KR101663465B1 - 생체 분자 표지를 위한 시아닌 염료 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체분자 표지를 위한 하기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 염료 및 그 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]

상기 [화학식 1]에서, Y, Z, R₁, R₁', R₂, R₂', R₃, l 및 m은 각각 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

생체 분자 표지를 위한 시아닌 염료 및 그 제조방법{Cyanine dye for laveling biomolecule and preparation method thereof}

본 발명은 다양한 생체분자에 형광 표지가 가능한 시아닌 염료 및 그 제조방법에 관한 것이다.

생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.

바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.

주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flowcytometer), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(qualitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.

일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.

상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.

바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.

이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.

특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점 외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있다.

일반적으로 생체 분자에 형광염료를 표지하는 경우에는 생체 분자 내에 존재하는 여러 치환기(functional group), 즉, 아민(amine), 티올(thiol), 히드록시(hydroxy) 기 등이 고려되며, 각 치환기와 반응할 수 있도록 특정 반응기를 가진 형광 염료를 선택하게 된다. 이를테면, 형광 염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는, 기본 단위 구조가 되는 아미노산(amino acid)의 화학 구조로부터 유추할 수 있으며, 구체적으로는 라이신(lysine)의 아미노기, 시스테인(cystein)의 티올기, 히스티딘(histidine)의 이미다졸 아민기, 트레오닌(threonine)의 2차 지방족 히드록시기, 세린(serine)의 1차 지방족 히드록시기, 티로신(tyrosine)의 페놀 히드록시기 등이 있으며, 아미노산의 N-말단 아미노기와의 결합도 가능하고, 역으로, 아미노산의 C-말단을 숙신이미딜 에스터(succimidyl ester), 말레이미드(maleimide) 등의 활성화기(activation group)를 갖도록 반응시킨 후, 아민이나 티올을 가진 염료와 공유 결합시키는 방법도 많이 이용되고 있다.

또한, 염료의 반응기는 당(sugar), 당단백(glycoprotein), 항체(antibody) 등의 생체 분자, 히알루론산(hyaluronic acid), 글리콜 키토산(glycol chitosan) 등을 단량체로 갖는 생체 적합성 고분자, 각종 약물 및 저분자 물질에 포함된 치환기와도 결합할 수 있다. 현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다.

수많은 반응기들이 알려져 있지만, 치환기 선택성, 반응 속도, 수율, 재현성, 안정성 등이 많은 연구자들로부터 장시간 검증되어 왔으며, 최근에는 실제 연구나 상업적인 목적으로 염료에 도입되는 반응기는 몇 가지로 한정되어져 있다. 예를 들면, 단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트(isothiocyanate)이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 디클로로트리아진(dichlorotriazine)이 주로 선택된다. 다만, 상기 반응기들은 치환반응으로 결합이 되거나 수용성 조건에서 장시간 반응 및 보관 안정성을 유지하기 어려운 경우가 대부분이다.

지이 헬스케어의 미국 특허 제5268486호, 제6043025호, 제6127134호와, 국제 공개 공보 제9633406호에서는 숙신이미딜 에스터를 다양한 시아닌 염료 구조에 도입하고, 항체, 펩타이드 등 결합 가능한 생체 분자에 대한 염색 방법도 예시하고 있다. 그러나, 이 숙신이미딜 에스터는 수용액 중에서 안정하지 않고, 염색 반응 시에 필수적으로 N-히드록시 숙신이미드가 부산물로서 생성되는 문제점이 있다.

다른 색원체를 가진 염료들도 마찬가지이지만, 시아닌 염료에서도 반응기의 도입 여부에 무관하게 색원체가 폴리메틴인 것은 변함이 없으므로, 형광 특성이 거의 동일하여 흡수 및 발광 파장이 거의 변하지 않는다고 알려져 있다.

시아닌 염료로서 상업적으로 가장 많이 활용되고 있는 것은 헤테로 고리로서 인돌(indole) 구조를 포함하고, 반응기로서 숙신이미딜 에스터기를 갖는 것이지만, 최근에는 연구자들의 다양한 수요에 따라 말레이미드, 아민, 하이드라자이드(hydrazide) 등의 여러 치환기 및 반응기를 단독 또는 혼합 사용하는 추세에 있다.

시아닌 발색단을 가진 대표적인 상품으로서는 Cy3 및 Cy5가 있으며, 특별히 생체 내 조영을 위한 목적으로는 인도시아닌 그린(indocyanine green)이 가장 많이 알려져 있다. 인도시아닌 그린은 미국 FDA의 승인을 받은 몇 안 되는 임상 사용이 허용된 염료 화합물의 하나로서, 안정성을 인정받아 응용 범위가 확대되고 있다. 하지만, 인도 시아닌 그린의 형광 강도는 낮은 편에 속하며 일반적으로 간(liver) 등에 축적이 잘 되는 것으로 알려져 있어 특정 부위의 영상을 보려고 하는 경우 장기에 축적된 염료로 인해 원하는 영상 데이터를 얻는데 있어 장애요인으로 작용할 수 있다. 또한, 인도시아닌 그린의 화학 구조 자체에는 반응기를 포함하고 있지 않아 생체 분자로의 표지가 용이하지 않다는 단점을 가지고 있어 대체되는 구조의 출현이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 프로테오믹스(proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 생체 분자의 동정을 관찰하는데 있어서 광범위하게 사용될 수 있으며, 생체 분자에 표지가 용이한 신규한 근적외 형광 시아닌 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물 및 이의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

