ES2331671T3 - Bioconjugados no covalentes utiles para diagnostico y terapia. - Google Patents

Bioconjugados no covalentes utiles para diagnostico y terapia. Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula: HM ---- CM en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.

Description

Bioconjugados no covalentes útiles para diagnóstico y terapia.
Antecedentes del invento Campo del invento
Este invento pertenece a bioconjugados de hapteno-portador no covalentes y a su uso para entregar selectivamente agentes de diagnóstico y terapéuticos a tejidos y órganos objetivo. Particularmente, este invento pertenece a la entrega selectiva de bioconjugados fluorescentes de hapteno-portador no covalentes a un lugar o región específico con el propósito de determinar la estructura y función de tejidos u órganos usando procedimientos de formación de imágenes tomográficos ópticos, procedimientos de vigilancia por fluorescencia, procedimientos de vigilancia por absorbancia, o procedimientos de examen endoscópico.
Descripción de la técnica anterior
Las fuerzas intermoleculares no covalentes (por ejemplo electrostáticas, de unión por hidrógeno e interacciones de Van der Waals) desempeñan una función vital en muchos procesos biológicos tales como catálisis de enzimas, interacción droga-receptor, interacción antígeno-anticuerpo, interacción biotina-avidina, formación de ADN de doble hélice, fagocitosis, pigmentación en plantas y animales, y transporte celular. La variedad de colores observados en flores y plantas por ejemplo, es atribuida a la asociación no covalente entre los pigmentos naturales e hidratos de carbono o proteínas encontrados en las células de las plantas.
Las fuerzas no covalentes pueden alterar las propiedades fisicoquímicas y/o biológicas de haptenos o portadores. Por ejemplo, la asociación de un tinte o una molécula de pigmento con proteínas o hidratos de carbono puede cambiar la estabilidad química o la fotoestabilidad, cambiar la intensidad y/o la longitud de onda de máxima absorción/emisión, o ambas. Aunque la energía de interacción por unidad de interacción es muy pequeña (es decir menor de 40 kJ/interacción), el efecto acumulativo de múltiples puntos de interacción a lo largo de las dos superficies puede ser sustancial y puede conducir a una fuerte aglutinación entre el hapteno y el portador. Esta aproximación ha sido usada satisfactoriamente para preparar anticuerpos anti-ADN. El ADN es una macromolécula aniónica muy cargada que normalmente no es inmunogénica; sino que, cuando es hecha más compleja con una albúmina de suero bovino metilado catiónico muy cargada (MBSA), el ADN resulta inmunogénico. Así, el bioconjugado de ADN-MBSA no covalente era lo bastante estable para provocar una respuesta inmune hacia el ADN.
Interacciones no específicas también desempeñan un papel importante en los procesos biológicos. Por ejemplo, la albúmina de suero humano aglutina distintas moléculas de una manera no selectiva y facilita el transporte de estas moléculas a través del sistema vascular a las células.
Así, queda claro a partir de los ejemplos anteriores que los bioconjugados unidos de modo no covalente funcionan biológicamente como una única unidad. Además de las propiedades antes mencionadas, la molécula portadora puede también proteger algunos haptenos de degradación química, fotoquímica o radiolítica. El presente invento pretende explotar el concepto de interacciones no covalentes en el diseño de nuevos bioconjugados para diagnosis y terapia.
