ES2324198T3 - Metodo para medir una funcion fisiologica con un colorante como acido poliacrilico de fluoresceina. - Google Patents

Abstract

Un método para medir una función fisiológica de un grupo de células en el cuerpo de un paciente, seleccionadas entre el grupo que consiste en células renales o hepáticas, que comprende las etapas de: a) seleccionar un agente detectable que emita una emisión electromagnética, siendo eliminado selectivamente dicho agente de un fluido corporal en el cuerpo de dicho paciente por dicho grupo de células en el cuerpo de dicho paciente, y en el que dicha emisión se produce en dicho fluido corporal en el cuerpo de dicho paciente; b) introducir dicho agente en dicho fluido corporal de un paciente, de forma que dicho fluido corporal entre en contacto con dicho grupo de células en el cuerpo de dicho paciente, y en el que dicha emisión se produce en dicho fluido corporal; c) medir dicha emisión de una parte del cuerpo en el cuerpo de dicho paciente a través de la cual pasa dicho fluido corporal, en el que dicha emisión resulta de un agente que todavía no ha sido eliminado de dicho fluido corporal en el momento de dicha medición; y d) determinar dicha función fisiológica basada en la medición de dicha emisión; en el que dicho agente es un colorante que da una respuesta fluorescente a una primera longitud de onda tras ser irradiado con luz de una segunda longitud de onda y en el que dicho colorante se selecciona entre el grupo que consiste en: Fluoresceína-poli(ácido aspártico), Fluoresceína-poli(ácido glutámico), Fluoresceína-poli(ácido acrílico), Fluoresceína-polinucleótidos, Fluoresceína-polinitrofenilalanina, Fluoresceína-polidinitrofenilalanina, Fluoresceína-politrinitrofelinalanina, Fluoresceína-polisulfonilfenilalanina, Fluoresceína-polidisulfonilfenilalanina, Fluoresceína-politrisulfonilfenilalanina, Fluoresceína-polisuccinato, Fluoresceína-polimalonato, en el que antes de dicha etapa de medición, dicha parte del cuerpo a través de la cual pasa dicho fluido corporal es irradiada con dicha luz de dicha segunda longitud de onda, provocando que dicho colorante dé una respuesta fluorescente a dicha primera longitud de onda; en el que dicha emisión que es medida es la fluorescencia de dicho colorante a dicha primera longitud de onda; y en el que dicha determinación de la función fisiológica está basada en la medición de la fluorescencia de dicha primera longitud de onda.

Description

Método para medir una función fisiológica con un colorante como ácido poliacrílico de fluoresceína.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención es del campo de la medición de una función fisiológica de un grupo de células corporales.

Descripción de la técnica anterior

La práctica clínica actual para determinar la función hepática incluye derivar una estimación de CTC, que es una compilación de datos de laboratorio y valoración clínica de ascitos y encefalopatía. D.A. Noe y R.C. Rock (eds), Laboratory Medicine, The selection and Interpretation of clinical laboratory Studies, Williams and Wilkins, 1994, Baltimore, MD, capitulo 5, Assessment of Organ Function, by D.A. Noe, pag. 55-60, capitulo 19, Liver and Biliary Tract, by A.T. Blei, pag. 363-379, capitulo 21, The Kidneys, by D.A. Oken and A.C. Schoolwerth, pag. 401-410.

Otro ensayo incluye el uso de verde de indocianina (ICG). El ICG se conoce que es suprimido exclusivamente de la corriente sanguínea por el hígado. Por tanto, un perfil del tiempo de supresión en sangre de ICG está directamente relacionado con la función hepática. J. Caesar, S. Shaldon, L. Chiandussi, L. Guevara y Sheila Sherlock, "The use of indocyanine green in the measurement of hepatic blood flow and as a test of hepatic finction", Clin Sci. 21, 43-57 (1961).

El ensayo de ICG ha experimentado una evolución de tecnología. En su primera realización se extraía sangre del sujeto en diversos momentos a continuación de una inyección de bolo IV. Las muestras de sangre se trataban seguidamente por espectrofotometría para determinar la concentración de de ICG. R. Jalan y P.C. Hayes, "Review article: quantitative tests of liver function", Aliment Pharmacol. Ther. 9, 263-270 (1995); A.W. Hemming, C. H. Scudamore, C.R. Shackleton, M. Pudek y S. R. Erb, "Indocyanine green clearance as a predictor of successful hepatic resection in cirrhotic patients", Am. J. Surg. 163, 515-518 (1992); P. Ott, S. Keiding y L. Bass, "Plasma elimination of indocyanine green in the intact pig after bolus injection and during constan infusion: comparison of spectrophotometry and high-pressure liquid chromatography for concentration analysis", Hepatology 18, 1504-1515 (1993). Posteriormente, se desarrolló una técnica no invasiva que empleaba densintometría de la oreja. C. M. Leevy, F. Smith, J. Longueville, G. Pau.mgartner y M. M. Howard, "Indocyanine green clearance as a test for hepatic function: Evaluation by dichromatic ear densitometry", Journal of Medicine 24, 10-27 (1993). Los problemas asociados con el desarrollo clínico de este dispositivo condujeron recientemente a investigadores japoneses a mejorar la técnica de densitometría de la oreja. Este método más reciente, denominado método de trozo de dedo "finger-piece", emplea la luz transmitida de dos longitudes de ondas medidas a través de un dedo para deducir la concentración de ICG. M. Kanda, K. Taniguchi, K. Awazu, Y. Ishigami, M. Masuzawa y H. Abe, "Continuous monitoring of Cardiogreen 25 removal by a diseased liver using an optical sensor", Proc. SPIE 904, 39-46 (1988); M. Nakayama, N. Kanaya, S. Fujita y 3 A. Namiki, "Effects of ephedrine on indocyanine green clearance during spinal anesthesia: Evaluation by the finger piece method", Anesth. Analg. 77, 947-949 (1993); N. Kanaya, H. Iwasaki y A. Namiki, "Noninvasive reG clearance test for estimating hepatic blood flow during halothane and isoflurane anaesthesia", Can. J. Anaesth. 42, 209-212 (1995); N. Kanaya, M. Nakayama, S. Fujita, y A. Namiki, "Comparison of the effects of sevoflurane, isoflurane and halothane on indocyanine green clearance", Br. J. Anaesth. 74, 164-167 (1995); S. Shimizu, W. Kamiike, N. Hatanaka, Y. Yoshida, K. Tagawa, M. Miyata y H. Matsuda, "New method for measuring ICG R_{max} with a clearance meter", World J. Surge 19, 113-118 (1995).

