ES2236131T3

ES2236131T3 - Procedimiento para el diagnostico in vivo mediante una radiacion nir.

Info

Publication number: ES2236131T3
Application number: ES01250366T
Authority: ES
Inventors: Kai Licha; Bjorn Riefke; Wolfhard Semmler; Ulrich Speck; Christoph-Stephan Hilger
Original assignee: Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-10-10
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2015-10-10
Also published as: IL116018A0; CA2205906A1; DK1181940T3; DE59510658D1; CA2205906C; EP1181940B1; US7655217B2; NO972509D0; EP1181940A2; KR100340290B1; IL141384A0; US20030170179A1; ES2198446T3; EP1181940A3; IL141384A; KR980700091A; EP0796111A1; US7445767B2; ATE238071T1; PT796111E

Abstract

Agente de diagnóstico para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR, que contiene compuestos de la fórmula general (I) B1-(F-Wn)m (I) así como eventualmente sus sales fisiológicamente compatibles, en la que l representa un número de 0 - 6, n representa un número de 0 - 10 y m representa el número de 1 - 100, B es una unidad de reconocimiento biológico con un peso molecular hasta de 30.000, que se fija a determinadas poblaciones de células o específicamente a receptores, o se enriquece en tejidos o tumores, o permanece predominantemente en la sangre, o es una macromolécula que no se fija específicamente, F representa un colorante, que tiene máximos de absorción en el intervalo de 650 a 1.200 nm, y W representa un grupo hidrófilo, que mejora la solubilidad en agua, con la condición de que l ha de ser = 0, el coeficiente de reparto entre n-octanol y agua del compuesto de la fórmula I es menor o igual que 2, 0 mmol, y F representa un colorante de cianina.

Description

Procedimiento para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR.

El invento se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vivo mediante una radiación infrarroja próxima (radiación NIR, de Near Infrared Radiation) mediando utilización de colorantes solubles en agua y de sus aductos con biomoléculas que poseen determinadas propiedades fotofísicas y farmacoquímicas, como agentes de contraste en el diagnóstico por fluorescencia y por transiluminación en la región de la NIR, a nuevos colorantes, y a agentes farmacéuticos que contienen éstos.

El reconocimiento de enfermedades es dependiente, en una parte esencial, de hasta qué punto se consigue obtener informaciones acerca de estructuras y sus modificaciones a partir de las capas más profundas, primariamente inaccesibles, de un tejido. Esto, junto a un sondeo, despeje o punteo, se puede realizar mediante los modernos procedimientos de producción de imágenes, tales como el estudio por rayos X, la tomografía por resonancia magnética o el diagnóstico por ultrasonidos.

Puesto que un tejido biológico posee una permeabilidad relativamente alta para una luz de onda larga situada en el intervalo de longitudes de onda de 650-1.000 nm, con esto se pone a disposición del profesional diagnosticador un procedimiento totalmente distinto para la representación de tejidos en imágenes. El hecho de que una luz infrarroja próxima puede penetrar a través de un tejido hasta en varios centímetros, se aprovecha en la producción de imágenes por transiluminación. Esta técnica permite hasta ahora el diagnóstico de inflamaciones de las cavidades paranasales y de las cavidades de la mandíbula, o la detección de acumulaciones de líquido o de sangre en regiones de los tejidos que están próximas a la superficie (Beuthan J., Müller G.; Infrarotdiaphanoskopie [Diafanoscopia por rayos infrarrojos], Med. Tech. 1 (1992) 13-17).

Los intentos para el reconocimiento de tumores de mama transcurrieron hasta ahora de una manera insatisfactoria (Navarro, G.A.; Profio, A.E.; Contrast in diaphanography of the breast [Contraste en la diafanografía del pecho]; Med. Phys. 150 (1988) 181-187; Aspegren, K.; Light Scanning Versus Mammography for the Detection of Breast Cancer in Screening and Clinical Practice [Exploración luminosa frente a la mamografía para la detección de un cáncer de mama en la práctica de exploración y clínica], Cancer 65 (1990) 1671-77), pero a causa de unos muy recientes perfeccionamientos técnicos en aparatos prometen un mejor éxito (Klingenbeck J.; Laser-Mammography with NIR-Light [Mamografía por láser con luz NIR], Gynäkol.-Geburtsh.-Rundsch. 33 suplemento 1 (1993) 299-300); Benaron D.A.; Optical Imaging reborn with technical advances [Renacimiento de la representación óptica de imágenes con avances técnicos], Diagnostic Imaging (1994) 69-76).

Junto a la detección de la radiación no absorbida, también la radiación de fluorescencia, emitida después de una irradiación con luz infrarroja próxima, puede proporcionar informaciones específicas acerca de tejidos. Esta denominada autofluorescencia se aprovecha para diferenciar un tejido aterosclerótico con respecto de un tejido normal (Henry, P.D. y colaboradores, Laser-Induced Autofluorescence of Human Arteries [Autofluorescencia, inducida por láser, de arterias humanas], Circ. Res. 63 (1988) 1053-59).

El problema esencial en el caso del aprovechamiento de una radiación infrarroja próxima es la dispersión extraordinariamente grande de la luz, por lo que incluso en el caso de presentarse diferentes propiedades fotofísicas, un objeto delimitado nítidamente se resalta sólo de una manera no nítida con respecto de su entorno. El problema aumenta al crecer la distancia desde la superficie y se puede considerar como un principal factor limitador tanto en el caso de la transiluminación como también en el caso de la detección de una radiación fluorescente.