Además, el uso de tintes y bioconjugados de tinte covalentes para la detección de distintas especies en los fluidos corporales es bien conocido en el campo de inmunodiagnósticos in vitro. Inmunoconjugados de tinte han sido ampliamente usados en inmunohistología, y la detección inmunoquímica de distintos antígenos, hormonas, drogas y similares en fluidos corporales mediante procedimientos de radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes de enlace enzimático (ELISA). Tintes fluorescentes han sido también usados como quimiosensores y en microscopia fluorescente. (J.P. Desvergne y A.W. Czarnik, Quimiosensores de Reconocimiento de Ión y Molécula, Kluver Academic, Boston, 1997; B.H. Satir, Ed., Técnicas No invasivas en Biología Celular, Wiley-Liss, New York, 1990). El verde de Indocianina, un tinte de polieno muy fluorescente, ha sido usado para vigilar el gasto cardiaco, valorar la función hepática, y formar imágenes tomográficas de tumores (K. Licha y col., Síntesis y Caracterización de Tintes de Cianina como Agentes de Contraste para Formación de Imágenes Próximas a los Infrarrojos; SPIE, 1996, vol. 2927, 192-197; X. Li y col., Localización de Tumores Usando Fluorescencia de Verde de Indocianina en Ratas Modelo, SPIE 1995, Vol. 2389, 789-798; B. Riefke y col., Caracterización in vivo de Tintes de Cianina como Agentes de Contraste para Formación de Imágenes Próximas a los Infrarrojos, SPIE, 1996, vol. 2927, 199-208).
En química de bioconjugados tradicional, los conjugados son preparados por enlace o unión covalente de distintas moléculas efectoras tales como drogas, hormonas, agentes radiofarmacéuticos, agentes de formación de imágenes por resonancia magnética, agentes quimioterapéuticos, y similares a los portadores bioactivos. Tal proceso implica a menudo una manipulación química engorrosa de los dos componentes, además de la síntesis complicada de haptenos activados apropiados necesarios para la unión o enlace covalente. Además, la bioactividad del complejo resultante es, en muchos casos, o bien muy disminuida o bien obviada en su totalidad.
Los tintes de polieno, en general, y el verde de indocianina, en particular, tiene varias desventajas que limitan su uso como agentes de contraste próximos a los infrarrojos (NTR). El verde de indocianina tiene una mitad de vida de plasma muy corta y es rápidamente absorbida por el hígado (D.K. Meijer y col., Farmacocinética de Excrección Biliar en el Hombre. VI. Verde de Indocianina, Eur. J. Clin. Pharmacol., 1998, Vol. 35, 295-303); tiene baja eficiencia de fluorescencia y sufre degradación en medio acuoso con pérdida de fluorescencia. Por ello, hay una necesidad de nuevos bioconjugados que sean simples de preparar y lo suficientemente estables para ser útiles como un agente de diagnóstico o terapéutico.
El documento DE 4445065 se refiere a un método para etiquetar anticuerpos antitumorales con propósitos oftalmológicos, en particular anticuerpos específicos para melanoma y cáncer de colon, usando fluoresceína y verde de indocianina (ICG).
El documento DE 3828360 se refiere a un proceso para el etiquetado no covalente de anticuerpos antitumorales con un tinte, en particular con fluoresceína o indocianina, y a los anticuerpos específicos de etiquetado de tinte que son obtenidos de ese modo.
Sauda K. y col. (Química Analítica, 1986, 58(13), 2649-2653) describe que ICG forma un complejo no covalente con una variedad de proteínas no específicamente. Describe que la ICG unida a BSA es más estable que la ICG en solución acuosa.
Davis, D.R. y col. (Comunicaciones de Investigación en Patología Química y Farmacología, 1980, 27(2), 373-388) describe que la ICG aglutina de forma competitiva las proteínas de citosol del hígado de la rata ligandina y Z.
Paumgartner G. (Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 1975, 105(17s), 1-30) describe que después de la inyección la ICG es rápida y completamente unida a proteínas de plasma, tales como albúmina o globulinas, o a proteínas intracelulares designadas Y y Z.
Objetos del invento
Es, por ello, un objeto del presente invento proporcionar bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que son simples de preparar y son útiles en procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos.
Es otro objeto del presente invento proporcionar bioconjugados que son estables durante el almacenamiento antes de ser usados en procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos.
Es aún otro objeto del presente invento proporcionar un método para realizar un diagnóstico o procedimiento terapéutico en un paciente.
Es otro objeto del presente invento proporcionar un método para alterar la persistencia en la sangre de un hapteno.
Es otro objeto del presente invento proporcionar un método para aumentar la vida fluorescente in vitro e in vivo de un tinte fluorescente.
