KR102121965B1 - 형광 화합물, 이를 포함하는 복합체 나노입자, 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광 화합물, 이를 포함하는 복합체 나노입자, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광 화합물은 체내에 투여 시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자는 우수한 암 타겟능을 보인다.
Description
본 발명은 형광 화합물, 이를 포함하는 복합체 나노입자, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.
바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flowcytometer), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(qualitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.
상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.
바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.
이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.
특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점 외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.
그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVDㅁR 등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 480~500 nm 및 540~560 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다.
상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.
본 발명은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 조영제 조성물로도 이용될 수 있는 형광 화합물, 이를 이용한 표지방법 등을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 우수한 암 타겟능을 갖는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물이다.
[화학식 1]
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 주사제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 담즙산-키토산 복합체 나노입자, (b) 담즙산-키토산 복합체 나노입자에 봉입된, 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 주사제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (A) 담즙산과 메탄올 등의 제1 용매를 혼합하고 NHS 등을 투입하여 담즙산 용액을 제조하는 단계, (B) 글라이콜 키토산과 메탄올 등의 제2 용매를 포함하는 수용액에 EDC 등을 투입하여 키토산 용액을 제조하는 단계, (C) 상기 키토산 용액을 상기 담즙산 용액에 투입한 후, 투석하고 분산시키고 나서 동결건조하는 단계를 포함하는 담즙산-키토산 복합체 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (A) 담즙산-키토산 복합체 나노입자를 카보네이트 버퍼 용액 등의 제1 용매에 용해하여 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액을 제조하는 단계, (B) 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 DMSO 등의 제2 용매에 용해하여 형광 화합물 용액을 제조하는 단계, (C) 상기 형광 화합물 용액을 상기 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액에 투입하고, 투석 동결건조하는 단계를 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형광 화합물은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여 시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자는 우수한 암 타겟능을 보인다.
도 1 및 도 2는 화합물 1의 광학분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3 및 도 4는 화합물 2의 광학분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 화합물 1의 형광 스펙트럼이다.
도 6은 화합물 2의 형광 스펙트럼이다.
도 7은 화합물 1과 화합물 2의 마우스 체내 분포양상을 보여주는 in vivo 이미징 결과이다.
도 8은 화합물 1과 화합물 2의 마우스 체내 분포양상을 보여주는 ex vivo 이미징 결과이다.
도 9는 ex vivo 이미징 이후 각 장기 별 형광 강도 값을 보여주는 그래프이다.
도 10은 화합물1-HGC 나노입자의 암 타겟능을 보여주는 in vivo 이미징 결과이다.
도 11은 화합물1-HGC 나노입자의 암 타겟능을 보여주는 ex vivo 이미징 결과이다.
도 3 및 도 4는 화합물 2의 광학분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 화합물 1의 형광 스펙트럼이다.
도 6은 화합물 2의 형광 스펙트럼이다.
도 7은 화합물 1과 화합물 2의 마우스 체내 분포양상을 보여주는 in vivo 이미징 결과이다.
도 8은 화합물 1과 화합물 2의 마우스 체내 분포양상을 보여주는 ex vivo 이미징 결과이다.
도 9는 ex vivo 이미징 이후 각 장기 별 형광 강도 값을 보여주는 그래프이다.
도 10은 화합물1-HGC 나노입자의 암 타겟능을 보여주는 in vivo 이미징 결과이다.
도 11은 화합물1-HGC 나노입자의 암 타겟능을 보여주는 ex vivo 이미징 결과이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물이다.
상기 X1, X2, X3, X4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO3H, SO3 - 중에서 선택되며,
상기 X5는 SO3H 또는 SO3 -이고,
(i) 상기 Y1은 하기 화학식 1a의 구조를 가지고 상기 Y2는 SO3H 또는 SO3 -이거나, 또는 (ii) 상기 Y1은 SO3H 또는 SO3 -이고 상기 Y2는 하기 화학식 1a의 구조를 가지며,
[화학식 1a]
상기 n1은 2 내지 7의 자연수이고,
상기 n3은 2 내지 7의 자연수이고,
상기 n2는 1 내지 5의 자연수이고,
상기 m1은 3 내지 7의 자연수이고,
상기 m2는 2내지 5의 자연수이고,
상기 m3은 3 내지 7의 자연수이고,
상기 Z는 Cl이다.