상기 [화학식 1]에서,

Y는 산소, 황 및 CR₆R₇ 중에서 선택되고,

Z는 산소 또는 황이며,

R₁, R₁', R₂ 및 R₂'는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기, 탄소수 7 내지 10개의 알킬기, 탄소수 1 내지 6개의 알콕시기, 설폰산기 및 설폰산염기 중에서 선택되며,

R₃은 히드록시기, 히드라지닐기, NH(CH₂)_pNH₂, N-히드록시숙신이미드기, NH-(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NHNH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 및 NH-A-SO₂CH=CH₂ 중에서 선택되고,

A는 (CH₂)_n, para-(C₆H₄) 및 meta-(C₆H₄) 중에서 선택되며,

R₆ 및 R₇은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6개의 알킬기 및 탄소수 7 내지 10개의 알킬기 중에서 선택되고,

R₈ 및 R₉는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 할로겐, NH₂ 및 히드라진기 중에서 선택되며,

m 및 m'은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 1 내지 23의 정수이고,

l, n, p 및 q는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 시아닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 근적외 형광 조영제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 시아닌 화합물은 근적외 파장영역에서 높은 형광강도를 가지면서도, 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐 아니라, 생체분자의 장시간 염색에서도 안정적이며, 생체 분자와의 결합반응성이 우수하면서도 반응 부산물이 생성되지 않아 생체 분자의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 시아닌 화합물은 체내에 축적되지 않으면서도 강한 형광을 나타내어 이를 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물은 생체 내로 투여되서 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻는데 보다 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 시아닌 계열 화합물을 이용하여 단백질에 표지시키고 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 근적외 형광 강도를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 제조예 및 비교예에 따른 시아닌 화합물을 동물에 투여 후 체내 분포 경향 및 잔류량을 측정한 영상화 이미지이다.

본 발명은 시아닌 발색단의 우수한 성능은 유지하면서도, 특히 근적외 파장 영역에서 높은 형광강도를 가지는 화합물을 제조하고자 예의 노력하여, 수용성 버퍼 조건에서 높은 안정성을 나타내면서도 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물과 반응성이 우수한 시아닌 화합물을 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에 따른 시아닌 화합물은 대부분 생체 분자에 적용 시 매질로 물을 대상으로 하고, 열에 대해서 안정하도록 설계되었다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 [화학식 1]에서,

Y는 산소, 황 및 CR₆R₇ 중에서 선택되고,

Z는 산소 또는 황이며,

R₁, R₁', R₂ 및 R₂'는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기, 탄소수 7 내지 10개의 알킬기, 탄소수 1 내지 6개의 알콕시기, 설폰산기 및 설폰산염기 중에서 선택되며,

R₃은 히드록시기, 히드라지닐기, NH(CH₂)_pNH₂, N-히드록시숙신이미드기, NH-(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NHNH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 및 NH-A-SO₂CH=CH₂ 중에서 선택되고,

A는 (CH₂)_n, para-(C₆H₄) 및 meta-(C₆H₄) 중에서 선택되며,

R₆ 및 R₇은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6개의 알킬기 및 탄소수 7 내지 10개의 알킬기 중에서 선택되고,

R₈ 및 R₉는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 할로겐, NH₂ 및 히드라진기 중에서 선택되며,

m 및 m'은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 1 내지 23의 정수이고,

l, n, p 및 q는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

상기 R₃에서 2-NHNH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine은

를 의미한다.

본 발명에 따르면, 상기 [화학식 1]은 하기 [화학식 2] 또는 [화학식 3]으로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 2] [화학식 3]

`

상기 [화학식 2] 또는 [화학식 3]에서,

Y, Z, R₁, R₁', R₂, R₂', l, m 및 m'은 상기 [화학식 1]에 대하여 정의한 바와 같으며,

R₄는 수소 또는 숙신이미드이고,

R₅은 아민, (CH₂)_pNH₂, (CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 및 A-SO₂CH=CH₂ 중에서 선택되며,

A는 (CH₂)_r, para-(C₆H₄) 및 meta-(C₆H₄) 중에서 선택되고,

R₈ 및 R₉는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 할로겐, NH₂ 및 히드라진기 중에서 선택되며,

n, p 및 q는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]은 좀 더 구체적으로 하기 [화학식 4] 내지 [화학식 7]로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

[화학식 4] [화학식 5]

[화학식 6] [화학식 7]

상기 [화학식 4] 내지 [화학식 7]에서

Y, R₁, R₁', R₂, R₂', l, m 및 m'은 상기 [화학식 1]에 대하여 정의한 바와 같으며,

R₄ 및 R₅는 상기 [화학식 2] 또는 [화학식 3]에 대하여 정의한 바와 같다.

본 발명에 따르면, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 예시하면, 하기 [화학식 8] 내지 [화학식 35]로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 8] [화학식 9]

[화학식 10] [화학식 11]

[화학식 12] [화학식 13]

[화학식 14] [화학식 15]

[화학식 16] [화학식 17]

[화학식 18] [화학식 19]

[화학식 20] [화학식 21]

[화학식 22] [화학식 23]

[화학식 24] [화학식 25]

[화학식 26] [화학식 27]

[화학식 28] [화학식 29]

[화학식 30] [화학식 31]

[화학식 32] [화학식 33]

[화학식 34] [화학식 35]

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물은 근적외 형광 영역인 500 내지 800 nm의 파장에서 형광을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물에 표지될 수 있는데, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물은 종래의 시아닌 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.

상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물을 표지하는 방법으로는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 [화학식 1]의 화합물과 상기 생체 분자, 나노입자 또는 유기화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.

생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물은 하기 [화학식 36]의 화합물을 하기 [화학식 37]의 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

[화학식 36]

[화학식 37]

상기 [화학식 36] 또는 [화학식 37]에서

X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이며,

Y, Z, R₁, R₁', R₂, R₂', R₃, l 및 m은 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.