Tanto la densitometría de la oreja como el método de trozo de dedo incluyen medir la absorción (o transmisión) de la luz por ICG.

Es también de interés lo que ha demostrado la determinación fluorométrica in vitro de ICG en plasma, B. Hollins, B. Noe y J.M. Henderson, "Fluorometric determination of indocyanine green in plasma", Clin. Chem. 33, 20 765-768 (1987).

Otras referencias de interés general incluyen: R.L. Sheridan, et al., "Burn depth estimation by indocyanine green fluorescence: Initial human trial", Journal of Burn Care & Rehabilitation 16, 602-604 (1995); M.A. O'Leary, D.A. Boas, B. Chance y A.G. Yodh, "Reradiation and imaging of diffuse photon density waves using fluorescent inhomogeneities", Journal of Luminescence 60 & 61,281-286 (1994); X. Li, B. Beauvoit, R. White, S. Nioka, B. Chance y A. Yodh, "Tumor localization using fluorescence of indocyanine green (lCG) in rat models", Proc. SPIE 2389,789-797 (1995).

El documento WO 98/40106 describe un método para medir la función fisiológica de un grupo de células corporales que incluye la etapa de seleccionar un agente detectable capaz de emitir una emisión electromagnética medible.

El documento DE 4445065 A se refiere a un método de diagnóstico in vivo basado en la radiación del infrarrojo cercano (radiación NIR) que usa colorantes solubles en agua y sus aductos de biomoléculas, que tienen cada uno propiedades fotofísicas y fármaco-químicas específicas como un medio de contraste para diagnósticos por fluorescencia y transiluminación en el intervalo de NIR, para nuevos colorantes y productos farmacéuticos que contienen estos colorantes.

Souli S. et al: "In Vivo Pharmacokinetic Study of Two Fluorescein Derivatives by Fluorescence Spectroscopy" Proceedings of the SPIE, Us, SPIE, Bellingham, VA, Vol. 26:27, 14 de septiembre de 1995 (1995-09-14), Páginas 109-117 describen el comportamiento in vivo de estas sondas fluorescentes, en particular, la verificación de la fluorescencia de tejidos después de una inyección de dos derivados de fluoresceína (carboxifluoresceína y biscarboxietil-carboxifluoresceína).

Koichi U. et al: "Clinical Evaluation of Indocyanine Green Clearance Using Finger Piece Method in Patients Undergoing Hepatic Surgery" base de datos STN, nº de acceso 118:78470 XP002135872 describe la velocidad de retención en plasma de verde de indocianina a través de un método de tomas de muestras de sangre.

Continúa habiendo una necesidad en la técnica de métodos mejorados para medir una función fisiológica.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, un método para medir una función fisiológica de un grupo de células corporales incluye la etapa de seleccionar un agente detectable capaz de emitir un miembro medible que comprende una emisión electromagnética. El agente es introducido en el fluido corporal que entra en contacto con el grupo de células corporales. La emisión es medida y la función fisiológica se determina basada en la medición de la emisión. La emisión puede ser medida usando técnicas no invasivas o invasivas. Las técnicas invasivas incluyen el uso endoscopios y catéteres insertados en la respectiva parte del cuerpo. Las técnicas no invasivas incluyen sondas superficiales como grapas para las orejas y sondas para los dedos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una ilustración esquemática de un aparato de detección de la fluorescencia in vivo de acuerdo con una realización.

La Fig. 2 expone gráficamente la dependencia con el tiempo de la fluorescencia in vivo después de una inyección de bolo de poli-D-lisina succinilada marcada con FITC en una ligadura única de previa al riñón de rata (normal) y ligadura posterior al riñón (ligada). La línea continua es un ajuste exponencial único para los datos medidos (excitación a 488 nm, emisión verificada a 518 nm).

La Fig. 3 expone gráficamente la dependencia del tiempo de la fluorescencia in vivo para tres ratas después de una inyección de bolo de ICG. Las líneas continuas son ajustes exponenciales únicos para los datos medidos.

La Fig. 4 expone gráficamente la dependencia del tiempo de la fluorescencia in vivo de una sucesión de inyecciones de bolo en una rata. En orden cronológico: ICG (ICG-1), FITC solamente, solución salina solamente, ICG nuevamente (ICG-2).

La Fig. 5 expone gráficamente la dependencia del tiempo de la fluorescencia in vivo después de una inyección de bolo de ICG en una extirpación parcial previa de hígado (normal) y extirpación parcial posterior de hígado (extirpado) de rata única. Las líneas continuas son ajustes exponenciales únicos para los datos medidos.

La Fig. 6 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (6000).

La Fig. 7 muestra el perfil de supresión de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (10000).

La Fig. 8 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poli(ácido glutámico) (13000).

La Fig. 9 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poliarginina (10000).

La Fig. 10 muestra el perfil de supresión en sangre de indocianina-mono(poli(ácido aspártico) (2000)) y de indocianina-bis(poli(ácido aspártico) (2000)).

La Fig. 11 muestra el perfil de supresión en sangre de indocianina-poli(ácido aspártico) (6000).

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con una realización de la presente invención, se describe un método para determinar una función en células y/o órganos midiendo la supresión acumulada en sangre de un agente dirigido a diana, denominado a veces en la presente memoria descriptiva un trazador. La función de células y/o órganos puede ser determinada mediante la velocidad con que estas células eliminan el trazador de la corriente sanguínea. La función puede ser valorada también midiendo la velocidad con que las células de interés acumulan el trazador o lo convierten en una forma activa u otra.

