility and sufficient fluorescence intensity of short-wave infrared rays.
  • the compound of formula (1) may be a compound represented by any of formulas (2) to (9) described above. This configuration is suitable from the viewpoint of application to bioimaging and molecular imaging with short-wave infrared.
  • the molecular identifier and the compound are bound via the residue of the reactive cross-linking group in the compound according to the embodiment of the present invention.
  • the conjugates can be used for biological and molecular imaging in short wave infrared.
  • the molecular identification agent may be an antibody or a fragment of the antibody having antigen-binding ability.
  • the antibody or fragment thereof is an antibody or fragment thereof that specifically binds to an antigen contained in a living tissue that is the target of molecular imaging. This configuration is much more effective from the viewpoint of realizing molecular imaging in living tissue using short-wave infrared rays.
  • the short-wave infrared fluorescent agent in the embodiment of the present invention contains one or both of the compound of the embodiment of the present invention and the complex of the embodiment of the present invention. Therefore, the short-wave infrared fluorescent agent can be used for bioimaging and molecular imaging by short-wave infrared.
  • the method for producing a compound according to an embodiment of the present invention comprises a first step of synthesizing the first compound represented by the above formula (1a), and replacing the anilino group in the formula (1a) with the above formula (1b). and a third step of replacing the phenylimino group in formula (1a) with the structure represented by formula (1c) above. Therefore, the production method can produce a novel compound (compound of formula (1)) that enables bioimaging in short-wave infrared.
  • n in the above formula is 3 and X is a salt of a sulfonic acid group, even if the second step and the third step are performed at once, good.
  • This configuration is more effective from the viewpoint of easier production of the compound of formula (2) and from the viewpoint of suppressing a decrease in yield due to an increase in the number of steps.
  • the third step may be performed after the second step.
  • This configuration is more effective from the viewpoint of increasing the yield of substitution of the phenylimino group in formula (1a) in the third step in the production of the compound of formula (3) described above.
  • the third step may be performed after the second step.
  • This configuration is also more effective from the viewpoint of increasing the yield of substitution of the phenylimino group in formula (1a) in the third step in the production of the compound of formula (4).
  • the third step may be performed before the second step.
  • This configuration is more effective from the viewpoint of increasing the yield in each replacement of the anilino group and the phenylimino group in formula (1a) in the production of the compound of formula (5).
  • Phosphoryl chloride (8 g, 52 mmol) was added dropwise to a mixed solution of dimethylformamide (10 mL, 130 mmol) and methanol (0.75 mL) at 0° C. with stirring under an inert atmosphere.
  • the reaction temperature was raised to 50° C.
  • 2,4-hexadienal 1 (2.5 g, 26 mmol) was added dropwise, the reaction mixture was stirred at 50° C. for about 4 hours, cooled to room temperature, and aqueous sodium perchlorate ( 5% aqueous solution) and extracted with dichloromethane (80 mL).
  • the organic phase was filtered through sodium sulfate.
  • MTT 3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • ICG-C11-NHS can also be synthesized according to the synthesis scheme shown below. Other methods for synthesizing ICG-C11-NHS are specifically described below.
  • short-wave infrared fluorescent agent 2 was prepared in the same manner as short-wave infrared fluorescent agent 1 except that compound 10 (ICG-C11) was used instead of compound 4.
  • the excitation wavelength was 905 nm, and the fluorescence detection wavelength was 1000 nm.
  • the excitation wavelength was 975 nm, and the fluorescence detection wavelength was 1100 nm.
  • the excitation light intensity was 20-40 mW/cm 2 and the exposure time was 5-10 seconds.
  • FIG. 3 shows a bright-field image of the lower limbs and abdomen of a hairless mouse and a photograph showing a short-wave infrared fluorescence image by short-wave infrared fluorescent agent 1.
  • FIG. 4 shows a photograph showing a bright-field image and a short-wave infrared fluorescent image obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 2 in the leg and abdomen of a hairless mouse.
  • both short-wave infrared fluorescent agent 1 and short-wave infrared fluorescent agent 2 can form clear images of blood vessels in limbs and abdomen in short-wave infrared light. .
  • the short-wave infrared fluorescent images obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 1 and the short-wave infrared fluorescent agent 2 are clear with high fluorescent signal intensity and less blurring.
  • the short-wave infrared fluorescent agent 1 and the short-wave infrared fluorescent agent 2 realize not only practical but also excellent fluorescence imaging of living organisms with short-wave infrared.
  • the short-wave infrared fluorescent agent 2 was used instead of the short-wave infrared fluorescent agent 1
  • the short-wave infrared fluorescence imaging of the cerebral blood vessels of hairless mice was performed in the same manner as the short-wave infrared fluorescence imaging using the short-wave infrared fluorescent agent 1. Fluorescence imaging was performed.
  • the short-wave infrared fluorescent agent C1 is a fluorescent agent prepared in the same manner as the short-wave infrared fluorescent agent 1 except that ICG is used instead of compound 4.
  • the excitation wavelength was 905 nm and the fluorescence detection wavelength was 1000 nm.
  • the excitation light intensity was 10 mW/cm 2 and the exposure time was 1 second.
  • the excitation wavelength was 975 nm and the fluorescence detection wavelength was 1100 nm.
  • the excitation light intensity was 20-40 mW/cm 2 and the exposure time was 1-2.5 seconds.
  • the excitation wavelength was 758 nm and the fluorescence detection wavelength was 900 nm.
  • the excitation light intensity was 5 mW/cm 2 and the exposure time was 1 second.
  • Fig. 5 shows a bright-field image of the parietal region of a hairless mouse and a photograph showing a short-wave infrared fluorescence image using short-wave infrared fluorescent agents C1, 1, and 2.
  • the short-wave infrared fluorescent agents 1 and 2 compared with the short-wave infrared fluorescent agent C1 containing ICG, show images of brain vessels of hairless mice that can be observed from the outside with short-wave infrared light. , Clearly, and even the details of cerebral blood vessels can be formed.
  • Short-wave infrared fluorescent agents 3 and 4 were prepared, respectively.
  • compound 14 ICG-C9-NHS
  • BSA bovine serum albumin
  • compound 17 ICG-C11-NHS
  • the preparation schemes of the short-wave infrared fluorescent agents 3 and 4 are shown below.
  • BSA-bound compound 14 (ICG-C9-BSA) was obtained. Purification was performed using a gel filtration column (PD10, GE Healthcare) using physiological phosphate buffer (PBS) as an eluent. ICG-C9-BSA was dissolved in PBS to a concentration of 1 mg/mL. The resulting aqueous solution is used as the short-wave infrared fluorescent agent 3 .
  • short-wave infrared fluorescent agent 4 was prepared in the same manner as short-wave infrared fluorescent agent 3, except that compound 17 was used instead of compound 14.
  • FIG. 6 shows a photograph showing a bright-field image of the leg and abdomen of a hairless mouse and a short-wave infrared fluorescence image obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 3. As shown in FIG.
  • FIG. 7 shows a photograph showing a bright-field image of the leg and abdomen of a hairless mouse and a short-wave infrared fluorescence image obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 4. As shown in FIG.
  • the short-wave infrared fluorescent agent 3 and the short-wave infrared fluorescent agent 4 are similar to the short-wave infrared fluorescent agent 1 and the short-wave infrared fluorescent agent 2. A clear image of short-wave infrared light can be formed.
  • Short-wave infrared fluorescence imaging of brain blood vessels of hairless mice was performed in the same manner as in Example 5 except that short-wave infrared fluorescent agent 3 or short-wave infrared fluorescent agent 4 was used instead of short-wave infrared fluorescent agent 1. .
  • short-wave infrared fluorescence imaging of brain blood vessels in hairless mice was performed in the same manner as in Example 5, except that short-wave infrared fluorescent agent C2 was used instead of short-wave infrared fluorescent agent 1.
  • Short-wave infrared fluorescent agent C2 is a fluorescent agent prepared in the same manner as short-wave infrared fluorescent agent 1 except that ICG-NHS is used instead of compound 14. ICG-NHS can be purchased from Goryo Kayaku Co., Ltd.
  • the excitation wavelength was 905 nm and the fluorescence detection wavelength was 1000 nm.
  • the excitation light intensity was 10 mW/cm 2 and the exposure time was 7.5 seconds.
  • the excitation wavelength was 975 nm and the fluorescence detection wavelength was 1100 nm.
  • the excitation light intensity was 20 to 40 mW/cm 2 and the exposure time was 1 second.
  • the excitation wavelength was 758 nm and the fluorescence detection wavelength was 900 nm.
  • the excitation light intensity was 5 mW/cm 2 and the exposure time was 20 seconds.
  • Fig. 8 shows a bright-field image of the parietal region of a hairless mouse and a photograph showing a short-wave infrared fluorescence image using short-wave infrared fluorescent agents C2, 3, and 4.
  • the short-wave infrared fluorescent agents 3 and 4 like the short-wave infrared fluorescent agents 1 and 2, clearly showed images of the cerebral blood vessels of hairless mice observable from the outside with short-wave infrared light. In addition, even the details of cerebral blood vessels can be formed.
  • complex 2 (ICG-C11-Erbitux) in which compound 17 was modified with Erbitux was prepared in the same manner as complex 1, except that compound 17 was used instead of compound 14.
  • Fluorescence spectra of aqueous solutions obtained by dissolving complexes 1 and 2 in PBS were measured.
  • the concentration of the measured aqueous solution is 1 mg/mL.
  • the wavelength of the excitation light is 785 nm for the complex 1 and 900 nm for the complex 2.
  • Fluorescence spectra of complexes 1 and 2 are shown in FIG. As shown in FIG. 9, the fluorescence emission peak of complex 1 was at about 950 nm, and the fluorescence emission peak of complex 2 was at about 1100 nm.
  • anti-HER2 antibody-tubulin polymerization inhibitor conjugate (Kadcyra (registered trademark of F Hoffmann La Roche)), which is an antibody-drug conjugate (ADC)
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Chugai Compound 3 (ICG-C11-Kadcyla), in which compound 17 was modified with Kadcyla, was prepared in the same manner as the preparation of conjugate 2, except that the compound 17 was modified with Kadcyla.
  • Conjugate 3 like Conjugate 2, is compound 17 (ICG-C11-NHS) bound to the antibody in the above antibody-drug conjugate via an amide group containing a carbonyl group. there is The excitation light wavelength and fluorescence peak of complex 3 are substantially the same as those of complex 2 .
  • a short-wave infrared fluorescent agent 6 was prepared in the same manner as the short-wave infrared fluorescent agent 5 except that the composite 2 was used instead of the composite 1. Further, a short-wave infrared fluorescent agent 7 was prepared in the same manner as the short-wave infrared fluorescent agent 5 except that the composite 3 was used instead of the composite 1.
  • the excitation wavelength was 905 nm and the fluorescence detection wavelength was 1000 nm.
  • the excitation light intensity was 10 mW/cm 2 and the exposure time was 15 seconds.
  • a photograph showing a bright-field image of a breast cancer tumor in nude mice in vivo and a short-wave infrared fluorescence image by short-wave infrared fluorescent agent 5 is shown in FIG. 11 shows bright-field images of breast cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver of nude mice ex vivo, and short-wave infrared fluorescence images obtained by short-wave infrared fluorescent agent 5.
  • FIG. 11 shows bright-field images of breast cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver of nude mice ex vivo, and short-wave infrared fluorescence images obtained by short-wave infrared fluorescent agent 5.
  • the excitation wavelength was 975 nm and the fluorescence detection wavelength was 1100 nm.
  • the excitation light intensity was 20 to 40 mW/cm 2 and the exposure time was 15 to 30 seconds.
  • a photograph showing a bright-field image of a breast cancer tumor in a nude mouse in vivo and a short-wave infrared fluorescence image by the short-wave infrared fluorescent agent 6 is shown in FIG. 13 shows bright-field images of breast cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver in nude mice ex vivo, and short-wave infrared fluorescence images obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 6.
  • FIG. 13 shows bright-field images of breast cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver in nude mice ex vivo, and short-wave infrared fluorescence images obtained by the short-wave infrared fluorescent agent 6.
  • breast cancer tumors emit short-wave infrared fluorescence due to the accumulation of complex 1 or complex 2.
  • both the short-wave infrared fluorescent agent 5 and the short-wave infrared fluorescent agent 6 can bind specifically to breast cancer tumors and can form images of breast cancer tumors by detection of short-wave infrared light. Recognize.