본 발명에 따르면, 상기 [화학식 36]의 화합물과 상기 [화학식 37]의 화합물을 반응시켜 상기 [화학식 1]의 화합물을 제조하는 단계는 1-step으로 진행될 수도 있지만 이에 한정되는 것은 아니며 2-step 이상으로 진행될 수도 있다.

예를 들어, 상기 [화학식 1]에서 R₃이 히드록시기일 수도 있지만, N-히드록시숙신이미드기, 히드라지닐기, NH(CH₂)_pNH₂, NH-(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NHNH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 또는 NH-A-SO₂CH=CH₂ 일 수 있는데,

상기 R₃이 히드라지닐기, NH(CH₂)_pNH₂, NH-(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NHNH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 및 NH-A-SO₂CH=CH₂ 중에서 선택되는 어느 하나라면,

상기 [화학식 36]의 화합물을 R₃이 히드록시기인 [화학식 37]의 화합물과 반응시켜 하기 [화학식 2a]를 제조한 후, 히드라진, NH₂(CH₂)_pNH₂, NH₂(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NH₂NH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 또는 NH₂-A-SO₂CH=CH₂과 반응시켜 [화학식 3]의 화합물을 제조할 수도 있다.

[화학식 2a]

상기 [화학식 2a]에서 Y, Z, R₁, R₁', R₂, R₂', l 및 m은 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.

또한, 상기 [화학식 2a]의 화합물로부터 [화학식 3]의 화합물을 제조하는 단계는 1-step으로 진행될 수도 있지만 이에 한정되는 것은 아니며 2-step 이상으로 진행될 수도 있다.

예를 들어, 반응성을 향상시키기 위하여 상기 [화학식 2a]의 화합물을 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate)와 반응시켜 하기 [화학식 2b]로 표시되는 화합물을 제조한 뒤, 이를 히드라진, NH₂(CH₂)_pNH₂, NH₂(CH₂)_q-N(CO)₂C₂H₂, 2-NH₂NH-4-R₈-6-R₉-1,3,5-triazine 및 NH₂-A-SO₂CH=CH₂ 중에서 선택되는 아민화합물과 반응시켜 상기 [화학식 3]의 화합물을 제조할 수 있으며, 이때, 상기 아민화합물은 보호기로 보호된 아민화합물일 수 있으며, 상기 보호기는 디-tert-부틸 디카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 2b]

상기 [화학식 2a]에서

Y, Z, R₁, R₁', R₂, R₂', l 및 m은 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.

또한, 상기 아민화합물 중에서, 상기 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진을 작용기로 가지는 [화학식 3]의 시아닌 화합물은 상기 [화학식 2a] 또는 [화학식 2b]의 화합물과 4,6-디클로로-2-히드라지닐-1,3,5-트리아진을 반응시켜 제조할 수도 있으나, 상기 [화학식 2a] 또는 [화학식 2b]의 화합물을 tert-부틸 카바제이트와 반응시켜 히드라진기를 도입시킨 후, 추가로 시아누릭클로라이드(cyanuric chloride)와 반응시켜 제조될 수도 있다.

상기 반응에 사용되는 용매로는 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라하이드로퓨란, N,N-디메틸포름아마이드, 메탄올, 에탄올을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며,

N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine; DIPEA), 트리에틸아민(triethylamine; TEA), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide; EDC), 4-(디메틸아미노)-피리딘(4-(Dimethylamino)-pyridine; DMAP), 1-에틸 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate; HBTU), 히드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole; HOBT) 및 소듐바이카보네이트로 이루어진 군중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 [화학식 36]의 화합물은 하기 [화학식 38]의 화합물 및 [화학식 38a]의 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 하기 [화학식 39]의 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

[화학식 38] [화학식 38a]

[화학식 39]

상기 [화학식 38] 또는 [화학식 38a]에서,

Y, R₁, R₁', R₂, R₂' 및 m은 상기 [화학식 1]에서 정의한 바와 같으며,

상기 [화학식 39]에서, X는 할로겐족에서 선택되는 어느 하나이며, 일반적으로 합성 시 흔히 사용되는 포스포러스옥시클로라이드(phosphorus oxychloride) 또는 포스포러스브로마이드(phosphorus bromide) 등에 따라 염의 형태가 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물의 제조방법을 간략하게 표현하면 하기 [반응식 1]로 나타내었다.

[반응식 1]

상기 [반응식 1]에서, Y, Z, R₁, R₂, R₃, l, 및 m은 상기 [화학식 1] 에서 정의한 바와 같으며,

X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이더,

상기 [반응식 1]에서는 [화학식 38]의 화합물을 이용하여 제조하는 방법을 나타내었으나 이에 한정되는 것은 아니며, [화학식 38a]의 화합물을 이용할 수도 있고, [화학식 38] 및 [화학식 38a]을 함께 사용할 수도 있다.

한편, [화학식 38] 또는 [화학식 38a]의 화합물은 하기 [반응식 2]과 같은 방법으로 제조될 수 있다.

[반응식 2]

상기 [반응식 2]에서, Y, R₁, R₂ 및 m은 상기 [화학식 1]에서 정의한 바와 같으며, 상기 X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이다.

본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물을 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물은 시아닌 발색단의 우수한 성능은 유지하면서도 형광 강도, 특히 500 내지 800 nm의 근적외 파장 영역에서 형광강도가 매우 높아 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 영상화용 조영제로 유용하다.

