CN108066777A - 肿瘤靶向核磁共振-荧光超分子成像造影剂及制备和应用 - Google Patents

肿瘤靶向核磁共振-荧光超分子成像造影剂及制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向核磁共振‑荧光超分子成像造影剂及其制备和应用，该造影剂由水溶性的高分子骨架材料经过具有特异性结合功能的分子修饰后，与相应的配体分子通过主客体相互作用自组装形成的超分子纳米粒,其中配体分子修饰有成像功能的顺磁性物质以及近红外荧光染料。此种超分子成像造影剂能够靶向高表达特异性受体的肿瘤细胞，并具有核磁共振、荧光双重成像功能,可用于肿瘤切除手术术中的荧光引导定位及术后的核磁共振监测。

Description

肿瘤靶向核磁共振-荧光超分子成像造影剂及制备和应用
技术领域
本发明涉及影像学诊断领域,特别涉及一种肿瘤靶向自组装核磁共振-荧光双模态超分子成像造影剂及其制备方法，和其在肿瘤切除手术术中荧光引导定位及术后核磁共振监测中的应用。
背景技术
在癌症发生的早期，如果能迅速精确地检测出病变器官或组织的生理形态学变化，并给出相应的影像学信息，对癌症的早期诊断具有非常重大的意义。造影剂就是这样一类物质，通过注入到人体特定的组织或器官，使之与正常组织部位产生密度或其他差异，并将这些差异进行显影，从而提供关于疾病重要的临床信息。
核磁共振成像(Magnetic Resonance imaging，MRI)是利用体液或组织中水分子或富氢小分子的氢核在外加磁场及特定射频脉冲的作用下产生共振来成像的一种技术。临床上，对体内某一结构或器官内的异常病灶进行磁共振成像扫描检查时，为了增强异常病灶的显影效果，提高测试仪器的对病变组织的分辨率，往往通过静脉注射造影剂进行增强扫描成像。目前常用的磁共振造影剂-钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)弛豫率低、缺乏与肿瘤组织识别的特异性并且小分子造影剂在体内清除较快。因此，提高磁共振造影剂的肿瘤靶向能力以及弛豫效能，是增强核磁共振成像对比度的关键步骤。
近红外荧光成像(Near-infrared fluorescence imaging)以其成像灵敏、快速等优势广泛应用于医学和生物学领域。其方法是将具有由近红外波长的激发光照射能发出荧光的造影剂进行生物体成像，从而反应病变组织的生理学变化。近红外荧光造影剂的发射光位于近红外波段(600-900nm)，有效避开了内体水、有氧及无氧血红蛋白等主要组织的吸收波长，具有良好的生物组织穿透能力，并且对组织无损伤。临床常用的近红外荧光造影剂为吲哚菁绿ICG，是目前唯一一个被FDA批准认证可用于人体的近红外荧光染料，应用于心输出量、肝功能、眼底造影等方面的检测。但吲哚菁绿体内代谢速度快，光及热稳定性差，且无肿瘤特异性检测，使其应用受到限制。
随着分子影像学方法的不断发展，结合多种成像方式的双模态或多模态分子探针受到人们的青睐，这类探针可同时用于不同影像设备的检测，实现多种显像模式的优势互补，对于复杂疾病可以提供更为全面的诊断学信息，其中基于核磁共振成像及近红外成像的MRI/NIR双模态探针同时具有MRI高空间分辨率、NIR高灵敏度且成像迅速的特点，在医学诊断中具有非常重要的意义。
2003年美国马萨诸塞州总医院和哈佛医学院分子成像中心研究人员首次将近红外染料Cy5.5共价接枝到葡聚糖包裹Fe2O3磁性中心得到MRI/NIR双模态探针Cy5.5-CLIO，并用于小鼠脑部胶质瘤的适时定位监测(Kircher.M.F.et al.CANCER RESEARCH.2003,63,8122–8125)。然而，该探针的水合粒径为32nm，易聚集，且探针缺乏肿瘤靶向性。因此，迫切需要发展高弛豫率/高荧光效率、可特异性靶向肿瘤的MRI/NIR双模态探针，以克服现有技术的瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向自组装核磁共振-荧光双模态超分子成像造影剂及其制备方法，和其在肿瘤切除手术术中荧光引导定位及术后核磁共振监测中的应用。此造影剂具有较高的MRI弛豫率、NIR荧光效能以及肿瘤靶向识别能力，并且具有好的生物相容性。
本发明的技术方案如下：
一种肿瘤靶向自组装核磁共振-荧光双模态超分子成像造影剂，该造影剂由水溶性的高分子骨架材料经过具有特异性结合功能的分子修饰后，与相应的配体分子通过自组装形成的超分子纳米粒,其中配体分子修饰有成像功能的顺磁性物质以及近红外荧光染料。
所述造影剂为纳米粒，粒径范围为40-50nm，组装体中高分子骨架材料分子量为10000-20000Da,相应的配体材料分子量为500-1000Da，适合的pH值为6-8。
所述的水溶性的高分子骨架材料分子，结构式如下，
是由水溶性高分子与具有特异性结合能力的环糊精反应所得的产物，所得的水溶性的高分子骨架材料的分子量范围10000-20000Da。