  • Tumor-bearing mice were prepared in the same manner as the above-described breast cancer model mice except that KPL-4 cells (provided by Kawasaki Medical School, about 1.5 ⁇ 10 7 cells) were used as human breast cancer cells, and tumor cells were grown. Grows to several millimeters in size. Then, in vivo and ex vivo fluorescence imaging of breast cancer tumors in breast cancer model mice was performed in the same manner, except that the short-wave infrared fluorescent agent 7 was used instead of the short-wave infrared fluorescent agent 6 .
  • FIG. 15 shows photographs showing bright-field images of breast cancer tumors, heart, kidney, spleen, and liver in nude mice ex vivo, and short-wave infrared fluorescence images obtained by short-wave infrared fluorescent agent 7 .
  • the short-wave infrared fluorescent agent 7 like the short-wave infrared fluorescent agent 6, also specifically binds to breast cancer tumors, and can detect images of breast cancer tumors by detecting short-wave infrared light. can be formed.
  • the fluorescence image was taken under conditions of an excitation wavelength of 905 nm and a fluorescence detection wavelength of 1000 nm or more.
  • the excitation light intensity was 20 mW/cm 2 and the exposure time was 5 seconds.
  • Photographs representing bright-field and short-wave infrared fluorescence images of breast cancer tumors in nude mice in vivo for short-wave infrared fluorescent agent 8 and short-wave infrared fluorescent agent 9, respectively, are shown in FIG. From these results, it was shown that breast cancer tumors can be clearly detected even with the short-wave infrared fluorescent agents 8 and 9.
  • the fluorescence image was taken under conditions of an excitation wavelength of 905 nm and a fluorescence detection wavelength of 1000 nm or more.
  • the excitation light intensity was 20 mW/cm 2 and the exposure times were 10 seconds (short-wave infrared fluorescent agent 10) and 30 seconds (short-wave infrared fluorescent agent 11).
  • Photographs representing bright-field and short-wave infrared fluorescence images of breast cancer tumors in nude mice in vivo with short-wave infrared fluorescent agent 10 and short-wave infrared fluorescent agent 11, respectively, are shown in FIG. These results indicate that breast cancer tumors can be clearly detected even with the short-wave infrared fluorescent agents 10 and 11.
  • the fluorescence image was taken under conditions of an excitation wavelength of 905 nm and a fluorescence detection wavelength of 1000 nm or more.
  • the excitation light intensity was 20 mW/cm 2 and the exposure times were 5 seconds (short-wave infrared fluorescent agent 12) and 10 seconds (short-wave infrared fluorescent agent 13).
  • the fluorescence image was taken under conditions of an excitation wavelength of 905 nm and a fluorescence detection wavelength of 1000 nm or more.
  • the excitation light intensity was 20 mW/cm 2 and the exposure time was 10 seconds.
  • Photographs representing bright-field and short-wave infrared fluorescence images of breast cancer tumors in vivo in nude mice injected with Kadcyla in short-wave infrared fluorescent agent 13 after specific time lapses are shown in FIG.
  • Kadcyla treatment induced apoptosis (cell death) of tumor cells and reduced tumor size. This result indicates that this short-wave infrared fluorescent agent is effective for confirming the effects of antibody-drug conjugates (ADC) at the level of animal experiments.
  • the present invention can be used for short-wave infrared fluorescence imaging technology, and it is expected that the present invention will enable visualization of deep parts of the body with high resolution that far surpasses conventional technologies.

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Abstract

短波赤外での生体イメージングを可能とする新規な化合物を提供する。本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で表される。下記式（１）中、ｎは３～５の整数を表し、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。

Description

化合物、その製造方法、複合体および短波赤外蛍光剤
　本発明は、化合物、その製造方法、複合体および短波赤外蛍光剤に関する。
　生体を非侵襲で可視化する生体イメージング技術として、７００～９００ｎｍの波長を有する近赤外光を発する蛍光剤を用いて血管または腫瘍等を可視化する方法が広く利用されている。生体イメージングに適用可能な蛍光剤の有効成分には、近赤外光の蛍光を発するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が知られている。
　一方で、近赤外光は、散乱しやすく組織に吸収されやすい。そのため、近赤外光を発する蛍光剤を用いる生体イメージングでは、対象の生体または生体組織の表面から例えば１ｃｍ以上深い部分にある微小構造を鮮明に可視化することは困難である。そのため、より散乱しにくい９００～１４００ｎｍの波長を有する短波赤外光を発する蛍光剤が求められている。これに関して、ＩＣＧの蛍光は、短波赤外光の波長領域まで及ぶことも知られている（例えば、非特許文献１参照）。
Setsuko Tsuboi and Takashi Jin，RSC Advances，p.28171-28179，2020
　しかしながら、ＩＣＧの短波赤外領域での蛍光強度は小さい。このため、ＩＣＧを含む蛍光剤を用いる短波赤外での生体イメージングでは、生体の表面から１ｃｍ以上深い部分にある微小構造を鮮明に可視化することが困難なことがある。よって、短波赤外での生体イメージング技術に適用可能な蛍光剤が求められている。
　本発明の一態様は、短波赤外での生体イメージングを可能とする新規の技術を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る化合物は、下記式（１）で表される。下記式（１）中、ｎは３～５の整数を表し、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　また、上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る複合体は、本発明の上記化合物における反応性架橋基の残基を介して分子識別剤と当該化合物とが結合している。
　さらに、上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る短波赤外蛍光剤は、本発明の上記化合物、および、本発明の上記複合体、の一方または両方を含有する。
　さらには、上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る下記式（１）で表される化合物の製造方法は、下記式（１ａ）で表される第一の化合物を合成する第一の工程と、式（１ａ）中のアニリノ基を下記式（１ｂ）で表される構造に置き換える第二の工程と、式（１ａ）中のフェニルイミノ基を下記式（１ｃ）で表される構造に置き換える第三の工程と、を含む。下記の式中、ｎは３～５の整数を表し、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明の一態様によれば、短波赤外での生体イメージングを可能とする新規の技術を提供することができる。
本発明の実施例における化合物４の濃度と細胞生存率との関係を示す図である。 本発明の実施例における化合物１０の濃度と細胞生存率との関係を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤１を光造影剤に用いたヘアレスマウスの下肢部および腹部における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤２を光造影剤に用いたヘアレスマウスの下肢部および腹部における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤１および短波赤外蛍光剤２ならびに比較例の短波赤外蛍光剤Ｃ１を光造影剤に用いたヘアレスマウスの頭頂部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤３を光造影剤に用いたヘアレスマウスの下肢部および腹部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤４を光造影剤に用いたヘアレスマウスの下肢部および腹部の視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例の短波赤外蛍光剤３および短波赤外蛍光剤４ならびに比較例の短波赤外蛍光剤Ｃ２を光造影剤に用いたヘアレスマウスの頭頂部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における複合体１および複合体２の蛍光スペクトルを示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤５を光造影剤に用いた担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤５を光造影剤に用いた担がんマウスのがん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤６を光造影剤に用いた担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤６を光造影剤に用いた担がんマウスのがん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤７を光造影剤に用いた担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤７を光造影剤に用いた担がんマウスのがん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤８および短波赤外蛍光剤９のそれぞれを光造影剤に用いた担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤１０および短波赤外蛍光剤１１のそれぞれを光造影剤に用いた担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤１２および短波赤外蛍光剤１３のそれぞれを光造影剤に用いて撮影した、カドサイラを注入した、またはカドサイラを注入していない担がんマウスの腫瘍部の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。 本発明の実施例における短波赤外蛍光剤１３を光造影剤に用いて、カドサイラを注入した担がんマウスの腫瘍部を特定の時間経過後に撮影した明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
　〔化合物〕
　本発明の実施形態の化合物は、下記式（１）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（１）中、ｎは３～５の整数を表す。ｎは、式（１）の化合物が短波赤外の蛍光を発し、かつ十分な水溶性を発現する観点から、適宜に決めることが可能である。上記の観点から、ｎは、３または４であることが好ましい。
　なお、本発明の実施形態において、「短波赤外」とは、９００ｎｍ以上１４００ｎｍ以下の波長を有する電磁波を意味する。式（１）の化合物は、その構造（例えばｎ）に応じて、短波赤外の波長領域内に蛍光強度のピークを有する。よって、式（１）の化合物の蛍光を検出する際の波長は、式（１）の化合物が短波赤外における十分に高い強度の蛍光を発する範囲で適宜に決めてよい。また、式（１）の化合物の蛍光における励起光の波長は、式（１）の化合物が励起する光の波長であればよい。励起波長は、式（１）の化合物の構造（例えばｎ）または検出対象部位の深度等に応じて、例えば９００～１１００ｎｍの範囲から適宜に決定することが可能である。
　式（１）中、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。スルホン酸基の塩は、限定されず、例えばアルカリ金属塩であってよく、より具体的にはナトリウム塩であってよい。
　反応性架橋基は、分子識別剤との結合に供される官能基である。分子識別剤との結合は、式（１）の化合物の用途に応じた適当な結合であればよく、例えば共有結合であってもよいし、水素結合であってもよい。また、反応性架橋基の分子識別剤との結合は、反応性架橋基に分子識別剤が結合する形態であってもよいし、反応性架橋基の一部の脱離を伴って反応性架橋基の一部が分子識別剤と結合する形態であってもよい。
　反応性架橋基は、室温での混合などの穏和な条件で分子識別剤との架橋に供される官能基であることが、安定性および取り扱いの容易さの観点から好ましい。このような観点から、反応性架橋基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基、アルキニル基およびアジド基からなる群から選ばれる一以上の有機基であることが好ましい。
　アルキニル基は、限定されないが、例えば式（１）の化合物の水溶性の観点から、その炭素数が５以下であることが好ましい。アルキニル基の例には、エチニル基およびプロピニル基が含まれる。
　Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基のエステル構造は、直鎖の炭化水素基に結合可能、または直鎖の炭化水素基を含む有機基から誘導可能な構造であればよく、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドカルボニル基であってよい。反応性架橋基は、上記の有機基以外にも、本実施形態の効果が得られる範囲において、式（１）の化合物を構成し得る他の分子構造をさらに有していてもよい。なお、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基以外の他の反応性架橋基も、直鎖の炭化水素基に結合可能、または直鎖の炭化水素基を含む有機基から誘導可能な構造（例えばアルキル基およびアミド基など）をさらに含んでいてもよい。
　上記の反応性架橋基は、アミノ基、スルフヒドリル基、アジド基あるいはアルキニル基を有する分子識別剤と容易に結合し得る。よって、生体組織を識別する部位を式（１）の化合物に簡易かつ的確に導入する観点から好ましい。
　あるいは、反応性架橋基は、アミノ酸への蛍光物質の結合に使用されるリンカー物質の結合によって式（１）の化合物に導入されてもよい。この場合、分子識別剤が有するアミノ基に結合可能な反応性架橋基を式（１）の化合物に導入し得る。リンカー物質の例には、６－アミノカプロン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、４－アミノ酪酸、５－アミノ吉草酸、７－アミノヘプタン酸、８－アミノオクタン酸、１１－アミノウンデカン酸、１２－アミノドデカン酸、２－アミノ安息香酸、３－アミノ安息香酸および４－アミノ安息香酸が含まれる。