Resumen del invento
El invento proporciona una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula: HM- - - - - -CM, donde HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanilico; y la línea de trazos es un enlace o unión no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
El invento proporciona también un bioconjugado de hapteno-portador no covalente que tiene la fórmula: HM- - - - -CM, donde HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanilico: y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina, para uso en diagnosis o terapia.
El invento proporciona también un método de alteración de la persistencia en la sangre de un hapteno que comprende la formación de bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula: HM- - - -CM, en donde HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
El invento proporciona también un método para aumentar la vida fluorescente in vitro e in vivo, de una molécula de hapteno que comprende la formación de bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula: HM- - - -CM, en donde HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
Otros aspectos del invento están fijados en las reivindicaciones adjuntas.
Los aspectos de la siguiente descripción que no se refieren específicamente al invento reivindicado son para comparación e ilustración.
Se han descrito aquí bioconjugados de hapteno-portador no covalentes estructuralmente diversos que tienen la fórmula:
HM - - - - - CM
en la que HM es una molécula de hapteno cuyo peso molecular es generalmente, pero no siempre, menor de 1000 Daltons y es capaz de realizar funciones específicas; CM es una molécula portadora, cuyo peso molecular es generalmente, pero no siempre, mayor de 1000 Daltons y es capaz de transportar el hapteno a un sitio específico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y la molécula de hapteno.
Preferiblemente, los bioconjugados son formados a partir de haptenos de tinte fluorescente y moléculas portadoras seleccionadas del grupo que consiste de albúmina sérica, albúmina sérica metilada, polipéptidos con peso molecular que oscila desde 2000 a 20000 Daltons, y polisacáridos con peso molecular que oscila desde 2000 a 20000 Daltons, polinucleótidos con peso molecular que oscila desde 2000 a 100000 Daltons, ciclodextrinas, calixarenos y surfactantes.
Más preferiblemente, los bioconjugados son formados a partir de haptenos de tinte fluorescente seleccionados del grupo que consiste de cianina, indocianina, escuarina (squaraine), porfirinas, Rosa de Bengala, y tinte azul de metileno y moléculas portadoras seleccionadas del grupo que consiste de albúmina sérica metilada, poliarginina, ácido poliaspártico, ácido poliglutámico, ciclodextrina, inulina, ácido poliadenilico, y ácido poliguanílico.
Los bioconjugados son útiles como agentes de diagnóstico y terapéuticos en procedimientos médicos ya que son estables in vitro antes de ser usados y estables in vivo durante y después de su uso. Se han enunciado teorías de que el enlace entre el hapteno y el portador estabiliza los bioconjugados y retrasa su degradación in vitro por factores ambientales. También, el enlace provoca que los bioconjugados sean metabolizados lentamente in vivo y por ello retenidos en el cuerpo durante un período mayor que el esperado para el hapteno no enlazado.
Otros objetos, ventajas y nuevas características de la presente descripción resultarán evidentes en la siguiente descripción detallada de la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras que no se refieren específicamente al invento reivindicado son para ilustración y comparación.
La fig. 1 muestra la tasa de depuración de sangre de rata para tinte verde de indocianina.
La fig. 2 muestra la tasa de depuración de sangre de rata para un bioconjugado de tinte verde de inulina-indocianina.
La fig. 3 muestra la tasa de depuración de sangre de rata para un bioconjugado de tinte verde de MBSA-indocianina.
La fig. 4 muestra la tasa de depuración de sangre de rata para un bioconjugado de tinte verde de gama ciclodextrina-indocianina.
La fig. 5 muestra la tasa de depuración de sangre de rata para un bioconjugado de tinte verde de ácido polaspártico-indocianina.
La fig. 6(a) muestra la tasa de depuración de sangre de rata para el bioconjugado de tinte verde de poliaspártico-indocianina y para tinte verde de indocianina solo en el momento de la preparación inicial en solución acuosa.
La fig. 6(b) muestra la tasa de depuración de sangre de rata para el bioconjugado de tinte verde de poliaspártico-indocianina y para tinte verde de indocianina solo un (1) día después de la preparación.
La fig. 6(c) muestra la tasa de depuración de sangre de rata para el bioconjugado de tinte verde de poliaspártico-indocianina y para tinte verde de indocianina solo cinco (5) días después de la preparación.