所述的核磁共振成像配体分子，结构式如下，
是由顺磁性物质与金刚烷胺进行反应所得的产物，分子量范围500-1000Da。
所述的近红外荧光染料配体分子，结构式如下，
是由近红外荧光染料与金刚烷胺进行反应所得的产物，分子量范围500-1000Da。
水溶性的高分子骨架材料：核磁共振配体分子：近红外荧光染料配体分子：之间的摩尔比范围为10:0.25:0.25-10:1:1，优选摩尔比范围为10:0.5:0.5-10:1:1，最佳摩尔比范围10:0.8:0.8-10:1:1。
所述的水溶性的高分子骨架材料是由水溶性高分子与环糊精反应所得的产物；所述的核磁共振配体分子是由顺磁性物质与金刚烷胺进行反应所得的产物；所述的近红外荧光染料配体分子是由近红外荧光染料与金刚烷胺进行反应所得的产物。
所述的顺磁性物质是含有钆的造影剂；所述的近红外荧光染料为菁染料(Cyanine)、含四吡咯基团的近红外荧光染料、咕吨类荧光染料、方酸衍生物、噻嗪类和嗯嗪类近红外荧光染料、二氟化硼-二吡咯甲烷荧光染料中的一种；
顺磁性物质为Gd-DOTA或Gd-DTPA；近红外荧光染料为菁染料Cy系列荧光染料Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7。
本发明所述的水溶性高分子、顺磁性物质、近红外荧光染料可以选择市售购买，根据需要自行制备或者在其基础上进行改进，根据具体要求进行选择，以符合本发明所要制备造影剂的性能。
本发明所述造影剂的制备方法为：
步骤a)制备亲水性骨架材料：具有亲水性的高分子聚合物与环糊精反应得到亲水性骨架材料；
步骤b)制备核磁共振配体分子：顺磁性物质与金刚烷胺反应，得核磁共振配体分子；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料金刚烷胺反应，产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子；
步骤d)制备肿瘤靶向自组装核磁共振及近红外荧光双模态超分子成像造影剂：将亲水性骨架材料和核磁共振配体分子在水溶液中混合之后，加入含有近红外荧光染料配体分子的有机溶剂中，混合后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向自组装核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。
具体的制备方法为:
步骤a)制备亲水性骨架材料：具有亲水性的高分子聚合物与环糊精在水溶液中反应，透析得到水溶性骨架材料；
步骤b)制备核磁共振配体分子：顺磁性物质与金刚烷胺，在室温碱性条件下反应，真空干燥得核磁共振配体分子，所述碱为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),其加入量为顺磁性物质摩尔量的3-10倍；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料与金刚烷胺，碱性条件下,氮气保护60-90℃回流，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯；所述碱为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),其加入量为近红外荧光染料摩尔量的3-10倍；
步骤d)制备肿瘤靶向自组装核磁共振及近红外荧光双模态超分子成像造影剂：分别取亲水性骨架材料与核磁共振配体分子溶于水中，取近红外荧光染料配体分子溶于DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。
本发明提供一种制备方法，但并不限制于此方法的保护范围，具体为：
步骤a)制备亲水性骨架材料：透明质酸(HA)、壳聚糖、聚谷氨酸中的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下生成N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯，将乙二胺基-环糊精加入到上述活性酯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),室温条件下反应，透析，得到亲水性骨架材料。
步骤b)制备核磁共振配体分子：DOTA或DTPA中的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下生成N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯，将金刚烷胺加入到上述活性酯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),室温条件下反应，抽滤，石油醚或乙醚洗涤反应产物，真空干燥得到沉淀；三氟乙酸(TFA)作用下脱去顺磁性物质中羧基保护基，水溶液中加热条件下，与水合醋酸钆或氯化钆螯合后，真空干燥得核磁共振配体分子；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料与金刚烷胺分子溶于二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),氮气保护下60-90℃回流，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子；