본 발명에 따른 형광 화합물은 기존 상용 형광 염료(cy 5.5, cy 7.5)에 비해 더욱 강한 형광 강도를 보임을 확인하였다.
일 구현예에 따르면, 상기 X1, X2, X3, X4는 (i) 모두 수소이거나 또는 (ii) 각각 독립적으로 SO3H 및 SO3 - 중에서 선택되고,
상기 n1은 3이거나 4이고,
상기 n3은 3이거나 4이고,
상기 n2는 2 또는 3이고,
상기 m1은 5이고,
상기 m2는 3이고,
상기 m3은 5이다.
다른 구현예에 따르면, 상기 X1, X2, X3, X4는 (i) 모두 수소이거나 또는 (ii) 이들 중 하나만 SO3 -이고 나머지는 SO3H이다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 형광 화합물은 하기 화학식 2a 또는 화학식 2b의 구조를 갖는다.
[화학식 2a]
[화학식 2b]
화합물 1과 화합물 2에 대한 체내 분포 양상을 관찰한 결과, 화합물 1과 화합물 2는 각각 신장과 간에 상대적으로 많은 양이 잔류하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 주사제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 담즙산-키토산 복합체 나노입자, (b) 담즙산-키토산 복합체 나노입자에 봉입된, 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자는 우수한 암 타겟능을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 주사제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (A) 담즙산과 메탄올을 혼합하고 NHS을 투입하여 담즙산 용액을 제조하는 단계, (B) 글라이콜 키토산과 메탄올을 포함하는 수용액에 EDC를 투입하여 키토산 용액을 제조하는 단계, (C) 상기 키토산 용액을 상기 담즙산 용액에 투입한 후, 투석하고 분산시키고 나서 동결건조하는 단계를 포함하는 담즙산-키토산 복합체 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (A) 담즙산-키토산 복합체 나노입자를 카보네이트 버퍼 용액에 용해하여 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액을 제조하는 단계, (B) 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 DMSO에 용해하여 형광 화합물 용액을 제조하는 단계, (C) 상기 형광 화합물 용액을 상기 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액에 투입하고, 투석 동결건조하는 단계를 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광 화합물을 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법에 관한 것이다.
이때, 상기 표지대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자 및 유기화합물 중에서 선택된 1종 이상이며, 상기 표지대상 물질은 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 기능기를 포함하며, 상기 기능기에 상기 형광 화합물이 결합할 수 있다.
또한, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실시예
제조예 1: 화합물 A의 제조
(1) 화합물 a의 합성
6-아미노-1,3-나프탈렌디설폰산 모노소듐 염 수화물) (TCI) (15 g)을 증류수 200 mL에 가한 후 12 시간 동안 이온교환수지를 이용하여 이온교환 후 감압 건조시켰다(15 g, 100%).
염화제일주석(tin(II) chloride)에 증류수 40 mL, 염산(HCl) 8 mL을 혼합하고 냉각시켰다. 앞에서 얻은 고체 물질(15 g, 49.5 mmol, 1eq)에 증류수 120 mL, 염산(HCl) 25 mL을 가한 후 5분 동안 0℃에서 반응시켰다. 아질산나트륨(sodium nitrite) (3.4 g, 49.5 mmol, 1 eq)에 증류수 50 mL 가하고 나서, 상기 용매에 적가 후 30분 동안 반응시켰다. 상기 냉각시킨 용액을 혼합액에 적가 후 12 시간 동안 상온에서 반응시키고 나서, 회전농축기(evaporator)로 용매를 건조 후 다이에틸 이터로 입자를 잡은 뒤 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(18 g, 114%).
