CN101638523A - 聚合物及具有所述聚合物的荧光探针 - Google Patents

聚合物及具有所述聚合物的荧光探针 Download PDF

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Abstract

具有对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物。当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构。

Description

聚合物及具有所述聚合物的荧光探针
技术领域
[0001]本发明涉及新型聚合物以及具有所述新型聚合物的荧光探针。
背景技术
[0002]检测肿瘤和炎症之类的疾病的病变位点是生物学和医学，尤其是临床医学研究和内部成像诊断领域中非常重要的任务。因此需要有可高灵敏度、特异性检测病变位点的分子探针以进行这样高灵敏度和高精度的检测。
[0003]肿瘤和炎症之类的病变位点异于正常组织环境于pH值。已知肿瘤或炎症位点(pH值约5-6)的pH值较正常组织(pH值约7.4)低。还知一些高度恶性肿瘤的pH值甚至会降到约5.5。因此期待以pH应答性化合物作为可检测癌症和炎症的分子探针的候选物。
[0004]日本专利公开No.2-25138(Japanese Patent PublicationNo.2-25138)公开了将具有pH反应性的荧光染料结合到不具有pH反应性的聚合物上的荧光聚合物指示剂作为pH应答性化合物。此外，日本专利公开No.2-25138(Japanese Patent Publication No.2-25138)还指出当把指示剂的周围环境从高pH值环境变至低pH值环境时，所述指示剂的荧光强度在低pH值区(pH值约5)降低。
[0005]日本专利特开No.2001-278914(Japanese PatentLaid-Open No.2001-278914)公开了经苯胺基萘荧光标记的聚羧酸，其是用于进行如用作增稠剂和稳定剂的聚羧酸的定量分析等的经荧光标记的聚羧酸。当使用这种经荧光标记的聚羧酸时，随着周围环境pH值由高变低，聚羧酸形成缔合。结果，缔合体内形成高疏水性的区域，苯胺基萘位于其内，从而诱导荧光发光。
[0006]此外，日本专利No.2884063还公开了具有第一侧链和第二侧链的聚合物，其中所述第一侧链具有聚谷氨酸，而所述第二侧链具有苯胺基萘，所述聚合物是可用于提取膜蛋白的两亲性聚合物。
[0007]但日本专利公开No.2-25138(Japanese Patent PublicationNo.2-25138)公开的指示剂的荧光强度会随着pH值的降低而减弱。因此，当所述指示剂被用来检测低pH值位点时，就很难区别荧光强度的减弱是由低pH值所致，还是由于指示剂的损失或是指示剂与杂质之间的相互作用所致。所以难以检测低pH值位点。
[0008]日本专利特开No.2001-278914(Japanese PatentLaid-Open No.2001-278914)描述的经荧光标记的聚羧酸由于主要由缔合形成高疏水性区域，因此，尽管所述聚羧酸在低pH区域具有应答性，但还检测不到足够的荧光强度。而日本专利特开2001-278914描述的经荧光标记的聚羧酸具有乙烯基聚合物骨架，因此其在活体内的代谢和分泌限制了其活体利用的可能性。
[0009]另外，日本专利No.2884063描述的两亲性聚合物在pH值8-9之间发生最大荧光波长变化。因此难以区分高度恶性肿瘤(pH值：约5.5)和正常位点(pH值：约7.4)。
发明内容
[0010]本发明一方面涉及具有对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物。当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4的范围内时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
[0011]本发明另一方面涉及具有对疏水环境敏感的荧光染料和聚氨基酸的聚合物。当所述聚氨基酸周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
[0012]本发明另一方面涉及含对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物，其中当pH值为7.4时，所述聚合物的二级结构为无规则卷曲的机率比其为螺旋结构的机率高；而当pH值为5.5时，所述聚合物的二级结构为螺旋结构的机率比其为无规则卷曲的机率高。本发明另一方面涉及含聚合物和对疏水环境敏感的荧光染料的荧光探针，其中所述探针在pH值为5.5时的荧光强度高于其在pH值为7.4时的荧光强度，这是由所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构所致。