\newpage

El agente puede ser dirigido a diana a un grupo de células u órgano que están en un sistema de supresión de capacidad elevada.

Para agentes que contienen cromóforos y/o fluoróforos, la supresión acumulada en sangre se puede medir usando un dispositivo de fuente de luz/fotocélula que mida la absorbancia o fluorescencia de tejidos en un sitio no diana, como un lóbulo de la oreja, dedo, cerebro o retina. La acumulación del trazador en las células de interés puede ser valorada de una forma similar. La detección de esta acumulación puede ser facilitada usando fluoróforos que emitan en las longitudes de onda el infrarrojo cercano, ya que los tejidos corporales son relativamente transparentes a estas longitudes de onda. El agente puede ser introducido en el paciente por cualquier método adecuado, que incluye una inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea o infusión, administración oral, absorción transdermal a través de la piel o por inhalación.

La presente invención puede ser usada para una evaluación rápida en el lecho del paciente de las funciones biológicas. Por ejemplo, se pueden obtener datos sobre el aporte cardíaco, la causa de hipercolesterolemia así como la función renal y hepática en menos de 60 minutos en el lecho del paciente después de una única inyección intravenosa. De acuerdo con una realización, un paciente puede recibir una inyección de bolo de un pluralidad (por ejemplo, tres) compuestos diferentes, que contienen cada una un agente diferente (por ejemplo, fluoróforo).

El aporte cardíaco puede ser determinado utilizando la presente invención conjuntamente con métodos conocidos como el principio de Fick.

La filtración glomerular puede ser determinada mediante la supresión de un agente fluorescente como fluoresceína-poli-D-lisina succinilada o fluoresceína-inulina.

Si la hipercolesterolemia está provocada por una escasa supresión de LDL puede ser determinado analizando la supresión de LDL marcado con fluorescente. La función hepática puede ser valorada midiendo la velocidad de supresión de una asialoglicoproteína marcada con fluorescente o un colorante como verde de indocianina.

La presente invención incluye la detección de la fluorescencia de un agente que es suprimido de la corriente sanguínea por los riñones o el hígado. Por tanto, la valoración de la función renal o hepática mediante una detección de la fluorescencia in vivo está abarcada dentro de la invención. La invención puede ser usada también para verificar la eficacia de una hemodiálisis.

Las células tumorales o células del cerebro pueden ser dirigidas a diana también de acuerdo con la invención.

La supresión de una pluralidad de trazadores separados puede ser determinada simultáneamente seleccionando longitudes de onda de excitación y filtros para los fotones emitidos. Las curvas de concentración/tiempo pueden ser analizadas en tiempo real mediante un microprocesador. Las velocidades de supresión resultantes pueden ser calculadas y exhibidas para un impacto clínico inmediato. En los casos en que están presentes compuestos competitivos sin marcar (por ejemplo, LDL o asialoglicoproteínas), puede ser analizada una única muestra de sangre en cuanto a la concentración de estos compuestos competitivos y los resultados pueden ser usados para calcular un flujo (micromoles/minuto) a través de las trayectorias de supresión.

Con el fin de demostrar la utilidad de la invención, se empleó un sistema no invasivo de detección de la fluorescencia de acuerdo con la presente invención para verificar continuamente la supresión de colorante de la vasculatura. La diferenciación entre la función normal y anormal en un modelo de rata se demostró tanto para el hígado como el riñón. Con referencia a la Figura 1, una fibra óptica 10 transmitía luz desde la fuente 12 hasta la oreja 14. Una segunda fibra óptica 16 colocada cerca de la oreja 14 transmitía la luz fluorescente hasta un sistema detector 20. Se emplearon dos colorantes en este estudio inicial. El verde de indocianina es exclusivamente suprimido de la corriente sanguínea por el hígado y fue excitado in vivo con una luz láser a 780 nm. La señal de fluorescencia fue detectada a 830 nm. Se obtuvo una curva característica de supresión de la función hepática normal. Tras la extirpación de una parte del hígado, la curva de supresión se extendió grandemente como era esperado. Se excitó poli-D-lisina succinilada marcada con FIT in vivo con luz láser a 488 nm. La señal de fluorescencia se detectó a 518 nm. Se obtuvo una curva característica de la supresión de la función renal normal. Tras la ligadura de los dos riñones, la curva de supresión permaneció elevada y constante, indicando poca o ninguna supresión. Véase la Figura 2.

Con el aparato esquemático para una detección no invasiva in vivo de la fluorescencia mostrado en la Figura 1, para la detección de la fluorescencia de ICG, se empleó una fuente de láser en estado sólido colimada de 785 nm nominales (LaserMax Inc. model # LAS-300-780-5). Para la detección de la fluorescencia de FITC, se usó un láser de iones de argón (Coherent Innova model 90) sintonizado a la línea de 488 nm. La fuente de láser fue dirigida también en el extremo de un haz 10 de fibra óptica de vidrio de 3,2 mm de diámetro interno (Oriel #77526). El otro extremo de este haz de suministro de láser se colocó aproximadamente a 2 cm del la oreja 14 de la rata a un ángulo aproximado de 45º. Se colocó un segundo haz 16 de fibra óptica similar para ser usado como el conducto de detección de la fluorescencia aproximadamente a 1 cm de la oreja 14 a un ángulo de 30º.

El extremo de salida del haz de 16 de fibra de detección se colocó a la longitud focal de una lente 18 de 20 mm de longitud focal. La luz producida fue así colimada después de salir del haz y pasar a través de la lente. Un filtro 20 de interferencia de banda estrecha (IF) fue el siguiente elemento en el montaje óptico (CVI Laser Corporation), permitiendo que la luz de la longitud de onda apropiada pasara hasta el detector 20. Para el experimento de fluorescencia de ICG, se usó un filtro de 830 nm (FWHM de 10 nm). Para el experimento de fluorescencia de FITC, se usó un filtro de 518 nm (FWHM de 3 nm).