(2) 화합물 b의 합성
화합물 a (6 g, 18.8 mmol, 1 eq,) 및 3-메틸-2-부탄온(6.05 mL, 56.4 mmol, 3.02 eq, TCI), 포타슘 아세테이트(3.7 g, 37.6 mmol, 2 eq, 덕산)를 아세트산 50 mL에 가한 후, 12 시간 동안 140℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고 용매를 감압 건조 후 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(7.4 g, 107%).
Rf = 0.57 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(3) 화합물 c의 합성
화합물 b (7.4 g, 20.3 mmol, 1 eq) 및 1,3-프로판설톤(7.9 mL, 90.5 mmol, 4.46 eq, TCI), 아세트산 나트륨(sodium acetate) (2 g, 40.6 mmol, 2 eq)을 아세토나이트릴 20 mL에 가한 후, 12 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 감압 건조하였다(15 g, 153%).
(4) 화합물 d의 합성
화합물 c (15 g, 30.4 mmol, 1 eq) 및 말론알데하이드 다이아닐리드 하이드로클로라이드(7.8 g, 30.4 mmol, 1 eq, TCI), 트리에틸아민(4.2 mL, 30.4 mmol, 1 eq, TCI)를 아세트산 100 mL에 가한 후 4 시간 동안 140℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(12 g, 60 %).
Rf = 0.5 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(5) 화합물 e의 합성
에틸 2-메틸아세토아세테이트(24.2 mL, 0.16 mol, 1 eq, TCI) 및 에틸-6-브로모헥사노에이트(34 mL, 0.17 mol, 1.1 eq, TCI), 소듐 에톡사이드(64 mL, 0.77 mol, 4.8 eq, TCI)에 에탄올 200 mL을 가한 후 12 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 1 M 염산을 소량 적가 후 pH를 중성으로 만들었다(pH = 7). 클로로포름과 증류수를 이용하여 추출 후 용매를 감압 건조하였다. 그 후 핵산과 에틸아세테이트를 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(48 g, 106.6%).
Rf = 0.4 (정상, 실리카겔, 핵산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1 v/v)
(6) 화합물 f의 합성
화합물 e (48 g, 0.16 mol, 1 eq) 및 수산화나트륨(21.4 g, 0.51 mol, 3.2 eq, 덕산)에 메탄올(165 mL, 3.9 mol, 24.4 eq) 및 증류수(54.6 mL, 2.89 mol, 18.1 eq)를 가한 후 12 시간 동안 50℃에서 가열하며 반응시켰다. 감압 건조 후 1M 염산을 200mL 적가하여 pH를 산성로 만들었다(pH = 1). 에틸아세테이트와 증류수로 추출 후 용매를 감압 건조하였다(30 g, 95.2%).
Rf = 0.0 (정상, 실리카겔, 핵산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1 v/v)
(7) 화합물 g의 합성
화합물 f (15.8 g, 84.8 mmol, 1.5 eq) 및 화합물 5-1 (18 g, 56.5 mmol, 1 eq)에 아세트산 87mL을 가한 후 5시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고 생성된 고체를 제거하기 위해 여과하였으며 여액을 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(30 g, 115.3%).
Rf = 0.45 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(8) 화합물 h의 합성
화합물 g (30 g, 63.9 mmol, 1 eq) 및 1,3-프로판설톤(37.5 mL, 428.1 mmol, 6.7 eq, TCI), 아세트산 나트륨(7.2 g, 105.4 mmol, 1,65 eq)을 아세토나이트릴 45 mL에 가한 후, 5 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 감압 건조하였다. 그 후 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하였다(52 g, 140%).
(9) 화합물 A의 합성
화합물 h (15 g, 25.9 mmol, 1.5 eq) 및 화합물 d (11.5 g, 17.3 mmol, 1 eq)를 디메틸포름아마이드에 완용하였다. 상기 용액에 트리에틸아민(20.5 mL, 147 mmol, 8.5 eq, TCI)를 아세트산무수물(9 mL, 95.1 mmol, 5.5 eq, 덕산)을 가한 후 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(12 g, 60 %).