La fig. 6(d) muestra la tasa de depuración de sangre de rata para el bioconjugado de tinte verde de poliaspártico-indocianina y para tinte verde de indocianina solo nueve (9) días después de la preparación.
Descripción detallada de la divulgación
La presente descripción proporciona bioconjugados de hapteno-portador no covalentes nuevos y estructuralmente diversos que tienen la fórmula:
HM - - - - - CM
en la que HM es una molécula de hapteno cuyo peso molecular es generalmente, pero no siempre, menor de 1000 Daltons y es capaz de realizar funciones específicas; CM es una molécula portadora, cuyo peso molecular es generalmente, pero no siempre, mayor de 1000 Daltons y es capaz de transportar el hapteno a un lugar específico, y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y la molécula de hapteno.
El hapteno es o bien una molécula pequeña o bien una macromolécula y es seleccionada del grupo consistente en péptidos, hidratos de carbono, y tintes fluorescentes. El hapteno pueden ser moléculas tales como hormonas, anticuerpos, agentes anti-neoplásticos, enzimas, coenzimas, peptidomiméticos, glicomiméticos, moléculas de adhesión de células, complejos de metal radionucleidos, agentes de formación de imágenes por resonancia magnética, agentes de opacificación a los rayos X, y agentes ecogénicos.
Preferiblemente, el hapteno es un tinte cuya absorción y emisión máxima caen en el intervalo de 200-1200 nanómetros (nm) o un fotosensibilizador capaz de transferir energía a los tejidos o a los otros componentes dentro o fuera de la célula. Más preferiblemente, el hapteno es un tinte fluorescente con absorción y emisión máxima en la región de 450-950 nm.
El portador es seleccionado del grupo consistente de proteínas tales como albúminas y globulinas, glicoproteinas, polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos, lipoproteínas, surfactantes, y otras sustancias poliméricas naturales o sintéticas.
Preferiblemente, el portador es una macromolécula seleccionada del grupo consistente de proteínas tales como albúmina o albúmina metilada, glicoproteínas tales como anticuerpos o selectinas, polisacáridos tales como inulina o lectinas, polinucleótidos tales como DNA o RNA, compuestos de inclusión tales como ciclodextrinas o calixarenos, y surfactantes tales como Tween. Más preferiblemente el portador es un polisacárido, polinucleótido, proteína, polipéptido, o ciclodextrina.
En una realización preferida, un bioconjugado consiste de un hapteno de tinte fluorescente con absorción y emisión máxima en la región de 450-950 nm y un portador del polisacárido mantenidos juntos por un enlace no covalente entre el tinte y el polisacárido.
En otra realización preferida, un bioconjugado de tinte consiste de un hapteno de tinte fluorescente con absorción y emisión máxima en la región de 450-950 nm y una proteína sujeta a junta por un vínculo no covalente entre el tinte y la proteína.
En otra realización preferida más, un bioconjugado consiste de un hapteno de tinte fluorescente con absorción y emisión máxima en la región de 450-950 nm y un portador de polipéptido mantenidos juntos por un enlace no covalente entre el tinte y el polipéptido.
Las moléculas de tinte de la presente divulgación pueden variar ampliamente dependiendo de la aplicación considerada. Para la formación de imágenes de diagnóstico de áreas de lesión, son deseables tintes fluorescentes que absorben y emiten en la región próxima a los infrarrojos (NIR), es decir 700-900 nm. Éstos pueden incluir, pero no están limitados a, cianinas, indocianinas, escuarinas. Para vigilar la depuración de sangre o para examen endoscópico de lesiones, son deseables tintes que absorben y emiten en la región de 450-950 nm, preferiblemente 600-900 nm.
De manera similar, las moléculas portadoras pueden también variar ampliamente. Para agentes persistentes en sangre, es preferible la albúmina o albúmina sérica metilada. Para mediciones de función renal, son deseables un polisacárido o polipéptidos aniónicos. Para examen endoscópico de lesiones, son preferidos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.