[0013]将通过下列例示实施方式参照附图说明本发明的更多特征。
附图简述
[0014]图1为示本发明的聚合物例PGA-AN1和苯胺基萘磺酸在含10％血清的PBS中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0015]图2为示本发明的聚合物例PGA-AN1和苯胺基萘磺酸在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0016]图3为示本发明的聚合物例PGA-NR在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0017]图4为示本发明的聚合物例PGA-AN-Gel在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0018]图5为示本发明的聚合物例PGA-AN、苯胺基萘磺酸和LysoSensorTM Blue DND-167在PBS中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0019]图6为示本发明的聚合物例PGA-AN2和PGA-AN3在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0020]图7为示本发明的聚合物例PGA-AN4在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0021]图8为示本发明的聚合物例PGA-AN5和PGA-AN6在水中的荧光强度的pH依赖性的坐标图。
[0022]图9为示本发明的聚合物例PGA-AN在水中的中性-酸性区的荧光强度比的坐标图。
[0023]图10为示各种染料在DMF和PBS中的荧光强度比的坐标图。
实施方式
[0024]以下说明本发明的实施方式。
[0025]本发明一方面涉及具有对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物，其中当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
[0026]本文所述“聚合物”是指具有至少一种合成聚合物或天然聚合物的化合物，例如聚氨基酸或糖链。本发明所述聚合物可被定义为重量平均分子量(Mw)不小于1000的化合物。对所述聚合物无特定限制，只要当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高即可。以下将所述二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构的变化称为“螺旋转变(helixtransition)”。
[0027]本发明另一方面涉及具有对疏水环境敏感的荧光染料和聚氨基酸的聚合物，其中当所述聚氨基酸周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
[0028]本文所述“...的pH值降低”是指本发明的聚合物周围的pH值由偏碱性变成偏酸性。
[0029]不受任何特定理论束缚，发明人基于下述本发明的机理的理论观察证实，本发明的聚合物在pH值为5.5时采取螺旋结构的机率比pH值为7.4时采取螺旋结构的机率高。本发明可选择优选所述机率差显著的(观察一组化合物时可检测的)聚合物。例如，假设pH值为5.5时所述聚合物采取螺旋结构的机率表示为x％，pH值为7.4时其采取螺旋结构的机率表示为y％，如果x-y≥5，则可认为二级结构在5.5≤pH值＜7.4的范围内由无规则卷曲变成螺旋结构。换言之，在pH值为7.4时，所述聚合物的二级结构为无规则卷曲的机率比所述聚合物为螺旋结构的机率高；在pH值为5.5时，所述聚合物的二级结构为螺旋结构的机率比所述聚合物为无规则卷曲的机率高。
[0030]可利用相关领域熟知的各种方法确认本发明的聚合物只有螺旋结构还是无规则卷曲结构。所述方法的例子包括：圆二色性(CD)测量，红外吸收光谱测量，荧光测量，核磁共振(NMR)光谱分析，中子散射和质谱。例如，可通过测量紫外线区的CD光谱分析来评价α-螺旋结构、β结构和无规则卷曲结构的存在及含率。更具体而言，在聚氨基酸溶液的CD光谱中，α-螺旋结构在208nm和222nm处呈负极大值，在192nm处呈正极大值；而无规则卷曲结构仅在200nm处呈负极大值。所以，可通过CD光谱来分析聚合物的二级结构。