El detector 20 era un foto diodo de silicio pequeño (UDT modelo PIN-10D) conectado a un amplificador de la transinpedancia (UDT modelo 101C). UN voltímetro digital 22 (DUBM) verifica la señal producida. Un amplificador de voltaje 24 posterior (Tektronix AM-502) aumenta la señal si es necesario. La señal amplificada es conectada a un panel de rotura National Instruments BNC-2080, que está en interfase con un panel 26 de adquisición de datos (A/D) National Instruments DAQ-700. El programa de adquisición de datos LabVIEW® en el ordenador 28 recoge los datos experimentales en bruto.

El método actual contrasta con los métodos de la técnica anterior que usaban trazadores radiomarcados. El presente método elimina las preocupaciones sobre la radioactividad y permite mediciones concurrentes de diferentes parámetros de forma simple mediante una alteración rápida de las longitudes de onda de excitación y emisión.

Aunque la invención reivindicada se refiere a colorantes particulares (véanse las reivindicaciones), se puede usar una diversidad de colorantes y materias portadoras para los métodos descritos. Los colorantes que pueden ser usados incluyen fenilxantenos (por ejemplo, fluoresceína), fenotiazinas, fenoselenazinas, cianinas, indocianinas y escuaraínas. Las materias portadoras preferidas son compuestos polianiónicos fisiológicamente aceptables que pueden estar conjugados a los colorantes anteriores. Las materias portadoras que pueden ser usadas incluyen poli(ácido acrílico), poli(ácido aspártico), poli(ácido glutámico), polinucleótidos, poliarginina, poliserina, poliornitina y polilisina. Se pueden usar los siguientes conjugados de colorante-materia portadora en relación con los métodos descritos en la presente memoria descriptiva, siendo preferidos los conjugados marcados con un "*". Los precedidos por RF son usados para ensayar la función renal; los precedidos por LF son usados para ensayar la función hepática y los precedidos por RF/LF son usados para ensayar la función renal y hepática.

RF

Fluoresceína-poli(ácido aspártico)*

RF

Fluoresceína-poli(ácido glutámico)*

RF

Fluoresceína-poli(ácido acrílico)*

RF

Fluoresceína-polinucleótidos

RF

Fluoresceína-polinitrofenilalanina

RF

Fluoresceína-polidinitrofenilalanina

RF

Fluoresceína-politrinitrofelinalanina

RF

Fluoresceína-polisulfonilfenilalanina

RF

Fluoresceína-polidisulfonilfenilalanina

RF

Fluoresceína-politrisulfonilfenilalanina

RF

Fluoresceína-polisuccinato

RF

Fluoresceína-polimalonato

RF

Fluoresceína-poliglutarato

RF

Fluoresceína-poliglicolato

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-poli(ácido aspártico)*

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-poli(ácido glutámico)*

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-poli(ácido acrílico)*

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polinucleótidos

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polinitrofenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polidinitrofenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-politrinitrofenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polisulfonilfenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polidisulfonilfenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-politrisulfonilfenilalanina

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polisuccinato

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-polimalonato

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-poliglutarato

LF

Bis(ácido hexanoico)verde de indocianina-poliglicolato

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-poli(ácido aspártico)*

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-poli(ácido glutámico)*

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-poli(ácido acrílico)*

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polinucleótidos

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polinitrofenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polidinitrofenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-politrinitrofenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polisulfonilfenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polidisulfonilfenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-politrisulfonilfenilalanina

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polisuccinato

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-polimalonato

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-poliglutarato

RF/LF

Bis(ácido propanoico)verde de indocianina-poliglicolato

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-poli(ácido aspártico)*

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-poli(ácido glutámico)*

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-poli(ácido acrílico)*

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polinucleótidos

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polinitrofenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polidinitrofenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-politrinitrofenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polisulfonilfenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polidisulfonilfenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-politrisulfonilfenilalanina

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polisuccinato

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-polimalonato

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-poliglutarato

RF

Bis(benzotiazol)escuaraina-poliglicolato

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-poli(ácido aspártico)*

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-poli(ácido glutámico)*

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-poli(ácido acrílico)*

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polinucleótidos

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polinitrofenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polidinitrofenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-politrinitrofenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polisulfonilfenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polidisulfonilfenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-politrisulfonilfenilalanina

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polisuccinato

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-polimalonato

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-poliglutarato

RF

Bis(trihidroxifenil)escuaraina-poliglicolato.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no están destinados a ser limitativos.

Ejemplo 1

Para estos 10 estudios in vivo, se anestesiaron en primer lugar ratas Sprague-Dawley que pesaban \sim 250 gramos con uretano (1,35 g/kg) administrado a través de inyección intraperitoneal.

Después de cada animal ha recibido el plan deseado de anestesia, se hizo una pequeña incisión (0,5 cm) en el tórax superior exponiendo la vena yugular izquierda. El lóbulo de la oreja izquierda se fijó a un cultivo inclinado para microscopio de vidrio la luz láser incidente suministrada por la fibra óptica se centró en esa oreja. Seguidamente se inició la adquisición de datos y se obtuvo una lectura de fondo de la fluorescencia antes de la administración del artículo del ensayo. Seguidamente se administró el colorante (ICG para la valoración de la supresión del hígado, poli-D-lisina marcada con FITC para la valoración de la supresión del riñón) a través de la vena yugular. La señal de fluorescencia aumentó inmediatamente hasta un valor pico. La señal decayó como una función del tiempo a medida que presumiblemente desaparecía el colorante de la corriente sanguínea.