Los bioconjugados de hapteno-portador no covalentes de esta presente divulgación pueden o bien ser ventajosamente preparados mezclando simplemente los dos componentes en unas proporciones estequiométricas óptimas y administrando una cantidad efectiva de esta mezcla contenida en una formulación farmacéuticamente aceptable a individuos bien sistemática o bien localmente al órgano o tejido que ha de ser estudiado. Alternativamente, los bioconjugados pueden ser aislados y almacenados por métodos bien conocidos en la técnica. Los nuevos bioconjugados de la presente divulgación tienen amplia utilidad clínica, que incluye, pero no está limitada a, formación de imágenes de diagnóstico de tumores, inflamación (tanto estéril como bacteriana), y un sistema vascular dañado; examen endoscópico guiado por láser de lugares de lesión; fotodinámica y quimioterapia de tumores o infecciones, y evaluación de la función dinámica de un órgano.
Los nuevos bioconjugados de esta descripción son formulados en composiciones de diagnóstico o terapéuticas para administración enteral, parenteral u oral. Estas composiciones contienen una cantidad efectiva de bioconjugados junto con portadores farmacéuticos tradicionales y excipientes apropiados para el tipo de administración considerada. Estas composiciones pueden también incluir agentes estabilizadores tales como ácido ascórbico o gentísico. Por ejemplo, las composiciones parenterales contienen ventajosamente una solución o suspensión acuosa estéril de bioconjugados cuya concentración oscila desde aproximadamente 1 \muM a aproximadamente 10 mM. Las formulaciones parenterales preferidas tienen una concentración de bioconjugados de 100 \muM a 2 mM. Tales soluciones pueden también contener tampones aceptables farmacéuticamente y, opcionalmente, electrolitos tales como cloruro sódico. Las formulaciones para administración enteral pueden variar ampliamente como es bien conocido en la técnica. En general, tales formulaciones son líquidos que incluyen una cantidad efectiva de bioconjugados en solución o suspensión acuosa. Tal composición enteral puede incluir opcionalmente tampones, surfactantes, agentes tixotrópicos, y similares. Las composiciones para administración oral pueden también contener agentes sazonantes o de condimento y otros ingredientes para mejorar sus cualidades organolépticas.
Las composiciones de diagnóstico son administradas en dosis efectivas para conseguir el objetivo de diagnóstico o terapéutico deseado. Tales dosis pueden variar ampliamente dependiendo de los bioconjugados particulares empleados, los órganos o tejidos que han de ser examinados, el equipamiento empleado en el procedimiento clínico, y similares.
La presente descripción proporciona un método de realizar un procedimiento de diagnóstico o terapéutico en un paciente con el propósito de determinar la estructura y función de tejidos u órganos. El método comprende administrar los bioconjugados de hapteno-portador no covalentes de la presente descripción a un paciente, permitiendo que los bioconjugados resulten localizados en o alrededor de un tejido u órgano, y realizar un procedimiento de diagnóstico o terapéutico tal como un procedimiento de formación de imágenes tomográfico óptico, procedimientos de vigilancia por fluorescencia, procedimientos de vigilancia de absorbancia, y procedimientos de examen endoscópico, preferiblemente un procedimiento de vigilancia por fluorescencia en el paciente.
La presente descripción proporciona también un método para alterar la persistencia en la sangre de un hapteno formando bioconjugados de hapteno-portador no covalentes del presente invento. Algunos bioconjugados son más estables in vivo que el hapteno solo y son depurados de la sangre del paciente a una tasa más lenta que el hapteno solo. La tasa de depuración de sangre lenta proporciona más tiempo para hacer un procedimiento médico de diagnóstico y terapéutico ya que el hapteno permanece en el sistema sanguíneo del paciente durante un periodo de tiempo prolongado. Otros bioconjugados son menos estables in vivo que el hapteno solo y son depurados de la sangre del paciente a una tasa más rápida que el hapteno solo. La tasa de depuración de sangre más rápida requiere menos tiempo para hacer un procedimiento médico de diagnóstico y terapéutico ya que el hapteno permanece en el sistema sanguíneo del paciente durante un periodo más corto. Esto significa que el paciente puede consumir menos tiempo teniendo el procedimiento y recuperándose.