[0031]可使用另一种方法——红外吸收光谱法来分析聚氨基酸的二级结构，其肽键的吸收带存在于1500-1700cm-1的频率范围内，酰胺基I的振动带是在1600-1700cm-1，而酰胺基II的振动带是在1500-1550cm-1。在α-螺旋结构中，吸收带落在1650cm-1和1546cm-1处；而在无规则卷曲结构中，吸收带落在1655cm-1和1535cm-1处。可通过观察这些吸收带来分析所述二级结构。CD光谱测量使用聚氨基酸溶液，而红外吸收光谱测量还可使用粉末或膜状样品进行。
[0032]本文所述“具有对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物”是指所述的聚合物的某些基团被对疏水环境敏感的荧光染料所取代。本发明的“对疏水环境敏感的荧光染料”可被定义为“在血清或水之类的介质中，当染料周围的环境由亲水性变成疏水性时荧光强度增大的染料”。此外，在一个实施方式中，当本发明的对疏水环境敏感的荧光染料本身由高流动性状态变成低流动性状态时，其荧光强度也增大。
[0033]本文所述“具有聚氨基酸的聚合物”是指含一种或多种聚氨基酸和聚氨基酸衍生物的聚合物。本发明的聚氨基酸可被定义为“十个以上的氨基酸通过肽键连接而成的化合物”。“聚氨基酸衍生物”是指其中某些聚氨基酸或聚氨基酸的某些基团被取代的聚合物。
[0034]聚氨基酸衍生物的例子可包括、但不限于：侧链上有羟烷基氨基、磺烷基氨基和硬脂酰基的聚谷氨酸或聚天冬氨酸及羧基被部分修饰的聚赖氨酸中的至少一种。所述聚氨基酸衍生物的主链的重复单元可为与包含非氨基酸的单体的聚合物的共聚物。所述共聚物是嵌段共聚物、无规共聚物和接枝共聚物中的至少一种。
[0035]当使用本发明的聚合物检测大量异常位点(包括低度恶性肿瘤和炎症位点)时，可选择二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构的pH值≥5.7(例如pH值≥6.0)的聚合物。为避免在正常位点中的某些pH降低的区域检测到干扰，二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构的pH值优选低于6.9，例如低于6.5。
检测pH值变化的机理
[0036]可通过当本发明的聚合物接近存在于待检体内的检测对象(例如，pH值为约5.5的低pH位点)时观察所述聚合物周围pH值的降低和所述聚合物荧光强度的增大来实现利用本发明的聚合物检测pH值的变化。例如，可将以下机理用于检测。
[0037]在一个实施方式中，当本发明的聚合物接近检测对象(即具有低pH值的检测对象)时，所述聚合物周围的pH值降低。而这种pH值降低的结果导致了所述聚合物的二级结构发生了变化(即发生螺旋形变)。还可发生所述聚合物的缔合和凝集。结果，在至少一些对疏水环境敏感的荧光染料周围形成了疏水环境，且荧光染料自身的流动性降低。因此，由所述染料发出的荧光强度增大。换言之，由于荧光强度增大，从而可检测到pH值的降低。此外，由于伴随螺旋形变的缔合和凝集，本发明的聚合物的表观分子量也会增大，且其扩散率也会降低。结果，所述聚合物可相对易于停留在低pH值区域。
[0038]举例来说，当要检测活体内肿瘤或炎症的酸性位点时，可优选使用具有对疏水环境敏感的荧光染料和聚谷氨酸的聚合物。聚谷氨酸以无规则卷曲状态溶于水中的生理pH区(pH值约为7.4)，但在低pH值区，则发生螺旋形变(即构象变化)，且二级结构变成螺旋结构。如果pH值进一步降低，则所述聚谷氨酸不溶于水。因此，在生理pH区，对疏水环境敏感的荧光染料位于亲水性环境中，在所述环境中，所述染料与相对大量的水分子接触。另外，染料本身也具有相对高的流动性。结果，所述染料的荧光强度被抑制。与此相比，在低pH值区，推知聚谷氨酸为螺旋结构，且所述螺旋结构形成缔合体和凝集体。结果，对疏水环境敏感的荧光染料可位于在螺旋结构内或缔合体内形成的疏水环境中，且染料本身的流动性受到限制。结果，荧光强度增大，从而可检测到pH值的降低。换言之，在肿瘤或炎症位点(pH值：5-6)的荧光强度增大强于正常位点(pH值：约7.4)。因此，由于荧光强度增大，从而可检测所述肿瘤或炎症位点。换言之，由于本发明的聚合物的二级结构从无规卷曲结构变成螺旋结构，从而本发明的探针在pH值为5.5时的荧光强度高于其在pH值为7.4时的荧光强度。