Al mejoramiento de la diferenciación entre un tejido normal y otro enfermo pueden contribuir apropiados colorantes fluorescentes, que se enriquecen en un tejido enfermo (en particular en tumores) y poseen un comportamiento específico de absorción y emisión. La modificación, producida por absorción del colorante, de la luz irradiada (dispersa) o la fluorescencia inducida por la radiación excitadora, se detecta y proporciona las informaciones propiamente dichas, específicas acerca de tejidos.

Ejemplos de la utilización de colorantes para el diagnóstico in vivo en seres humanos son el seguimiento en la sangre con métodos fotométricos para el reconocimiento de los espacios de distribución, del flujo sanguíneo o de las funciones de metabolismo y segregación, así como la visualización de estructuras transparentes del ojo (oftalmología). Colorantes preferidos para estas aplicaciones son el verde de indocianina y la fluoresceína (Googe, J.M. y colaboradores, Intraoperative Fluorescein Angiography [Angiografía intraoperativa con fluoresceína]; Ophtalmology, 100, (1993), 1167-70).

El verde de indocianina (Cardiogreen) se utiliza para la medición de la función hepática, del volumen del corazón en función del tiempo y de los latidos, así como de circulaciones sanguíneas a través de órganos y periféricas (I. Med. 24, (1993) 10-27), y se ensaya como agente de contraste para la detección de tumores. El verde de indocianina se fija en un 100% a una albúmina y es puesto en libertad en el hígado. El rendimiento cuántico de fluorescencia es pequeño en un medio acuoso. La DL_{50} [dosis letal del 50%] (0,84 mmol/kg) es suficientemente alta, pero pueden provocarse intensas reacciones anafilácticas. El verde de indocianina es inestable en una solución y no puede ser aplicado en medios que contienen sales, puesto que se llega a la precipitación.

Para la localización y la reproducción de tumores se utilizaban hasta ahora los agentes fotosensibilizadores concebidos para una aplicación en la terapia fotodinámica (PDT, de PhotoDynamischen Therapie), (entre otros, derivados de hematoporfirina, fotofrina II, benzoporfirinas, tetrafenilporfirinas, clorinas, ftalocianinas) (Bonnett R.; New photosensitizers for the photodynamic therapy of tumours [Nuevos agentes fotosensibilizadores para la terapia fotodinámica de tumores], SPIE volumen 2078 (1994)). Los compuestos señalados tienen en común la desventaja de que ellos, en el intervalo de longitudes de onda de 650-1.200 nm, presentan solamente una moderada absorción. La fototoxicidad necesaria para la PDT, es perturbadora para misiones puramente de diagnóstico. Otros documentos acerca de esta temática son: la patente de los EE.UU. U.S.-PS 4.945.239; los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 84/04665 y WO 90/10219 y los documentos de publicación de solicitud de patente alemana DE-OS 4136769 y de patente alemana DE-PS 2.910.760.

En el documento US-PS 4.945.239 se describen numerosas disposiciones de aparatos para la detección de un cáncer de mama mediante transiluminación, y como colorantes de absorción que aumentan el contraste se mencionan la conocida fluoresceína, la fluorescamina y la riboflavina. Estos colorantes tienen en común la desventaja de que absorben en la región visible de longitudes de onda, de 400-600 nm, en la que la permeabilidad a la luz de un tejido es muy pequeña.

En el documento DE-OS 4136769 se describe un equipo para la detección por fluorescencia de regiones de tejidos enriquecidas con sustancias fluorescentes. Las sustancias son la bacterioclorofila y sus derivados, así como naftalocianinas. Estas estructuras se distinguen por unas absorciones situadas en el intervalo de 700-800 nm con unos coeficientes de extinción hasta de 70.000 l mol^{-1} cm^{-1}. Los compuestos aquí reseñados, junto a las propiedades de fluorescencia, poseen la capacidad de generar por radiación oxígeno de singulete y, de esta manera, de actuar citotóxicamente (agentes fotosensibilizadores para la terapia fotodinámica). Este efecto fotosensibilizador es indeseado en elevadísima medida para un agente de diagnóstico puro, exento de efectos.

Además de esto, la síntesis de los compuestos de bacterioclorofila son por añadidura costosos y caros, puesto que se necesitan productos naturales como sustancias de partida; las naftalocianinas se distinguen con frecuencia por una muy pequeña fotoestabilidad. Los compuestos conocidos de estas clases son mal solubles en agua, y la síntesis de derivados hidrófilos uniformes es costosa.

El documento WO 84/04665 describe un procedimiento in vivo para la detección por fluorescencia de tumores mediando utilización de los agentes fotosensibilizadores hematoporfirina y uno de sus derivados (Hp y HpD), uro- y copro- y proto-porfirinas y numerosas porfirinas sustituidas en meso, así como los colorantes riboflavina, fluoresceína, anaranjado de acridina, sulfato de berberina y de tetraciclinas. Los antes mencionados requisitos fotofísicos y farmacoquímicos no son cumplidos por las mencionadas sustancias.

Folli y colaboradores, Cancer Research 54, 2643-2649 (1994), describen un anticuerpo monoclonal unido con un colorante de cianina, que se utilizaba para la detección de un tumor implantado subcutáneamente. La detección de procesos patológicos situados a mayor profundidad hace necesaria, no obstante, la utilización de colorantes aún más mejorados. Además, unas dosificaciones más altas de un colorante hacen aparecer como inapropiada la utilización de anticuerpos como vehículos, a causa de los efectos colaterales que son de esperar.