步骤d)制备肿瘤靶向自组装核磁共振及近红外荧光双模态超分子成像造影剂：分别取亲水性骨架材料与核磁共振配体分子溶于水中，取近红外荧光染料配体分子溶于DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。
其中，步骤a)中室温条件下反应时间为24-48h；步骤b)中氮气保护下回流8-12h；步骤c)中室温条件下反应24-48h，步骤d)中，超声时间范围20-40min。
在本发明造影剂的制备过程中：水溶性高分子与环糊精的摩尔比范围为10:0.5-10:2；顺磁性物质与金刚烷胺的摩尔比范围为1:1-1:5；近红外荧光染料与金刚烷胺的摩尔比范围为1:5-1:10。
本发明的优点和有益效果为：
此种超分子成像造影剂能够靶向高表达特异性受体的肿瘤细胞，并具有核磁共振、荧光双重成像功能,可用于肿瘤切除手术术中的荧光引导定位及术后的核磁共振监测。
本发明肿瘤靶向自组装核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂，由经具有特异性结合能力的分子修饰的亲水性骨架材料与核磁共振配体分子、近红外荧光配体分子在水溶液中超声自组装形成的纳米结构，通过该方法得到的双模态探针粒径分布均一且有较好的稳定性。同时亲水性骨架材料能够与肿瘤细胞表面高表达受体特异性结合，可以有效实现靶向显影。此外，肿瘤靶向自组装核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂可用在肿瘤切除术中集术前磁共振诊断，术中荧光引导切除及术后核磁共振疗效评价等多重功能于一体，并能特异性识别高表达受体的肿瘤细胞，提高核磁共振成像及近红外荧光成像扫描的特异性及敏感性，可作为造影剂用于肿瘤切除手术术中荧光引导及术后核磁共振监测。
该肿瘤靶向自组装核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂具有高的弛豫率、优良的荧光性能，较低的毒副作用等特点，可以有效应用于活细胞的磁共振成像和荧光成像，有望进一步运用于活体成像。
附图说明
图1为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的透射电镜结果图；
图2为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的粒径分布图；
图3为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的水合粒径分布图；
图4为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的Zeta电位结果图；
图5为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的核磁共振成像结果图；
图6为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的弛豫率结果图；
图7为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂的吸收和发射光谱图；
图8为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂在MCF-7细胞和U87-MG细胞的荧光成像结果图，其中a,b,c,d为本超分子造影剂对CD44受体阳性MCF-7细胞的荧光成像能力图；e,f,g,h为本超分子造影剂对CD44受体阴性U87-MG细胞的荧光成像能力。
具体实施方式
下述实施例用于说明本发明，其中的原料为实验室制备，但并不影响本发明对权利要求所要保护的范围。
实施例1
肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光超分子成像造影剂制备：
(1)制备亲水性高分子骨架材料：取0.1013g的透明质酸(HA)加入10mL去离子水中，在0.0095g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和0.0059g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下活化30min，加入0.0147g乙二胺基-β-环糊精，室温条件下反应24h。然后加入到500Da的透析袋中，去离子水中透析48h，冻干得亲水性高分子骨架材料。
