CN102127059B

CN102127059B - 一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针

Info

Publication number: CN102127059B
Application number: CN 201010600287
Authority: CN
Inventors: 邵建辉
Original assignee: JIANGSU MAIJIAN BIO-TECH DEVELOPMENT CO LTD
Current assignee: JIANGSU MAIJIAN BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD.
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: CN102127059A

Abstract

一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针，属于特异性分子识别诊断试剂技术领域。本发明提供了一种具有极大Stoke位移的荧光染料，该染料由藻胆蛋白中的藻蓝素和近红外荧光染料偶联而成，既具有极大的Stoke位移，达到了300nm以上，又具有分子量较小的特点，可以标记叶酸等小分子量的物质，用于肿瘤标志物，抗体等的特异性荧光检测。

Description

一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针

技术领域

本发明涉及一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针，可以用于肿瘤标志物，抗体等的特异性荧光检测，属于特异性分子识别诊断试剂技术领域。

背景技术

恶性肿瘤已经成为人类死亡的第一位原因，每年约有1000万人以上死于各种癌症，而且随着现代工业的快速发展和生活方式的变化，肿瘤发病率、死亡率呈明显上升趋势。在当前肿瘤临床研究中，中、晚期肿瘤治疗尚未找到有效的根治方法，但是早期肿瘤不伴转移，容易切除，可为患者赢得较多的存活机会，因此，人们将注意力集中在肿瘤的早期诊断和预防研究。随着分子生物标记技术的不断发展，该技术在医学领域，尤其是在恶性肿瘤细胞的早期识别和诊断方面逐渐受到人们广泛的关注。

近红外荧光探针在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段（600~800nm）的光波避开了体内水、有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，因而具有良好的生物组织穿透能力，且对生物组织无损伤。该类染料的类型比较多，摩尔消光系数高，具有良好的水溶性，分子量比较小（一般小于1000），这样就不会对被标记分子的连接与功能产生空间位阻效应。但是荧光吸收峰和发射峰的位置比较接近，其Stoke位移较小，一般在10~15nm 左右。小的斯托克斯位移造成的问题，一是使染料自淬灭，也称为染料的自吸收。这是因为小斯托克斯位移的染料的吸收光谱与发射光谱有很大的交盖，这样染料有部分发射光能被其自身吸收，从而导致荧光强度下降。另一个问题是造成荧光分析技术的测量误差。这是因为小的斯托克斯位移使激发波长与荧光检测波长太过接近，激发波长易对荧光检测狭缝造成散射光干扰。因而开发具有大斯托克斯位移的荧光染料有着十分重要的意义。

藻胆蛋白（Phycobiliprotein）是一类纯天然荧光物质，包括藻红蛋白(Phycoerythrin, PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin, APC)和藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin, PEC)，它们具有非特异性结合的程度高，所发荧光不为其它生物物质自发淬灭，摩尔消光系数和荧光量子产率高等优点，作为荧光探针正被广泛应用于免疫标记与肿瘤光动力治疗等领域。但是藻胆蛋白的分子量巨大，为17000~18000，并且稳定性比较差，当温度超过40℃即会发生变性，从而在一定程度上影响了使用。

为能克服藻胆蛋白分子量巨大，不能标记小分子物质的不足，同时利用近红外荧光探针对肿瘤标志物检测的灵敏度，提出本发明中的具有极大Stoke位移的荧光探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针，涉及特异性分子识别诊断试剂领域中的近红外检测荧光探针。具体地讲，本发明涉及可以用于肿瘤标志物，抗体等的特异性荧光检测的探针材料。

本发明的技术方案：一种具有极大Stoke位移的近红外荧光探针，该探针由藻胆蛋白中的藻蓝素和近红外荧光染料偶联而成，分子结构为：

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE001

或

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE002

，

其Stoke位移达到300nm。

藻蓝素是开链线性延展的四吡咯化合物，由藻蓝蛋白脱除载体蛋白后获得。

藻蓝蛋白由钝顶螺旋藻、极大螺旋藻、多管藻、条斑紫菜、坛紫菜或红毛紫菜中分离得到。

近红外荧光染料由以下两种分子结构组成：

NIR-1

或

NIR-2

近红外荧光染料的吸收波长在600~700nm范围内。

藻蓝素中的羧基官能团活化后通过共价偶联的方式与近红外荧光染料分子结构中的氨基连接。

该探针用于肿瘤标志物，抗体的特异性荧光检测。

肿瘤标志物选自叶酸、低密度脂蛋白或单克隆抗体。

藻胆蛋白是一类寡聚体蛋白，由载体蛋白和发色团-开链线性延展的四吡咯化合物组成，载体蛋白和发色团通过硫醚键连接，每分子藻胆蛋白含有α和β两个亚基，分子量在17~18KDa之间。其结构为：