Los colorantes de cianinas y los colorantes de polimetinas, afines a ellos, encuentran utilización también como constituyentes de capas fotográficas. Tales colorantes no necesitan propiedades luminiscentes de ningún tipo. Los colorantes de cianinas con propiedades de luminiscencia (fluorescencia) son sintetizados para la utilización en la microscopía por fluorescencia y la citometría de flujo pasante, y se acoplan a biomoléculas, p.ej. a compuestos con grupos yodoacetilo como marcadores específicos para grupos sulfhidrilo de proteínas (Waggoner, A.S. y colaboradores; Cyanine dye Labeling Reagents for Sulhydryl Groups [Reactivos para marcación con colorantes de cianinas para grupos sulfhidrilo], Cytometry, 10, (1989), 3-10). De esta manera, las proteínas son marcadas y aisladas. Otros ejemplos de la bibliografía son: Cytometry, 12 (1990), 723-30); Anal. Lett. 25 (1992) 415-28; Bioconjugate Chem. 4 (1993) 105-11.

En el documento DE-OS 39 12 046 de Waggoner, A.S., se describe un procedimiento para la marcación de biomoléculas con colorantes de cianinas y afines, tales como colorantes de merocianina y estirilo, que contienen por lo menos una agrupación de sulfonato o ácido sulfónico. El mencionado documento se refiere a un procedimiento de marcación de una sola etapa, así como de dos etapas, en un medio acuoso, teniendo lugar una reacción covalente entre un colorante y un grupo amino, hidroxi, aldehído o sulfhidrilo en proteínas u otras biomoléculas.

El documento DE-OS 3828360 se refiere a un procedimiento para la marcación de anticuerpos anti-tumores, especialmente anticuerpos específicos para melanomas y carcinomas de colon, con fluoresceína y verde de indocianina para misiones oftalmológicas. La fijación del verde de indocianina a biomoléculas no es covalente (combinación de colorantes y anticuerpos, mezcla).

Los procedimientos conocidos a partir del estado de la técnica, para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR, presentan por consiguiente una serie de desventajas, por causa de las cuales era imposible hasta ahora su aplicación en el diagnóstico médico amplio.

La utilización directa de una luz visible o una radiación NIR está limitada a regiones del cuerpo próximas a la superficie, lo cual está conectado con la intensa dispersión de la luz irradiada.

La adición de colorantes, con el fin de mejorar el contraste y la capacidad de resolución, provoca sin embargo una serie de otros problemas. En efecto, a estos colorantes se les han de aplicar unas escalas que son válidas en términos generales para agentes de diagnóstico. Así, tales sustancias, puesto que éstas se administran en la mayor parte de los casos en dosis más altas, también a lo largo de un prolongado período de tiempo de diagnóstico, deben presentar solamente una pequeña toxicidad. Además, estos colorantes apropiados para el diagnóstico deben ser bien solubles en agua y suficientemente estables desde puntos de vista químicos y fotofísicos, a saber por lo menos durante el período de tiempo de diagnóstico. También hay que pretender una estabilidad en lo que se refiere a la metabolización en el organismo.

Hasta ahora no están a disposición ni colorantes con tales propiedades ni un procedimiento apropiado para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR.

El invento se basa por lo tanto en la misión de proporcionar un agente de diagnóstico para el diagnóstico in vivo, que supere las desventajas del estado de la técnica.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones 1-5.

El problema planteado por esta misión se resuelve, conforme al invento, poniendo a disposición un agente de diagnóstico para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR, en el que se utilizan compuestos de la fórmula general I

(I)B_{1} - (F-W_{n})_{m}

en la que

: l representa un número de 0-6, n representa un número de 0-10 y m representa el número de 1-100,

: B es una unidad de reconocimiento biológico con un peso molecular hasta de 30.000, que se fija a determinadas poblaciones de células o de manera específica a receptores o que se enriquece en tejidos o tumores, o permanece predominantemente en la sangre, o es una macromolécula que no se fija específicamente,

: F representa un colorante, que presenta unos máximos de absorción en el intervalo de 650 a 1.200 nm,

: W representa un grupo hidrófilo, que mejora la solubilidad en agua, realizándose que el coeficiente de reparto entre octanol y agua del compuesto de la fórmula I es menor o igual que 2,0, con la condición de que l ha de ser = 0,

así como sus sales fisiológicamente compatibles, estando indicadas las características adicionales en las reivindicaciones.

Agentes de diagnóstico, especialmente apropiados para el procedimiento conforme al invento, que contienen compuestos de la fórmula general I son aquellos en los que por ejemplo B es un aminoácido, un péptido, unas CDR (de Complementarity Determining Regions = regiones determinantes de la complementariedad), un antígeno, un hapteno, un substrato de enzima, un cofactor de enzima, biotina, un carotinoide, una hormona, una neurohormona, un neurotransmisor, un factor de crecimiento, una linfocina, una lectina, una toxina, un hidrato de carbono, un oligosacárido, un polisacárido, un dextrano, un oligonucleótido o un medicamento que se fija a receptores.

Los colorantes utilizados conforme al invento absorben en la región espectral de 650 nm a 1.200 nm. Los coeficientes de absorción de los compuestos son de aproximadamente 100.000 l mol^{-1} cm^{-1} y mayores, referidos a una molécula de colorante. Los rendimientos cuánticos de fluorescencia son mayores que 5% en el caso de colorantes, que se utilizan para la producción de imágenes por fluorescencia.