Rf = 0.5 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
실시예 1: 화합물 1의 제조
(1) 화합물 A-1의 합성
화합물 A (500 mg, 0.5 mmol, 1 eq) 및 N,N-다이석시니미딜 카보네이트(DSC, 384 mg, 1.5 mmol, 3 eq, TCI), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) (870 μL, 5 mmol, 10 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 50 mL에 가한 후, 1 시간 동안 40℃에서 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다(500 mg, 91%).
Rf = 0.31 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
LC/MS, 계산치 1215.14, 측정치 1216.2
(2) 화합물 A-2의 합성
화합물 A-1 (500 mg, 0.035mmol, 1 eq)에 1,3-다이아미노프로판(9.72 μL, 0.1165 mmol, 1 eq)을 DMF 10mL에 가한 후, 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후, 감압 건조시켰다. 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 A-2를 얻었다(400 mg, 75.6%).
Rf = 0.33 (정상, 실리카겔, 아세토니트릴:증류수=4:1 v/v)
LC/MS, 계산치 1174.2, 측정치 1175.3
(3) 화합물 A-3의 합성
시아누릭 클로라이드(383 mg, 2.08 mmol, 5.5 eq)를 아세토나이드릴 35 mL와 얼음 35 mL에 넣은 후 온도를 0 내지 5 ℃로 0.5 시간 동안 섞어주었다. 화합물 A-2 (400 mg, 0.378 mmol, 1eq), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 191 mg를 첨가하여 온도를 0 내지 5 ℃로 2 시간 동안 반응시켰다. 감압 건조 뒤, 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 A-3을 얻었다(373 mg, 81.9 %).
Rf = 0.47 (이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3)
LC/MS, 계산치 1321.14, 측정치 1322.8
(4) 화합물 A-4의 합성
화합물 A-3 (373 mg, 0.309 mmol, 1eq), 6-아미노헥사노익산(284 mg, 2.16 mmol, 7 eq), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) (538 μL, 3.09 mmol, 10 eq, TCI)을 증류수 30 mL에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 A-4를 얻었다(235 mg, 58.5 %).
Rf = 0.33 (이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3)
LC/MS, 계산치 1416.26, 측정치 1416.9
(5) 화합물 1의 합성
화합물 A-4 (235 mg, 0.18 mmol, 1 eq) 및 N,N-다이석시니미딜 카보네이트(DSC) (139 mg, 0.542 mmol, 3 eq, TCI), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 314 μL, 1.8 mmol, 10 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 20 mL에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1을 얻었다(39 mg, 15.5 %).
Rf = 0.65 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
LC/MS, 1513.28, 측정치 1514.3
제조예 2: 화합물 B의 제조
(1) 화합물 i의 합성
1,1,2-트리메틸벤즈 인돌(2 g, 9.56 mmol, 1 eq) 및 1,4-부탄설톤(2.9 mL, 28.7 mmol, 3.01 eq, TCI), 아세트산 나트륨(941 mg, 11.5 mmol, 1,2 eq)을 아세토나이트릴 10 mL에 가한 후, 12 시간 동안 100℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매 제거 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(1.56 g, 47.3 %).
Rf = 0.37 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(2) 화합물 j의 합성
1,1,2-트리메틸벤즈 인돌(2 g, 9.56 mmol, 1 eq) 및 6-브로모헥사노익산(5.6 g, 28.7 mmol, 3.01 eq, TCI), 아세트산 나트륨(941 mg, 11.5 mmol, 1,2 eq)을 아세토나이트릴 10 mL에 가한 후, 12 시간 동안 100 ℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매 제거 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(1.01 g, 33.7 %).
Rf = 0.37 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(3) 화합물 k의 합성
화합물 i (15 g, 30.4 mmol, 1 eq) 및 글루타콘다이아닐리드 하이드로클로라이드(glutacondianilide Hydrochloride) (7.5 g, 30.4 mmol, 1 eq, TCI), 트리에틸아민(4.2 mL, 30.4 mmol, 1 eq, TCI)를 아세트산 100mL에 가한 후 4 시간 동안 140℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(16 g, 96.9 %).