La rata anestesiada se colocó sobre su dorso y se hizo una incisión en la piel abdominal ventral de línea media que se extendía desde el cartílago xifoide hasta aproximadamente la mitad de la cola. Seguidamente se hizo una incisión similar en los músculos abdominales, exponiendo el hígado. La rata se volvió a colocar se colocó una sutura compuesta bajo el tórax para provocar que el hígado cayera ligeramente hacia adelante y alejado del diafragma. Los lóbulos laterales mediano e izquierdo del hígado se desplazaron suavemente fuera de la cavidad abdominal y se colocaron en un apósito de gasa con solución salina. Los dos lóbulos se elevaron verticalmente y se colocó una ligadura 3-0 alrededor de los lóbulos aislados pero no ligado en este momento del procedimiento. Los lóbulos se volvieron a colocar en la cavidad abdominal y se retiró la sutura compuesta La incisión se cerró con grapas para heridas.

Se administró ICG al animal a través de la vena yugular expuesta como en el estudio previo. La supresión del artículo del ensayo se verificó como anteriormente para determinar la supresión hepática normal del ICG. Después de que se obtuvo la curva de supresión normal, la ligadura alrededor de los dos lóbulos aislados del hígado se amarró de forma afianzada la ligadura alrededor de los dos lóbulos aislados de hígado para efectuar una hepatectomía parcial. Se dejó que el animal se equilibrara durante 20 minutos en este estado. Seguidamente se administró el ICG a través de la vena yugular expuesta y se verifico la supresión del artículo del ensayo. Se obtuvieron curvas de supresión de animales hepatectomizados parciales frente a normales para una muestra de n = 3.

La dependencia del tiempo de la fluorescencia medida en la oreja antes y después de la inyección del bolo de ICG para tres ratas se muestra en la Figura 3. Los datos pueden ser descritos en términos de tres fases. La fase 1 consistió en aproximadamente los primeros 30 segundos de datos, que reunieron la inyección previa al bolo. Estos datos fueron constantes y representaron el valor de línea de base para el experimento que siguió. El valor de la línea de base debe ser cero, ya que no se produce ninguna fluorescencia durante esta fase. La fase 2 produjo una inyección posterior de varios segundos, la señal se elevó rápidamente hasta un valor máximo a medida que el colorante alcanzó la oreja y se equilibró en la agrupación de sangre. En la tercera etapa, la señal de fluorescencia decayó con el tiempo a medida que el hígado filtraba el ICG de la corriente sanguínea. Visualmente, las velocidades de disminución fueron similares para la totalidad de las tres. Después de 15 minutos, se perdió aproximadamente un 90% de la señal inicial.

Para verificar que la medición era de hecho la de la fluorescencia de ICG, se realizó el siguiente estudio testigo. Una rata fue inyectada, como anteriormente, con 500 230 \mul de ICG 1,41 mM. Se obtuvo un transcurso del tiempo de la fluorescencia normal y se marcó como ICG-1 en la Figura 4. Seguidamente la misma rata fue inyectada con 500 \mul de fluoresceína 1,41 mM (Sigma, St. Louis, MO). Como se muestra en la Figura 4, no se detectó ninguna señal de fluorescencia. Como una comprobación adicional, se inyectaron 500 \mul de solución salina (Baxter, Deerfield, IL) en la misma rata a continuación. Nuevamente, no se obtuvo ninguna señal detectable. Finalmente, la rata fue inyectada una vez más con 500 \mul de ICG 1,41 mM y se obtuvo una segunda curva "normal".

Para verificar que estas curvas de disminución de la fluorescencia estaban relacionadas con la función del hígado, se realizó un experimento que incluía una extirpación parcial del hígado. El procedimiento de extirpación parcial del hígado se indicó con anterioridad. Una vez que se completó la cirugía y estaban preparadas las ligaduras para ser usadas en la extirpación parcial del hígado, la rata fue inyectada con 500 \mul de solución de ICG 1 mM. Se obtuvo una curva del transcurso del tiempo de la fluorescencia normal y se muestra en la Figura 5.

Seguidamente fue parcialmente extirpado el hígado apretando las ligaduras. La rata se dejó equilibrar durante diez minutos. Seguidamente se proporcionó otra inyección de 500 \mul de ICG 1 mM. Se midió la curva del tiempo de fluorescencia y se muestra también en la Figura 5. La capacidad del hígado para separar ICG de la agrupación de sangre se alteró enormemente, y la velocidad de disminución de la fluorescencia para el hígado parcialmente extirpado era mucho más baja que la normal. Tras el sacrificio, se peso el hígado y se encontró que un 44% del hígado había sido extirpado.

Ejemplo 2

Se disolvieron 500 mg (\sim 125 equivalentes moles de lisina) de poli-D-lisina 4000 (Sigma P-0296) en 10 ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M en un vial de vidrio oscuro con una barra de agitación magnética. Se disolvieron 24,3 mg (62,5 \mumoles) de FITC (isotiocianato de fluoresceína, Sigma F-7250) en 1,5 ml de DMSO (dimetilsulfóxido). A 25ºC, con agitación, se añadió lentamente la solución de FITC a la solución de poli-D-lisina. La reacción se dejó que continuara durante 30 minutos a 25ºC, seguidamente se llevó a 4ºC y se agitó 12 horas. El conjugado de fluoresceína se separó del FITC sin unir mediante filtración sobre gel en una columna Sephadex G-25, eluyendo con 0,9% (p/v) de NaCl.

Se colocaron 20 ml de NaCl al 0,9% que contenían \sim 30 \mumoles del conjugado anterior en un vial de vidrio oscuro con una barra de agitación magnética y un electrodo de pH a 25ºC; el pH se elevó hasta 9,5 mediante la adición de NaOH 0,5 M. Se añadieron lentamente 500 mg de anhídrido succínico a esta solución con agitación, durante un período de 30 minutos, manteniendo el pH a 9,5-10,0 mediante la adición de NaOH 0,5 M. Seguidamente el pH se dejó caer hasta un valor estable de 7,5, con un volumen final de 27 ml. La mezcla de reacción se dializó frente NaCl al 0,9% (p/v) usando una membrana de diálisis con un corte de 3,5 kd y el conjugado de polímero retenido, a un equivalente de concentración de fluoresceína de \sim 4,0 \muM se usó directamente para una infusión.