Son objeto del presente invento agentes de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1, que contienen compuestos de la fórmula (I), con colorantes de cianinas de la fórmula general V

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1

realizándose que

Q es un fragmento

100

: realizándose que R^{30} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un radical alcoxi con 1 a 4 átomos de carbono o un átomo de cloro, b significa un número entero 2 ó 3, R^{31} representa un átomo de hidrógeno o un radical alquilo con 1 a 4 átomos de carbono,

X e Y independientemente uno de otro, representan un fragmento -O-, -S-, -CH=CH- o -C(CH_{2}R^{32})(CH_{2}R^{33})-,

R^{20} hasta R^{29}, R^{32} y R^{33} independientemente unos de otros, representan un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi, un radical carboxi, un radical de ácido sulfónico o un radical carboxialquilo, alcoxicarbonilo o alcoxioxoalquilo con hasta 10 átomos de C o un radical sulfoalquilo con hasta 4 átomos de C,

o representan una macromolécula que no se fija específicamente

o representan un radical de la fórmula general VI,

con la condición de que en el caso de los significados de X e Y iguales a O, S, -CH=CH- o -C(CH_{3})_{2}-, por lo menos uno de los radicales R^{20} hasta R^{29} ha de corresponder a una macromolécula que no se fija específicamente, o a la fórmula general VI,

(VI)-(O)_{v}-(CH_{2})_{o}-CO-NR^{34}-(CH_{2})_{s}-(NH-CO)_{q}-R^{35}

realizándose que

: o y s son iguales a 0, o independientemente uno de otro, representan un número entero de 1 a 6,

: q y v independientemente uno de otro, representan 0 ó 1,

: R^{34} representa un átomo de hidrógeno o un radical metilo,

: R^{35} significa un radical alquilo con 3 a 6 átomos de C, que tiene desde 2 hasta n-1 grupos hidroxi, siendo n el número de los átomos de C, o significa un radical alquilo con 1 a 6 átomos de C, un radical arilo con 6 a 9 átomos de C o un radical arilalquilo con 7 a 15 átomos de C, sustituido con 1 a 3 grupos carboxi, o significa un radical de la fórmula general IIId o IIIe

2

: con la condición de que q ha de representar 1,

: o significa una macromolécula que no se fija específicamente,

o R^{20} y R^{21}, R^{21} y R^{22}, R^{22} y R^{23}, R^{24} y R^{25}, R^{25} y R^{26}, R^{26} y R^{27} en común con los átomos de carbono situados entre ellos, forman un anillo aromático o condensado saturado de 5 ó 6 miembros,

así como sus sales fisiológicamente compatibles, poseyendo los colorantes de cianinas una hidrofília caracterizada por un factor de reparto entre n-octanol y agua menor que 2,0.

En los compuestos de la fórmula general V, conformes al invento, los radicales alquilo, arilo o aralquilo con grupos hidroxi o carboxi poseen los grupos mencionados con anterioridad como preferidos.

Colorantes de cianinas especialmente preferidos son

: 5-[2-[(1,2-dicarboxietil)amino]-2-oxoetil]-2-[7-[5-[2-(1,2-dicarboxietil)amino]-2-oxoetil]-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna, sal de monopotasio,

: 2-[7-[5-[2-[(11-carboxi-2-oxo-1,4,7,10-tetraaza-4,7,10-tri(carboximetil)-1-undecil)amino]-2-oxoetil]-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-etil-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna,

: 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-5-[2-[(metoxipolioxi-etilen)-amino]-2-oxoetil]-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-[2-[(metoxi-polioxi-etilen)amino]-2-oxoetil]-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio,

: 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-(metoxipolioxi-etilen)aminocarbonil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio,

: 3-(3-carboxipropil)-2-[7-[3-(3-carboxipropil)-1,3-dihidro-3-metil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3-metil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio,

: 2-[7-[1,3-dihidro-5-[2-[(2,3-dihidroxipropil)amino]-2-oxoetil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-5-[2-[(2,3-dihidroxi-propil)amino]-2-oxoetil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio.

Una propiedad esencial de los compuestos utilizados conforme al invento consiste en que ellos poseen una hidrofília caracterizada por un coeficiente de reparto entre n-octanol y agua menor que 2,0 (coeficiente de reparto entre n-octanol y un tampón TRIS 0,01 M ajustado a un pH de 7,4 con una solución al 0,9% de cloruro de sodio, estando ambas fases recíprocamente saturadas). Los compuestos no poseen propiedades fotosensibilizadoras o fototóxicas pronunciadas, que son indeseadas para un agente de diagnóstico puro. Ellos, además de esto, son bien compatibles y se segregan.

Mediante esta propiedad, los compuestos se distinguen de los colorantes hasta ahora conocidos, propuestos o utilizados como agentes para el diagnóstico in vivo. Los rendimientos cuánticos de fluorescencia, que disminuyen drásticamente por agregación en medios acuosos especialmente en los casos de los colorantes de cianinas, son comparables con los medidos en disolventes apolares, puesto que mediante la solubilidad elevada en agua y la exigencia de espacio de los grupos hidrófilos se reprime una formación de agregados y micelas.

La afinidad con proteínas de un grupo de los compuestos preferidos es pequeña, el comportamiento farmacocinético se corresponde de modo aproximado, por ejemplo, con el de la insulina o la sacarosa.

Sorprendentemente, se mostró que, incluso en los casos de estos compuestos, a pesar de la sencilla constitución de las moléculas, se efectúa un enriquecimiento suficiente para un diagnóstico en determinadas estructuras en el organismo, p.ej. también en tumores, y después de una distribución uniforme del colorante en el organismo la eliminación desde las zonas con tumores tiene lugar de un modo retardado en comparación con el tejido situado en torno a ellas.

La compatibilidad de las sustancias es muy alta. Se prefieren especialmente las sustancias con unos valores de DL_{50} mayores que 0,5 mmol/kg de peso corporal, referidos a una molécula individual de colorante.