　分子識別剤は、特定の分子を識別可能な分子構造を有する成分である。分子識別剤は、特定の分子に結合可能な分子構造を含む成分であればよく、一種でもそれ以上でもよい。また、分子識別剤は、反応性架橋基との結合に供される部位を有する。当該部位の例には、アミノ基、スルフヒドリル基、アジド基およびアルキニル基が含まれる。分子識別剤の例には、ペプチド、タンパク質、核酸誘導体、抗体、抗原結合能を有する当該抗体の断片、および、細胞が含まれる。
　上記のような式（１）の化合物は、より具体的には下記式（２）～式（９）のいずれかで表され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（１）の化合物は、短波赤外の蛍光を発する有機色素である。このような有機色素は、前述したように生体イメージングへの適用が期待されており、そのため、短波赤外の蛍光剤として、様々な分子骨格を有する化合物の検討がなされている（例えば、「Jin T, ECS J. Solid State Sci. Technol, 8, R9-R13 (2019)」など）。このように、従来、分子骨格に特有な蛍光特性として短波赤外の蛍光を有する化合物の検討がなされている。
　ところで、蛍光化合物では、一般に、励起光から吸収されたエネルギーの一部は、分子の振動エネルギーに変換され、消費される。そして、分子構造がより大きくなると、上記の吸収されたエネルギーが変換され、消費される割合はより高まる、と考えられている。このような一般的な傾向によれば、ＩＣＧの鎖状構造をより長くすると、蛍光の発光効率はより低下することが予想される。
　しかしながら、式（１）の化合物は、ＩＣＧと同様の構造を有し、かつＩＣＧに比べてより長い鎖状構造を有する一方で、短波赤外の蛍光において、ＩＣＧの近赤外での蛍光と同等かそれ以上の高い発光効率を有する。したがって、式（１）の化合物は、ＩＣＧに比べてより大きな分子構造を有しているにも関わらず、上記の一般的な傾向に当てはまらない、ユニークな化合物である。
　〔化合物の製造方法〕
　式（１）の化合物は、下記の第一から第三の工程の三工程を含む製造方法によって製造することが可能である。なお、以下の製造方法の説明において、一般式中の文字の意味は、前述の化合物のそれと同じである。
　第一の工程は、下記式（１ａ）で表される第一の化合物を合成する工程である。前述したように、ｎは３～５の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（１ａ）の化合物は、直鎖ジエンアルデヒドをリン化合物の存在下で反応させて直鎖ジエン構造を適宜に伸長させ、次いでアニリンを反応させることによって合成することが可能である。当該合成は、温度を適宜に調整することにより、効率よく進めることが可能である。直鎖ジエン構造の伸長では、中間生成物の反応性、溶解性あるいは安定性などの観点から、当該中間生成物における直鎖ジエン構造の末端のアルデヒドを、カルボン酸エステルまたはアルコールなどの他の構造に一時的に置き換えてもよい。
　第二の工程は、式（１ａ）中のアニリノ基を下記式（１ｂ）で表される構造に置き換える工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（１ａ）中のアニリノ基は、下記式（１ｂ１）で表される化合物を、無水酢酸および酢酸ナトリウムの存在下で、式（１ａ）の化合物、あるいは、式（１ａ）中のフェニルイミノ基が下記式（１ｃ）で表される構造に置き換えられた化合物、と反応させることにより、式（１ｂ）の構造に置き換えることが可能である。式（１ｂ１）の化合物は、１，１，２－トリメチル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドールと１，４－ブタンスルトンとを反応させることによって得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　第三の工程は、式（１ａ）中のフェニルイミノ基を下記式（１ｃ）で表される構造に置き換える工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　Ｘがスルホン酸基の塩である場合では、式（１ａ）中のフェニルイミノ基は、前述した式（１ａ）中のアニリノ基の置き換えと同様にして、式（１ａ）の化合物、あるいは、式（１ａ）中のフェニルイミノ基が式（１ｂ）で表される構造に置き換えられた化合物、を原料として式（１ｃ）の構造に置き換えることが可能である。
　Ｘが前述した反応性架橋基である場合では、式（１ａ）中のフェニルイミノ基は、当該フェニルイミノ基をまず下記式（１ｃ１）で表される構造に置き換え、次いで末端のカルボキシル基に反応性架橋基を結合させ、あるいは当該カルボキシル基を反応性架橋基と置き換えることによって、式（１ｃ）の構造に置き換えることが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　式（１ａ）中のフェニルイミノ基の式（１ｃ１）で表される構造への置き換えは、例えば、式（１ｂ１）のスルホン酸基がカルボキシル基に置き換わった化合物の臭素塩を用いることにより、前述した式（１ａ）中のアニリノ基の置き換えと同様に行うことが可能である。式（１ｃ１）で表される構造への置き換え後のカルボキシル基に対して反応性架橋基を導入する反応は、目的とする反応性架橋基に応じて、公知の方法を適用して行えばよい。
　上記の製造方法において、第二の工程と第三の工程の順序は、目的とする式（１）の化合物を製造可能な範囲において、原料または生成物の溶解性あるいは原料の反応性などの観点から適宜に決めることが可能である。
　たとえば、目的の化合物が式（２）の化合物である場合、すなわち上記式中のｎが３であり、Ｘがスルホン酸基の塩である場合では、第二の工程と第三の工程とを一度に行ってもよい。前述の第二の工程および第三の工程は、例えば、式（１ａ）の化合物に対して二当量以上の式（１ｂ１）の化合物を第二の工程の条件で反応させることによって一度に行うことが可能である。第二の工程と第三の工程とを一度に行うことにより、式（１）の化合物をより簡易に製造することが可能であり、また、工数の増加による収率の低下を抑制する観点から有利である。
　目的の化合物が式（３）の化合物である場合、すなわち上記式中のｎが４であり、Ｘがスルホン酸基の塩である場合では、第二の工程の後に第三の工程を行うことが好ましい。また、目的の化合物が式（４）の化合物である場合、すなわち上記式中のｎが３であり、Ｘが反応性架橋基である場合では、第二の工程の後に第三の工程を行うことが好ましい。これらの場合では、第二の工程の生成物を原料として第三の工程を行えばよい。式（３）の化合物または式（４）の化合物の製造において第二の工程の後に第三の工程を行うことは、第三の工程における式（１ａ）中のフェニルイミノ基の置き換えの収率を高める観点から好適である。
　目的の化合物が式（５）の化合物である場合、すなわち上記式中のｎが４であり、Ｘが反応性架橋基である場合では、第二の工程の前に第三の工程を行うことが好ましい。この場合では、第三の工程の生成物を原料として第二の工程を行えばよい。式（５）の化合物の製造において第二の工程の前に第三の工程を行うことは、式（１ａ）中のアニリノ基およびフェニルイミノ基のそれぞれの置き換えにおける収率を高める観点から好適である。
　上記の製造方法は、本実施形態の効果が得られる範囲において、前述した第一の工程から第三の工程以外の他の工程をさらに含んでもよい。たとえば、上記の製造方法は、各工程における生成物を精製する工程をさらに含んでもよい。このような精製工程は、溶剤による洗浄あるいはカラムクロマトグラフィーなどの公知の方法によって適宜に行うことが可能である。
　上記の製造方法では、各式の化合物は、公知の技術を利用して合成することが可能であるが、反応性と生産性との観点から、合成条件を適宜に選択することが好ましい。
　たとえば、式（１ａ）の化合物の合成反応、第二の工程および第三の工程は、高い温度により促進される。その反面、反応温度を高くすると、所期の長さの鎖状構造を有する目的化合物と、それよりも短い鎖状構造を有する副生成物とがほぼ同じ割合で生成することがある。
　当該目的化合物と副生成物とは、極性などの物性が類似しており、これらの混合物から目的化合物を分離することは困難であることは、容易に予想され得ると考えられ、実際に、物性が類似しており、また上記混合物からの目的化合物の単離は困難である。
　式（１ａ）の化合物の合成反応、第二の工程および第三の工程では、反応温度を低くすると、反応速度も低くなるが、目的化合物をより高い割合で合成することが可能である。たとえば、後述の実施例に示すように、鎖状構造を長くする反応を敢えて室温で反応させると、反応速度は高くないものの、効率よく高純度の目的化合物を得ることが可能となる。このように、上記の製造方法では、公知の技術を利用しつつ、反応性と生産性との観点から、必要に応じて反応温度などの合成条件を適切に調整することにより、目的の化合物を高い効率で得ることが可能である。
　ここで、本発明の実施形態における上記の合成反応について具体例を示しつつより詳しく説明する。従来より生体イメージングに利用されているＩＣＧの合成では、通常、ｎが２である式（１ａ）の化合物のアニリノ基を式（１ｂ）で表されるスルホン酸化合物に置換し、続いて当該スルホン酸化合物に式（１ｃ）の構造を導入する。本実施形態の化合物の製造方法に対応させると、前述の第二の工程、第三の工程をこの順で実施する。ＩＣＧの合成では、上記の合成を進めるほどに、特に上記スルホン酸化合物への置換を行うと、生成物の溶解性が著しく低下する。このため、ＩＣＧの通常の合成方法では、式（１ｂ）の化合物および式（１ｃ）の構造を導入する合成反応は、より高い温度で実施する。
　一方で、本発明の実施形態では、ＩＣＧの合成に比べて、用いられる式（１ａ）の化合物における炭素鎖（直鎖のポリエン鎖）がより長い。特に、式（５）の化合物（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）を合成する際に用いる際の式（１ａ）の化合物は、そのｎが４と、直鎖のポリエン鎖がより一層長い。このために、本実施形態における製造方法では、式（１ａ）の化合物の安定性が、ＩＣＧの合成における式（１ａ）の化合物に比べて明らかに低くなる。このため、式（１ｂ）の化合物の導入後、式（１ｃ）の化合物を合成するにあたり、これらの合成を高温条件下で行うと、目的化合物よりもポリエン鎖の炭素数が２少ない副生成物が高い割合（おおよそ目的化合物：副生成物＝１：１の比率）で生成する。目的化合物と副生成物は極性が非常に近いことから、これらの分離によって目的化合物を得ることは、収率の観点では好ましくない。
　そこで、前述したように、特に式（５）の化合物の合成では、第二の工程に先立って第三の工程を実施することが好ましい。このような合成を行うことにより、先に行う第三の工程によって、溶媒への溶解性がより高い生成物が生成し、その結果、室温もしくはそれ以下の低温の条件で、その後の第二の工程を実施することが可能となる。それにより、第二の工程において、副生成物の生成が抑えられ、実質的に目的化合物のみを得ることが可能となる。このような工程の順序の合成方法は、目的化合物の反応率は若干低いものの、目的化合物を高い純度で得る観点から好ましい。
　〔複合体〕
　本発明の実施形態の複合体は、前述の本実施形態の化合物における反応性架橋基の残基を介して分子識別剤と当該化合物とが結合している。反応性架橋基および分子識別剤の意味は、本発明の実施形態の化合物の説明で前述したとおりである。分子イメージングへの適用の観点から、分子識別剤は、生体中の特定の部位に結合可能な成分であることが好ましい。このような観点から、分子識別剤は、先に例示した中でも、抗体、または、抗原結合能を有する当該抗体の断片であることが好ましい。このような抗体または断片と結合してなる複合体は、腫瘍などの特定の生体組織の蛍光マーカとして有用である。また、当該複合体は、短波赤外による分子イメージングによって腫瘍の検出および腫瘍に対する薬理効果または治療効果の確認に用いることが可能である。
　〔短波赤外蛍光剤〕
　本発明の実施形態の短波赤外蛍光剤は、前述の式（１）の化合物および前述の複合体の一方または含有する組成物である。本発明の実施形態の短波赤外蛍光剤における式（１）の化合物は一種でもそれ以上でもよく、複合体も一種でもそれ以上でもよい。本実施形態の短波赤外蛍光剤は、式（１）の化合物またはそれを含む上記複合体が短波赤外を発する性質を有することから、本発明の実施形態の短波赤外蛍光剤は、短波赤外による蛍光イメージングに使用することが可能である。
　本実施形態の短波赤外蛍光剤は、本実施形態の効果が得られる範囲において、前述の式（１）の化合物および複合体以外の他の成分をさらに含んでもよい。たとえば、短波赤外蛍光剤は、通常、生体に使用されることから、リン酸緩衝生理食塩水の溶液として利用され得る。
　また、ＩＣＧおよびその複合体の水溶液中での安定性は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で向上すること、および、ＩＣＧおよびその複合体の蛍光の発光強度は、ＢＳＡの存在下で高まること、が知られている（例えば、「Takashi Jin et al., Med. Chem. Commun, 2016, 7, 623-631」参照）。本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤においても同様である。すなわち、本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤がＢＳＡを含有することは、本実施形態の化合物および複合体の水溶液中での安定性を高める観点、および、短波赤外の蛍光の発光強度を高める観点から好ましい。
　短波赤外蛍光剤における本実施形態の化合物または複合体の濃度は、短波赤外蛍光剤の用途に応じた蛍光の十分な発光強度が実現する濃度であればよい。たとえば、生体イメージングまたは分子イメージングの用途であれば、短波赤外蛍光剤における本実施形態の化合物または複合体の濃度は、短波赤外での生体イメージングまたは分子イメージングにおいて十分に明確な像を形成する観点から、０．１μＭ以上であることが好ましく、１μＭ以上であることがより好ましく、１０μＭ以上であることがさらに好ましい。また、生体イメージングまたは分子イメージングの用途において、短波赤外蛍光剤における本実施形態の化合物または複合体の濃度は、上記の観点から、１００μＭ以下であってよく、１０μＭ以下であってよく、あるいは１μＭ以下であってよい。
　また、短波赤外蛍光剤におけるＢＳＡの含有量は、上記の蛍光の発光強度を高める効果が得られる範囲において適宜に決めてよく、このような観点から、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。
　なお、ＢＳＡ以外にも、短波赤外蛍光剤とミセルを形成する成分であれば、ＢＳＡの併用と同様の上記の効果が期待される。このような観点から、ＢＳＡ以外の同様の他の成分の例には、ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ）、レシチンなどのリン脂質および長鎖脂肪酸が含まれる。
　〔用途〕
　本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤は、波長領域９００ｎｍ以上の短波赤外光での生体の蛍光イメージングにおいて優れた光造影剤として機能する。生体の蛍光イメージングでは、化合物の説明で前述した範囲から、励起光の波長および蛍光の検出波長を適宜に決めることが可能である。また、励起波長および蛍光の検出波長の複数の異なる組み合わせを設定すると、短波赤外蛍光剤の生体への一回の投与によって、深さが異なる複数の生体組織または生体分子のイメージングを実施することが可能である。
　また、本発明の実施形態における複合体を含有する短波赤外蛍光剤は、容易に調製でき、また分子イメージング用の光造影剤として使用することが可能である。
　本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤を光造影剤として用いることにより、短波赤外光による非侵襲での、脳内血管を含む血管の造影、リンパ節の造影、がん腫瘍の高感度での検出が可能である。
　また、本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤は、例えば前述の複合体における分子識別剤に薬物成分を複合させることにより、抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）による薬剤評価にも使用することが可能である。
　生体イメージングに用いる場合の短波赤外蛍光剤の投与は、イメージングの対象に対して適切な公知の方法によって行うことが可能である。たとえば、当該短波赤外蛍光剤の投与は、イメージングしたい部分への直接投与であってもよいし、静脈注射のような生体の血管内への投与であってもよい。
　〔作用効果〕
　本発明の実施形態における式（１）の化合物は、臨床応用されているＩＣＧにその分子構造が類似しているＩＣＧの類縁体である。ＩＣＧは、現在、ヒトの網膜の血管造影、肝機能検査（ＩＣＧ検査）などの医薬品として使われている。本実施形態の式（１）の化合物は、ＩＣＧに類似の分子構造を有しており、ＩＣＧと同様に、後述の実施例で示すように細胞毒性を実質的に有さず、また水溶液の状態で使用し得る。さらには、式（１）の化合物は、ＩＣＧと同様の手法で抗体と結合させることができるなど、従来使用されているＩＣＧと同様に、短波赤外での造影に適した形態で使用することが可能である。
　また、最終的な流体力学的直径が５ｎｍ未満の量子ドットは、生体から迅速かつ効率的に尿中に排泄され、体内から除去されることが知られている（例えば、「Hak Soo Choi1 et al., NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 25 NUMBER 10 OCTOBER 2007」参照）。よって、本実施形態の式（１）の化合物も、生体外へ実質的に排出される十分に高い腎クリアランスを有する。このように、ＩＣＧの類縁体である式（１）の化合物は、生体に対する高い安全性を有する。
　また、式（１）の化合物はスルホン基を有する。そのため、水溶性が高く、生理的緩衝液に溶解する。また、水溶性が高い有機分子であるため、生体へ導入した場合に容易に体外へ排出される。
　式（１）の化合物は、近赤外領域における長波長域の波長（９００ｎｍ以上）の光での励起が可能である。また、水溶液の状態で生体の蛍光イメージングに十分な短波赤外の蛍光強度を有する。短波赤外の波長領域は、生体組織による吸収、散乱が弱く、また生体組織からの自家蛍光が弱いことが知られている。したがって、式（１）の化合物は、生体におけるＩＣＧの蛍光イメージングで観察可能な部分よりもより深い部分での蛍光イメージングを実現することが可能である。
　また、式（１）の化合物の励起波長がＩＣＧよりも長波長側であることから、ＩＣＧの生体における蛍光イメージングに比べて、励起光の生体組織への光吸収がより弱められる。そのため、式（１）の化合物を生体の蛍光イメージングに適用することにより、蛍光イメージングにおける生体組織への影響をより減らすことができる。