La presente descripción proporciona también un método para incrementar la vida fluorescente in vitro e in vivo de un tinte fluorescente formando los bioconjugados de hapteno-portador no covalentes del presente invento. Los bioconjugados retienen la capacidad para fluorescer durante períodos prolongados cuando es comparado con el tinte fluorescente solo. Esta vida fluorescente más larga permite que los bioconjugados sean almacenados en la estantería durante períodos prolongados y a continuación ser usados para procedimientos médicos de diagnóstico y
terapéuticos.
La presente descripción proporciona también bioconjugados de tinte fluorescente que tienen una vida fluorescente más larga in vitro e in vivo que el tinte fluorescente solo. Esta vida fluorescente más larga permite que los bioconjugados sean almacenados en la estantería durante períodos prolongados y a continuación ser usados para procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos.
Los siguientes ejemplos ilustran la realización de la divulgación descrita en este documento. Como sería evidente para los expertos en la técnica, son posibles distintos cambios y modificaciones y están considerados dentro del marco del invento descrito.
Los ejemplos que no se refieren específicamente al invento reivindicado, son sólo para ilustración y comparación.
Procedimientos experimentales 
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Ejemplo 1
Propiedades de depuración de la sangre de tinte verde de indocianina
1
Una parte de 500 \mul de solución de verde de indocianina (0,8 mg/ml) fue inyectada a través de la vena lateral de la cola de ratas de Sprague-Dawley o Fischer. La depuración de la sangre del bioconjugado de tinte fue vigilada por una señal de fluorescencia que emana de los capilares de la superficie de la oreja usando un aparato de fluorescencia de láser (excitación, 780 nm; emisión 830 nm). La constante (\tau) de tiempo para la depuración de la sangre de verde de indocianina es de 138 segundos (Fig. 1).
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Ejemplo 2
Preparación y propiedades de depuración de la sangre de un bioconjugado de tinte verde de inulina-indocianina
Una solución de inulina (MW 500, 30 mg) en agua (5 ml) fue tratada con verde de indocianina (4 mg) y la mezcla completa fue sacudida vigorosamente durante aproximadamente 2 min. La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado fue determinada usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La constante (\tau) de tiempo para la depuración de la sangre para este bioconjugado es de 130 segundos (Fig. 2). La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado es la misma que para el verde de indocianina.
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Ejemplo 3
Preparación y propiedades de depuración de la sangre de un bioconjugado de tinte verde de MBSA-indocianina
Una solución de albúmina sérica bovina metilada (MBSA)(MW 70000, 25 mg) en agua (5 ml) fue tratada con verde de indocianina (4 mg) y la mezcla completa se sacudió suavemente durante aproximadamente 5 minutos. La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado se determinó usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La constante (\tau)de tiempo para la depuración de la sangre de este bioconjugado es de 224 segundos (Fig. 3). La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado es aproximadamente dos veces más lento que la del verde de indocianina.
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Ejemplo 4
Preparación y propiedades de depuración de la sangre de un bioconjugado de tinte verde de gama ciclodextrina-indocianina
Una solución de \gamma-ciclodextrina (MW 1100, 11.2 mg) en agua (5 ml) fue tratada con verde de indocianina (4 mg) y la mezcla completa se sacudió suavemente durante 1 hora. La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado se determinó usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La constante (\tau) de tiempo para la depuración de la sangre de este bioconjugado es de 142 segundos (Fig. 4). La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado es aproximadamente la misma que para el verde de indocianina.
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Ejemplo 5
Preparación y propiedades de depuración de la sangre de un bioconjugado de tinte verde de ácido poliaspártico-indocianina
Una solución de ácido poliaspártico (MW 6000, 82 mg) en agua (10 ml) fue tratada con verde de indocianina (4 mg) y la mezcla completa se sacudió suavemente durante aproximadamente 5 minutos. La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado fue determinada usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La constante (\tau) de tiempo para la depuración de la sangre de este bioconjugado es de 91 segundos (Fig. 5). La tasa de depuración de la sangre de este bioconjugado es más rápida que la del verde de indocianina.