Los compuestos utilizados conforme al invento se distinguen por unas altas estabilidades in vitro e in vivo, así como por una alta fotoestabilidad. Al dejar reposar una solución acuosa en recintos iluminados con luz diurna, en el caso de los compuestos especialmente preferidos éstos están inalterados en un 98% después de 2 días y en un 70% después de 12 días.

Las descritas propiedades fotofísicas y farmaco-cinéticas de los compuestos utilizados conforme al invento se diferencian también de las del único colorante de cianina que está admitido para la utilización en un paciente, a saber el verde de indocianina (Cardiogreen).

Conforme al invento, se utilizan además compuestos de la fórmula general I, en los cuales los valores de l de B son mayores o iguales que 1, y preferiblemente son 1 ó 2.

Es posible la síntesis de colorantes de cianinas, que absorben a unas longitudes de onda de 650 a 1.200 nm con altos coeficientes de extinción y emiten fluorescencia con alta eficiencia. La síntesis de los colorantes de cianinas, conformes al invento y utilizados conforme al invento, se efectúa de manera predominante apoyándose en métodos conocidos por la bibliografía, por ejemplo en las citas de F.M. Hamer en The Cyanine Dyes and Related Compounds [Los colorantes de cianinas y compuestos afines], John Wiley and Sons, Nueva York, 1964; Cytometry [Citometría], 10 (1989) 3-10; 11 (1990) 418-430; 12 (1990) 723-30; Bioconjugate Chem. 4 (1993) 105-11, Anal. Biochem. 217 (1994) 197-204; Tetrahedron 45 (1989) 4845-66, Solicitud de Patente Europea 0 591 820 A1.

La preparación de los aductos de colorantes y biomoléculas de la fórmula general I, utilizados conforme al invento, se efectúa por reacción de un compuesto F-W_{n} preparado de acuerdo con métodos conocidos, citados con anterioridad, con una unidad de reconocimiento biológico B.

Para esto el compuesto F-W_{n} debe contener por lo menos una, de modo preferido exactamente una, agrupación, que es reactiva covalentemente frente a un grupo amino, hidroxi, aldehído o sulfhidrilo en las unidades de reconocimiento biológico. Tales agrupaciones son conocidas en la bibliografía y se describen, entre otros documentos, en el DE-OS 39 12 046.

De modo especialmente preferido, las agrupaciones son las de isotiocianato, isocianato y ésteres hidroxi-succinimídicos o ésteres hidroxi-sulfosuccinimídicos, que son reactivas frente a funciones amino y forman un puente de tiourea, urea y amida, así como las agrupaciones de halogenoacetilo y de imida de ácido succínico. que son reactivas frente a grupos sulfhidrilo, y se forma un puente de tioéter.

Además, los grupos carboxi pueden formar con funciones de alcohol enlaces de ésteres o estructuras de éteres, mediando utilización de apropiados reactivos de activación (p.ej. DCC), así como las funciones aldehído pueden conducir con hidrazinas a estructuras de iminas.

Las mencionadas agrupaciones reactivas son unidas a los colorantes de la fórmula general I, conformes al invento o utilizados conforme al invento, o a sus compuestos precursores sintéticos, o bien funcionalidades presentes se transforman en las agrupaciones reactivas. Las agrupaciones reactivas pueden estar unidas directamente al sistema de colorante o a través de las denominadas estructuras engarzadoras (p.ej. cadenas de alquilo, estructuras de aralquilo).

La reacción de F-W_{n} con las unidades de reconocimiento biológico B se efectúa de modo preferido en DMF (dimetil-formamida), o bien en un medio acuoso, o en mezclas de DMF y agua a unos valores del pH de 7,4 a 10. La relación molar entre la molécula de colorante y la biomolécula (grado de carga) se determina mediante espectroscopía de absorción. Los constituyentes no fijados se separan por cromatografía o por filtración.

De igual manera, las macromoléculas, que poseen las apropiadas funcionalidades, se pueden acoplar a los colorantes.

Las sustancias pueden tener propiedades muy diversas. El peso molecular puede ser desde unos pocos cientos hasta de más de 100.000. Las sustancias pueden ser neutras o estar cargadas eléctricamente. Se prefieren unas sales de colorantes de carácter ácido con bases fisiológicamente compatibles, tales como sodio, metil-glutamina, lisina o sales con litio, calcio, magnesio o gadolinio como cationes.

Los aductos de colorantes y biomoléculas, que se han obtenido, cumplen de un modo sobresaliente los requisitos fotofísicos, toxicológicos, químicos y económicos antes descritos.

Un objeto adicional del presente invento es la utilización de los agentes que contienen colorantes de cianinas de la fórmula general V, para la preparación de agentes destinados al diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR, de modo correspondiente a la utilización de los agentes que contienen compuestos de acuerdo con la fórmula general I.

Un objeto del presente invento son agentes de diagnóstico, que contienen compuestos de las fórmulas generales V ó I.

Estos agentes se preparan de acuerdo con métodos conocidos por un experto en la especialidad, eventualmente mediando utilización de usuales sustancias coadyuvantes y/o de vehículo, así como de agentes diluyentes y similares. A éstos pertenecen electrólitos, tampones, detergentes fisiológicamente compatibles y sustancias para la adaptación de la osmolalidad así como para el mejoramiento de la estabilidad y de la solubilidad, tales como por ejemplo ciclodextrinas. Mediante las medidas habituales en la farmacia hay que procurar la esterilidad de las formulaciones al realizar la preparación y en particular antes de la aplicación.