La rata anestesiada se colocó en la superficie ventral y se hicieron incisiones dorsoventrales bilaterales en la cavidad abdominal cercana al límite costal del tórax. Los riñones fueron liberados de tejido conectivo y se extrajeron suavemente del abdomen fijando el tejido graso perirrenal. Se colocó una única ligadura 3-0 alrededor de los vasos renales y el uréter con el fin de no ocluir los vasos colaterales. Las ligaduras no se cosieron en este momento del procedimiento.

Se administró poli-D-lisina marcada con fluoresceína succinilada a través de la vena yugular expuesta. La supresión del artículo del ensayo se verificó como anteriormente para determinar la desaparición renal normal de poli-D-lisina. Después de que se obtuvo la curva de supresión normal, la ligadura se amarró para efectuar una nefrectomía total (bilateral). El animal se dejó estabilizar en este estado durante 20 minutos. Seguidamente el artículo del ensayo se administró a través de la vena yugular expuesta y se verificó la supresión del compuesto. Se obtuvieron las curvas de supresión de animales normales frente a nefrectomizados totales para una muestra de n = 3.

Ejemplo 3

Preparación de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (6000)

Se añadió una solución de isotiocianato de fluoresceína (20 mg) en DMSO (0,5 ml) a una solución de poli(ácido aspártico) (TM: 6000, 180 mg) en agua (1 ml). La solución homogénea rojiza-naranja se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se trató con acetona (20 ml). El precipitado fino se separó por centrifugación. La materia sobrenadante se desecho y el precipitado se volvió a poner en suspensión en acetona (10 ml). Este procedimiento de lavado se repitió tres veces para separar el conjunto del isotiocianato de fluoresceína sin reaccionar. El sedimento se disolvió en agua (0,5 ml) y se cromatografió a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10 previamente rellenada). Se recogieron fracciones de un milímetro. Las fracciones deseadas
(1-4) se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 87 mg del conjugado deseado en forma de un sólido naranja. La absorbancia de una solución de 0,21 mg/ml era 0,26, que corresponde a una conjugación de 10,2%. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros. La Figura 6 muestra el perfil de supresión de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (6000).

Ejemplo 4

Preparación de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (10000)

Se añadió una solución de isotiocianato de fluoresceína (20 mg) en DMSO (0,5 ml) a una solución de poli(ácido aspártico) (PM: 10000, 180 mg) en agua (1 ml). La solución homogénea rojiza-naranja se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se trató con acetona (20 ml). El precipitado fino se separó por centrifugación. La materia sobrenadante se desechó y el precipitado se volvió a poner en suspensión es acetona (10 ml). Este procedimiento de lavado se repitió tres veces más para separar el conjunto del isotiocianato de fluoresceína sin reaccionar. El sedimento se disolvió en agua (0,5 ml) y se cromatografió a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10 previamente rellenada). Las fracciones deseadas (1-4) se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 100 mg del conjugado deseado en forma de un sólido naranja. La absorbancia de la solución de 0,19 mg/ml era 0,05, que corresponde a una conjugación de 3,3%. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros. La Figura 7 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poli(ácido aspártico) (10000).

Ejemplo 5

Preparación de conjugado de fluoresceína-poli(ácido glutámico (13000)

Se añadió una solución de isotiocianato de fluoresceína (20 mg) en DMSO (5,5 ml) a una solución de poli(ácido glutámico) (PM: 13000), 150 mg) en agua (1 ml). La solución homogénea rojiza-naranja se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se trató con acetona 20 ml). El precipitado fino se separó por centrifugación. La materia sobrenadante se desechó y el precipitado se volvió a poner en suspensión en acetona (10 ml). Este procedimiento de lavado se repitió tres veces más para separar el conjunto del isotiocianato de fluoresceína sin reaccionar. El sedimento se disolvió en agua (0,5 ml) y se cromatografió a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia PD-10 previamente rellenada). Las fracciones deseadas (1-4) se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 80 mg del conjugado deseado en forma de un sólido naranja. La absorbancia de una solución de 0,21 mg/ml era 0,79, que corresponde a una conjugación de 60,8%. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros. La Figura 8 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poli(ácido glutámico) (13000).

Ejemplo 6

Preparación de conjugado de fluoresceína-poliarginina (10000)

Se añadió una solución de isotiocianato de fluoresceína (20 mg) en DMSO (0,5 ml) a una solución de poliarginina (PM: 10000, 150 mg) en agua (1 ml). La solución homogénea rojiza-naranja se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se trató con acetona (20 ml). El precipitado fino se separó por centrifugación. La materia sobrenadante se desechó y el precipitado se volvió a poner en suspensión en acetona (10 ml). Este procedimiento de lavado se repitió tres veces más para separar el conjunto del isotiocianato de fluoresceína sin reaccionar. El sedimento se disolvió en agua (0,5 ml) y se cromatografió a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia PD-0 previamente rellenada). Las fracciones deseadas (1-4) se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 80 mg del conjugado deseado en forma de un sólido naranja. La absorbancia de una solución de 0,21 mg/ml era 0,73, que corresponde a una conjugación de 60,5%. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros. La Figura 9 muestra el perfil de supresión en sangre de conjugado de fluoresceína-poliarginina (10000).

Ejemplo 7

(Comparativo)

Preparación de conjugado de indocianina-ácido dodecaaspártico

(a) Síntesis del péptido: Se prepararon mono- y bi-aspartimida de ácido dodecaaspártico mediante síntesis de péptidos Fmoc en fase sólida con un sintetizador automatizado Applied Biosystems 432A Synergy. Las unidades de aminoácidos (75 micromoles cada una) se activaron secuencialmente con una mezcla de N-hidroxibenzotriazol (HOBT) y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilunorio (HBTU). El FMOC del aminoácido terminal se separó con piperidina al 20% en dimetilformamida.