본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 시아닌 화합물과 표지 대상 화합물을 결합시키는 단계를 포함하는 화합물 표지방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 표지 대상 화합물은 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물 중에서 선택된 1종 이상이며, 상기 표지대상 화합물은 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 기능기를 포함할 수 있으며,

상기 표지는 [화학식 1]의 화합물에 존재하는 카르복시기, 숙신이미딜에스터기, 비닐설폰기, 아민기 또는 할로겐기와 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다.

상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]의 화합물은 단백질과 [화학식 1]의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.

따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 [화학식 1]의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.

한편, 생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐 아니라, 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.

이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

실시예

실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다.

FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 500을 사용하였고, LC/MS는 Agilent Technology사의 LC/MSD SL을 사용하여 ESI(electrospray ionization) 방식으로 측정되었다.

합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Perkin Elmer사의 Lambda 45로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS 55를 사용하여 얻었다.

유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)에는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 사용하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18(40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다.

겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치(mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply(Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels(Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다.

시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d ₆ 또는 D₂O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이(chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도(chemical shift multiplicity; s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant(Hz)의 순으로 기록하였다.

제조예 1 : 제조예 1의 화합물

1 단계

p-히드라지노벤젠설폰산(p-hydrazinobenzenesulfonic acid) 10 g(53 mmol, 1 eq)과 3-메틸-2-부탄온(3-methyl-2-butanone) 17.18 mL(160 mmol, 3.02 eq)을 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (11.34 g, 89%)

R_f = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)

수산화칼륨 1.427 g(25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올 35 mL에 용해시키고, 앞에서 얻은 고체 물질 5.073 g(21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올 35 mL에 용해시키고 적가한 후, 상온에서 24 시간 교반하고, 여과하여 노란색의 고체 입자를 얻었다. (5.35 g, 90%)

R_f = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴:증류수=1:4 v/v)

2 단계

1 단계에서 제조한 화합물 6.0 g(21.6 mmol, 1 eq)과 1,4-부탄설톤(1,4-butanesultone) 6.4 mL(68.9 mmol, 3.1 eq)과 소듐아세테이트(sodium acetate) 2.1 g(25.9 mmol, 1.2 eq)을 10 mL의 아세토니트릴에 넣고 12 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응이 종료되면 실내온도까지 냉각시킨 후 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트를 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다. (6.3 g, 100%)

Rf = 0.33 (실리카겔 (silicagel), 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

3 단계

N,N-다이메일폼아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF) 60.8 mL(2 mol, 5 eq)와 디클로로메탄(dichloromethane) 40 mL을 혼합하고 온도를 0 ℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄 40 mL에 포스포러스 옥시클로라이드(phosphorus oxychloride) 45.2 mL(1.5 mol, 3.7 eq)를 용해시킨 후 상기 냉각시킨 용액에 10분 동안 적가하였다. 상기 혼합액에 디클로로메탄 60 mL에 싸이클로헥사논(cyclohexanone) 11.7 mL(0.4 mol, 1 eq)을 용해시킨 용액을 10분 동안 적가하였다. 3시간 동안 가열 환류시킨 뒤 상온으로 냉각시키고, 아닐린(aniline) 31.0 mL(1.0 mol, 2.7 eq)을 넣고 추가로 1 시간 동안 상온에서 교반한다. 반응 종료 후, 50 mL의 증류수를 혼합 용액에 넣고 냉장 보관 한 후 생성된 어두운 보라색 침전을 여과하여 감압 건조하였다. (38 g, 26%)

Rf = 0.99 (실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

4 단계

2 단계의 화합물 5 g(13.3 mmol, 2 eq), 3 단계의 화합물 2.4 g(6.6 mmol, 1 eq) 및 소듐아세테이트 1.4 g(17.1 mmol, 2.5 eq)을 에탄올 6 mL에 혼합한 후 50 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 감압 농축하여 용매를 제거한 뒤, 80 mL의 에틸아세테이트를 사용하여 결정을 생성시키고, 여과한 후, 감압 건조시켰다. (3.9 g, 66%)

Rf = 0.5 (실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

5 단계

4 단계의 화합물 200 mg(0.22 mmol, 1eq)을 DMF 1 mL에 용해시킨 후, 포타슘카보네이트(potassium carbonate) 62.1 mg(0.45 mmol, 2 eq) 및 3-(4-하이드록시페닐)프로피오닉산(3-(3-hydroxyphenyl)propionic acid) 148.7 mg(0.9 mmol, 4eq)를 첨가하여 40 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 40 mL의 에틸아세테이트를 가하여 결정을 얻고, 여과한 뒤, 감압 건조하였다. 10% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 제조예 1의 화합물을 얻었다. (16.8 mg, 7%)

Rf = 0.67 (RP-C18, 아세토니트릴 : 증류수 = 3:7 v/v)

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) : δ 8.28 (m, 1H), 8.21 (m, 1H), 7.76-7.71 (m, 3H), 7.64-7.58 (m, 4H), 7.41 (m, 1H), 7.37 (d, 1H, J = 8 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 8 Hz), 6.32 (d, 1H, J = 13.5 Hz), 6.17 (d, 1H, J = 14 Hz), 4.17 (m, 4H), 2.73-2.71 (m, 2H), 2.71-2.67 (m, 2H), 2.37 (m, 4H), 1.90-1.61 (m, 10H), 1.50 (m, 2H), 1.33 (s, 12H)

LC/MS: 1017 (참고, 이론값 C₄₇H₅₇N₂O₁₅S₄ ⁺ 1017.26)

λ_abs (MeOH) : 787 nm (ε = 1.46 x 10⁵ M^-1cm^-1), λ_fl (MeOH) : 813 nm

실시예 1 : 화학식 8의 화합물

제조예 1의 화합물 40 mg(0.0393 mmol, 1 eq)을 DMF 0.5 ml 에 완전히 용해시킨 뒤, N,N-디아이소프로필에딜아민(N,N-Diisopropylethylamine) 20.5 uL(0.118 mmol, 3 eq) 와 N,N-디숙신이미딜카보네이트(N,N-disuccinimidyl carbonate) 30 mg(0.118 mmol, 3 eq) 을 넣고 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 확인 후 에테르(ether)를 첨가하여 결정을 형성시키고, 여과 및 건조하여 전구체를 생성하였다.