Los siguientes Ejemplos explican el invento.

Ejemplo 1 Preparación de 5-[2-[(1,2-dicarboxietil)amino]-2-oxoetil]-2-[7-[5-[2-(1,2-dicarboxietil)amino]-2-oxoetil]-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna, sal de monopotasio

A partir de 5-carboximetil-2-[7-[5-carboximetil-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna, sal de monopotasio, se prepara de acuerdo con procedimientos conocidos el di-éster de N-hidroxi-succinimida (Cytometry 11 (1990) 418-430).

A una solución de 0,5 g (0,51 mmol) del diéster de succinimidilo en 5 ml de DMF se le añaden 0,16 g (1,22 mmol) de ácido aspártico en 1 ml de DMF. La mezcla de reacción se agita a la temperatura ambiente durante 48 h y el producto se precipita por adición de un éter. La purificación en presencia de RP-18 (LiChroprep, 15-25 \mu, H_{2}O:MeOH desde 99:1 hasta 1:1) y la subsiguiente liofilización, así como la desecación durante 24 horas (h) a 50ºC/0,01 mbar proporcionan 0,27 g (51%) de un producto.

Análisis:

Calculado:	C 54,43	H 5,54	N 5,40	O 24,68	S 6,18	K 3,77
Encontrado:	C 54,04	H 5,81	N 5,22		S 6,13	K 3,85

Ejemplo 2 Preparación de 2-[7-[5-[2-[(11-carboxi-2-oxo-1,4,7,10-tetraaza-4,7,10-tri(carboximetil)-1-undecil)amino]-2-oxoetil]-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-etil-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna

A una solución de 0,5 g (0,73 mmol) del N-éster succinimidílico de 2-[7-[5-(carboximetil)-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-etil-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal interna (Cytometry 11 (1990) 418-430) en 5 ml de metanol se le añaden gota a gota con lentitud a -10ºC, 43 mg (0,65 mmol) de hidrato de hidrazina al 85 por ciento en 1 ml de metanol, y se agita durante 2 h a esta temperatura. La solución de reacción se concentra por evaporación en vacío hasta aproximadamente 3 ml, se mezcla con 1 ml de isopropanol y se conserva durante una noche a -20ºC. Los cristales precipitados se filtran con succión y se secan en una bomba de aceite. Se obtienen 0,27 g (61%) de la hidrazida de ácido tricarbocianina-carboxílico.

A una solución de 0,21 g (0,51 mmol) del monoanhídrido del monoéster etílico de ácido dietilentriaminapentaacético en 20 ml de DMF y 0,2 ml de trietilamina, se le añaden mediando agitación 0,27 g (0,45 mmol) de la hidrazida, la mezcla se agita durante 48 h a la temperatura ambiente. Después de una filtración, el disolvente se evapora a 0,2 mbar, el residuo se mezcla agitando con CH_{2}Cl_{2}, se separa por filtración y se seca en un alto vacío. El producto obtenido se agita a la temperatura ambiente durante 4 h en 5 ml de NaOH acuoso 3 M, luego se ajusta a un pH de 2,0 con HCl semiconcentrado, se añade 1 ml de isopropanol y los cristales, obtenidos después de reposar durante 18 horas a 4ºC, se filtran con succión y se secan en un alto vacío durante 24 h a 60ºC, rendimiento 0,23 g (52%) de un granulado oscuro reluciente de color rojo.

Análisis:

Calculado:	C 59,32	H 6,60	N 9,88	O 20,96	S 3,23
Encontrado:	C 54,15	H 6,70	N 9,50		S 3,19

Ejemplo 3 Preparación de 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-5-[2-[(metoxipolioxietilen)-amino]-2-oxoetil]-1-(4-sulfobutil)-2H-in- dol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-[2-[(metoxipolioxi-etilen)amino]-2-oxoetil]-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio

A una solución de 800 mg de metoxi-polioxietilen-amina (aproximadamente 0,16 mmol; masa molecular media aproximadamente 5.000) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} se le añade una solución de 0,08 mmol del N,N-di-éster succinimidílico procedente del Ejemplo 1 en 1 ml de DMF, y se deja en agitación a la temperatura ambiente durante 24 h. El material sólido, precipitado después de haber añadido un éter, se separa por filtración y se purifica por cromatografía (con Sephadex G50 medium, H_{2}O como eluyente), rendimiento aproximadamente 58% como un polvo de color azul verdoso después de liofilización y desecación sobre P_{2}O_{5}.

Masa molecular media calculada: 10771, encontrada: 10820.

Ejemplo 4 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-(metoxipolioxi-etilen)aminocarbonil-2-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio

0,41 g (0,5 mmol) del N-éster succinimidílico de 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-carboxi-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio, se agitan bajo argón a la temperatura ambiente, juntamente con 2,3 g de metoxi-polioxietilen-amina (0,46 mmol; masa molecular media 5.000) durante 18 h en 70 ml de CH_{2}Cl_{2}, el disolvente se concentra hasta la mitad del volumen por evaporación en vacío y el producto se aisla tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. Se obtienen 2,1 g de un producto en forma de un polvo de color azul verdoso.

Masa molecular media calculada: 5701, encontrada: 5795.

Ejemplo 5 Preparación de 3-(3-carboxipropil)-2-[7-[3-(3-carboxipropil)-1,3-dihidro-3-metil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-hepta-trienil]-3-metil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio

6,5 g (50 mmol) del hidrocloruro de fenilhidrazina y 8,7 g (55 mmol) de ácido 5-metil-6-oxo-heptanoico se agitan en 50 ml de ácido acético concentrado durante 1 h a la temperatura ambiente y durante 5 h a 120ºC. Después de haber concentrado por evaporación, el residuo se mezcla agitando con 20 ml de agua y los cristales resultantes se separan por filtración y se separan en una bomba de aceite.