　さらに、式（１）の化合物は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの反応性架橋基を有する場合では、抗体などの生体分子へ容易に結合させることが可能であり、短波赤外蛍光ラベルとしての複合体を容易に形成することが可能である。よって、分子イメージング用の光造影剤の開発が容易であり、また、短波赤外領域での非侵襲の分子イメージングが可能である。
　さらには、式（１）の化合物は、励起光の露光時間を比較的短くすることが可能である。このため、式（１）の化合物を生体の蛍光イメージングに適用することにより、式（１）の化合物の蛍光およびそれによる生体組織の検出操作を効率よく行うことができる。
　〔まとめ〕
　以上の説明から明らかなように、本発明の実施形態における化合物は、前述の式（１）で表される。よって、短波赤外での生体イメージングを可能とする新規な化合物が提供される。
　式（１）中の反応性架橋基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基、アルキニル基およびアジド基からなる群から選ばれる一以上の有機基を含んでもよい。この構成は、反応性架橋基が抗体などの生体由来の分子識別剤と結合して複合体を構成するにあたり、複合体を安定して収率よく得る観点からより一層効果的である。
　式（１）中のｎは、３または４であってよい。この構成は、十分な水溶性と短波赤外の十分な蛍光強度とを発現させる観点からより一層効果的である。
　式（１）の化合物は、前述の式（２）～式（９）のいずれかで表される化合物であってよい。この構成は、短波赤外での生体イメージングおよび分子イメージングへの利用の観点から好適である。
　本発明の実施形態における複合体は、本発明の実施形態の化合物における反応性架橋基の残基を介して分子識別剤と当該化合物とが結合している。当該複合体は、短波赤外での生体イメージングおよび分子イメージングに使用することができる。
　当該複合体において、分子識別剤は、抗体、または、抗原結合能を有する当該抗体の断片であってよい。一例において、抗体またはその断片は、分子イメージングの対象となる生体組織に含まれる抗原に対して特異的に結合をする、抗体またはその断片である。この構成は、短波赤外による生体組織での分子イメージングを実現する観点からより一層効果的である。
　本発明の実施形態における短波赤外蛍光剤は、本発明の実施形態の化合物、および、本発明の実施形態の複合体、の一方または両方を含有する。よって、当該短波赤外蛍光剤は、短波赤外による生体イメージングおよび分子イメージングに使用することができる。
　本発明の実施形態における化合物の製造方法は、前述の式（１ａ）で表される第一の化合物を合成する第一の工程と、式（１ａ）中のアニリノ基を前述の式（１ｂ）で表される構造に置き換える第二の工程と、式（１ａ）中のフェニルイミノ基を前述の式（１ｃ）で表される構造に置き換える第三の工程と、を含む。よって、当該製造方法は、短波赤外での生体イメージングを可能とする新規な化合物（式（１）の化合物）を製造することができる。
　本発明の実施形態における化合物の製造方法において、前述の式におけるｎが３であり、Ｘがスルホン酸基の塩である場合では、第二の工程と第三の工程とを一度に行ってもよい。この構成は、前述の式（２）の化合物をより簡易に製造する観点、および、工数の増加による収率の低下を抑制する観点からより一層効果的である。
　本発明の実施形態における化合物の製造方法において、前述の式におけるｎが４であり、Ｘがスルホン酸基の塩である場合では、第二の工程の後に第三の工程を行ってよい。この構成は、前述の式（３）の化合物の製造において、第三の工程における式（１ａ）中のフェニルイミノ基の置き換えの収率を高める観点からより一層効果的である。
　本発明の実施形態における化合物の製造方法において、前述の式におけるｎが３であり、Ｘが反応性架橋基である場合では、第二の工程の後に第三の工程を行ってよい。この構成も、前述の式（４）の化合物の製造において、第三の工程における式（１ａ）中のフェニルイミノ基の置き換えの収率を高める観点からより一層効果的である。
　本発明の実施形態における化合物の製造方法において、前述の式におけるｎが４であり、Ｘが反応性架橋基である場合では、第二の工程の前に第三の工程を行ってよい。この構成は、前述の式（５）の化合物の製造において、式（１ａ）中のアニリノ基およびフェニルイミノ基のそれぞれの置き換えにおける収率を高める観点からより一層効果的である。
　本発明は上述した各実施形態に限定されず、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態も、本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明の実施例について以下に説明する。
　〔試薬の購入先および化合物の同定方法〕
　下記実施例で使用する市販の溶剤および化学薬品は、シグマ　アルドリッチ、東京化成工業株式会社、および富士フィルム和光純薬株式会社から購入した。
　下記実施例での合成反応は、シリカゲルプレート（０．２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ　６０　Ｆ－２５４）での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターされた。下記実施例において、カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ（富士フィルム和光純薬株式会社の登録商標）Ｎ６０、球状、３８－１００μｍ）を使用して実施した。
　下記実施例において、１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ－Ｉｎｏｖａ－５００　ＮＭＲ装置（Ｖａｒｉａｎ社）を用いて、２５°Ｃで測定した。測定用の溶媒には、ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、またはＤＭＳＯ－ｄ６を用いた。化学シフト（δ）はｐｐｍで計測され、結合定数値（Ｊ）はＣＤＣｌ３（δ７．２７）またはＣＤ３ＯＤ（δ３．３１、４．８５）、ＤＭＳＯ－ｄ６（δ２．５０）およびテトラメチルシランに対するヘルツ（Ｈｚ）で示している。なお、信号の多重度には、次の略語を使用している。
　　ｓ＝シングレット；ｄ＝ダブレット；ｔ＝トリプレット；ｑ＝クアルテット；ｍ＝多重項；ｄｄ＝二重項－二重項；
　また、下記実施例において、高分解能質量スペクトルは、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ　Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ、米国）によって取得された。
　〔実施例１　ＩＣＧ－Ｃ９の合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ９を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　［化合物１］
　化合物１として、１，１，２－トリメチル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール（富士フィルム和光純薬）を用意した。
　［化合物２］
　１，１，２－トリメチル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール（１）（２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）と１，４－ブタンスルトン（２．６ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）の混合物を１３０℃で４時間撹拌した。得られた固体を真空濾過により収集し、アセトンで完全に洗浄し、真空下で乾燥させた。こうして、化合物２を淡青色の固体（２．８５ｇ、収率８６％）として得た。化合物２の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ１９Ｈ２３ＮＯ３Ｓの［Ｍ－Ｈ］＋に対する
　　計算値：３４４．１３４４
　　実測値：３４４．１３１
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．１９－８．２１（２Ｈ，ｍ），７．７７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．９４（３Ｈ，ｓ），２．５１－２．５３（２Ｈ，ｍ），２．０３（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．７６－１．８０（２Ｈ，ｍ），１．７５（６Ｈ，ｓ）
　［化合物３］
　化合物３の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　０℃でジメチルホルムアミド（１０ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ）およびメタノール（０．７５ｍＬ）混合溶液に、撹拌しながら不活性雰囲気下で塩化ホスホリル（８ｇ、５２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応温度を５０℃に上げ、２，４－ヘキサジエナール１（２．５ｇ、２６ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を５０℃で約４時間撹拌し、室温に冷却し、過塩素酸ナトリウム水溶液（５％水溶液）に加え、ジクロロメタン（８０ｍＬ）で抽出した。有機相を硫酸ナトリウムに通して濾過した。室温で撹拌したジクロロメタン相に、アニリン（４．８ｇ、５２ｍｍｏｌ）を滴下して加え、一晩撹拌した。得られた沈殿物を濾過により収集し、ジクロロメタンで数回洗浄した。こうして、純粋な化合物３を青色の固体として得た（６．８ｇ、収率７８％）。化合物３の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ１９Ｈ１８Ｎ２の［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：２７５．１５４２
　　実測値：２７５．１５３４
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），７．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ），７．４２（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．４９（７Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），６．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）
　［化合物４（ＩＣＧ－Ｃ９）］
　室温で、化合物２（０．５ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）の無水酢酸（１０ｍＬ）溶液と化合物３（２１５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の混合溶液に、撹拌しながら酢酸ナトリウム（２００ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を加えた。不活性雰囲気下で酢酸（４ｍＬ）を滴下した。混合物を１２０℃で１時間撹拌し、室温に冷却した。反応混合物を３０ｍＬのジエチルエーテルに移し、得られた沈殿物を２－プロパノール：水（４：１、５０ｍＬ）に溶解し、さらに２－プロパノール（３００ｍＬ）で希釈し、再結晶するために一晩４℃で保存した。沈殿物を遠心分離により収集し、得られた残留物を、クロロホルム／メタノール（８：２）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。こうして、化合物４であるＩＣＧ－Ｃ９を褐色の固体（２７０ｍｇ、収率２３％）として得た。化合物４の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ４５Ｈ４９Ｎ２Ｏ６Ｓ２の［Ｍ］＋に対する
　　計算値：７７７．３０２６
　　実測値：７７７．３００５
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．８９－８．０５（６Ｈ，ｍ），７．７６－７．８０（１Ｈ，ｍ），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．５９－７．６６（３Ｈ，ｍ），７．４２－７．５０（３Ｈ，ｍ），６．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），６．４２－６．５１（２Ｈ，ｍ），４．１８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．９４－２．０２（４Ｈ，ｍ），１．９０（１２Ｈ，ｓ），１．７１－１．８５（８Ｈ，ｍ），１．０２－１．０６（２Ｈ，ｍ）
　［化合物４の細胞毒性試験］
　ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０３個ずつ播種し、一晩培養した。０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの各濃度の化合物４の水溶液を試験薬として調製し、各濃度の試験薬をウェルに添加し、ＨｅＬａ細胞をさらに６、２４、４８時間培養した。各時間培養の後、ウェルにＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）試薬を加え、さらに２時間培養した。
　２時間培養の後、ウェルに可溶化液を加え生細胞において生成されたホルマザンをピペッティングにより溶解させた。９６ウェルプレートをシールして密閉し、３７℃のインキュベーターで一晩置くことにより、ホルマザンを完全に可溶化させた。プレートリーダーにより５７０ｎｍ（ホルマザン色素）、６５０ｎｍ（バックグラウンド）を測定し、試験薬を添加していないウェルの細胞生存率を１００％として各濃度の試験薬を添加したウェルの細胞生存率を求めた。結果を図１に示す。上記試験結果から、化合物４は、濃度１～１００ｎＭにおいて、６、２４、４８時間培養条件で細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
　〔実施例２　ＩＣＧ－Ｃ１１の合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ１１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　また、化合物８の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　［化合物５］
　不活性雰囲気下、０℃で水素化ナトリウム（鉱油中６０％、８３３ｍｇ、２０．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフランの溶液に、撹拌しながらトリエチルホスホノ酢酸（５．２ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、次に２，４－ヘキサジエナール１（２ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応物を室温に温め、約２時間撹拌し、塩化アンモニウムでクエンチし、そして酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮して、残留物を得た。これをヘキサン／酢酸エチル（９．５：０．５）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物５を白色固体として得た（３．２５ｇ、収率９４％）。化合物５の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２の［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：１６７．１０６６
　　実測値：１６７．１０６８
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ＝７．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，４．４Ｈｚ），６．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７，４．４Ｈｚ），６．１４－６．２４（２Ｈ，ｍ），５．９０－５．９８（１Ｈ，ｍ），５．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．２１（２Ｈ，ｍ），１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）
　［化合物６］
　不活性雰囲気下、－６０℃で化合物５のジクロロメタン溶液（２．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を攪拌しながら、水素化ジイソブチルアルミニウム（ヘキサン中１．０Ｍ、４５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を－６０℃で３０分間、次いで０℃で１時間撹拌した。水（１０ｍＬ）をゆっくりと加え、続いて水酸化ナトリウム（１５％水溶液１０ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、白色の沈殿物を得た。混合物を室温で１時間激しく撹拌し、硫酸マグネシウムを加え、混合物を、ジクロロメタンを含むセライトで濾過した。有機相を真空で濃縮して粗製物を得、これをヘキサン／酢酸エチル（８：２）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物６を白色固体として得た（１．６５ｇ、収率８９％）。化合物６の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ８Ｈ１０Ｏの［Ｍ＋Ｈ－Ｈ２Ｏ］＋に対する
　　計算値：１０７．０８５５
　　実測値：１０７．０８６０
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ＝６．２０－６．２８（２Ｈ，ｍ），６．０６－６．１４（２Ｈ，ｍ），５．７１－５．８３（２Ｈ，ｍ），４．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），１．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４０（１Ｈ，ｓ）
　［化合物７］
　不活性雰囲気下、室温で、化合物６（１．５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）溶液に、活性化酸化マンガン（７．４ｇ、８４．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合液を濾過し、濾液を濃縮してヘキサン／酢酸エチル（９：１）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製された粗製物を得た。こうして、化合物７を黄色の固体として得た（１．０８ｇ、収率７３％）。化合物７の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ８Ｈ１０Ｏの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：１２３．０８０４
　　実測値：１２３．０８０４