상기 생성된 전구체를 DMF 0.5 ml 에 완전히 용해시킨 후 N,N-디아이소프로필에딜아민 20.5 uL(0.118 mmol, 3 eq)을 투입한다. 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(2-(2-chloroethylsulfonyl)-ethylamine hydrochloride) 8 mg(0.0393 mmol, 1 eq)을 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 24 시간 이상 교반하였다. 반응이 종료되면, 에틸아세테이트를 첨가하여 결정을 생성한 후 여과 및 농축하고, RP-C18 역상 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 분리된 물질을 감압건조하여 [화학식 8]의 화합물을 얻었다. (15 mg, 33.5 %)

Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴:증류수 = 1:2 v/v)

실시예 2 : 화학식 9의 화합물

제조예 1의 화합물 200 mg(0.197 mmol, 1 eq)을 DMF 5 ml 에 용해시키고, N,N-디아이소프로필에딜아민 137 μL(0.788 mmol, 4 eq) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오르포스페이트(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 149 mg(0.394 mmol, 2 eq)를 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합 용액에 tert-부틸 카바제이트(tert-Butyl carbazate) 26 mg(0.197 mmol, 1 eq)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 추가 교반하였다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 투입하여 결정을 생성시킨 후 여과 및 감압건조 한 뒤, 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하였다.

얻어진 화합물을 클로로포름 6 mL, 증류수 3 mL 혼합용액에 넣고 완전히 용해 시킨 후 트리플루오르아세틱 산 12 mL 을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응된 화합물을 감압 건조한 후 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 [화학식 9]의 화합물을 얻었다. (58 mg, 28.5 %)

Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴:증류수 = 3:7 v/v)

실시예 3 : 화학식 10의 화합물

제조예 1의 화합물 200 mg(0.197 mmol, 1 eq) 을 DMF 5 ml 에 용해시킨 후, N,N-디아이소프로필에딜아민 137 μL(0.788 mmol, 4 eq) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니 헥사플루오르포스페이트 149 mg(0.394 mmol, 2 eq)를 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합 용액에 에틸렌디아민(ethylene diamine) 118 mg(1.97 mmol, 10 eq)을 넣고 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 투입하여 결정을 생성시킨 후 여과 및 감압 건조하고, 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 [화학식 10]의 화합물을 얻었다. (74.7 mg, 35.8 %)

Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴 : 증류수 = 3:7 v/v)

실시예 4 : 화학식 11의 화합물

제조예 1의 화합물 200 mg(0.197 mmol, 1 eq) 을 DMF 5 ml 에 용해시킨 후, N,N-디아이소프로필에딜아민 137 μL(0.788 mmol, 4 eq) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니 헥사플루오르포스페이트 149 mg(0.394 mmol, 2 eq)를 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합 용액에 N-(2-아미노에틸)말레이미드(N-(2-aminoethyl)maleimide) 75 mg(0.296 mmol, 1.5 eq)을 넣고 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 투입하여 결정을 생성시킨 후 여과 및 갑압건조하고, 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 [화학식 11]의 화합물을 얻었다. (85.7 mg, 38.2 %)

Rf = 0.50 (RP-C18, 아세토니트릴 : 증류수 = 3:7 v/v)

실시예 5 : 화학식 12의 화합물

시아누릭클로라이드 (cyanuric chloride) 17 mg(0.093 mmol, 1 eq)을 증류수 10 ml 에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각한 후 30 분간 교반하였다. 온도를 유지하며 실시예 2에서 제조한 [화학식 9]의 화합물 110 mg(0.093 mmol, 1 eq) 을 투입한 후 10 분간 교반하였다. 반응액에 소디움바이카보네이트 (sodium bicarbonate) 15 mg 을 투입한 후 온도를 유지하며 2시간 반응하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 [화학식 12]의 화합물을 얻었다. (47 mg, 42.9 %)

제조예 2. 제조예 2의 화합물

1 단계

2,3,3-트리메틸인돌레닌(2,3,3-trimethylindolenine) 1.0 g(6.2 mmol, 1 eq), 1,4-부탄설톤(1,4-butanesultone) 1.8 mL(20.0 mmol, 3.1 eq) 및 소듐아세테이트 0.6 g(7.5 mmol, 1.2 eq)을 5 mL의 아세토나이트릴에 첨가한 후, 12 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후 상온으로 냉각 한 후 에틸아세테이트를 가하여 결정을 생성시키고, 여과 및 감압 건조하여 분홍색의 고체를 얻었다. (2.3 g, 100%)

Rf = 0.26 (실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2:4:1:3 v/v)

2 단계

상기 제조예 2의 1 단계 화합물 0.5 g(1.6 mmol, 2 eq), 제조예 1의 3 단계에서 제조한 화합물 0.3 g(0.8 mmol, 1 eq) 및 소디움아세테이트 0.17 g(2.1 mmol, 2.5 eq)을 에탄올 20 mL에 용해시킨 후 50 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 감압 농축하여 용매를 제거 한 후 80 mL의 에틸 아세테이트로 결정을 생성시키고, 여과하여, 감압 건조하였다. (1.1 g, 92%)