Rf = 0.5 정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
(4) 화합물 B의 합성
화합물 j (15 g, 46.3 mmol, 1.5 eq) 및 화합물 k (16.7 g, 30.9 mmol, 1 eq)를 디메틸포름아마이에 완용하였다. 상기 용액에 트리에틸아민(20.5 mL, 147 mmol, 8.5 eq, TCI)를 아세트산무수물(9 mL, 95.1 mmol, 5.5 eq, 덕산)를 가한 후, 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다(5.7 g, 24.9 %).
Rf = 0.5 정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
실시예 2: 화합물 2의 제조
(1) 화합물 B-1의 합성
화합물 B (500 mg, 0.67 mmol, 1 eq) 및 N,N-다이석시니미딜 카보네이트(DSC) (518 mg, 2.0 mmol, 3 eq, TCI), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) (1.1 mL, 6.7 mmol, 10 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 50 mL에 가한 후, 1 시간 동안 40℃에서 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다 (500 mg, 89%).
Rf = 0.31 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
LC/MS, 계산치 827.36, 측정치 828.1
(2) 화합물 B-2의 합성
화합물 B-1 (500 mg, 0.6 mmol, 1 eq)에 1,3-다이아미노프로판) (49.8 μL, 0.6 mmol, 1 eq)을 디엠에프(DMF) 10 mL에 가한 후, 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 B-2를 얻었다(327mg, 68.4%).
Rf = 0.33 (정상, 실리카겔, 아세토니트릴:증류수=4:1 v/v)
LC/MS, 계산치 786.42, 측정치 785.9
(3) 화합물 B-3의 합성
시아누릭 클로라이드(416 mg, 2.26 mmol, 5.5 eq)를 아세토나이드릴 35 mL와 얼음 35 mL에 넣은 후 온도를 0 내지 5 ℃로 0.5 시간 동안 섞어주었다. 화합물 B-2 (327 mg, 0.41 mmol, 1eq), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 200 mg를 첨가하여 온도를 0~5℃로 2시간 동안 반응시켰다. 감압 건조 뒤, 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 B-3을 얻었다(157mg, 40.6 %).
Rf = 0.47 (이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3)
LC/MS, 계산치 933.36 측정치 932.6
(4) 화합물 B-4의 합성
화합물 B-3 (157 mg, 0.166 mmol, 1eq), 6-아미노헥사노익산 (153 mg, 1.16 mmol, 7 eq), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) (279 μL, 1.6 mmol, 10 eq, TCI)을을 증류수 30 mL에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 B-4를 얻었다(112 mg, 65.5 %).
Rf = 0.33 (이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3)
LC/MS, 계산치 1028.47, 측정치 1027.8
(5) 화합물 2의 합성
화합물 B-4 (112 mg, 0.11 mmol, 1 eq) 및 N,N-다이석시니미딜 카보네이트(DSC) (83.7 mg, 0.33 mmol, 3 eq, TCI), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) (192 μL, 1.1 mmol, 10 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 20 mL에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2를 얻었다(57 mg, 46 %).