Con referencia a los Ejemplos 1-5, los datos muestran que distintos portadores tales como albúminas, globulinas, glicoproteínas, polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos, lipoproteínas y surfactantes interactúan con el tinte verde de indocianina para formar bioconjugados de hapteno-portador no covalentes y que la persistencia en la sangre de un hapteno es alterada cuando está en forma de bioconjugado.
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Ejemplo 6
Estabilidad y propiedades fotofísicas de varios bioconjugados de tinte verde de indocianina
Una solución acuosa de verde de indocianina (ICG) y los portadores, inulina, poli-d, ácido l-aspártico, ácido poliguanílico, MBSA, y \gamma-ciclodextrina fue preparada y la intensidad de fluorescencia fue vigilada a temperatura ambiente en distintos intervalos de tiempo.
La Tabla 1 y las Figs. 6(a), 6(b), 6(c) y 6(d) muestran los datos de estabilidad de los bioconjugados.
TABLA 1 Porcentaje de disminución de la intensidad de fluorescencia a 822 nanómetros
2 
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Con referencia a las figs. 6(a), 6(b), 6(c) y 6(d), los datos muestran la mejora de estabilidad conseguida por el bioconjugado de tinte verde de ácido poliaspártico-indocianina sobre el de tinte verde de indocianina solo. Con referencia a la Tabla 1, los datos muestras que alguna mejora de estabilidad se ha visto también para bioconjugados que implican MBSA y ácido poliguanílico.
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Ejemplo 7
Preparación de tinte de carboxifloroglucinol-escuarina
Una mezcla de ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico (3,40 g, 0,02 moles) y ácido escuárico (1,14 g, 0,01 moles) en ácido acético glacial (15 ml) fue calentada bajo reflujo durante 4 horas. La solución rojo cereza fue vertida sobre agua (100 ml) y el tinte púrpura fue recogido por filtración, lavado bien con mucha agua y secado. El tinte fue suspendido en agua (100 ml) y se calentó a ebullición durante aproximadamente 10 minutos, filtrado en caliente y secado. El tinte fue a continuación usado como tal para otros estudios. (A. Treibs y K. Jacob, Angew. Chem. Int. Ed English, 1965, 4, 694).
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Ejemplo 8
Estabilidad y propiedades fotofísicas de varios bioconjugados de tinte carboxifloroglucinol-escuarina
3 
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Una solución acuosa de tinte de carboxifloroglucinol-escuarina y los portadores, inulina, poli-l-arginina, poli-d, ácido l-aspártico y \gamma-ciclodextrina fueron preparados y la fluorescencia fue temporalmente vigilada a temperatura ambiente durante 48 horas (\lambda_{ex} = 515, \lambda_{em} = 613). Los resultados están mostrados en la Tabla 2.
TABLA 2 Porcentaje de disminución en intensidad de fluorescencia a 613 nanómetros
4 
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Con referencia a la Tabla 2, los datos muestran que distintos portadores tales como polisacáridos, compuestos de inclusión y polinucleótidos interactúan con bioconjugados de hapteno-portador no covalentes de tinte de carboxifloroglucinol-escuarina y que la vida de fluorescencia in vitro e in vivo del tinte fluorescente es aumentada cuando está en forma de bioconjugado.
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Ejemplo 9
Preparación de tinte de benzotiazolim-escuarina
Una mezcla de 2-methylbenzotiazol (2,98 g, 0,020 moles) y ácido bromoacético (2,98 g, 0,022 moles) fue calentada a aproximadamente 100ºC durante 15 minutos. La mezcla de reacción oscura fue vertida sobre acetona (100 ml) y el sólido de color lavanda se recogió por filtración, lavado con acetona y secado. Una mezcla de esta sal de benzotiazolio (1,38 g, 5 mmoles) y ácido escuárico (0,28 g, 2,5 mmoles) en n-butanol/tolueno (1:1, 15 ml) fue calentada en condiciones de Dean-Stark durante 4 horas. La solución azul oscura fue vertida sobre agua (100 ml) y el tinte azul fue recogido por filtración, lavado bien con mucha acetona y secado (S. Das y col., J. Phys. Chem., 1996, 100, 17310 - 17315).