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE005

由于藻胆蛋白的分子量巨大，使其无法标记小分子，并且当外界的条件发生变化时，藻胆蛋白容易发生变性，这些不足在一定程度上限制了其应用。在研究中发现，通过对藻胆蛋白进行适当的处理，可以破坏分子中载体蛋白和发色团之间的连接，得到单一的发色团（藻蓝素）。与藻胆蛋白相比，由于去除了载体蛋白，藻蓝素的稳定性得到了提高，分子量下降到600多，同时其光谱性质也发生了变化。藻蓝蛋白的荧光激发峰和发射峰分别在621nm与646nm，藻蓝素的荧光激发峰的位置为330nm和421nm,与藻蓝蛋白相比发生了明显的蓝移。藻蓝素的发射峰的位置为660nm,与藻蓝蛋白相比也发生了14nm 的红移。藻蓝素的Stoke位移可以达到300nm左右，如果用于分子诊断和识别中可以提高检测的信噪比，这是一个极具应用潜力的特征。

利用荧光共振能量转移原理（FRET）可以充分利用藻蓝蛋白具有极大Stoke位移的优势。FRET发生的条件：供体D和受体A的距离必须达到一定的数量级（1~10 nm）；受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。藻蓝素的发射峰位置在660nm附近，属于近红外区。在近红外区有数量众多的荧光探针，比如花菁类染料、方酸菁类、噻嗪和恶嗪类染料，发射波长在可见区的荧光素、罗丹明、BODIPY等探针都有其近红外荧光发射衍生物。因此藻蓝素和近红外荧光探针之间可以发生FRET现象。

本发明对藻蓝素-近红外荧光探针的研究中发现，藻蓝素和花菁染料配对尤其合适。花菁染料的摩尔消光系数大，荧光发射波长范围宽，一般在600～800 nm的近红外区。花菁染料可以采用静电结合或者共价标记两种方式与被标记物结合。如已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用在临床活体组织荧光造影和癌症组织检测的吲哚菁绿ICG（Indocyanine Green）就是采用静电结合方式进行检测。而检测肿瘤的荧光探针则是采用花菁染料中的活性基团与叶酸共价结合后形成的。

本发明中的藻蓝素从条斑紫菜中提取。首先称取1g条斑紫菜，加适量磷酸盐缓冲液后将组织捣碎，捣碎液10000g冷冻离心20min，取上清。上清采用25%，50%饱和度的硫酸铵分段沉淀法沉淀蛋白，最终沉淀仍用磷酸盐缓冲液溶解，15000g冷冻离心30min，取出沉淀用蒸馏水透析一段时间后除去杂质离子得到粗提的藻蓝蛋白。将得到的藻蓝蛋白用10mol/L的浓盐酸在80℃下裂解30min后，用氯仿萃取，将多次萃取后的溶液合并后除去其中的氯仿后得到藻蓝素。

为了和花菁染料偶联，需要对藻蓝素上的羧基进行活化。采用干燥的二甲基甲酰胺（DMF）做溶剂，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）做为活化剂，二环己基碳二亚胺(DCC)为脱水剂与藻蓝素避光室温下反应24~36小时。得到活化后的藻蓝素。

与活化藻蓝素偶联的花菁染料具有如下结构式，

NIR-1

或

NIR-2

它们具有优异的水溶性，与藻蓝素偶联后也具有良好的水溶性。分子结构上具有的羧基活化后，可以在水性介质中与带有氨基的生物活性分子发生偶联反应，产物可以作为肿瘤检测和早期诊断的造影剂。

近红外花菁染料可以通过下述合成步骤得到：

中间体II的合成：

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE006

中间体I（名称3-(4-苯甲酸基)-2，3-二甲基-3H-吲哚-5-磺酸钠）和丙磺酸内酯在邻二氯苯中避光回流反应一定时间后，得到红棕色固体物，用乙酸乙酯洗涤后得到中间体II：3-(4-苯甲酸基)-2，3-二甲基-1-(3-磺酸丙基)-3H-吲哚-5-磺酸钠。