[0039]可通过本领域已知的各种技术确认本文所述“对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高”中的“疏水性升高”，所述技术例如荧光测量和核磁共振光谱分析。在荧光测量中，可将对疏水环境敏感的荧光染料溶于各种极性溶剂，例如，水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、甲醇、氯仿和己烷中的一种或多种，并可观察到荧光变化的溶剂依赖性。例如，当对疏水环境敏感的荧光染料是苯胺基萘时，观察表明，在疏水性溶剂(如己烷)中，荧光波长移至短波区域且荧光强度增大；而在亲水性溶剂(如水)中，则荧光波长移至长波区域且荧光强度减弱。
[0040]可对结合有对疏水环境敏感的荧光染料的聚氨基酸的荧光强度进行测量。可由所得荧光强度和先前测定的荧光强度变化的溶剂依赖性来评价结合到聚氨基酸上的对疏水环境敏感的荧光染料周围的亲水性和疏水性。例如，结合有苯胺基萘的聚氨基酸的荧光强度增大表明，苯胺基萘周围的疏水性升高；而其荧光强度的减弱表明，苯胺基萘周围的疏水性降低。此外，还可通过观察在NMR光谱分析法中染料流动性的降低后NMR信号峰的增宽来评价染料周围的疏水性。因此，当染料周围的疏水性升高时，染料通过疏水相互作用凝集在一起，且染料的流动性降低。结果，所述染料的NMR信号峰增宽。
[0041]根据一个实施方式，可将在被检体中pH值约为5.5的环境中的荧光强度比pH值约为7.4的环境中高的聚合物用作本发明的聚合物。被检体的例子包括血清和水。
[0042]根据以上描述的信息，以下将描述本发明的实施方式的例子。
聚氨基酸
[0043]当本发明的聚合物具有聚氨基酸时，优选当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚氨基酸的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构的聚合物。从而，当5.5≤所述聚合物周围的pH值＜7.4时，所述聚氨基酸可具有可成为疏水性基团的基团；而当所述聚合物周围的pH值≥7.4时，所述聚氨基酸可具有可成为亲水性基团的基团。羧基是所述基团的一例。其中也可包括解离性基团，如氨基、胍基、苯基、咪唑基、磷酸基、巯基和砜基。可适宜选择这些基团的类型和含率，从而，当所述聚氨基酸周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
[0044]聚氨基酸的例子包括、但不限于：谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸和赖氨酸的均聚物中的至少一种(如谷氨酸均聚物(如聚谷氨酸)和天冬氨酸均聚物中的至少一种)。聚氨基酸也可包含多种上述均聚物。而且，在一个实施方式中可使用任意聚氨基酸，只要所述聚氨基酸周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。因此，可使用一种或多种无规聚合物，嵌段共聚物，接枝聚合物，其包括谷氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，组氨酸，精氨酸，酪氨酸等中的至少一种作为组成元素。
[0045]此外，在一个实施方式中，优选当pH值发生变化时聚氨基酸的二级结构发生改变的聚合物；且为具备水溶性及低粘性，所述聚氨基酸的数量平均分子量优选为20-1000。当其数量平均分子量小于20时，则聚氨基酸难以发生二级结构变化，同时，染料周围也难以形成疏水环境。
[0046]当在活体内使用本发明的聚合物和荧光探针时，它们可被存在于活体内的酶分解，因此，优选对活体的毒性或抗体活性少或无的聚合物和荧光探针。基于此观点，在一个实施方式中，优选具有良好的生物相容性，当5.5≤pH值＜7.4时其显示出螺旋形变，且聚合度在163-434的聚氨基酸。
[0047]从生物降解性的角度而言，在一个实施方式中，优选L型的上述氨基酸，但也可使用D型或L型和D型的混合物。还可使用非天然氨基酸。也可以延长聚合物在血液中的半衰期为目的而将非天然氨基酸或D型-氨基酸残基引入所述聚合物。
[0048]此外，也可将抗体，片段化的抗体或受体结合分子结合到本发明的聚合物上。这可使检测靶标更具特异性。
[0049]上述大量的聚氨基酸已商品化，本领域技术人员可容易购买和使用合适的聚氨基酸。此外，也可通过连续的肽液相合成法或肽固相合成法，或N-羧酸酐(NCA)法合成聚氨基酸。
对疏水环境敏感的荧光染料
[0050]上文已定义了本发明的对疏水环境敏感的荧光染料。在一个实施方式中，本发明的对疏水环境敏感的荧光染料少或无pH应答性。在此实施方式中，因为本发明的聚合物所含聚氨基酸具有pH应答性，如果对疏水环境敏感的荧光染料具有pH应答性，则难以进行调节以便本发明的聚合物在合适的pH值范围内显示出应答性。此外，当将本发明的聚合物在活体内用作荧光探针，并且体外观察其发出的荧光时，优选在近红外区有吸收波长和发射波长的对疏水环境敏感的荧光染料。而当将本发明的聚合物在活体内用作荧光探针，并且在活体内进行观察或将观测对象移出活体外进行观察时，优选在UV和可见光区有吸收波长和发射波长的对疏水环境敏感的荧光染料。