(2)制备核磁共振配体分子：取0.1018g三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于10mL二氯甲烷(DCM)，与0.026gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在0.1861g二环己基碳二亚胺(DCC)作用下室温活化2h，然后加入0.032g金刚烷胺，室温条件下搅拌反应12h，抽滤后用乙醚沉淀反应产物，真空干燥得乳白色粉末；再加入到10mL三氟乙酸(TFA)与DCM的混合液(体积比1:1)中，搅拌反应2h，反应液加入乙醚中立即有白色沉淀析出，真空干燥得白色粉末；将白色粉末在30mL水中复溶，同时加入0.0471g氯化钆，用0.1M的NaOH调溶液pH至5-6，90℃反应2h，真空干燥得核磁共振配体分子。
(3)制备近红外荧光染料配体分子：取16.75g三氯氧磷与2.499g环己酮溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和DCM的混合液(体积比1:1)中，80℃氮气保护下回流3h，反应产物在水中重结晶，真空干燥得中间产物1；取2.225g2,3,3-三甲基吲哚与1.875g碘丙酸溶于10mL甲苯中，100℃氮气回流3h，乙醚、丙酮混合液(体积比1:1)萃取反应产物，真空干燥得中间产物2；取中间产物1(0.532g)和2(2.204g)溶于12mL甲苯和DMF混合溶剂(体积比5；7)，160℃氮气保护下回流10h，反应产物在乙醚和水相(体积比1:1)中萃取，真空干燥得墨绿色固体近红外染料Cy7，取0.1997g Cy7与0.2084g金刚烷胺溶于10mLDMF中，加入192μL三乙胺，氮气保护下70℃回流8h，旋转蒸发出溶剂，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子。
(4)制备肿瘤自组装靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂：分别取50mg亲水性高分骨架材料与1.25mg核磁共振配体分子溶于1mL水中，取1.75mg近红外荧光染料配体分子溶于20μLDMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声40min即得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。其中，所用三种基元摩尔比为亲水性高分骨架材料：核磁共振配体分子：近红外荧光配体分子＝10:0.25:0.25。
实施例2
肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光超分子成像造影剂制备：
(1)制备亲水性高分子骨架材料：取0.100g的透明质酸(HA)加入10mL去离子水中，在0.0198g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和0.0115g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下活化30min，加入0.0294g乙二胺基-β-环糊精，室温条件下反应24h。然后加入到500Da的透析袋中，去离子水中透析48h，冻干得亲水性高分子骨架材料。
(2)制备核磁共振配体分子：取0.1018g三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于10mL二氯甲烷(DCM)，与0.026g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在0.1861g二环己基碳二亚胺(DCC)作用下室温活化2h，然后加入0.032g金刚烷胺，室温条件下搅拌反应12h，抽滤后用大量乙醚沉淀反应产物，真空干燥得乳白色粉末；再加入到10mL三氟乙酸(TFA)与DCM的混合液中(体积比：1:1)，搅拌反应2h，反应液加入乙醚中立即有白色沉淀析出，真空干燥得白色粉末；将白色粉末在30mL水中复溶，同时加入0.0629g水合醋酸钆，0.1M NaOH调溶液pH至5-6，90℃反应2h，真空干燥得核磁共振配体分子。
(3)制备近红外荧光染料配体分子：取实施例1中制备的0.1997g Cy7与0.2084g金刚烷胺溶于10mL DMF中，加入192μL三乙胺，氮气保护下70℃回流8h，旋转蒸发出溶剂，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子。