中间体IV的合成：

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE007

中间体III（名称2，3，3-三甲基-5-硝基-3H-吲哚）和丙磺酸内酯在邻二氯苯中避光条件下回流反应一定时间后，得到的固体产物用甲醇洗涤，得到中间体IV。

中间体V的合成：

中间体IV在避光和氮气保护条件下和苯胺丙烯醛缩苯胺盐酸盐反应后，用乙酸乙酯将产物析出，过硅胶柱层析纯化后得到中间体V。

中间体VI的合成：

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE009

中间体II和中间体V在醋酸酐/吡啶的混合溶剂中避光条件下回流反应一段时间后，得到中间体VI：3-(4-苯甲酸基)-2-(5-(3,3-二甲基-5-硝基-1-(3-丙磺酸基)-3H-吲哚基2-烯基)-戊-2，4-二烯基)-3-甲基-1-（3-丙磺酸基）-吲哚基-5-磺酸盐。

NIR-1的合成：

中间体VI在水溶液中和Na₂S加热回流反应若干小时后，进行反相高效液相色谱进行纯化，得到NIR-1：3-(4-苯甲酸基)-2-(5-(3,3-二甲基-5-氨基-1-(3-丙磺酸基)-3H-吲哚基-2-烯基)-戊-2，4-二烯基)-3-甲基-1-（3-丙磺酸基）-吲哚基-5-磺酸盐。

当合成中间体VI时，将丙磺酸内酯改用丁磺酸内酯时，经与上述相类同的反应步骤后，即得到NIR-2：3-(4-苯甲酸基)-2-(5-(3,3-二甲基-5-氨基-1-(3-丁磺酸基)-3H-吲哚基-2-烯基)-戊-2，4-二烯基)-3-甲基-1-（3-丁磺酸基）-吲哚基-5-磺酸盐。

已经活化后的藻蓝素和上述步骤得到的花菁染料反应后得到具有极大Stoke位移的荧光探针。

Figure 2010106002873100002DEST_PATH_IMAGE011

叶酸是核酸生物合成所必需的维生素，尤其是对增生细胞。叶酸的细胞转运是通过两种跨膜蛋白即低亲和力的还原型叶酸载体和高亲和力的叶酸受体（FR）。已证实FR在多种肿瘤细胞过度表达，当叶酸摄入量受限时，肿瘤细胞摄取叶酸的能力要强得多。且FR在多数新生正常组织中的表达仅限于一些难于进人血液循环的上皮细胞顶膜。正因为FR表达的特性，比如具有高亲和力（Kd=10^-10mol·L^-1），低免疫原性，易于修饰，体积小（Mr=441.4），高度化学稳定性和生物学稳定性，与有机溶剂的生理相容性，低成本等优点使叶酸介导靶向肿瘤的研究得到迅速发展。叶酸的化学名称为N-(4-((2-氨基-4-氧代-1,4-二氢-6-蝶啶)甲氨基)苯甲酰基)-L-谷氨酸，含有α和γ两个羧基，实验证明通过叶酸的γ-羧基衍生的偶联物具有与叶酸受体较高的结合能力。

藻蓝素近红外荧光探针可以通过如下方法与叶酸偶联：

a、将叶酸溶解于适量无水二甲基亚砜（DMSO）中，加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺活化后，滴入到溶解在无水DMSO中与双氨基聚乙二醇反应，然后通过硅胶柱层析的方法进行纯化处理，得到纯化的叶酸-聚乙二醇偶联物。

b、将藻蓝素近红外荧光探针也通过1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺活化，然后按照一定比例将活化的藻蓝素近红外荧光探针滴加到叶酸-聚乙二醇的碳酸盐缓冲液中反应，12~24小时后进行透析，然后通过反向柱层析方法进行纯化，得到偶联叶酸的藻蓝素近红外荧光探针。