溶剂化荧光变色染料(solvatofluorochromic dyes)
[0051]在对疏水环境敏感的荧光染料中，溶剂化荧光变色染料为已知的荧光强度显著增大的染料。正如将在以下实施例中描述的那样，本发明的溶剂化荧光变色染料被定义为在DMF溶液(N，N-二甲基甲酰胺)中荧光强度比其在PBS(磷酸盐缓冲液)中的荧光强度高20倍以上的染料。
[0052]溶剂化荧光变色染料的例子包括、但不限于：苯胺基萘、尼罗红、丹磺酰(二甲基氨基萘璜酸)、硝基苯并噁二唑(nitrobenzoxadiazole)(NBD)、芘及它们的衍生物中的至少一种。在一个实施方式中，可选以下式(1)所示的苯胺基萘衍生物和以下式(2)所示的尼罗红衍生物。其中尤其优选例如，苯胺基萘基马来酰亚胺和经羟基修饰的尼罗红(DEAHB：9-二乙氨基-2-羟基-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮)。式(1)和(2)中的R代表结合的活性基团，如马来酰亚胺基和羟基。
Figure A20091016501600131
…(式1)
Figure A20091016501600132
…(式2)
对疏水环境敏感的荧光染料的结合
[0053]可通过已知的常规偶联方法将对疏水环境敏感的荧光染料结合到尚未结合对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物的某些基团上。例如，当所述基团为羧基时，可偶联具有对所述羧基显示出应答性的氨基、巯基和羟基中的至少一种的染料。当所述基团是氨基时，可偶联具有对所述氨基显示出应答性的下列基团的染料，所述基团选自羧基、磺酸基、羟基琥珀酰亚胺基、醛基、巯基，异硫氰酸基和缩水甘油基中的至少一种。当所述基团是羟基或巯基时，可偶联具有对所述基团显示出应答性的下列基团的染料，所述基团选自羧基、磺酸基、卤素、二硫基和马来酰亚胺基中的至少一种。
[0054]此外，聚合物与对疏水环境敏感的荧光染料的结合并不限于直接结合，也可通过例如合适的间隔分子进行结合。在一个实施方式中，可将双官能团短链烷烃(如二硫烷烃和二胺烷烃)、双官能团寡聚环氧乙烷链或酸酐用作间隔分子。一般情况下，所述间隔分子的一端基团可与聚合物的基团结合，而所述间隔分子的另一端基团可与染料的基团结合。聚合物与对疏水环境敏感的荧光染料间的结合以及所用间隔分子的类型并不仅限于上文所述，本领域技术人员可从各种结合方法和可用间隔分子中适宜选择。当将本发明的聚合物在活体内使用时，优选溶于水的聚合物。因此，在一个实施方式中，可以相对整个聚合物的聚合度为0.0005-0.03的比例导入式(1)和(2)所示对疏水环境敏感的染料。
末端残基
[0055]只要残基不抑制检测pH值变化的能力，可将任何残基结合到所述聚合物的末端基团上。例如，可结合由合成所述聚合物时使用的聚合起始剂和加帽剂决定的基团。当所述聚合物具有聚氨基酸时，聚氨基酸的N端可考虑例如一个或多个-H、-OCH3和-COCH3。而C端可考虑例如一个或多个-NH2、-OH、-NH(CH2)zCH3(其中Z代表2到5的整数)。
聚合物的例子
[0056]本发明的聚合物的实施方式的例子包括如以下式(3)和(4)所示聚合物。可通过向聚谷氨酸中引入苯胺基萘亚胺和经羟基修饰的尼罗红获得这些聚合物。其数量平均分子量(m+n)在50-1000的范围内，而染料修饰率n/(m+n)在0.0005-0.03的范围内。
Figure A20091016501600151
…(式3)
Figure A20091016501600152
…(式4)
水凝胶化
[0057]可通过分子间交联水凝胶化本发明的聚合物。例如，可通过使用多官能团交联剂结合所述聚合物的对疏水环境敏感的荧光染料之外的基团来进行水凝胶化。在一个实施方式中，可通过与所述聚合物和所述对疏水环境敏感的荧光染料的结合相同的方式进行所述结合。可将二胺化合物、二醇化合物和缩水甘油醚用作交联剂。可根据以下实施例中将要描述的本领域熟知的方法将本发明的聚合物塑型进纳米水凝胶颗粒中。例如，已知可使用反向胶束作为纳米反应场通过塑型方法来获得纳米水凝胶颗粒。交联反应和交联剂的类型并不限于上文的这些描述，本领域技术人员也可从各种合适的交联反应和交联剂中适宜选择。可将本发明的聚合物的纳米凝胶颗粒用作可抑制染料与蛋白质之类的杂质接触，并可由EPR效应实现高肿瘤滞留能力的pH应答性荧光探针。
本发明的聚合物的应用