(4)制备肿瘤自组装靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂：分别取50mg亲水性高分骨架材料与2.5mg核磁共振配体分子溶于1mL水中，取3.5mg近红外荧光染料配体分子溶于20μL DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声40min即得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。其中，所用三种基元摩尔比为亲水性高分骨架材料：核磁共振配体分子：近红外荧光配体分子＝10:0.5:0.5。
实施例3
肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光双模态成像造影剂制备：
(1)制备亲水性高分子骨架材料：取0.1009g的透明质酸(HA)加入10mL去离子水中，在0.0389g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和0.0231g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下活化30min，加入0.0583g乙二胺基-β-环糊精，室温条件下反应24h。然后加入到500Da的透析袋中，去离子水中透析48h，冻干得亲水性高分子骨架材料。
(2)制备核磁共振配体分子：取0.1018g三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于10mL二氯甲烷(DCM)，与0.026g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在0.1861g二环己基碳二亚胺(DCC)作用下室温活化2h，然后加入0.032g金刚烷胺，室温条件下搅拌反应12h，抽滤后用大量乙醚沉淀反应产物，真空干燥得乳白色粉末；再加入到10mL三氟乙酸(TFA)与DCM的混合液中(体积比：1:1)，搅拌反应2h，反应液加入乙醚中立即有白色沉淀析出，真空干燥得白色粉末；将白色粉末在30mL水中复溶，同时加入0.0629g水合醋酸钆，0.1M NaOH调溶液pH至5-6，90℃反应2h，真空干燥得核磁共振配体分子。
(3)制备近红外荧光染料配体分子：取实施例1中制备的0.1997g Cy7与0.2084g金刚烷胺溶于10mL DMF中，加入192μL三乙胺，氮气保护下70℃回流8h，旋转蒸发出溶剂，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子。
(4)制备肿瘤自组装靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂：分别取50mg亲水性高分骨架材料与5mg核磁共振配体分子溶于1ml水中，取7mg近红外荧光染料配体分子溶于20μL DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声40min即得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。其中，所用三种基元摩尔比为亲水性高分骨架材料：核磁共振配体分子：近红外荧光配体分子＝10:1:1。
实施例4
造影剂的形貌与粒径分布表征：
实施例3制备的造影剂利用透射电镜表征其形貌和粒径分布。将样品溶液滴加至铜网上，在透射电子显微镜(Tecnai Spirit美国FEI)下观察，结果见图1和图2，显示本发明造影剂为不规则颗粒，分散均一，粒径为40±5nm。
实施例5
造影剂的水合粒径测定：
将实施例3和制备的造影剂利用激光粒度仪对其水合粒径进行测定。将样品溶液稀释后于激光粒度仪(Beckman-CoulterLS-100Q，美国)下测定，结果见图3，显示本发明造影剂的水合粒径为30±5nm，粒径分布较窄。
实施例6
造影剂的Zeta电位测定：
将实施例3制备的造影剂利用激光粒度仪对其Zeta进行测定。将样品溶液用生理盐水稀释后于激光粒度仪(Beckman-CoulterLS-100Q，美国)测定其Zeta电位。结果见图4，显示超分子造影剂的Zeta电位为-10mV左右。
实施例7
造影剂的核磁共振成像：
将实施例3和制备的造影剂利用核磁共振扫描仪对其核磁共振成像能力进行测定。将样品用水稀释成不同浓度，放入1.5ml EP管中，利用小动物核磁共振成像系统(MiniMR-Rat苏州纽迈科技)测定不同浓度造影剂的成像能力。结果见图5，图5为肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂的核磁共振成像结果图,显示实验组造影剂具有良好的核磁共振成像能力,随着造影剂浓度增加,核磁共振信号显著增强；
实施例8
造影剂的弛豫率测定：