藻蓝素近红外荧光探针也可以与相应的抗体结合。反应过程如下：

首先将具有琥珀酰亚胺基的藻蓝素近红外荧光探针与抗体混合，抗体上的氨基接近荧光探针的琥珀酰亚胺基的酯结合部位。

然后，抗体上的氨基与藻蓝素近红外荧光探针的酯部位反应，从抗体上的氨基夺取一个氢原子，从而氨基脱离的氢原子与藻蓝素荧光探针上琥珀酰亚胺基的琥珀酰亚胺结合，琥珀酰亚胺脱离成游离状态。与此同时，藻蓝素近红外荧光探针上残留的羰基与抗体上的氨基形成酰胺键，达到与抗体共价偶联的目的。

本发明的有益效果：本发明提供了一种具有极大Stoke位移的荧光染料，该染料由藻胆蛋白中的藻蓝素和近红外荧光染料偶联而成，既具有极大的Stoke位移，达到了300nm以上，又具有分子量较小的特点，可以标记叶酸等小分子量的物质，用于肿瘤标志物，抗体等的特异性荧光检测。

这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

具体实施方式

以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。

实施例1 藻蓝素的提取

首先称取1g条斑紫菜，加适量磷酸盐缓冲液后将组织捣碎，捣碎液10000g冷冻离心20min，取上清。上清采用25%，50%饱和度的硫酸铵分段沉淀法沉淀蛋白，最终沉淀仍用磷酸盐缓冲液溶解，15000g冷冻离心30min，取出沉淀，用蒸馏水透析一段时间后除去杂质离子得到粗提的藻蓝蛋白。将得到的藻蓝蛋白用10mol/L的浓盐酸在80℃下裂解30min后，用氯仿萃取，将多次萃取后的溶液合并后旋转蒸发除去其中的氯仿后得到藻蓝素。

实施例2 藻蓝素的活化

将2mmol 藻蓝素，20mmol N-羟基琥珀酰亚胺和40mmol二环己基碳二亚胺（DCC）加入到5ml 无水DMF中，避光条件下室温搅拌反应36小时。将反应液过滤后，滤液加入到乙醚中，使产物析出。然后将产物离心机离心，去除上层清液后，下层固体再用乙醚洗涤三次，然后用离心机离心，去除上层清液，得到固体粗品。该粗品用正相硅胶柱层析纯化后得到活化后的藻蓝素，置于冰箱中避光保存。

实施例3 NIR-1的合成

中间体II的合成

在干燥洁净三口烧瓶中加入10mmol的3-(4-苯甲酸基)-2，3-二甲基-3H-吲哚-5-磺酸钠（中间体I）和13mmol的丙磺酸内酯，以邻二氯苯作为溶剂，在避光条件下磁力加热搅拌至回流，回流反应18小时后停止加热，将溶剂去除后用乙醚洗涤产物三次，得到红棕色固体产物3-(4-苯甲酸基)-2，3-二甲基-1-(3-磺酸丙基)-3H-吲哚-5-磺酸钠（中间体II）。

中间体IV的合成

在干燥洁净三口烧瓶中加入10mmol的2，3，3-三甲基-5-硝基-3H-吲哚（中间体III）和13mmol的丙磺酸内酯，以邻二氯苯作为溶剂，在避光条件下磁力加热搅拌至回流，回流反应15小时后停止加热，将溶剂去除后用乙醚洗涤产物三次，得到红棕色固体产物2，3，3-三甲基-5-硝基-1-(3-磺酸丙基)-3H-吲哚（中间体IV）。

中间体V的合成

在干燥洁净的三口烧瓶中加入5mmol 的中间体IV，7.5mmol 的苯胺丙烯醛缩苯胺盐酸盐，加入18ml醋酸作为反应的溶剂，在避光和充氮气保护的条件下磁力搅拌并加热至回流，回流反应4小时后停止反应，待体系冷却至室温后在旋转蒸发仪上蒸出大部分的醋酸，并用乙酸乙酯洗涤，得到深红色粗品。用反相硅胶柱色谱进行纯化，得到3-(3,3-二甲基-5-硝基-2-(4-(苯胺基)-1,3-二烯-丁基)-3H-吲哚基)-丙基磺酸（中间体V）。