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ＝９．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．９Ｈｚ），６．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３，４．４Ｈｚ），６．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７，４．０Ｈｚ），６．２１（１Ｈ，ｍ），６．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，７．３Ｈｚ），６．０５（１Ｈ，ｍ），１．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
　［化合物８］
　０℃でジメチルホルムアミド（３．２ｍＬ、４２．５ｍｍｏｌ）およびメタノール（０．４ｍＬ）の溶液に、撹拌しながら不活性雰囲気下で塩化ホスホリル（２．５ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応温度を４０℃に上げ、化合物７（１ｇ、８．２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（０．５ｍＬ）を滴下し、反応混合物を４０℃で約４時間撹拌した。反応物を室温（室温）に冷却し、過塩素酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ中１ｇ）に加え、ジクロクロロメタン（２５ｍＬ）で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム層に通して濾過した。室温で攪拌したジクロクロロメタン相に、アニリン（１．５ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を滴下し、一晩攪拌した。得られた沈殿物を濾過により収集し、ジクロロメタンで数回洗浄した。こうして、化合物８を緑色の固体として得た（１．２５ｇ、収率４５％）。化合物８の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ２１Ｈ２０Ｎ２の［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：３０１．１６９９
　　実測値：３０１．１６９９
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），７．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），７．４（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．２７（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．４７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），６．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）
　［化合物９］
　室温で化合物２（２５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１７８ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、当該溶液を撹拌しながら化合物８（２４４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えた。次に無水酢酸（０．４ｍＬ、４．３４ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下で滴下した。反応を３０分間続け、溶媒を真空で除去した。残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物９を金褐色の固体（２７４ｍｇ、収率６４％）として得た。化合物９の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ３６Ｈ３８Ｎ２Ｏ４Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：５９５．２６２５
　　実測値：５９５．２６１７
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），８．２０－８．２５（２Ｈ，ｍ），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．８６－７．９４（２Ｈ，ｍ），７．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５３－７．６１（３Ｈ，ｍ），７．２８－７．３６（３Ｈ，ｍ），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），６．８６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），６．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），５．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ），４．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．００（６Ｈ，s），１．８９－１．９８（２Ｈ，ｍ）
　［化合物１０（ＩＣＧ－Ｃ１１）］
　室温で化合物２（２９ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１２ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）溶液に、当該溶液を攪拌しながら無水酢酸（９μＬ、０．０９２ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（３ｍＬ）に溶解した化合物９（５０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で反応混合物に加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（７．５：２．５）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１０であるＩＣＧ－Ｃ１１を褐色の固体として得た（３３ｍｇ、収率４８％）。化合物１０の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ４７Ｈ５１Ｎ２Ｏ６Ｓ２の［Ｍ］＋に対する
　　計算値：８０３．３１８３
　　実測値：８０３．３２２１
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．０１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．８１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），７．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．４７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），６．４８－６．５７（４Ｈ，ｍ），６．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），４．１７（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．８８（１２Ｈ，ｓ），１．７５－１．８１（１２Ｈ，ｍ）
　［化合物１０の細胞毒性試験］
　化合物４に代えて化合物１０を用いて試験薬を調製する以外は、化合物４の細胞毒性試験と同様にして、ＨｅＬａ細胞の培養とウェルの細胞生存率とを行った。結果を図２に示す。上記試験結果から、化合物１０は、化合物４と同様に、濃度１～１００ｎＭにおいて、６、２４、４８時間培養条件で細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
　〔実施例３　ＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　［化合物１１］
　室温で化合物２（１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（７１２ｍｇ、８．６８ｍｍｏｌ）とエタノール（２５ｍＬ）の混合溶液に、当該溶液を撹拌しながら化合物３（９００ｍｇ）を加えた。次に無水酢酸（１．７ｍＬ、１７．３７ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下で滴下した。反応を３０分間続け、溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１１を金褐色の固体（１．１２ｇ、収率６８％）として得た。化合物１１の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ３４Ｈ３６Ｎ２ＯＳの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：５６９．２４６８
　　実測値：５６９．２４８１
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２５，３．４Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．００－８．０４（１Ｈ，ｍ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５６－７．６７（４Ｈ，ｍ），７．３１－７．３６（３Ｈ，ｍ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，３．０Ｈｚ），６．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．０Ｈｚ），６．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７，２．５Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ），４．５８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１０－２．１６（２Ｈ，ｍ），２．００（６Ｈ，ｓ），１．９８（３Ｈ，ｓ），１．９５－１．９７（２Ｈ，ｍ）
　［化合物１２］
　化合物１２の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　１，１，２－トリメチル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール（化合物１）（２．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）と６－ブロモヘキサン酸（７ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１００ｍＬ）を９０℃、不活性雰囲気下で２日間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。ジエチルエーテルで希釈して生成物を沈殿物として得、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。こうして、化合物１２を薄緑色の固体として得た（３．８ｇ、収率７９％）。化合物１２の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ２１Ｈ２６ＮＯ２の［Ｍ］＋に対する
　　計算値：３２４．１９５８
　　実測値：３２４．１９４９
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．９３（３Ｈ，ｓ），２．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），１．８７－１．９３（２Ｈ，ｍ），１．７５（６Ｈ，ｓ），１．５４－１．６０（２Ｈ，ｍ），１．４３－１．４９（２Ｈ，ｍ）
　［化合物１３］
　室温での化合物１２（１６４ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（５５ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）とエタノール（８ｍＬ）の混合溶液に、当該溶液を撹拌しながら無水酢酸（４３μＬ、０．４４６ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（１０ｍＬ）に溶解した化合物１１（２３０ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で反応混合物に加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（８：２）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１３を暗緑色の固体として得た（２３４ｍｇ、収率７６％）。化合物１３の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ４７Ｈ５２Ｎ２Ｏ５Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：７５７．３６６９
　　実測値：７５７．３６６６
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．８５－８．００（７Ｈ，ｍ），７．５８－７．６５（３Ｈ，ｍ），７．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．３４－７．４８（４Ｈ，ｍ），６．５０－６．６４（３Ｈ，ｍ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６１（１Ｈ，ｑ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．９９－２．０７（４Ｈ，ｍ），１．８６（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．７１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５３（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
　［化合物１４（ＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳ）］
　不活性雰囲気下、化合物１３（２００ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（７６ｍｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１０ｍＬ）に、当該溶液を撹拌しながらＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３６ｍｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液とするカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１４であるＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳを暗緑色の固体（１２５ｍｇ、収率５５％）として得た。化合物１４の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ５１Ｈ５５Ｎ３Ｏ７Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：８５４．３８３３
　　実測値：８５４．３８２８
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．９６（６Ｈ，ｍ），７．６２（３Ｈ，ｍ），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３４－７．５３（４Ｈ，ｍ），６．５０－６．６５（３Ｈ，ｍ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６５－２．７０（２Ｈ，ｍ），２．００－２．０７（４Ｈ，ｍ），１．９７（１２Ｈ，ｓ），１．８２－１．９２（６Ｈ，ｍ），１．６１－１．７３（２Ｈ，ｍ），１．３９－１．４５（２Ｈ，ｍ）
　〔実施例４　ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　［化合物１５］
　室温で化合物１２（２５０ｍｇ、０．６１８ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（１０１ｍｇ、１．２３６ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍＬ）溶液に、当該溶液を撹拌しながら化合物８（２０８ｍｇ、０．６１８ｍｍｏｌ）を加えた。次に無水酢酸（１７５μＬ、１．８５５ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下で滴下した。反応を３０分間続け、溶媒を真空で除去した。残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液とするカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１５を金褐色の固体（３１０ｍｇ、収率７７％）として得た。化合物１５の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ３８Ｈ４１Ｎ２Ｏ３の［Ｍ］＋に対する
　　計算値：５７３．３１１１
　　実測値：５７３．３１０８
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，４．０Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．８９（２Ｈ，ｍ），７．７７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｊ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．８，２．４Ｈｚ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），６．７９－６．９０（２Ｈ，ｍ），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．４Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．０Ｈｚ），６．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．４Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．０Ｈｚ），４．５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）２．０１（６Ｈ，ｓ），１．９２－１．９７（５Ｈ，ｍ），１．６９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
　［化合物１６］