[0058]在一个实施方式中，可将本发明的聚合物用作检测疾病相关异常pH值变化的荧光探针。例如，可将所述聚合物用作可对炎症或肿瘤部位(pH值约5-约6)的pH降低荧光敏感的荧光探针。还可用作可对高度恶性肿瘤部位(pH值约5.5)的pH降低荧光敏感的荧光探针。但本发明的探针的应用对象并不仅限于这些疾病。
[0059]在一个实施方式中，本发明的聚合物也可适于用作用于了解细胞内运输和蛋白质分解的机理的荧光探针。例如，可将所述聚合物用作可检测细胞内的内含体中的酸性环境，及跟踪胞吞作用的荧光探针。可将所述探针用于例如，细胞生物学领域。
实施例
[0060]将通过以下实施例描述使用聚谷氨酸(本发明的聚合物的一例)的例示化合物及其制备方法。可通过参考这些方法适宜修饰或改变起始材料、试剂及反应条件来相对易于制备荧光探针。需知，用于制备本发明的聚合物的方法并不限于以下实施例中的描述。
实施例1
聚合物的合成
实施例1-1
聚-L-谷氨酸的琥珀酰亚胺化
[0061]将共1g聚-L-谷氨酸的钠盐(PGA；分子量41,000，PeptideResearch Institute)溶于100ml蒸馏水中，然后进行搅拌同时滴加盐酸，脱盐的PGA沉淀。将所得脱盐的PGA用丙酮彻底洗涤，再用乙醚洗涤，然后真空干燥。然后将经洗涤和干燥的PGA(150mg)溶于1ml无水DMSO，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS；13.5mg)和1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺的盐酸盐(EDC；22.2mg)，然后在室温下振荡过夜。按相对全部COOH 10％的比例来进行琥珀酰亚胺化。此反应后，用无水丙酮进行再沉淀，以去除未反应的EDC以及NHS和EDC的反应产物——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)尿素。然后进行离心分离，并再通过倾注洗涤两次。然后通过用己烷洗涤、乙醚置换，及真空干燥而得到琥珀酰亚胺化的PGA。
实施例1-2
用苯胺基萘亚胺修饰琥珀酰亚胺化的PGA
[0062]将根据上述实施例1-1制备的琥珀酰亚胺化的PGA(150mg)溶于无水DMSO(5ml)。然后，向所述溶液混合N-(1-苯胺基萘基-4-)-马来酰亚胺(苯胺基萘亚胺：ANM)(21mg)和6-氨基-1-己硫醇(11mg)，加入经过夜搅拌的1.5ml DMSO溶液，并在室温下过夜避光搅拌。用丙酮再沉淀反应溶液，然后通过倾注洗涤两次。然后通过用己烷洗涤、乙醚置换，及真空干燥而得到136mg经苯胺基萘亚胺修饰的PGA(PGA-AN1)(产率90％)。通过测量所得PGA-AN1的吸光度(350nm)和苯胺基萘基(AN)确定了所述AN基团相对所述PGA的全部COOH的修饰率是0.006。所得PGA-AN1的结构式示于上式3。在此式中，m为316，且N为1.9。
[0063]也对根据实施例1-1制备的具有不同分子量的琥珀酰亚胺化的PGA使用相同方法用苯胺基萘基马来酰亚胺进行了修饰(PGA-AN2和PGA-AN3)。还制备了导入了约5倍量的苯胺基萘基马来酰亚胺的体系(PGA-AN4)。也制备了使用11-氨基-1-十一烷硫醇代替6-氨基-1-己硫醇的体系(PGA-AN5和PGA-AN6)。合成的PGA-AN1-PGA-AN6的分子量、聚合度、AN修饰率、接头的烷基链长度示于表1。
表1合成的聚合物及其AN修饰率
聚合物 分子量 聚合度(n+m) AN修饰率(n/n+m)   接头的烷基链长度
  PGA-AN1   41,000   318   0.006   6
  PGA-AN2   21,100   163   0.001   6
  PGA-AN3   56,000   434   0.0007   6
  PGA-AN4   41,000   318   0.027   6
  PGA-AN5   21,100   163   0.002   11
  PGA-AN6   56,000   434   0.006   11
实施例1-3
用9-二乙氨基-2-羟基-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮修饰琥珀酰亚胺化的PGA