Se obtienen 9,6 g (83%) de cristales de color parduzco, que se suspenden en 60 ml de diclorobenceno y, después de haber añadido 11,6 g (85 mmol) de 1,4-butanosultona, se calientan a 150ºC durante 8 h. Después de haber enfriado a la temperatura ambiente, se añaden 200 ml de acetona y el precipitado resultante se separa por filtración. Éste se suspende en un éter y, después de haber agitado durante 18 horas, se separa de nuevo por filtración y se seca en una bomba de aceite. Se obtienen 10,7 g (70%) de 3-(3-carboxipropil)-2,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolenina, que se purifica por cromatografía (con RP-18, LiChroprep, 15-25 \mu, MeOH:H_{2}O como eluyente).

La preparación del colorante de indotricarbocianina se efectúa por calentamiento a 120ºC durante 30 min de 5,0 g (13,6 mmol) de indolenina y de 1,9 g (6,8 mmol) de hidrocloruro de glutaconaldehído-dianilo en 100 ml de anhídrido de ácido acético, mediando adición de 25 ml de ácido acético concentrado y de 2,3 g (27,6 mmol) de acetato de sodio anhidro. El precipitado, obtenido después de haber añadido 500 ml de un éter, se purifica por cromatografía (en porciones de 1,0 g, RP-18, LiChroprep, 15-25 \mu, MeOH:H_{2}O como eluyente) y finalmente se liofiliza. Se obtienen 2,5 g (45%) de un producto.

Análisis:

Ejemplo 6 Preparación de 2-[7-[1,3-dihidro-5-[2-[(2,3-dihidroxipropil)amino]-2-oxoetil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-5-[2-[(2,3-dihidroxipropil)amino]-2-oxoetil]-3,3-dimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio

2,0 g (6,4 mmol) del éster succinimidilico de ácido 2,3,3-trimetil-3H-indol-5-ilacético se mezclan en 50 ml de CH_{2}Cl_{2} con 0,84 g (6,4 mmol) de 4-aminometil-2,2-dimetil-1,3-dioxolano. Después de haber agitado durante 5 horas a la temperatura ambiente, se vierte sobre 100 ml de agua, se extrae con CH_{2}Cl_{2} y las fases orgánicas se concentran por evaporación. Después de una purificación por cromatografía (en gel de sílice con una mezcla de CH_{2}Cl_{2}:MeOH 98:2) se obtienen 1,86 g (88%) de la amida, que se agita en 20 ml de diclorobenceno con 1,36 g (10,0 mmol) de 1,4-butano-sultona durante 7 h a 100ºC y durante 12 h a la temperatura ambiente. El granulado, resultante después de haber agitado con 50 ml de acetona, se separa por filtración y se purifica por cromatografía (RP-18, LiChroprep, 15-25 \mu, MeOH:H_{2}O como eluyente). Se obtienen 0,85 g (28% referido al compuesto de partida de 5-[2-[(2,2-dimetil-1,3-dioxa-4-ciclopentil)metil]amino-2-oxoetil]-2,3,3-trimetil-1-(4-sulfobutil)-3H-indolenina.

La reacción para formar el colorante se efectúa apoyándose en el Ejemplo 4, calentando durante 10 min a 120ºC. El producto bruto se agita a la temperatura ambiente durante 16 h en 5 ml de MeOH, mediando adición de 100 mg de ácido p-toluenosulfónico, las porciones insolubles se separan y el material filtrado se conserva a continuación a -20ºC después de haber añadido 3 ml de isopropanol. El polvo precipitado se purifica por cromatografía (RP-18, LiChroprep, 15-25 \mu, MeOH:H_{2}O como eluyente), se liofiliza y se seca durante 24 h a 50ºC/0,01 mbar, rendimiento 0,32 g (37%).

Análisis:

Calculado:	C 56,70	H 6,45	N 5,88	O 20,14	S 6,73	K 4,10
Encontrado:	C 56,39	H 6,88	N 5,67		S 6,58	K 3,93

Ejemplo 7

A un ratón desprovisto de inmunidad (desnudo) (Swiss-Nude, un tumor LS 174 T en el flanco posterior derecho), portador de tumores y narcotizado, se le aplicó por vía i.v. (intravenosa) la 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-5-(metoxi-carbonil)-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-hepta-trienil]-3,3-dimetil-5-(metoxicarbonil)-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio, en una dosis de 3,8 \mumol/kg de peso corporal.

Las fotografías con fluorescencia, inducidas por láser, se llevaron a cabo antes de, y en diferentes momentos después de, la aplicación de la sustancia con un reproductor en imágenes fluorescentes (Physikalisch-Technische Bundes-anstalt, Berlin Charlottenburg). La excitación se efectuó con una luz láser monocromática a 740 nm mediante desacoplamiento de la radiación a través de un sistema de conductores de luz. La irradiación excitadora por debajo de 740 nm se eliminó mediante un filtro de aristas, y la luz fluorescente inducida por láser por encima de 740 nm se recogió con una cámara de CCD (Charge Coupled Device = dispositivo acoplado por carga) y los datos se almacenaron como imágenes en blanco y negro.