将实施例3和制备的造影剂利用核磁共振扫描仪对其弛豫率进行测定。将样品用水稀释成不同浓度，放入1.5mlEP管中，利用核磁共振分析系统(NM12，苏州纽迈科技)测定不同浓度造影剂T1弛豫时间，然后计算造影剂的弛豫率(r1及r2)。结果见图6，图中直线1和直线2为实施例3制备的造影剂的横向弛豫和纵向弛豫，显示该造影剂的弛豫率分别为r1＝11.4mM-1s-1和r2＝13.3mM-1s-1。
实施例9
造影剂的吸收谱与荧光发射光谱测定：
将实施例3制备的造影剂利用紫外-可见分光光度计(UH5300，日本日立公司)测定其吸收光谱，利用荧光分光光度计系统(安捷伦科技公司，USA)测定其发射光谱。结果见图7，图中曲线1为本造影剂的吸收光谱,曲线2为本造影剂的发射光谱，具有良好的近红外成像性能、荧光性能。
实施例10
造影剂在体外细胞成像能力测定：
将实施例3制备的造影剂利用透明质酸受体CD44阳性细胞MCF-7细胞和CD44受体阴性细胞U87-MG细胞测定其肿瘤细胞靶向能力。所用肿瘤细胞在35mm的共聚焦小皿(105cell/皿)中培养48h后，加入1mL含有HA-CD的超分子纳米粒溶液(0.55mM[Gd])，37℃孵育4h，弃去培养基，PBS洗两遍，加入10μg/mL的Hoechst 33342核染液。孵育20min，弃去染液，PBS洗2遍。于共聚焦显微镜下对细胞进行荧光成像。结果见图8，其中,第一行为本超分子造影剂对CD44受体阳性MCF-7细胞的荧光成像能力；第二行为本超分子造影剂对CD44受体阴性U87-MG细胞的荧光成像能力。从图中可以看出MCF-7细胞表现出较强的荧光而U87-MG细胞荧光较弱，这可能是由于MCF-7细胞表面较高表达量的CD44受体，纳米粒通过受体介导的内吞作用进入细胞。综上，本发明肿瘤自组装靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂能够特异性的识别细胞表面高表达的CD44受体，具有较好的靶向识别成像能力。
以上所述实施例并不限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤靶向核磁共振-荧光超分子成像造影剂，其特征在于：该造影剂由水溶性的高分子骨架材料经过具有特异性结合功能的分子修饰后，与相应的配体分子通过主客体相互作用自组装形成的超分子纳米粒,其中部分配体分子修饰有成像功能的顺磁性物质、其余部分配体分子修饰有近红外荧光染料；所述的水溶性高分子骨架材料为具有亲水性的高分子聚合物，所述的具有特异性结合功的分子为环糊精，所述的相应的配体为金刚烷胺。
2.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于：所述的水溶性高分子骨架材料为具有亲水性的高分子聚合物，为透明质酸(HA)、壳聚糖、聚谷氨酸中的一种或二种以上，其分子量为10000-20000Da；
所述的具有特异性结合功能的分子为环糊精，其分子量为1000-1500Da；
所述的相应的配体分子为金刚烷胺，其分子量为100-200Da。
3.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述的顺磁性物质是含钆造影剂，为Gd-DOTA或钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)中的一种或二种；DOTA或DTPA为螯合剂，螯合时所用的含钆化合物为水合醋酸钆或氯化钆中的一种或二种。
4.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述的近红外荧光染料为菁染料(Cyanine)、含四吡咯基团的近红外荧光染料、咕吨类荧光染料、方酸衍生物、噻嗪类和嗯嗪类近红外荧光染料、二氟化硼-二吡咯甲烷荧光染料中的一种或二种以上；所述的菁染料为Cy系列荧光染料，包括Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7中的一种或二种以上。
5.根据权利要求4所述的造影剂，其特征在于，
亲水性的高分子聚合物与环糊精摩尔比例10：0.5-10：2；环糊精与金刚烷胺摩尔比例为1：1；顺磁性物质与金刚烷胺摩尔比例1：2；近红外荧光染料与金刚烷胺摩尔比例1：2。
6.一种权利要求1-5任一所述造影剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a)制备亲水性骨架材料：具有亲水性的高分子聚合物与环糊精反应得到亲水性骨架材料；亲水性的高分子聚合物与环糊精摩尔比例10：0.5-10：2；
步骤b)制备核磁共振配体分子：顺磁性物质与金刚烷胺反应，得核磁共振配体分子；顺磁性物质与金刚烷胺摩尔比例1：1；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料与金刚烷胺反应，产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子；近红外荧光染料与金刚烷胺摩尔比例1：1；