[0064]将根据上述实施例1-1制备的琥珀酰亚胺化的PGA(150mg)溶于无水DMSO(5ml)，然后将20mg尼罗红衍生物9-二乙氨基-2-羟基-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(DEAHB)与上述溶液混合，并在室温下避光搅拌过夜。将反应液用丙酮再沉淀，并通过倾注洗涤两次。然后通过用己烷洗涤、乙醚置换，及真空干燥而得到116mg经DEAHB修饰的PGA(PGA-NR)(产率76％)。通过测量所得PGA-NR的吸光度(600nm)确定相对所述PGA的全部COOH的所述DEAHB基团的修饰率是0.002。所得PGA-NR的结构式示于上式4。在此式中，m为317，且N为0.6。
实施例1-4
水凝胶颗粒的制备
[0065]将共10mg的PGA-AN1溶于1ml蒸馏水中，并向所述溶液中加入0.1ml乙二醇缩水甘油醚(EGDGE)作为交联剂。随即加入200ml 0.05M的二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)的正己烷溶液，进行超声辐射，然后在室温下搅拌5天。然后用蒸发器去除溶剂，并进行过夜真空干燥。用丙酮/甲醇(9/1)洗涤3次，并进行乙醚置换，随后进行真空干燥。结果得到了PGA-AN1的水凝胶颗粒PGA-AN-Gel。将所得PGA-AN-Gel分散在水中，并通过0.45μm的过滤器过滤。通过动态光散射(DLS)法证实了形成的颗粒直径约是100nm。
实施例2
聚合物的评价
实施例2-1
对PGA-AN在水中的荧光强度的pH依赖性的测量
[0066]将共1ml PAG-AN1水溶液(1mg/ml)加入石英杯，并在室温下进行荧光测量。然后，用6N HCl和6N NaOH调节pH值。其激发波长为350nm，且测量了荧光强度呈440-470nm的最大荧光波长值。如图2的黑色圆点所示，当PAG-AN1水溶液的pH值发生变化时荧光强度发生变化。观察到荧光强度随着pH值的降低而增大。与此相比，在pH值≥7时，荧光强度没有改变。在pH值≤3时观察到探针沉淀。在pH值为4时的荧光强度相比pH值为7.4时的荧光强度增大了约10倍。作为比较例，图2中描绘了对单独染料(即苯胺基萘磺酸)在水中的荧光强度的pH依赖性的测量结果。如图2所示，未观察到荧光强度的pH依赖性。上述结果表明，有对疏水环境敏感的荧光染料(其为苯胺基萘基)被导入到聚谷氨酸的基团的荧光探针PAG-AN1在pH值＜7.4时表现出荧光强度增大。因此，可将所述探针用于检测pH值从生理pH值7.4的降低。
[0067]也同样测量了荧光探针PGA-AN2-PGA-AN6的荧光强度的pH依赖性。有关PGA-AN2和PGA-AN3的结果示于图6，有关PGA-AN4的结果示于图7，而有关PGA-AN5和PGA-AN6的结果示于图8。在全部情况下观察到荧光强度随着pH值的降低而增大。图9中显示了PGA-AN1-PGA-AN6的水溶液在pH7与pH5的荧光强度比及在pH7与pH4的荧光强度比。图9显示PGA-AN1、PGA-AN2和PGA-AN3表现出高于PGA-AN4、PGA-AN5和PGA-AN6的荧光强度比。认为分子量、AN修饰率和PGA骨架和AN基团间的烷基接头长度可影响在酸性区中的二级结构变化。
实施例2-2
对PGA-NR在水中的荧光强度的pH依赖性的测量
[0068]同实施例2-1中一样对PGA-NR的水溶液(浓度为1mg/mL)进行荧光测量。其激发波长为550nm，且测量了荧光强度呈600-660nm的最大荧光波长值。如图3所示，当PAG-NR水溶液的pH值发生变化时荧光强度发生变化。观察到荧光强度随着pH值的降低而增大。与此相比，在pH值≥7时，荧光强度没有改变。在pH值为4时的荧光强度相比pH值为7.4时的荧光强度增大了约2.4倍。因为DEAHB不溶于水，未进行单独染料的荧光测量。上述结果表明，有尼罗红衍生物(其为溶剂化荧光变色染料)被导入到聚谷氨酸的基团的荧光探针PAG-NR在pH值＜7.4时表现出荧光强度增大。因此，可将所述探针用于检测pH值从生理pH值7.4的降低。此外，与PGA-AN相比，其激发波长和荧光波长位于更长的波长侧(≥550nm)，发现这种荧光探针更适用于细胞和活体组织。
实施例2-3
对PGA-AN-Gel在水中的荧光强度的pH依赖性的测量
[0069]同实施例2-1中一样对PGA-AN-Gel的水溶液(浓度为1mg/mL)进行荧光测量。其激发波长为350nm，且测量了荧光强度呈440-470nm的最大荧光波长值。如图4所示，当PGA-AN-Gel水溶液的pH值发生变化时荧光强度发生变化。观察到荧光强度随着pH值的降低而增大。而在pH值为3时的荧光强度相比pH值为7.4时的荧光强度增大了约1.6倍。
[0070]上述结果证明，可将通过纳米水凝胶化PGA-AN而得到的荧光探针同未经水凝胶化的荧光探针一样用作可检测pH值从生理pH值7.4降低的荧光探针。
实施例2-4
对PGA-AN1在10％血清中的荧光强度的pH依赖性的测量.