(b) Síntesis del colorante: El colorante de bis(carboxihexil) indocianina de absorción en el infrarrojo cercano (NIRD) se preparó mediante la reacción de 1,1,2-trimetil-[1H]benc[e]indol(20 g, 95,6 mmoles) y ácido 6-bromohexanoico (28,1 g, 144,1 mmoles) en 1,2-diclorobenzeno (DCB) a 110ºC durante 12 horas. La solución verde se enfrió a temperatura ambiente y el precipitado sólido marrón formado se recogió por filtración. Después de lavar el sólido con DCB y dietil-éter, el polvo marrón obtenido (24 g, 64%) se secó bajo vacío a temperatura ambiente. Una parte de este sólido (4,0 g, 9,8 mmoles), dianil-monohidrocloruro de glutaconaldehído (1,4 g, 5 mmoles) y trihidrato de acetato de sodio (1,8 g, 12,9 mmoles) se llevó a reflujo en etanol durante 1 hora. Después de evaporar el disolvente se añadieron 20 ml de una solución acuosa 2 N de HCl al residuo y la mezcla se centrifugó y la materia sobrenadante se separó por decantación. Este procedimiento se repitió hasta que la materia sobrenadante se hizo casi incolora. Se añadieron aproximadamente 5 ml de una mezcla de agua: acetonitrilo (3:2) al residuo sólido que se liofilizó para obtener aproximadamente 2 g de copos verdes oscuros. La pureza del compuesto se estableció mediante espectrometría ^{1}H-RMN y de masas LC.

(c) Conjugado de colorante-péptido: se añadió el colorante (60 mg, 75 micromoles) a un reactivo de activación que consistía en 0,4 ml de HBTU en DMSO (0,2 M) y 0,4 ml de diisopropiletilamina en DMSO (0,4 M). La activación se completó en aproximadamente 30 minutos y se añadió el péptido unido a resina (25 micromoles) al colorante. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se filtró y el residuo sólido se lavó con DMG, acetonitrilo y THF. Después de secar el residuo verde, se realizó la escisión del grupo protector de la cadena lateral de ácido aspártico y el péptido de la resina en una etapa con una mezcla de 85% de ácido trifluoroacético, 5% de agua, 5% de tioanisol y 5% de fenol. La resina se filtró y se usó t-butil-metil-éter frío (MTBE) para precipitar el conjugado de colorante-péptido que se liofilizó y se purificó mediante HPLC. Se obtuvieron dos compuestos, mono- y bis-aspartimidas de ácido dodecaaspártico.

Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 780 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 830 nanómetros. La Figura 10 muestra el perfil de supresión en sangre de indocianina-mono(poli(ácido aspártico 6000)).

Ejemplo 8

(Comparativo)

Preparación de conjugado de indocianina (NIRD)-poli(ácido aspártico) 6000

Se activó NIRD (60 mg, 75 micromoles) con una mezcla de 0,4 ml de HBTU en DMSO (0,2 M) y 0,22 ml de diisoporpiletilamina en DMSO (0,2 M) y 0,22 ml de diisopropiletilamina en DMSO (0,4 M) durante 1 hora. Se añadió poli(ácido aspártico) al colorante y la conjugación estuvo completada después de 3 horas. Se añadió MTBE frío (4 x 10 ml) para precipitar el conjugado de péptidos y se escurrieron los disolventes y reactivos de la reacción. La pasta verde obtenida se disolvió en agua y se liofilizó para proporcionar un sólido verde. El compuesto se purificó mediante cromatografía de filtración sobre gel con una columna de Pharmacia PD-10 (Sephadex G-25) eluyendo con PBS. El producto se liofilizó y se analizó mediante HPLC, espectrofotometría UV-visible, fluorometría y espectrometría de masas. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando una longitud de onda de excitación de 780 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 830 nanómetros. La Figura 11 muestra el perfil de supresión en sangre de indocianina (poli(ácido aspártico) 6000).

Ha sido establecida la utilidad de la detección de fluorescencia no invasiva para verificar la función hepática o de los riñones.

Las etapas de la invención pueden ser repetidas con el fin de determinar si está cambiando la función fisiológica.

El verde de indocianina es un colorante que da una respuesta fluorescente a una longitud de onda de aproximadamente 830 nm y se usó para medir la función fisiológica del hígado. Con el fin de medir la función fisiológica del hígado, una parte del cuerpo fue irradiada con luz con una longitud de onda de aproximadamente 780 nm. La función fisiológica o hepática de las células del hígado se midió usando el método reivindicado.

La poli-D-lisina succinilada marcada con fluoresceína es un colorante que da una respuesta fluorescente a una longitud de onda de aproximadamente 518 nm y se usó para medir la función fisiológica de los riñones. Con el fin de medir la función fisiológica de los riñones, una parte del cuerpo fue irradiada con luz con una longitud de onda de 488 nm. La función renal se midió usando el método de la invención anteriormente descrito. Véase la Figura 2.

Los colorantes fueron inyectados por vía intravenosa. Una parte del cuerpo, que incluía vasos sanguíneos cercanos a la superficie de la piel, fue irradiada con un láser o con radiación infrarrojos.

La invención reivindicada puede ser usada también para evaluar la hipercolesterolemia. Las mediciones de la velocidad de supresión pueden permitir al facultativo determinar si el colesterol elevado en suero resultaba de una velocidad aumentada de producción de LDL o de una velocidad disminuida de supresión de LDL, lo que puede tener un impacto sobre la terapia. La invención reivindicada puede ser usada también para medir el aporte cardíaco. La capacidad de medir concurrentemente la función cardiaca mientras se mide también al mimo tiempo la función hepática y renal puede permitir al facultativo extraer conclusiones preliminares sobre si cualesquiera cambios observados en las funciones hepática y renal eran debidos principalmente a una enfermedad renal o hepática o secundariamente a una enfermedad cardiaca.