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Ejemplo 10
Estabilidad y propiedades fotofísicas de bioconjugados de tinte de benzotiazolim-escuarina
5 
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Una solución acuosa de tinte de benzotiazolim-escuarina y los portadores, inulina, poliarginina, poli-d, ácido l-aspártico, ácido poliguanidílico, y \gamma-ciclodextrina fueron preparados y la fluorescencia fue vigilada temporalmente a temperatura ambiente durante 48 horas. Los resultados están mostrados en la Tabla 3.
TABLA 3 Porcentaje de disminución en intensidad de fluorescencia a 665 nanómetros
6 
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Con referencia a la Tabla 3, los datos muestran que distintos portadores tales como polisacáridos, compuestos de inclusión y polinucleótidos interactúan con los bioconjugados de hapteno-portador no covalentes de tinte de benzotiazolio escuarina y que la vida fluorescente in vitro e in vivo del tinte fluorescente es aumentada cuando está en forma de bioconjugado.
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Ejemplo 11
Preparación de conjugados de tinte azul de cianina 
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8 
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Una mezcla de 2-methylbenzotiazol (2,98 g, 0,020 moles) y ácido bromoacético (2,98 g, 0,022 moles) fue calentada aproximadamente a 100ºC durante 15 minutos. La mezcla de reacción oscura fue vertida sobre acetona (100 ml) y el sólido de color lavanda fue recogido por filtración, lavado con acetona y secado. Una mezcla de esta sal de benzotiazolio (1,44 g, 5 mmoles) y malonaldehído tetrametil acetal (0,42 g, 2,5 mmoles) en piridina fue calentada bajo reflujo durante 4 horas. La solución azul oscura fue vertida sobre éter (500 ml) y el tinte azul fue recogido por filtración, lavado bien con copiosa agua y secado.
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Ejemplo 12
Estabilidad y propiedades fotofísicas de conjugados de tinte azul de cianina
Una solución acuosa de tinte azul de cianina y los portadores, inulina, poliarginina, poli-d, ácido l-aspártico y \gamma-ciclodextrina fueron preparados y la fluorescencia fue vigilada temporalmente a temperatura ambiente durante 24 horas. Los resultados están mostrados en la Tabla 4.
TABLA 4 Porcentaje de disminución en intensidad de fluorescencia a 670 nanómetros
9 
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Con referencia a la Tabla 4, los datos muestran que distintos portadores tales como polisacáridos, compuestos de inclusión y polinucleótidos interactúan con los bioconjugados de hapteno-portador no covalentes de tinte azul de cianina y que la vida fluorescente in vitro e in vivo del tinte fluorescente es aumentada cuando está en forma de bioconjugado.

Claims (12)

1. Una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:
HM - - - - CM
en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
2. La composición según la reivindicación 1, en la que CM es ácido poliaspártico.
3. La composición según la reivindicación 1, en la que CM es ácido poliguanílico.
4. Un bioconjugado de hapteno-portador no covalente que tiene la fórmula:
HM - - - - CM
en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina, para uso en diagnosis o terapia.
5. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según la reivindicación 4, para usar en un procedimiento seleccionado del grupo de procedimientos de formación de imágenes tomográfico óptico, procedimientos de vigilancia de fluorescencia, procedimientos de vigilancia de absorbancia, y procedimientos de examen endoscópico.
6. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según la reivindicación 4, para usar en un procedimiento de vigilancia de fluorescencia.
7. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que CM es ácido poliaspártico.
8. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que CM es ácido poliguanílico.
9. Un método de alterar la persistencia en sangre de un hapteno que comprende la formación de bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:
HM - - - - CM
en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
10. Un método de aumentar la vida fluorescente in vitro e in vivo de una molécula de hapteno formando bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:
HM - - - - CM
en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.
11. El método según la reivindicación 9 o 10 en el que CM es ácido poliaspártico.
12. El método según la reivindicación 9 o 10 en el que CM es ácido poliguanílico.
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