步骤d)制备肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光超分子成像造影剂：将亲水性骨架材料和核磁共振配体分子在水溶液中混合之后，加入含有近红外荧光染料配体分子的有机溶剂中，混合后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向自组装核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a)制备亲水性骨架材料：具有亲水性的高分子聚合物与环糊精在水溶液中反应，透析得到水溶性骨架材料；
步骤b)制备核磁共振配体分子：顺磁性物质与金刚烷胺，在室温碱性条件下反应，真空干燥得核磁共振配体分子，所述碱为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),其加入量为顺磁性物质摩尔量的3-10倍；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料与金刚烷胺，碱性条件下,氮气保护60-90℃回流，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和/或甲苯；所述碱为三乙胺和/或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),其加入量为近红外荧光染料摩尔量的3-10倍；
步骤d)制备肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光超分子成像造影剂：分别取亲水性骨架材料与核磁共振配体分子溶于水中，取近红外荧光染料配体分子溶于DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态成像造影剂。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
步骤a)制备亲水性骨架材料：透明质酸(HA)、壳聚糖、聚谷氨酸中的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下生成N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯，将乙二胺基-环糊精加入到上述活性酯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),室温条件下反应，透析，得到亲水性骨架材料；
步骤b)制备核磁共振配体分子：DOTA或DTPA中的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下生成N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯，将金刚烷胺加入到上述活性酯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),室温条件下反应，抽滤，石油醚或乙醚洗涤反应产物，真空干燥得到沉淀；三氟乙酸(TFA)作用下脱去顺磁性物质中羧基保护基，水溶液中加热条件下，与水合醋酸钆或氯化钆螯合后，真空干燥得核磁共振配体分子；
步骤c)制备近红外荧光染料配体分子：取近红外荧光染料与金刚烷胺分子溶于二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯中，同时加入三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(DIPEA),氮气保护下60-90℃回流，反应产物通过柱层析纯化，真空干燥得近红外荧光染料配体分子；
步骤d)制备肿瘤靶向核磁共振及近红外荧光超分子成像造影剂：分别取亲水性骨架材料与核磁共振配体分子溶于水中，取近红外荧光染料配体分子溶于DMSO中，将三种溶液混合之后充分搅拌，超声,既得肿瘤靶向核磁共振和近红外荧光双模态超分子成像造影剂；
步骤a)中室温条件下反应时间为24-48h；步骤b)中氮气保护下回流8-12h；步骤c)中室温条件下反应24-48h，步骤d)中，超声时间范围20-40min。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤d)自组装过程的pH值范围为6-8；经过具有特异性结合功能分子修饰后的高分子骨架材料与带有成像基团的配体分子的混合摩尔比例范围为10:0.5-10:2，带有成像基团的配体分子为摩尔比1：1的核磁共振配体分子和近红外荧光染料配体分子；所形成的超分子成像造影剂的粒径为40-50nm。
10.一种权利要求1-5任一所述造影剂的应用，所述造影剂为用于肿瘤切除手术术中的荧光引导定位中的造影剂或肿瘤切除手术后的核磁共振监测中的造影剂。
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