[0071]同实施例2-1中一样对PGA-AN1的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(探针浓度为1mg/mL)进行荧光测量，所述溶液含有10％的胎牛血清(FCS)。其激发波长为350nm，且测量了荧光强度呈440-470nm的最大荧光波长值。如图1的黑色圆点所示，当PAG-NR水溶液的pH值发生变化时荧光强度发生变化。观察到荧光强度随着pH值的降低而增大。与此相比，在pH值≥7时，荧光强度没有改变。在pH值≤4.6时，观察到探针沉淀。在pH值为5时的荧光强度比pH值为7时的荧光强度增大了约4倍。作为比较例，图1中用白色圆点描绘了对单独染料(即苯胺基萘磺酸)的荧光强度的pH依赖性。如图1所示，未观察到荧光强度的pH依赖性。上述结果表明，可将有苯胺基萘基(其为溶剂化荧光变色染料)被导入到聚谷氨酸侧链上的聚合物PAG-AN1用作可甚至在10％的血清溶液中维持pH应答性功能的荧光探针。
实施例2-5
对PGA-AN1的荧光强度对血清浓度的依赖性的评价
[0072]通过测量PGA-AN1的荧光强度对血清浓度的依赖性来评价了PGA-AN1和血清蛋白的相互作用。将单独染料(即苯胺基萘磺酸)用作用于进行比较的低分子探针。此外，还将当环境酸化时荧光强度以pH依赖性方式升高的LysoSensorTM Blue DND-167(Invitrogen公司生产；激发波长为373nm，荧光波长为425nm)用作用于进行比较的低分子pH应答性探针。将各探针溶液加入含0、10％和100％FCS的PBS中，然后充分混匀以测量荧光强度。图5描绘了FCS浓度与经无血清PBS溶液中的荧光强度标准化的荧光强度间的关系。使用低分子探针时，荧光强度随着血清浓度的增大而增大。此荧光强度的增大显然是由所述探针与血清蛋白通过疏水相互作用结合所致。与此相比，PGA-AN1甚至在100％的FCS中都观察不到显著的荧光强度变化，这表明，PGA主链抑制染料和血清蛋白的相互作用。上述结果表明，在本发明的荧光探针中，多肽主链有两个作用：pH应答性和抑制染料-蛋白相互作用。
实施例3-1
本发明的溶剂化荧光变色染料的定义
[0073]将共七种荧光染料溶于DMF和PBS中，并测量它们的荧光强度，其中所述染料为：苯胺基萘磺酸镁(ANS)和苯胺基萘的衍生物——苯胺基萘亚胺(ANM)，尼罗红(NR)和尼罗红衍生物——9-二乙氨基-2-羟基-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(NROH)，Cy5、Cy5.5和LysoSensorTM Blue DND-167(LS)。所有染料均以0.3-1mM的DMSO溶液作为原液，并通过用PBS或DMF将其稀释1000倍而得到测量样品。样品浓度为：ANS为3μM，ANM、NR、NROH、Cy5和LS为1μM，且Cy5.5为0.6μM。激发坡长ex/荧光坡长emDMF、emPBS(均以nm表示)如下：ANS(ex350/em468、em520)、ANM(ex350/em456、em520)、NR(ex550/em622、em660)、NROH(ex550/em616、em659)、Cy5(ex650/em677、em665)、Cy5.5(ex678/em710、em690)及LS(ex373/em439、em429)。这些结果示于图10。如图所示，本发明的溶剂化荧光变色染料在DMF中的荧光强度比在PBS中的荧光强度高20倍以上。
[0074]这些实施例证明本发明提供了新型聚合物探针，当所述探针被置于pH值约为5.5的环境中时比被置于pH值约为7.4的环境中时具有更高的荧光强度，并且可产生相对高的荧光强度。
[0075]这些实施例也证明，可将本发明的聚合物和荧光探针用于相对精确检测高度恶性肿瘤位点(即pH值约为5.5的那些位点)。
[0076]虽然参照例示实施例描述了本发明，但应了解本发明不仅限于所公开的例示实施例。需对以下权利要求进行最款范围的阐释，以涵盖所有可能的修饰，等效结构和功能。

Claims (12)

1.具有对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物，其中当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4的范围内时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
2.具有对疏水环境敏感的荧光染料和聚氨基酸的聚合物，其中当所述聚氨基酸周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构，且所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性升高。
3.权利要求2的聚合物，其中所述聚氨基酸是聚谷氨酸。
4.权利要求1的聚合物，其中所述对疏水环境敏感的荧光染料是溶剂化荧光变色染料。
5.权利要求4的聚合物，其中所述溶剂化荧光变色染料是苯胺基萘、尼罗红、丹磺酰、硝基苯并噁二唑、芘和它们的衍生物中的至少一种。
6.用于检测活体病变位点的荧光探针，其包含权利要求1的聚合物。
7.权利要求1的聚合物，其中当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于6.9时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构。
8.权利要求2的聚合物，其中当所述聚合物周围的pH值降低至等于或大于5.5并小于6.9时，所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构。
9.含对疏水环境敏感的荧光染料的聚合物，其中当pH值为7.4时，所述聚合物的二级结构为无规则卷曲的机率比其为螺旋结构的机率高；而当pH值为5.5时，所述聚合物的二级结构为螺旋结构的机率比其为无规则卷曲的机率高。
10.含聚合物和对疏水环境敏感的荧光染料的荧光探针，其中所述探针在pH值为5.5时的荧光强度高于其在pH值为7.4时的荧光强度，这是由所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构所致。
11.权利要求10的荧光探针，其中所述聚合物包括糖链、聚氨基酸和它们的衍生物中的至少一种。
12.权利要求10的荧光探针，其中所述对疏水环境敏感的荧光染料周围的疏水性随着所述聚合物的二级结构由无规则卷曲变成螺旋结构而升高。
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