Rf = 0.5 (실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

3 단계

상기 제조예 2의 2 단계 화합물 200 mg(0.27 mmol, 1eq)을 DMF 1 mL에 용해시킨 뒤, 포타슘카보네이트 75.7 mg(0.54 mmol, 2 eq) 및 3-(4-하이드록시페닐)프로피오닉산 31.8 mg(0.54 mmol, 2 eq)를 넣고 40 ℃에서 12 시간 동안 교반 하였다. 반응 종료 후, 40 mL의 에틸아세테이트를 가하여 결정을 생성시키고, 여과하여 감압 건조하였다. 클로로포름:메틸알코올=4:3 용매를 사용하여 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다. (53.1 mg, 23%)

Rf = 0.66 (실리카겔, 클로로포름 : 메틸알코올 = 4:3 v/v)

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) : δ 8.12 (m, 1H), 8.01 (m, 2H), 7.94 (m, 2H), 7.77 (m, 2H), 7.72 (m, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.45 (m, 1H), 7.37 (m, 1H), 7.29 (m, 1H), 7.22 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.16-7.12 (m, 2H), 6.39 (d, 1H, J = 14.5 Hz), 4.41 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.98 (dd, 2H, J = 26.7 Hz, 2 Hz), 3.72 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 2.77-2.73 (m, 4H), 2.59 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 2.33 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.05-2.02 (m, 2H), 1.96-1.90 (m, 2H), 1.90-1.87 (m, 2H), 1.87-1.84 (m, 4H), 1.58 (s, 12H)

LC/MS : 895 (참고, 이론값 C₄₇H₅₆KN₂O₉S₂ ⁺ 895.31)

λ_abs (MeOH) : 805 nm (ε = 3.26 x 104 M^-1cm^-1), λ_fl (MeOH) : 825 nm

실시예 6 : 화학식 13의 화합물

제조예 2의 화합물 40 mg(0.046 mmol, 1 eq) 을 DMF 0.5 ml 에 완전히 용해시킨 후, N,N-디아이소프로필에틸아민 23.4 uL(0.14 mmol, 3 eq) 및 N,N-디숙신이미딜 카보네이트 35.8 mg(0.14 mmol, 3 eq) 을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반 시켰다. 반응 종료 후 에테르를 투입하여 결정을 생성시키고 여과 및 건조시켰다. 건조 완료 후 DMF 0.5 ml 에 완전히 용해시킨 후 N,N-디아이소프로필에틸아민 23.4 uL(0.14 mmol, 3 eq)를 첨가하였다. 추가로 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 9.6 mg(0.046 mmol, 1 eq)을 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 24 시간 이상 교반하였다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 첨가하여 결정을 생성시킨 후 여과 및 감압 건조하였다. 아세토니트릴 50% 용액을 이동상으로 사용하여 역상크로마토그래피로 분리하고, 분리된 물질을 감압건조 하여 목적하는 [화학식 13]의 화합물을 얻었다.

Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴:증류수 = 1:1 v/v)

LC/MS = 973.13 (참고, 이론값 C₅₁H₆₃N₃O₁₀S₃ 973.37)

λ_abs (MeOH) : 805 nm (ε = 1.24 x 10⁵ M^-1cm^-1), λ_fl (MeOH) : 825 nm

제조예 3

1 단계

2,3,3-트리메틸인돌레닌(2,3,3-trimethylindolenine) 10.0 mL(62.8 mmol, 1 eq)과 1-아이오도프로판 (1-iodopropane) 15.2 mL(157.2 mmol, 2.5 eq)를 5 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온 냉각시키고 후 에틸아세테이트를 가하여 결정을 생성시킨 뒤 여과 및 감압 건조하여 고체를 얻었다. (12.7 g, 100%)

Rf = 0.5 (실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

2 단계

상기 제조예 3의 1단계에서 제조한 화합물 5.0 g(24.7 mmol, 2 eq), 제조예 1의 3 단계에서 제조한 화합물 4.4 g(12.3 mmol, 1 eq) 및 소듐아세테이트 2.6 g(31.7 mmol, 2.5 eq)을 20 mL의 에틸알코올에 용해 시킨 후 50 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 감압 농축한 후 에틸아세테이트로 결정을 생성시키고, 여과 및 감압 건조시켰다. (5.3 g, 79%)

Rf = 0.83 (실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2:4:1:3 v/v)

3 단계

제조예 3의 2단계에서 제조한 화합물 500 mg(0.92 mmol, 1eq)을 DMF 2.5 mL에 용해시킨 후, 포타슘카보네이트 255.6 mg(1.85 mmol, 2 eq) 및 3-(4-하이드록시페닐)프로피오닉산 307.4 mg(1.85 mmol, 2 eq)를 넣고 40 ℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 120 mL의 에틸아세테이트를 가하여 결정을 생성시키고, 여과 및 감압 건조하였다. 클로로포름:메틸알코올 (6:1)로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 7-3 을 얻었다. (62.0 mg, 10%)

Rf = 0.30 (실리카겔, 클로로포름 : 메틸알코올 = 4:1 v/v)

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) : δ 7.82 (m, 2H), 7.49 (m, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.21-7.18 (m, 2H), 7.04 (m, 2H), 6.98 (m, 2H), 6.65 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.18 (d, 2H, J = 14.5 Hz), 4.10 (d, 4H, J = 7 Hz), 2.75-2.67 (m, 8H), 2.43-2.37 (m, 4H), 1.93 (m, 4H), 1.76-1.67 (m, 4H), 1.27 (s, 12H)

LC/MS = 669.4 (참고, 이론값 C₄₅H₅₃N₂O₃ 669.41)

λ_abs (MeOH) : 766 nm (ε = 1.87 x 10⁵ M^-1cm^-1), λ_fl (MeOH) : 798 nm

실시예 7 : 화학식 18의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 3의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 목적하는 [화학식 18]의 화합물을 제조하였다.