Rf = 0.65 (정상, 실리카겔, 이소부탄올 : 프로판올 : 에틸아세테이트 : 증류수 = 2 : 4 : 1 : 3 v/v)
LC/MS, 계산치 1124.5, 측정치 1125.1
제조예 3: 담즙산-키토산 나노입자의 제조
(1) 키토산의 정제
글라이콜 키토산(GC) (100kDa) 1 g을 250 mL 삼각플라스크에 넣고 초순수수 80 mL에 녹인 후 투석용 멤브레인(MWCO 100 kDa)을 사용하여 수 차례 투석하였다. 투석 완료 후, 영하 80 ℃에서 12 시간 냉각 후 동결건조 진행하여 정제된 GC를 얻었다( 0.571 g, 57.1 %),
(2) 담즙산-키토산(HGC) 나노입자의 합성
정제된 GC 500 mg을 초순수수 60 mL에 완용한 후, 60 mL의 메탄올을 추가로 투입하여 충분히 교반하였다. 150 mg의 담즙산(5β-cholanic acid)을 120 mL의 메탄올에 넣고 완용하였다. 150 mg N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염 (EDC)에 1000 mL의 메탄올을 넣고 교반한 후, GC 용액에 투입하여 교반하였다. 72 mg의 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 메탄올 1 mL에 넣고 교반한 후, 담즙산 용액에 투입하여 교반하였다. 담즙산 혼합용액을 GC 혼압용액에 투입하여, 상온 일야교반 진행하였다. 반응액을 주사기 필터(pore size 80 μm)를 이용하여 여과한 후, 투석용 멤브레인(MWCO 12~14 kDa)에 넣고 4일 동안 투석 진행하였다. 투석 완료 후 초음파 분산기(Waterbath sonicator)에 30 초 동안 분산한 후 동결건조 진행하여 HGC 나노입자를 얻었다(0.492 g, 75.7 %).
- 1~2일차 투석용액: 메탄올/초순수수 3:1 v/v
- 3일차 투석용액: 메탄올/초순수수 1:1 v/v
- 4일차 투석용액: 초순수수
실시예 3: 화합물1-HGC의 제조
(1) 화합물1-HGC 나노입자의 합성
담즙산-키토산(HGC) 나노입자(20 mg, 0.21 μmol, 1 eq)를 8 mL 카보네이트 버퍼 용액(pH=9.0)에 넣고 완용하였다. 화합물 1 (1.29mg, 0.85 μmol)을 DMSO에 10 mg/mL의 농도로 녹인 후, HGC 용액에 적가하여 상온 일야반응 하였다. 반응액을 투석용 멤브레인 (MWCO 12~14 kDa)을 사용하여 5일동안 투석 진행하였다. 투석이 완료된 화합물을 동결건조 하여 화합물1-HGC 나노입자를 얻었다(15 mg, 75 %).
- 1~2일차 투석용액: 정제염/초순수수 8.4 g/1 L
- 3~5일차 투석용액: 초순수수
실시예 4: 화합물2-HGC의 제조
(2) 화합물2-HGC 나노입자의 합성
담즙산-키토산(HGC) 나노입자(20 mg, 0.21 μmol, 1 eq)를 8 mL 카보네이트 버퍼 용액(carbonate buffer, pH=9.0)에 넣고 완용하였다. 화합물 2 (0.96mg, 0.85 μmol)를 DMSO에 10 mg/mL의 농도로 녹인 후, HGC 용액에 적가하여 상온 일야반응 하였다. 반응액을 투석용 멤브레인(MWCO 12~14 kDa)을 사용하여 5일 동안 투석 진행하였다. 투석이 완료된 화합물을 동결건조 하여 HGC-FSD ICG 나노입자를 얻었다(17 mg, 85 %).
- 1~2일차 투석용액: 정제염/초순수수 8.4 g/1 L
- 3~5일차 투석용액: 초순수수
시험예 1: 화합물의 광학분석
(1) 화합물 1의 흡수, 형광파장 분석
화합물 1의 흡수, 형광파장의 분석을 진행하였다. 화합물 1에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하였다. 10 mg/mL의 농도로 Stock solution을 제조한 후 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline(이하 1X PBS)을 이용하여 6.6 μM의 농도로 희석하였다. 합성된 물질의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수 값은 Agilent 사의 Cary 8454 기기를 사용하여 측정하였고, 678 nm에서의 최대 흡수 값을 확인하였다(도 1).
형광 파장 및 최대 형광 파장에서의 형광 값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 측정하였고, 측정된 최대흡수파장인 678 nm으로 Excitation을 설정한 후 66 nM로 희석된 시약으로 형광을 측정하였다(도 2).