　不活性雰囲気下、０℃で化合物１５（１１０ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（４８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、当該溶液を撹拌しながらＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（８６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物を、クロロホルム／メタノール（９．５：０．５）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１６を褐色の固体として得た（８８ｍｇ、収率７０％）。化合物１６の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ４２Ｈ４４Ｎ３Ｏ５の［Ｍ］＋に対する
　　計算値：６７０．３２７５
　　実測値：６７０．３２７２
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ＝８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．８７－７．８９（２Ｈ，ｍ），７．７７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５４－７．６１（４Ｈ，ｍ），７．２９－７．３８（３Ｈ，ｍ），７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），６．７８－６．９０（２Ｈ，ｍ），６．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．５０（Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．７６－２．８４（４Ｈ，ｍ），２．０１（６Ｈ，ｓ），１．８９－１．９７（４Ｈ，ｍ），１．８５（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ）
　［化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）］
　室温で、化合物２（５５ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）溶液に、当該溶液を撹拌しながら無水酢酸（１５μＬ、０．１６０ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（５ｍＬ）に溶解した化合物１６（８０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で反応混合物に加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液としてカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１７であるＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳを暗緑色の固体として得た（４２ｍｇ、収率４５％）。化合物１７の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ５３Ｈ５７Ｎ３Ｏ７Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：８８０．３９９０
　　実測値：８８０．３９８５
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３７－７．４４（２Ｈ，ｍ），７．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），６．４５－６．６４（５Ｈ，ｍ），６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ），４．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．８０（４Ｈ，ｓ），２．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．９０（６Ｈ，ｓ），１．８８（６Ｈ，ｓ），１．８２－１．８６（３Ｈ，ｍ），１．６８－１．７９（７Ｈ，ｍ），１．５０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．４０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
　［ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳの他の合成方法］
　なお、ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳは、以下に示す合成スキームにしたがっても合成することが可能である。以下、ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳの他の合成法を具体的に説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　［化合物１８］
　室温で化合物２（１７５ｍｇ、０．５０５ミリモル）および酢酸ナトリウム（２１ｍｇ、０．８３８ミリモル）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、無水酢酸（５３μＬ、０．５５５ミリモル）を加えた。次に、エタノール（１０ｍＬ）に溶解した化合物１５（３３０ｍｇ、０．５０５ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で上記反応混合物に加え、混合物を６０℃で約１．５時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（８：２）を溶出液とするカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、化合物１８を暗褐色の固体として得た（１２７ｍｇ、６４％）。化合物１８の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｚ）：分子式Ｃ４９Ｈ５４Ｎ２Ｏ５Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：７８３．３８２６
　　実測値：７８３．３８１７
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．６５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３７－７．４４（２Ｈ，ｍ），７．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），６．４５－６．６３（５Ｈ，ｍ），６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），４．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．１４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．９０（６Ｈ，ｓ），１．８８（６Ｈ，ｓ），１．８２－１．８４（２Ｈ，ｍ），１．６８－１．７９（４Ｈ，ｍ），１．５５（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．４０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
　［化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）］
　不活性雰囲気下０°Ｃで化合物１８（５３ｍｇ、０．０６７７ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（２０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（８ｍＬ）溶液に、当該溶液を攪拌しながら、Ｎ，Ｎ‘－ジシクロヘキシルカルボジイミド（３５ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１ｍＬ）溶液を滴下し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物を、クロロホルム／メタノール（９：１）を溶出液とするカラムクロマトグラフィーによって精製した。こうして、ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ（化合物１７）を暗褐色の固体として得た（３１ｍｇ、５２％）。得られた化合物１７の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果は、前述の通りである。
　〔実施例５　ＩＣＧ－Ｃ９－マレイミドの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ９－マレイミドを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　［化合物１９］
　不活性雰囲気下、室温でジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物１３（６０ｍｇ、０．０７９ミリモル）の撹拌溶液に、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）（７５ｍｇ、０．１９８ミリモル）、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３１ｍｇ、０．２３７ミリモル）、１－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で約４～５時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、暗褐色の固体として化合物１９を得た（４５ｍｇ、６４％）。化合物１９の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析　（ｍ／ｓ）：　分子式Ｃ５３Ｈ５８Ｎ４Ｏ６Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：８７９．４１４９
　　実測値：８７９．４１２１
　１Ｈ　ＮＭＲ　（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．５，８．３Ｈｚ），７．９９－８．０６（４Ｈ，ｍ），７．８５－７．８８（２Ｈ，ｍ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５９－７．６５（３Ｈ，ｍ），７．４３－７．５１（３Ｈ，ｍ），７．３４－７．３７（１Ｈ，ｍ），６．４６－６．６４（４Ｈ，ｍ），６．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），４．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．５８（１Ｈ，ｓ），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），１．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），１．９０（６Ｈ，ｓ），１．８９（６Ｈ，ｓ），１．８４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．７７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
　〔実施例６　ＩＣＧ－Ｃ９－アルキンの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ９－アルキンを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　［化合物２０］
　不活性雰囲気下、室温でＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物１３（６０ｍｇ、０．０７９ミリモル）の撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（７５ｍｇ、０．１９８ミリモル）、ＤＩＰＥＡ（３１ｍｇ、０．２３８ミリモル）、プロパルギルアミン（９ｍｇ、０．１５９ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で約４～５時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール（９：１）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、暗褐色の固体として化合物２０を得た（４３ｍｇ、６８％）。化合物２０の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｓ）：分子式Ｃ５３Ｈ５８Ｎ４Ｏ６Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：７９３．３９０７
　　実測値：７９３．３７９０
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．１９－８．２４（３Ｈ，ｍ），８．００－８．０６（４Ｈ，ｍ），７．８８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．２），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６０－７．６５（３Ｈ，ｍ），７．４４－７．５１（３Ｈ，ｍ），６．５０－６．６４（３Ｈ，ｍ），６．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），４．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．１３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８０－３．８２（２Ｈ，ｍ），３．０６（１Ｈ，ｓ），２．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．９０（６Ｈ，ｓ），１．８９（６Ｈ，ｓ），１．８４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６８－１．７９（４Ｈ，ｍ），１．５６（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３８（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２２－１．２５（２Ｈ，ｍ）
　〔実施例７　ＩＣＧ－Ｃ１１－マレイミドの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ１１－マレイミドを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　［化合物２１］
　不活性雰囲気下、室温でジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物１８（５０ｍｇ、０．０６４ミリモル）の撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（６０ｍｇ、０．１６０ミリモル）、ＤＩＰＥＡ（２５ｍｇ、０．１９２ミリモル）、１－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（１７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物を、クロロホルム／メタノール（９：１）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、暗緑色の固体として化合物２１を得た（３２ｍｇ、５５％）。化合物２１の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｓ）：分子式Ｃ５３Ｈ５８Ｎ４Ｏ６Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：９０５．４３０６
　　実測値：９０５．４２９５
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．９４（２Ｈ，ｓ），８．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．９７－８．００（２Ｈ，ｍ），７．８７－７．９０（２Ｈ，ｍ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５７－７．７５（５Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３６－７．４４（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），６．９８（２Ｈ，ｓ），６．４６－６．６２（４Ｈ，ｍ），６．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ），４．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．１１－３．１５（２Ｈ，ｍ），１．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．８９（６Ｈ，ｓ），１．８７（６Ｈ，ｓ），１．８１－１．８６（２Ｈ，ｍ），１．７６（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６８（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３２－１．３７（２Ｈ，ｍ）
　〔実施例８　ＩＣＧ－Ｃ１１－アルキンの合成〕
　以下に示す合成スキームにしたがって、本発明の化合物であるＩＣＧ－Ｃ１１－アルキンを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　［化合物２２］
　不活性雰囲気下、室温でジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物１８（５０ｍｇ、０．０６４ミリモル）の撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（６１ｍｇ、０．１６０ミリモル）、ＤＩＰＥＡ（２５ｍｇ、０．１９２ミリモル）、プロパルギルアミン（７ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残留物を、クロロホルム／メタノール（９：１）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、暗緑色の固体として化合物２２得た（３０ｍｇ、５８％）。化合物２２の質量分析（ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の分析結果を以下に示す。
　高分解能質量分析（ｍ／ｓ）：分子式Ｃ５３Ｈ５８Ｎ４Ｏ６Ｓの［Ｍ＋Ｈ］＋に対する
　　計算値：９２０．４１４２
　　実測値：９２０．４１３０