Como se pueden hacer muchas modificaciones, variaciones y cambios en detalles en las realizaciones descritas, está previsto que toda la materia en la descripción que antecede y mostrada en los dibujos que se acompañan sean interpretada como ilustrativa y no en un sentido limitativo.

Claims (24)

1. Un método para medir una función fisiológica de un grupo de células en el cuerpo de un paciente, seleccionadas entre el grupo que consiste en células renales o hepáticas, que comprende las etapas de:

a) seleccionar un agente detectable que emita una emisión electromagnética, siendo eliminado selectivamente dicho agente de un fluido corporal en el cuerpo de dicho paciente por dicho grupo de células en el cuerpo de dicho paciente, y en el que dicha emisión se produce en dicho fluido corporal en el cuerpo de dicho paciente;

b) introducir dicho agente en dicho fluido corporal de un paciente, de forma que dicho fluido corporal entre en contacto con dicho grupo de células en el cuerpo de dicho paciente, y en el que dicha emisión se produce en dicho fluido corporal;

c) medir dicha emisión de una parte del cuerpo en el cuerpo de dicho paciente a través de la cual pasa dicho fluido corporal, en el que dicha emisión resulta de un agente que todavía no ha sido eliminado de dicho fluido corporal en el momento de dicha medición; y

d) determinar dicha función fisiológica basada en la medición de dicha emisión;

en el que dicho agente es un colorante que da una respuesta fluorescente a una primera longitud de onda tras ser irradiado con luz de una segunda longitud de onda y en el que dicho colorante se selecciona entre el grupo que consiste en:

Fluoresceína-poli(ácido aspártico),

Fluoresceína-poli(ácido glutámico),

Fluoresceína-poli(ácido acrílico),

Fluoresceína-polinucleótidos,

Fluoresceína-polinitrofenilalanina,

Fluoresceína-polidinitrofenilalanina,

Fluoresceína-politrinitrofelinalanina,

Fluoresceína-polisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polidisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-politrisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polisuccinato,

Fluoresceína-polimalonato,

en el que antes de dicha etapa de medición, dicha parte del cuerpo a través de la cual pasa dicho fluido corporal es irradiada con dicha luz de dicha segunda longitud de onda, provocando que dicho colorante dé una respuesta fluorescente a dicha primera longitud de onda;

en el que dicha emisión que es medida es la fluorescencia de dicho colorante a dicha primera longitud de onda; y

en el que dicha determinación de la función fisiológica está basada en la medición de la fluorescencia de dicha primera longitud de onda.

2. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que las etapas b) a d) son repetidas para determinar si cambia la función fisiológica.

3. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicho agente es inyectado.

4. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicho agente es inyectado por vía intravenosa.

5. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha parte del cuerpo incluye vasos sanguíneos cercanos a una superficie de la piel de dicho paciente.

\newpage

6. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha segunda longitud de onda es de aproximadamente 400-1200 nanómetros.

7. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha segunda longitud de onda es de aproximadamente 488 nanómetros.

8. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha parte del cuerpo es irradiada con un láser.

9. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha parte del cuerpo es irradiada con radiación infrarrojos.

10. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dichas células del cuerpo son células de riñón.

11. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dichas células del cuerpo son células de hígado.

12. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha primera longitud de onda es de aproximadamente 830 nanómetros.

13. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha primera longitud de onda es de aproximadamente 518 nanómetros.

14. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha función fisiológica es una función renal.

15. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha función fisiológica es una función hepática.

16. Un método como se define en la reivindicación 1, en el que dicha emisión es medida invasivamente o no invasivamente con respecto a dicha parte del cuerpo.

17. Un método como se define en la reivindicación 16, en el que dicha emisión es medida endoscópicamente.

18. Un método como se define en la reivindicación 16, que incluye adicionalmente la etapa de insertar un catéter en dicha parte del cuerpo con el fin de medir dicha emisión.

19. Un método como se define en la reivindicación 16, en el que dicha parte del cuerpo es una oreja del cuerpo del paciente.

20. Un método como se define en la reivindicación 16, en el que dicha parte del cuerpo es un dedo del cuerpo del paciente.

21. Uso de un agente detectable en la elaboración de una composición para medir una función fisiológica de un grupo de células en el cuerpo de un paciente, seleccionadas entre el grupo que consiste en células renales o hepáticas, en el que dicho agente incluye un colorante que da una respuesta fluorescente a una primera longitud de onda tras ser irradiado con luz de una segunda longitud de onda y en el que dicho colorante se selecciona entre el grupo que consiste en:

Fluoresceína-poli(ácido aspártico),

Fluoresceína-poli(ácido glutámico),

Fluoresceína-poli(ácido acrílico),

Fluoresceína-polinucleótidos,

Fluoresceína-polinitrofenilalanina,

Fluoresceína-polidinitrofenilalanina,

Fluoresceína-politrinitrofelinalanina,

Fluoresceína-polisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polidisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-politrisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polisuccinato,

Fluoresceína-polimalonato,

Fluoresceína-poliglutarato,

Fluoresceína-poliglicolato.

22. Un producto de diagnóstico, que comprende un agente detectable que incluye un colorante seleccionado entre el grupo que consiste en:

Fluoresceína-poli(ácido aspártico),

Fluoresceína-poli(ácido glutámico),

Fluoresceína-poli(ácido acrílico),

Fluoresceína-polinucleótidos,

Fluoresceína-polinitrofenilalanina,

Fluoresceína-polidinitrofenilalanina,

Fluoresceína-politrinitrofelinalanina,

Fluoresceína-polisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polidisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-politrisulfonilfenilalanina,

Fluoresceína-polisuccinato,

Fluoresceína-polimalonato,

Fluoresceína-poliglutarato,

Fluoresceína-poliglicolato

para un uso en diagnóstico.

23. El producto de diagnóstico según la reivindicación 22, para ser usado en la medición de emisiones electromagnéticas de diagnóstico.

24. El producto de diagnóstico según la reivindicación 22 ó 23, en el que el colorante es fluoresceína-poli(ácido aspártico).