(2) 화합물 2의 흡수, 형광파장 분석
화합물 2의 흡수, 형광파장의 분석을 진행하였다. 화합물 2에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하였다. 10 mg/mL의 농도로 Stock solution을 제조한 후 Methanol을 이용하여 6.6 μM의 농도로 희석하였다. 합성된 물질의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수 값은 Agilent 사의 Cary 8454 기기를 사용하여 측정하였고, 786 nm에서의 최대 흡수 값을 확인하였다(도 3).
형광 파장 및 최대 형광 파장에서의 형광 값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 측정하였고, 측정된 최대흡수파장인 786 nm으로 Excitation을 설정한 후 0.22 μM로 희석된 시약으로 형광을 측정하였다(도 4).
(3) 대조형광물질과 형광강도 비교
화합물 1과 화합물 2, 대조형광염료(Cy 5.5, Cy 7.5)의 형광강도를 비교하였다. 4 종의 형광염료에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하였다. 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다. 이후 화합물 1과 Cy 5.5는 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline(이하 1x PBS)을 이용하여 1 nM의 농도로 희석한 후 Excitation 678 nm 설정 하에 형광을 측정하였고, 화합물 2와 Cy 7.5는 Methanol을 이용하여 10 nM의 농도로 희석한 후 Excitation 768 nm 설정 하에 측정하였다. 측정은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다.
도 5 및 도 6은 화합물 1, 화합물 2의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이며, 본 분석으로 화합물 1과 화합물 2의 형광강도가 모든 대조형광염료(Cy 5.5, Cy 7.5)보다 형광강도가 상대적으로 강함을 확인하였다.
시험예 2: 화합물 1 및 화합물 2의 동물실험 분석
(1) 마우스에서의 체내 분포양상 측정
화합물 1과 화합물 2를 DMSO에 10mg/mL로 녹여 Stock solution으로 만들어 사용하였고, 1X PBS를 이용하여 희석하여 5 μg/200 μL로 마우스의 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 마우스는 6주령의 수컷 Balb/c-nu (20g)의 마우스를 사용하였다. 이미징은 IVIS spectrum (PerkinElmer)를 이용하여 화합물을 주사한 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간이 지난 뒤 In vivo 이미징하였고, 24시간 이미징을 한 후 Liver, Lung, Spleen, Kidney, Heart를 적출하여 ex vivo 이미징을 수행하였다. 이때 화합물 1은 710 nm / 760 nm (Excitation / Emission) 화합물 2는 745 nm / 820 nm (Excitation / Emission) 설정 하에 수행하였다.
도 7의 In vivo 이미징 결과로 화합물 1은 화합물을 주사한 후 1시간이 지났을 때 마우스의 각 장기에 염료가 퍼져있었고, 2시간이 지나 면서 점차 소변을 통해 빠져나가면서 24시간이 지났을 때는 거의 모든 화합물가 빠져 나간 것을 확인하였다. 화합물 2는 화합물을 주사한 후 1시간이 지났을 때 마우스의 Kidney에 축적이 많이 되는 것을 확인하였고, 시간이 지나면서 소변을 통해 빠져나가는 것을 확인하였다.
도 8의 ex vivo 이미징 결과로 화합물 1은 Kidney에 화합물 2는 Liver에 잔유 화합물이 많은 것으로 확인하였다. ex vivo 이미징 이후 각 장기 별 형광 강도 값은 도 9에 나타내었다.
(2) 화합물1-HGC 나노입자의 Xenograft mouse model을 이용한 암 타겟능 확인
화합물1-HGC의 암 타겟능을 확인하기 위해 6주령의 수컷 Balb/c-nu (20 g)에 Squamous cell carcinoma 세포주인 SCC7 세포(1x106/0.1mL)를 마우스의 왼쪽 허벅지 위에 Subcutaneous injection하여 Xenograft mouse model을 제작하였다. 화합물1-HGC는 1 mg/mL의 농도로 Distilled water (이하 DW)에 녹여 Stock solution을 제조하고, 마우스 종양의 부피가 60 내지 80 mm3가 되었을 때 화합물1-HGC를 120 μg 꼬리정맥을 통해 주사하였다. In vivo 이미징은 IVIS spectrum (PerkinElmer)을 이용하여 710 nm / 760 nm (Excitation / Emission) 설정 하에 수행하였다. 나노입자 주사 후 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간 이미징을 수행하였고, ex vivo 이미징은 24 시간 이미징을 한 후 Liver, Lung, Spleen, Kidney, Heart, Tumor를 적출하여 수행하였으며, 분석은 IVIS spectrum의 software를 이용하여 수행하였다.