La secuencia de fotografías de la Figura 1 muestra con claridad el aumento general de la intensidad de fluorescencia después de la aplicación de una sustancia (imágenes A, B). Después de 30 segundos (s) se puede observar una intensidad distribuida uniformemente con valores aumentados en las regiones del hígado y de los pulmones y en los tumores (B). En la evolución ulterior hasta durante 1 h (C,D,E) la sustancia se reparte crecientemente en el animal. Después de 18 h se puede observar en el tumor (flanco trasero derecho) una intensidad de fluorescencia aumentada de una manera manifiesta con respecto al resto del cuerpo.

La Figura 1 muestra fotografías con luz fluorescente (imágenes en blanco y negro) de un ratón desnudo (Swiss-Nude) en diferentes momentos después de una aplicación por vía i.v. de 3,8 \mumol/kg de peso corporal de 2-[7-[1,3-dihidro-3,3-dimetil-5-(metoxicarbonil)-1-(4-sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1,3,5-heptatrienil]-3,3-dimetil-5-(metoxi-carbonil)-1-(4-sulfobutil)-3H-indolio, sal de sodio.

A-E:: fotografías laterales a la derecha (dextrolaterales),

F:: fotografía posterior,

A:: antes de la aplicación,

B:: 30 s (segundos),

C:: 1 min,

D:: 10 min,

E:: 1 h después de la aplicación,

F:: 18 h después de la aplicación.

Claims

1. Agente de diagnóstico para el diagnóstico in vivo mediante una radiación NIR, que contiene compuestos de la fórmula general (I)

(I)B_{1}-(F-W_{n})_{m}

así como eventualmente sus sales fisiológicamente compatibles,

en la que

: B es una unidad de reconocimiento biológico con un peso molecular hasta de 30.000, que se fija a determinadas poblaciones de células o específicamente a receptores, o se enriquece en tejidos o tumores, o permanece predominantemente en la sangre, o es una macromolécula que no se fija específicamente,

: F representa un colorante, que tiene máximos de absorción en el intervalo de 650 a 1.200 nm,

: y W representa un grupo hidrófilo, que mejora la solubilidad en agua, con la condición de que l ha de ser = 0, el coeficiente de reparto entre n-octanol y agua del compuesto de la fórmula I es menor o igual que 2,0 mmol,

: y F representa un colorante de cianina de la fórmula general V

3

siendo

Q un fragmento

4

5

representando R^{30} un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un radical alcoxi con 1 a 4 átomos de carbono o un átomo de cloro,

b significa un número entero de 2 ó 3,

X e Y independientemente uno de otro, representan un fragmento -O-, -S-, -CH=CH- o -(CH_{2}R^{32})(CH_{2}R^{33})-,

o representa una polilisina, un polietilenglicol, un metoxipolietilenglicol, un poli(alcohol vinílico), un dextrano, un carboxidextrano o una estructura a modo de polímero en cascada,

o representa un radical de la fórmula general VI,

(VI)-(O)_{v}-(CH_{2})_{o}-CO-NR^{34}-(CH_{2})_{s}-(NH-CO)_{q}-R^{35}

con la condición de que en el caso de que los significados de X e Y sean iguales a O, S, -CH=CH- o -C(CH_{3})_{2}-, por lo menos uno de los radicales R^{20} hasta R^{29} corresponde a una polilisina, un polietilenglicol, un metoxipolietilenglicol, un poli(alcohol vinílico), un dextrano, un carboxidextrano o una estructura a modo de polímero en cascada, o corresponde a la fórmula general VI,

realizándose que

: o y s son iguales a 0, o independientemente uno de otro, representan un número entero de 1 a 8,

: q y v independientemente uno de otro, representan 0 ó 1,

: R^{34} representa un átomo de hidrógeno o un radical metilo,

: R^{35} significa un radical alquilo con 3 a 6 átomos de C, que tiene desde 2 hasta n-1 grupos hidroxi, siendo n el número de los átomos de C, o significa un radical alquilo con 1 a 6 átomos de C, sustituido con 1 a 3 grupos carboxi, un radical arilo con 6 a 9 átomos de C o un radical arilalquilo con 7 a 15 átomos de C, o significa un radical de la fórmula general IIId o IIIe

6

: con la condición de que q ha de representar 1,

: o significa una polilisina, un polietilenglicol, un metoxipolietilenglicol, un poli(alcohol vinílico), un dextrano, un carboxidextrano o una estructura a modo de polímero en cascada,

: o R^{20} y R^{21}, R^{21} y R^{22}, R^{22} y R^{23}, R^{24} y R^{25}, R^{25} y R^{26},

: R^{26} y R^{27} en común con los átomos de carbono situados entre ellos, forman un anillo aromático o condensado saturado de 5 ó 6 miembros,

así como sus sales fisiológicamente compatibles,

poseyendo los colorantes de cianinas una hidrofília caracterizada por un factor de reparto entre n-octanol y agua menor que 2,0.

2. Agente de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1, estando seleccionado el colorante de cianina entre el siguiente conjunto:

3. Agente de diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque en la fórmula general I, R es un aminoácido, un péptido, una CDR (región determinante de complementariedad), un antígeno, un hapteno, un substrato de enzima, un cofactor de enzima, biotina, un carotinoide, una hormona, una neurohormona, un neurotransmisor, un factor de crecimiento, una linfocina, un lectina, una toxina, un hidrato de carbono, un oligosacárido, un polisacárido, un dextrano, un oligonucleótido o un medicamento que se fija a receptores.

4. Utilización de agentes de diagnóstico de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la preparación de agentes destinados al diagnóstico in vivo mediante una radiación de NIR.

5. Agente para el diagnóstico in vivo, caracterizado porque contiene por lo menos uno de los colorantes de cianinas de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, juntamente con los materiales coadyuvantes y de vehículo usuales, así como agentes diluyentes.