中间体VI的合成

在干燥洁净的三口烧瓶中加入3mmol 的中间体V和3.3mmol 的中间体II，并向其中加入4ml 的醋酸酐和4ml的吡啶使原料溶解，在避光条件下磁力搅拌并加热至体系回流，回流反应2小时后停止。待体系冷却至室温后旋转蒸发除去其中部分溶剂后，将反应物倒入乙醚中，产物静置后析出，倾倒上层清液后过滤，得到粗品3-(4-苯甲酸基)-2-(5-(3,3-二甲基-5-硝基-1-(3-丙磺酸基)-3H-吲哚基2-烯基)-戊-2，4-二烯基)-3-甲基-1-（3-丙磺酸基）-吲哚基-5-磺酸盐（中间体VI）。

NIR-1的合成

在干燥洁净的三口烧瓶中加入3mmol 的粗品VI，加入4.5mmol的Na₂S ，加入10ml 水，磁力搅拌并加热至回流，保持回流状态12小时，停止反应，待反应体系冷却至室温后过滤，并用少量冷水洗涤，收集滤液并进行浓缩，然后反相硅胶柱色谱进行纯化，得到3-(4-苯甲酸基)-2-(5-(3,3-二甲基-5-氨基-1-(3-丙磺酸基)-3H-吲哚基2-烯基)-戊-2，4-二烯基)-3-甲基-1-（3-丙磺酸基）-吲哚基-5-磺酸盐（NIR-1）。

实施例4 藻蓝素-NIR-1的合成

取浓度为2x10-2mol/L 的NIR-1 的水溶液50ul,在剧烈的搅拌条件下加入浓度为2.5x10-2mol/L 的活化藻蓝素琥珀酰亚胺酯的DMF溶液90ul，在室温下反应8小时后停止，用高效液相色谱（HPLC）进行纯化，得到藻蓝素偶联的NIR-1荧光探针。

实施例5 藻蓝素-NIR-1探针与叶酸的偶联

叶酸的活化

在干燥洁净的三口烧瓶中加入5mmol 叶酸并溶解在12ml在无水DMSO中，在不断搅拌条件下加入1-乙基-3-（3-二甲基丙胺）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化反应4小时，将活化后的反应液滴加到含有200mg的双氨基聚乙二醇（PEG-bis-Amine, 分子量为4000）的无水DMSO 溶液中，避光条件下反应10小时，然后通过硅胶柱层析的方法纯化，获得叶酸偶联的聚乙二醇。

藻蓝素-NIR-1探针与叶酸的偶联

在2ml无水DMSO溶液中加入2mg的藻蓝素-NIR-1荧光探针,溶解后加入1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化反应4小时，然后将活化液滴加到上述含有叶酸偶联聚乙二醇的缓冲液中，避光条件下反应24小时。然后在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中透析3天和去离子水中透析1天，截留分子量大于3500的物质，然后冻干，通过高效液相色谱（HPLC）纯化，得到藻蓝素-NIR-1-叶酸偶联的荧光探针。

实施例6 藻蓝素-NIR-1探针对小鼠IgG的标记

在2ml无水DMSO溶液中加入2mg的藻蓝素-NIR-1荧光探针,溶解后加入1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化反应4小时，然后将活化液滴加到1mg小鼠IgG溶于2ml磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌反应20小时，将反应液离心处理后，小心吸取上清液，以琼脂糖凝胶（Sephadex G25柱）过滤，得到藻蓝素-NIR-1标记的小鼠IgG。

已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。

Claims

1.一种具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，该探针由藻胆蛋白中的藻蓝素和近红外荧光染料偶联而成，分子结构为：

其Stokes位移达到300nm。

2.根据权利要求1所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：藻蓝素是开链线性延展的四吡咯化合物，由藻蓝蛋白脱除载体蛋白后获得。

3.根据权利要求2所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：藻蓝蛋白由钝顶螺旋藻、极大螺旋藻、多管藻、条斑紫菜、坛紫菜或红毛紫菜中分离得到。

4.根据权利要求1-3之一所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：近红外荧光染料由以下两种分子结构组成：

5.根据权利要求1-3之一所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：近红外荧光染料的吸收波长在600~700nm范围内。

6.根据权利要求1-3之一所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：藻蓝素中的羧基官能团活化后通过共价偶联的方式与近红外荧光染料分子结构中的氨基连接。

7.根据权利要求1-3之一所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：该探针用于肿瘤标志物，抗体的特异性荧光检测。

8.根据权利要求7所述具有极大Stokes位移的近红外荧光探针，其特征在于：肿瘤标志物选自叶酸、低密度脂蛋白或单克隆抗体。