Rf = 0.5 (실리카겔, 클로로포름:메탄올 = 4:3 v/v)

LC/MS = 786.49 (참고, 이론값 C₄₉H₆₀N₃O₄S⁺ 786.43)

λ_abs (MeOH) : 766 nm (ε = 1.51 x 10⁵ M^-1cm^-1), λ_fl (MeOH) : 793 nm

제조예 4

제조예 3의 3 단계에서 사용된 3-(4-하이드록시페닐)프로피오닉산 대신에 4-머캅토하이드로시나믹산(4-mercaptohydrocinnamic acid)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 3의 방법을 사용하여 목적하는 화합물을 합성하였다.(710 mg, 18%)

Rf = 0.31 (실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수 = 2:4:1:3 v/v)

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) : δ 8.50 (m, 1H), 8.18 (m, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.85 (m, 1H), 7.66 (m, 2H), 7.33 (m, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.99 (dd, 1H, J = 9.95 Hz, 5.50 Hz), 6.26 (dd, 2H, J = 4 Hz, 2.1 Hz), 6.17 (d, 1H, J = 13.15 Hz), 6.23 (m, 1H), 3.64-3.58 (m, 4H), 3.16-3.11 (m, 2H), 2.05 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.27-1.19 (m, 18H)

LC/MS = 685.56 (참고, 이론값 C₄₅H₅₃N₂O₂S 685.98)

실시예 8 : 화학식 23의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 목적하는 [화학식 23]의 화합물을 제조하였다.

실시예 9 : 화학식 24의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 목적하는 [화학식 24]의 화합물을 제조하였다.

실시예 10 : 화학식 25의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3의 방법으로 목적하는 [화학식 25]의 화합물을 제조하였다.

실시예 11 : 화학식 26의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4의 방법으로 목적하는 [화학식 26]의 화합물을 제조하였다.

실시예 12 : 화학식 27의 화합물

제조예 1의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5의 방법으로 목적하는 [화학식 26]의 화합물을 제조하였다.

시험예 1 : 단백질 표지실험

시험예 1.1 실시예 6의 화합물의 단백질 표지 실험

근적외 형광을 나타내는 시아닌 염료들과의 비교를 위해서 시판 중인 시아닌 계열 염료인 NIR-797 isothiocyanate(여기파장 795 nm, 형광파장 817 nm, Aldrich), 비닐설폰 반응기 염료인 FNI-774(여기파장 777 nm, 형광파장 802 nm, BioActs) 및 실시예 6(여기파장 805 nm, 형광파장 825 nm) 1mg씩을 각각 DMF 100 μL에 용해하여 준비하였다.

알부민(Albumin from bovine serum, lyophilized powder, Aldrich) 단백질 30 μg을 0.1 M 바이카보네이트/카보네이트 완충액(pH 9.0) 30 μL에 용해시킨 후 3개로 분취하고, 상기 3 개의 형광 염료 용액을 각 단백질 용액에 2 μL씩 넣고 강하게 혼합하고 4 시간 동안, 상온에서 반응시켰다.

반응 용액 전량을 각각 겔에 로딩(loading)하고 2시간 동안, 125 V에서 SDS-PAGE 겔 전기영동을 진행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서, 제일 왼쪽의 marker는 단백질의 크기를 확인하기 위한 단백질 마커이며, 1은 NIR-797 isothiocyanate이고, 2는 FNI-774이며, 3은 본 발명의 실시예 6에 따른 [화학식 13]의 화합물이다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 실시예 6의 화합물(3)은 대부분이 단백질에 표지되었다. 반면, 비교예인 NIR-797 isothiocyanate(1) 및 FNI-774(3)은 단백질에 표지되지 못하고 남아 있는 염료량이 많은 것을 확인할 수 있다.

시험예 1.2 실시예 8의 화합물의 단백질 표지 실험

실시예 6의 화합물 대신에 실시예 8의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 시험예 1.1과 동일한 방법으로 단백질 표지 실험을 수행하였다.

비교예인 NIR-797 isothiocyanate(1) 및 FNI-774(3)은 단백질에 표지되지 못하고 남아 있는 염료량이 상당 부분 존재하였으나, 본 발명에 따른 실시예 8의 화합물(화학식 23의 화합물)은 대부분 단백질에 표지되었으며, 시험예 1.1의 실시예 6의 화합물과 비교하였을 때, 단백질에 표지되지 못하고 남은 염료량이 더 적은 것으로 확인되었다.

시험예 2. 근적외 형광 강도 측정

시험예 2.1 제조예 3의 근적외 형광강도 측정

생체 내의 직접 투여를 통한 형광 강도 평가를 실시하였다. 실시예 6의 화합물은 생체 분자와 직접 반응이 가능한 화합물임을 고려하여 간접적인 형광강도 비교를 위해 전단계 화합물인 제조예 3을 이용하여 인도시아닌 그린과의 비교 평가를 실시하였다.