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ＝８．１７－８．２４（３Ｈ，ｍ），８．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），７．７０－７．７９（２Ｈ，ｍ），７．５８－７．６６（３Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７），６．４６－６．６２（４Ｈ，ｍ），６．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），４．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），３．８０－３．８２（２Ｈ，ｍ），３．０６（１Ｈ，ｓ），２．９１（２Ｈ，ｓ），２．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．８９（６Ｈ，ｓ），１．８７（６Ｈ，ｓ），１．８１－１．８４（２Ｈ，ｍ），１．７６（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．７０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．３７（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
　〔実施例９、１０〕
　［短波赤外蛍光剤１、２の調製］
　化合物４（ＩＣＧ－Ｃ９）の１ｍｇを１ｍＬのジメチルスルホキシド（富士フィルム和光純薬株式会社）に溶解する。次に、この溶液の０．１ｍＬを重量比１％の牛血清アルブミン（シグマ　アルドリッチ）０．９ｍＬに加える。この溶液１ｍＬを蒸留水で透析（スペクトラム透析、ＭＷＣＯ：５０ｋＤａ）した。こうして、血管、およびリンパ節の造影用の蛍光プローブ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１％牛血清アルブミン）を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤１とする。
　また、化合物４に代えて化合物１０（ＩＣＧ－Ｃ１１）を用いる以外は、短波赤外蛍光剤１と同様にして、短波赤外蛍光剤２を調製した。
　［短波赤外蛍光剤１、２による血管およびリンパ節の造影］
　＜マウスの下肢部および腹部の血管の造影＞
　ヘアレスマウス（オス５週齢、Ｈｏｓ：ＨＲ－１、日本エスエルシー株式会社）をイソフルラン（富士フィルム和光純薬株式会社）の麻酔下で、その尾静脈から０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤１を注入した。その後、ヘアレスマウスの下肢部および腹部の血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。
　また、短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤２を用いる以外は、短波赤外蛍光剤１による短波赤外での蛍光イメージングと同様にして、ヘアレスマウスの下肢部および腹部の血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。浜松ホトニクス株式会社製、冷却ＩｎＧａＡｓ短波赤外カメラ（Ｃ１０６３３－３４、ペルチェ冷却＋水冷　－７０°Ｃ、暗電流１３２ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ／ｐｉｘｅｌ／ｓ）を使用して蛍光画像を撮影した。
　短波赤外蛍光剤１による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９０５ｎｍ、蛍光検出波長は１０００ｎｍであった。短波赤外蛍光剤２による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９７５ｎｍ、蛍光検出波長は１１００ｎｍであった。いずれの短波赤外での蛍光イメージングにおいても、励起光の強度は、２０～４０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は５～１０秒間であった。
　へアレスマウスの下肢部および腹部における明視野画像と、短波赤外蛍光剤１による短波赤外蛍光画像を表す写真を図３に示す。また、へアレスマウスの下肢部および腹部における明視野画像と、短波赤外蛍光剤２による短波赤外蛍光画像を表す写真を図４に示す。図３、図４に示されるように、短波赤外蛍光剤１、短波赤外蛍光剤２は、いずれも、肢部および腹部における血管の短波赤外光の明瞭な像を形成することができる。より詳しくは、短波赤外蛍光剤１、短波赤外蛍光剤２による短波赤外蛍光画像は、いずれも、蛍光シグナルの強度が強く、かつ画像のにじみが少なく、鮮明である。このように、短波赤外蛍光剤１および短波赤外蛍光剤２によって、実用可能のみならず実用上優れた短波赤外での生体の蛍光イメージングが実現される。
　＜マウスの脳血管の造影＞
　ヘアレスマウス（オス５週齢、Ｈｏｓ：ＨＲ－１、日本エスエルシー株式会社）をイソフルラン（富士フィルム和光純薬株式会社）の麻酔下で、その尾静脈から０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤１を注入した。その後、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。蛍光画像の撮影は、浜松ホトニクス株式会社製、冷却ＩｎＧａＡｓ短波赤外カメラ（Ｃ１０６３３－３４、ペルチェ冷却＋水冷　－７０℃、暗電流１３２ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ／ｐｉｘｅｌ／ｓ）を使用した。
　また、短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤２を用いる以外は、短波赤外蛍光剤１による短波赤外での蛍光イメージングと同様にして、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。
　さらに、比較のため、短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤Ｃ１を用いる以外は、短波赤外蛍光剤１による短波赤外での蛍光イメージングと同様にして、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。短波赤外蛍光剤Ｃ１は、化合物４に代えてＩＣＧを用いる以外は短波赤外蛍光剤１と同様に調整された蛍光剤である。
　短波赤外蛍光剤１による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９０５ｎｍであり、蛍光検出波長は１０００ｎｍであった。また、励起光の強度は１０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１秒間であった。
　短波赤外蛍光剤２による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９７５ｎｍであり、蛍光検出波長は１１００ｎｍであった。励起光の強度は２０～４０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１～２．５秒間であった。
　短波赤外蛍光剤Ｃ１による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は７５８ｎｍであり、蛍光検出波長は９００ｎｍであった。また、励起光の強度は、５ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１秒間であった。
　へアレスマウスの頭頂部における明視野画像と、短波赤外蛍光剤Ｃ１、１、２による短波赤外蛍光画像を表す写真を図５に示す。図５に示されるように、短波赤外蛍光剤１、２は、ＩＣＧを含有する短波赤外蛍光剤Ｃ１に比べて、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外光の外部から観察可能な像を、明確に、また脳血管の細部まで形成することができる。
　〔実施例１１、１２〕
　［短波赤外蛍光剤３、４の調製］
　短波赤外蛍光剤３、４をそれぞれ調製した。短波赤外蛍光剤３は、化合物１４（ＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳ）が反応性架橋基の残基であるカルボニル基を含むアミド基を介して牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合しており、短波赤外蛍光剤４は、化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）が当該アミド基を介してＢＳＡと結合している。短波赤外蛍光剤３、４の調製スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の５ｍｇを１０ｍＭの炭酸ナトリウム溶液１ｍＬに溶解し、化合物１４のジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の０．１ｍＬを反応させた。こうして、ＢＳＡが結合した化合物１４（ＩＣＧ－Ｃ９－ＢＳＡ）を得た。精製は、生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を溶出液としてゲル濾過カラム（ＰＤ１０，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって行った。ＩＣＧ－Ｃ９－ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳに溶解させた。得られた水溶液を短波赤外蛍光剤３とする。
　また、化合物１４に代えて化合物１７を用いる以外は、短波赤外蛍光剤３と同様にして、短波赤外蛍光剤４を調製した。
　［短波赤外蛍光剤３、４による血管およびリンパ節の造影］
　＜マウスの下肢部および腹部の血管の造影＞
　短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤３または短波赤外蛍光剤４を用いる以外は実施例５と同様にして、ヘアレスマウスの下肢部および腹部の血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。
　短波赤外蛍光剤３による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９０５ｎｍであり、蛍光検出波長は１０００ｎｍであった。また、励起光の強度は１０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は５秒間であった。へアレスマウスの下肢部および腹部の明視野画像と、短波赤外蛍光剤３による短波赤外蛍光画像を表す写真を図６に示す。
　短波赤外蛍光剤４による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９７５ｎｍであり、蛍光検出波長は１１００ｎｍであった。また、励起光の強度は２０～４０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は５～１５秒間であった。へアレスマウスの下肢部および腹部の明視野画像と、短波赤外蛍光剤４による短波赤外蛍光画像を表す写真を図７に示す。
　図６、図７に示されるように、短波赤外蛍光剤３、短波赤外蛍光剤４も、短波赤外蛍光剤１、短波赤外蛍光剤２と同様に、下肢部および腹部における血管の短波赤外光の明瞭な像を形成することができる。
　＜マウスの脳血管の造影＞
　短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤３または短波赤外蛍光剤４を用いる以外は実施例５と同様にして、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。
　さらに、比較のため、短波赤外蛍光剤１に代えて短波赤外蛍光剤Ｃ２を用いる以外は実施例５と同様にして、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外での蛍光イメージングを行った。短波赤外蛍光剤Ｃ２は、化合物１４に代えてＩＣＧ－ＮＨＳを用いる以外は短波赤外蛍光剤１と同様に調整された蛍光剤である。ＩＣＧ－ＮＨＳは、五稜化薬株式会社から購入することができる。
　短波赤外蛍光剤３による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９０５ｎｍであり、蛍光検出波長は１０００ｎｍであった。また、励起光の強度は１０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は７．５秒間であった。
　短波赤外蛍光剤４による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９７５ｎｍであり、蛍光検出波長は１１００ｎｍであった。また、励起光の強度は２０～４０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１秒間であった。
　短波赤外蛍光剤Ｃ２による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は７５８ｎｍであり、蛍光検出波長は９００ｎｍであった。また、励起光の強度は５ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は２０秒間であった。
　へアレスマウスの頭頂部における明視野画像と、短波赤外蛍光剤Ｃ２、３、４による短波赤外蛍光画像を表す写真を図８に示す。図８に示されるように、短波赤外蛍光剤３、４も、短波赤外蛍光剤１、２と同様に、ヘアレスマウスの脳血管の短波赤外光の外部から観察可能な像を、明確に、また脳血管の細部まで形成することができる。これに対して、短波赤外蛍光剤Ｃ２による短波赤外光の像からでは、ヘアレスマウスの脳血管を外部から観察することは困難であった。
　〔実施例１３～１５〕
　［複合体１～３の調製］
　複合体１、２をそれぞれ調製した。複合体１は、化合物１４（ＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳ）が反応性架橋基の残基であるカルボニル基を含むアミド基を介して抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）と結合しており、複合体２は、化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）が当該アミド基を介して抗体と結合している。複合体１、２の調製スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　抗ヒトＥＧＦＲモノクロナール抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ（アービタックス）、メルクセローノ株式会社）の２ｍｇを１０ｍＭの炭酸ナトリウム溶液１ｍＬに溶解し、化合物１４のジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の５０μＬを反応させ、化合物１４がＥｒｂｉｔｕｘで修飾された複合体１（ＩＣＧ－Ｃ９－Ｅｒｂｉｔｕｘ）を得た。精製は、ゲル濾過カラムによって行った。
　また、化合物１４に代えて化合物１７を用いる以外は、複合体１と同様にして、化合物１７がＥｒｂｉｔｕｘで修飾された複合体２（ＩＣＧ－Ｃ１１－Ｅｒｂｉｔｕｘ）を調製した。
　［蛍光特性］
　複合体１、２のそれぞれをＰＢＳに溶解した水溶液の蛍光スペクトルを測定した。測定した水溶液の濃度は１ｍｇ／ｍＬである。また、励起光の波長は、複合体１では７８５ｎｍ、複合体２では９００ｎｍである。複合体１、２の蛍光スペクトルを図９に示す。図９に示されるように、複合体１の蛍光の発光ピークは約９５０ｎｍであり、複合体２の蛍光の発光ピークは約１１００ｎｍであった。
　さらに、抗ヒトＥＧＦＲモノクロナール抗体に代えて抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である抗ＨＥＲ２抗体チューブリン重合阻害剤複合体（Ｋａｄｃｙｒａ（カドサイラ、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社の登録商標）、中外製薬）を用いる以外は複合体２の調製と同様にして、化合物１７がＫａｄｃｙｌａで修飾された複合体３（ＩＣＧ－Ｃ１１－Ｋａｄｃｙｌａ）を調製した。複合体３も、複合体２と同様に、化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）が、カルボニル基を含むアミド基を介してアミド基を介して、上記抗体－薬物複合体における抗体と結合している。複合体３の励起光の波長および蛍光ピークは、複合体２のそれと実質的に同じである。
　〔実施例１６～１８〕
　［短波赤外蛍光剤５～７の調製］
　複合体１をＰＢＳで希釈して濃度１ｍｇ／ｍＬの複合体１の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤５とする。
　複合体１に代えて複合体２を用いる以外は短波赤外蛍光剤５と同様にして短波赤外蛍光剤６を調製した。また、複合体１に代えて複合体３を用いる以外は短波赤外蛍光剤５と同様にして短波赤外蛍光剤７を調製した。
　［短波赤外蛍光剤５、６による乳がん腫瘍の蛍光イメージング］
　＜乳がんモデルマウスの作製＞
　５週令ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ　Ｓｌｃ－ｎｕ／ｎ、日本ＳＬＣ）にヒト乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＡＴＣＣ）、約１．５×１０７個）をマウス下肢の第２乳房付近に移植した。こうして、乳がんモデルマウスとしての担がんマウスを作製した。当該マウスを２～３週間生育し、腫瘍のサイズを数ミリまで成長させた。
　＜乳がんモデルマウスにおける乳がん腫瘍の蛍光イメージング＞
　上記担がんマウスをイソフルラン（富士フィルム和光純薬株式会社）の麻酔下で、その尾静脈から０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤５を注入した、その後、担がんマウスの乳がん腫瘍の短波赤外での蛍光イメージングをｉｎ　ｖｉｖｏで行った。その後、担がんマウスを解剖し、担がんマウスの乳がん腫瘍および臓器（心臓、腎臓、脾臓および肝臓）を取り出した。そして、取り出した乳がん腫瘍および各臓器の短波赤外での蛍光イメージングをｅｘ　ｖｉｖｏで行った。
　短波赤外蛍光剤５による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９０５ｎｍであり、蛍光検出波長は１０００ｎｍであった。また、励起光の強度は１０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１５秒間であった。ｉｎ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍の明視野画像と、短波赤外蛍光剤５による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１０に示す。また、ｅｘ　ｖｉｖｏでのヌードマウスの乳がん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓の明視野画像と、短波赤外蛍光剤５による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１１に示す。