도 10의 In vivo 이미징의 분석 결과, 주사 후 8 시간 까지는 체내 전체에 분포되어 있다가 차츰 종양에 축적되어 24 시간에는 종양에 축적된 나노입자를 제외하고 대부분 대사과정을 통해 빠져 나가는 것을 확인하였다.
도 11에서 종양 외 다른 장기에 축적되는지 확인하기 위해 장기를 적출하고, ex vivo 이미징을 하여 장기의 형광 강도를 비교한 결과, 종양 이외에 Kidney에 많이 축적되는 것을 확인되었는데, 이것은 화합물1-HGC가 소변으로 배출되기 때문인 것으로 보인다. In vivo, ex vivo 이미징으로 화합물1-HGC의 암 타겟능을 확인하였고, 화합물 1이 다양한 동물실험에서 사용 가능한 것을 확인하였다.
Claims (15)
- 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물:
[화학식 1]
상기 X5는 SO3H 또는 SO3 -이고,
(i) 상기 X1, X2, X3, X4는 각각 독립적으로 SO3H 또는 SO3 - 이고, 상기 Y1은 하기 화학식 1a의 구조를 가지고, 상기 Y2는 SO3H 또는 SO3 -이거나, 또는
(ii) 상기 X1, X2, X3, X4는 모두 수소이고, 상기 Y1은 수소이고, 상기 Y2는 하기 화학식 1a의 구조를 가지고,
[화학식 1a]
상기 n1은 3이거나 4이고,
상기 n3은 3이거나 4이고,
상기 n2는 2 또는 3이고,
상기 m1은 5이고,
상기 m2는 3이고,
상기 m3은 5이고,
상기 Z는 Cl이다. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 X1, X2, X3, X4는 (i) 모두 수소이거나 또는 (ii) 이들 중 하나만 SO3 -이고 나머지는 SO3H인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
- 제3항에 있어서, 상기 형광 화합물은 하기 화학식 2a 또는 화학식 2b의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 형광 화합물:
[화학식 2a]
[화학식 2b]
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 주사제.
- (a) 담즙산-키토산 복합체 나노입자, (b) 담즙산-키토산 복합체 나노입자에 봉입된 형광 화합물을 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자로서,
상기 형광 화합물은 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물인 것을 특징으로 하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자. - 제7항에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 조성물.
- 제7항에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 포함하는 조영제 주사제.
- 삭제
- 하기 단계를 포함하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자 제조방법:
(A) 담즙산-키토산 복합체 나노입자를 카보네이트 버퍼 용액에 용해하여 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액을 제조하는 단계,
(B) 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 DMSO에 용해하여 형광 화합물 용액을 제조하는 단계,
(C) 상기 형광 화합물 용액을 상기 담즙산-키토산 복합체 나노입자 용액에 투입하고, 투석 동결건조하는 단계. - 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법으로서,
상기 표지대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자 및 유기화합물 중에서 선택된 1종 이상이며,
상기 표지대상 물질은 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 기능기를 포함하며,
상기 기능기에 상기 형광 화합물이 결합하는 것을 특징으로 하는 형광 화합물 표지방법. - 제12항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 형광 화합물 표지방법.
- 제7항에 따른 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자를 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 형광 화합물 표지방법으로서,
상기 표지대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자 및 유기화합물 중에서 선택된 1종 이상이며,
상기 표지대상 물질은 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 기능기를 포함하며,
상기 기능기에 상기 형광 화합물이 결합하는 것을 특징으로 하는 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자의 표지방법. - 제14항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 형광화합물-담즙산-키토산 나노입자의 표지방법.
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