비교예로 임상용 인도시아닌 그린 제품인 Diagnogreen(Daiichi)을 사용하였다. 제조예 3 및 비교예를 PBS를 용매로 하여 0.5 mg/mL의 농도로 0.4 mL씩 준비하고, 절반의 농도로 PBS로 희석하는 방법으로 반복하여 각 0.2 mL, 9 개의 샘플을 제조하고, 대조군으로 PBS 0.2 mL를 더하여 총 10개의 샘플을 준비하였다. 동물용 형광 이미징 장치(IVIS) 안에 10 개의 튜브를 가로로 나란히 놓고 ICG 파장 검출 필터를 이용하여 촬영하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 형광 강도의 크기는 적색이 높고 청색이 낮은 형광을 나타낸다. 도 2의 사진에서 확인할 수 있는 것처럼 제조예 3이 비교예에 비해 더 높은 형광 강도를 보여주고 있으며 고농도에서도 자체소광(self-quenching) 현상이 적은 것으로 관찰되었다.

시험예 2.2 제조예 4의 근적외 형광강도 측정

시험예 2.1과 동일한 이유로, 제조예 3 대신에 제조예 4를 이용한 것을 제외하고 시험예 2.1의 방법으로 근적외 형광강도를 측정하였다.

제조예 4에 따른 화합물은 비교예에 비해 높은 형광 광도를 나타냈으며, 제조예 3 보다도 높은 것으로 확인되었으며, 제조예 3과 마찬가지로 고농도에서 자체소광 현상이 거의 발생되지 않는 것으로 관찰되어 생체 분자 표지를 위한 형광체로 이용이 가능할 것으로 예상되었다.

시험예 3. 동물 투여 후 체내 분포 경향 확인 실험

시험예 3.1 제조예 3의 동물실험

(1) 실험 동물 준비

Balb/c nude mouse(암컷, Jungang Lab Animal, Inc) 5주령 3마리를 구입하여, 1주간의 실험 환경 적응 기간을 가졌으며, 실험쥐 사육은 전남대학교 의과대학 동물실험 관련 위원회의 표준 가이드라인을 준수하였다.

(2) 실험 동물 내로 형광 염료 용액 주입

시험예 2와 같은 이유로, 실시예 6의 전단계 화합물인 제조예 3을 이용하여 동물실험을 수행하였다. 비교예 및 제조예 3의 주사액 제조를 위해 각각 0.00781 mg/mL, 0.0313 mg/mL의 농도로 0.5mL 제조하였고, 별도로 대조군을 위해 멸균된 1XPBS 0.5 mL을 준비하였다.

3마리의 실험쥐는 2% isoflurane과 산소를 이용하여 호흡마취 하였다. 마취 상태에서 주사액 주입 전 이미지를 촬영하기 위해 호흡마취 장치가 설치된 IVIS를 이용하여 실험쥐 3마리를 촬영하였다(노출시간 1초, ICG filter 사용). 준비된 PBS, 비교예, 제조예 3의 주사액에서 0.2mL을 멸균 주사기(BD Ultra-FineTMIIm Short Needle, 1mL, 0.25mm(31G) X 8mm)로 흡입하여 꼬리 정맥 주사하였다.

주사 후, 10분, 15분, 20분, 40분 그리고 24시간 후에 형광 이미지를 촬영하였고, 각각 촬영 후 다음 촬영 시점까지 마취약에 노출시키지 않고 촬영 시점 30초 전에 마취를 다시 실시하는 방법으로 반복 촬영하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이 제조예 3은 비교예(임상용 ICG)와 유사한 체내 분포 및 이동이 관찰되었고, 또한 24 시간 후에 체내에서 형광이 검출되지 않아 모두 방출되는 것으로 나타났다. 특히, 비교예에 비해 약 3.5배 강한 형광강도를 나타내어 상기 시험예 2에서 측정된 형광 강도의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다.

시험예 3.2 제조예 4의 동물실험

제조예 3의 화합물 대신에 제조예 4의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 시험예 3.1의 방법으로 동물실험을 수행하였다. 주사 후, 10분, 15분, 20분, 40분 그리고 24시간 후에 형광 이미지를 촬영하였고, 각각 촬영 후 다음 촬영 시점까지 마취약에 노출시키지 않고 촬영 시점 30초 전에 마취를 다시 실시하는 방법으로 반복 촬영하여 체내 분포 경향을 확인하였다.

약물 투입 10분 경과 후 간에서 강한 형광을 확인하였으며, 점차 이동하여 약물투입 20분 경과 후에는 담즙으로 이동하는 것이 관찰되었다. 1시간 경과 후 비교예의 화합물은 검출양이 작았으나, 제조예 4의 화합물은 간 및 담즙에서 형광을 나타냈으며, 24시간 경과후에는 체내에서 검출되지 않았다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 화합물은 장시간 영상화하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

상기 시험예 1 내지 3에서의 결과를 고려할 때, 본 발명에 따른 화학식 1의 시아닌 염료가 표지된 생체 분자의 경우 비교예로 사용되었던 인도시아닌 그린 또는 유사한 파장을 갖는 근적외 염료를 사용하는 경우보다 상대적으로로 높은 형광 강도를 나타낼 것으로 예측되어 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Claims (14)

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8. 하기 [화학식 36]의 화합물을 하기 [화학식 37]의 화합물과 반응시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 하기 [화학식 12] 또는 [화학식 27]로 표시되는 시아닌 화합물의 제조방법:
   [화학식 36]
   

   

   
   [화학식 37]
   

   

   
   [화학식 12]
   

   

   
   [화학식 27]
   

   

   
   상기 [화학식 36] 또는 [화학식 37]에서,
   X는 할로겐이며,
   Y는 C(CH₃)₂이고,
   Z는 산소 또는 황이며,
   R₁은 설폰산염기이고, R₁'는 설폰산기이며,
   R₂ 및 R₂'는 서로 동일하고, 각각 CH₂SO₃H 또는 수소이고
   m 및 m'은 각각 3이고,
   l은 2이며,
   R₃은 2-NHNH-4,6-dichloro-1,3,5-triazine이다.
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