　また、短波赤外蛍光剤５に代えて短波赤外蛍光剤６を用いる以外は、短波赤外蛍光剤５による短波赤外での蛍光イメージングと同様にして、上記のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｅｘ　ｖｉｖｏでの短波赤外での蛍光イメージングを行った。
　短波赤外蛍光剤６による短波赤外での蛍光イメージングでは、励起波長は９７５ｎｍであり、蛍光検出波長は１１００ｎｍであった。また、励起光の強度は２０～４０ｍＷ／ｃｍ２であり、露光時間は１５～３０秒間であった。ｉｎ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍の明視野画像と、短波赤外蛍光剤６による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１２に示す。また、ｅｘ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓の明視野画像と、短波赤外蛍光剤６による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１３に示す。
　図１０、１１、１２および１３から明らかなように、乳がん腫瘍は、複合体１または複合体２の集積により短波赤外蛍光を発している。このように、短波赤外蛍光剤５および短波赤外蛍光剤６は、いずれも、乳がん腫瘍に特異的に結合し、かつ短波赤外光の検出により乳がん腫瘍の像を形成することができることがわかる。
　また、図１０、１１、１２および１３から明らかなように、心臓、腎臓、脾臓および肝臓の各臓器からも、複合体１または複合体２による短波赤外蛍光の発光が認められた。心臓および腎臓での発光は、脾臓および肝臓での発光に比べて弱い。心臓の発光が弱い理由は、血液は心臓には滞留せず通過するだけであるため、と考えられる。また、腎臓の発光が弱い理由は、腎臓に到達した複合体は尿として体外に排出されることから、脾臓および肝臓に比べて複合体の貯蔵量が少ないため、と考えられる。
　［短波赤外蛍光剤７による乳がん腫瘍の蛍光イメージング］
　ヒト乳がん細胞にＫＰＬ－４細胞（川崎医大からの提供、約１．５×１０７個）を用いる以外は前述の乳がんモデルマウスの作製と同様にして、担がんマウスを作製し、腫瘍のサイズを数ミリまで成長させた。そして、短波赤外蛍光剤６に代えて短波赤外蛍光剤７を用いる以外は同様にして、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｅｘ　ｖｉｖｏによる乳がんモデルマウスにおける乳がん腫瘍の蛍光イメージングを行った。ｉｎ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍の明視野画像と、短波赤外蛍光剤７による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１４に示す。また、ｅｘ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍、心臓、腎臓、脾臓および肝臓の明視野画像と、短波赤外蛍光剤７による短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１５に示す。
　図１４および図１５から明らかなように、短波赤外蛍光剤７も、短波赤外蛍光剤６と同様に、乳がん腫瘍に特異的に結合し、かつ短波赤外光の検出により乳がん腫瘍の像を形成することができることがわかる。
　〔実施例１９、２０〕
　［複合体４、５の調製］
　複合体４、５をそれぞれ調製した。複合体４は、化合物１９（ＩＣＧ－Ｃ９－マレイミド）が反応性架橋基の残基であるスクシンイミド基を介して抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と結合しており、複合体５は、化合物２１（ＩＣＧ－Ｃ１１－マレイミド）が当該スクシンイミド基を介して当該抗体と結合している。複合体４、５の調製スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　抗ヒトＨＥＲ２モノクロナール抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ハーセプチン）、中外製薬株式会社）の２ｍｇを１０ｍＭの炭酸ナトリウム溶液１ｍＬに溶解し、これに２０μＬのＮＨＳ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）ジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、室温で１時間反応させた。次に２ｍｇのジチオトレイトール（東京化成工業株式会社）を加え３０分間放置し、ＰＢＳを溶出液としてゲル濾過により過剰のジチオトレイトールを除去した。この溶液に、５０μＬの化合物１９（ＩＣＧ－Ｃ９－マレイミド）ないしは化合物２１（ＩＣＧ－Ｃ１１－マレイミド）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、２時間室温で反応させた。精製はゲル濾過カラムにより行い、複合体４（ＩＣＧ－Ｃ９－マレイミド－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）および複合体５（ＩＣＧ－Ｃ１１－マレイミド－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を得た。
　〔実施例２１、２２〕
　［複合体６、７の調製］
　複合体６、７をそれぞれ調製した。複合体６は、化合物２０（ＩＣＧ－Ｃ９－アルキン）が反応性架橋基の残基であるトリアゾール基を介して抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と結合しており、複合体７は、化合物２２（ＩＣＧ－Ｃ１１－アルキン）が当該トリアゾール基を介して当該抗体と結合している。複合体６、７の調製スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　抗ヒトＨＥＲ２モノクロナール抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ハーセプチン）、中外製薬株式会社）の２ｍｇを１０ｍＭの炭酸ナトリウム溶液１ｍＬに溶解し、これに２０μＬのＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳｅｓｔｅｒ（東京化成工業株式会社）ジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、室温で１時間反応させた。未反応のＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳｅｓｔｅｒは、ＰＢＳを溶出液としてゲル濾過により除去し、Ａｚｉｄｏ－ＰＥＧ４を修飾した抗ヒトＥＧＦＲモノクロナール抗体を調整した。次に、０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に、１０μＬのトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（３ｍｇ／ｍＬ水溶液、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの硫酸銅（０．５ｍｇ／ｍＬ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，ナカライテスク株式会社）、５０μＬの化合物２０（ＩＣＧ－Ｃ９－アルキン）ないしは化合物２２（ＩＣＧ－Ｃ１１－アルキン）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。さらに１０μＬのアスコルビン酸ナトリウム（１００ｍｇ／ｍＬ，ナカライテスク株式会社）を加え１分間放置した。この溶液に、１ｍＬのＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４修飾抗ヒトＥＧＦＲモノクロナール抗体（２ｍｇ／ｍＬ）を加え１２時間室温で反応させた。精製は遠心およびゲル濾過（ＰＤ１０カラム，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、複合体６（ＩＣＧ－Ｃ９－アルキン－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）および複合体７（ＩＣＧ－Ｃ１１－アルキン－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を得た。
　〔実施例２３、２４〕
　［短波赤外蛍光剤８、９の調製］
　複合体４をＰＢＳで希釈して濃度１ｍｇ／ｍＬの複合体４の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤８とする。また、複合体５をＰＢＳで希釈して濃度１ｍｇ／ｍＬの複合体５の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤９とする。
　［短波赤外蛍光剤８（複合体４）および９（複合体５）による乳がんイメージング］
　ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞（ＫＰＬ－４）を移植したヌードマウスに、０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤８（１ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体４）および０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤９（１ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体５）を尾静脈から注入し、３日後に、担がんマウスの乳がん腫瘍の短波赤外での蛍光イメージングをｉｎ　ｖｉｖｏで行った。蛍光画像の撮影条件は、励起波長が９０５ｎｍで蛍光検出波長は１０００ｎｍ以上であった。励起光の強度は、２０ｍＷ／ｃｍ２で、露光時間は５秒間であった。短波赤外蛍光剤８および短波赤外蛍光剤９のそれぞれにおけるｉｎ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１６に示す。この結果から、短波赤外蛍光剤８、９によっても乳がん腫瘍が明瞭に検出できることが示された。
　〔実施例２５、２６〕
　［短波赤外蛍光剤１０、１１の調製］
　複合体６をＰＢＳで希釈して濃度１ｍｇ／ｍＬの複合体６の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤１０とする。また、複合体７をＰＢＳで希釈して濃度１ｍｇ／ｍＬの複合体７の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤１１とする。
　［短波赤外蛍光剤１０（複合体６）および１１（複合体７）による乳がんイメージング］
　ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞（ＫＰＬ－４）を移植したヌードマウスに、０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤１０（１ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体６）および０．２ｍＬの短波赤外蛍光剤１１（１ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体７）を尾静脈から注入し、３日後に担がんマウスの乳がん腫瘍の短波赤外での蛍光イメージングをｉｎ　ｖｉｖｏで行った。蛍光画像の撮影条件は、励起波長が９０５ｎｍで蛍光検出波長は１０００ｎｍ以上であった。励起光の強度は、２０ｍＷ／ｃｍ２で、露光時間は１０秒間（短波赤外蛍光剤１０）と３０秒間（短波赤外蛍光剤１１）であった。短波赤外蛍光剤１０および短波赤外蛍光剤１１のそれぞれにおけるｉｎ　ｖｉｖｏでのヌードマウスにおける乳がん腫瘍の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１７に示す。この結果から、短波赤外蛍光剤１０、１１によっても乳がん腫瘍が明瞭に検出できることが示された。
　〔実施例２７、２８〕
　［複合体８、９の調製］
　組み換えタンパク質であるアネキシンＶの合成は発明者の論文（Setsuko Tsuboi and Takashi Jin, ChemBioChem 18, 2231-2235, 2017）で公表されている方法に従った。１ｍＬのアネキシンＶのＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に５０μＬの化合物１４（ＩＣＧ－Ｃ９－ＮＨＳ）ないしは化合物１７（ＩＣＧ－Ｃ１１－ＮＨＳ）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１時間反応させた。精製はゲル濾過カラムにより行い、複合体８（ＩＣＧ－Ｃ９－アネキシンＶ）および複合体９（ＩＣＧ－Ｃ１１－アネキシンＶ）を得た。
　〔実施例２９、３０〕
　［短波赤外蛍光剤１２、１３の調製］
　複合体８をＰＢＳで希釈して濃度０．５ｍｇ／ｍＬの複合体８の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤１２とする。また、複合体９をＰＢＳで希釈して濃度０．５ｍｇ／ｍＬの複合体９の水溶液を得た。当該水溶液を短波赤外蛍光剤１３とする。
　［短波赤外蛍光剤１２（複合体８）および１３（複合体９）による乳がん細胞のアポトーシス（細胞死）イメージング］
　ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞（ＫＰＬ－４）を移植したヌードマウスに、０．１ｍＬのＫａｄｃｙｌａ（カドサイラ、２ｍｇ／ｍＬ）を尾静脈から注入し、３日後に腫瘍部分の短波赤外蛍光剤１２（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体８）または短波赤外蛍光剤１３（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体９）を注入した。翌日、担がんマウスの乳がん腫瘍の短波赤外での蛍光イメージングをｉｎ　ｖｉｖｏで行った。蛍光画像の撮影条件は、励起波長が９０５ｎｍで蛍光検出波長は１０００ｎｍ以上であった。励起光の強度は、２０ｍＷ／ｃｍ２で、露光時間は５秒間（短波赤外蛍光剤１２）と１０秒間（短波赤外蛍光剤１３）であった。短波赤外蛍光剤１２および短波赤外蛍光剤１３のそれぞれについて、カドサイラを注入したヌードマウス（左）とカドサイラを注入していないヌードマウス（右）とにおけるｉｎ　ｖｉｖｏでの乳がん腫瘍の明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１８に示す。
　蛍光画像から、Ｋａｄｃｙｌａにより腫瘍細胞のアポトーシス（細胞死）が誘導されていることが示された。コントロールの画像（右図）はＫａｄｃｙｌａを注入していない乳がん腫瘍ヌードマウスに対するもので、短波赤外蛍光剤１２および１３の顕著な集積は認められなかった。
　［短波赤外蛍光剤１３（複合体９）による乳がん細胞のアポトーシス（細胞死）の時間経過イメージング］
　ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞（ＫＰＬ－４）を移植したヌードマウスに、０．１ｍＬのＫａｄｃｙｌａ（カドサイラ、２ｍｇ／ｍＬ）を尾静脈から注入し、３日後に腫瘍部分の短波赤外蛍光剤１３（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の複合体９）を注入した。その後、３日、５日、１１日後に、担がんマウスの乳がん腫瘍の短波赤外での蛍光イメージングをｉｎ　ｖｉｖｏで行った。蛍光画像の撮影条件は、励起波長が９０５ｎｍで蛍光検出波長は１０００ｎｍ以上であった。励起光の強度は、２０ｍＷ／ｃｍ２で、露光時間は１０秒間であった。短波赤外蛍光剤１３におけるカドサイラを注入したヌードマウスのｉｎ　ｖｉｖｏでの乳がん腫瘍の、特定の時間経過後における明視野画像と短波赤外蛍光画像とを表す写真を図１９に示す。
　蛍光画像からは、Ｋａｄｃｙｌａ処理により腫瘍細胞のアポトーシス（細胞死）が誘導され、腫瘍サイズが小さくなることが確認できた。この結果は、本短波赤外蛍光剤が動物実験レベルでの抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の効果確認に有効であることを示している。
　本発明は、短波赤外での蛍光イメージング技術に利用することができ、本発明によって、従来技術をはるかに凌ぐ高分解能な生体深部の可視化が期待される。

Claims (12)

  1. 　下記式（１）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（式（１）中、ｎは３～５の整数を表し、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。）
  2. 　前記反応性架橋基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アルキニル基、マレイミド基およびアジド基からなる群から選ばれる一以上の有機基を含む、請求項１に記載の化合物。
  3. 　前記ｎは、３または４である、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 　下記式（２）～式（９）のいずれかで表される、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  5. 　請求項１～４のいずれか一項の化合物における前記反応性架橋基の残基を介して分子識別剤と前記化合物とが結合している複合体。
  6. 　前記分子識別剤は、抗体、または、抗原結合能を有する当該抗体の断片である、請求項５に記載の複合体。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、および、請求項５または６に記載の複合体、の一方または両方を含有する短波赤外蛍光剤。
  8. 　下記式（１ａ）で表される第一の化合物を合成する第一の工程と、
    　前記式（１ａ）中のアニリノ基を下記式（１ｂ）で表される構造に置き換える第二の工程と、
    　前記式（１ａ）中のフェニルイミノ基を下記式（１ｃ）で表される構造に置き換える第三の工程と、
    を含む、下記式（１）で表される化合物の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（前記の式中、ｎは３～５の整数を表し、Ｘは、スルホン酸基の塩、または、分子識別剤に対する反応性架橋基、を表す。）
  9. 　前記ｎが３であり、前記Ｘがスルホン酸基の塩であり、前記第二の工程と前記第三の工程とを一度に行う、請求項８に記載の化合物の製造方法。
  10. 　前記ｎが４であり、前記Ｘがスルホン酸基の塩であり、前記第二の工程の後に前記第三の工程を行う、請求項８に記載の化合物の製造方法。
  11. 　前記ｎが３であり、前記Ｘが前記反応性架橋基であり、前記第二の工程の後に前記第三の工程を行う、請求項８に記載の化合物の製造方法。
  12. 　前記ｎが４であり、前記Ｘが前記反応性架橋基であり、前記第二の工程の前に第三の工程を行う、請求項８に記載の化合物の製造方法。
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