CN104758955A - 一种拥有多重刺激药物释放以及mri造影能力的超分子胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法，过层层自组装技术我们制备了一种四氧化三铁的微胶囊作为一种新型的多功能磁共振噪音以及药物治疗药剂。通过不同超分子聚合物的主客体作用以及库伦作用，药物分子通过非侵入性的紫外辐射印发的偶氮苯异构以及酸性响应的席夫碱从而被可控的释放出来。进一步的，通过封装超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒，磁靶向的MRI造影剂可以被获得。通过微酸性(pH＝5.6)的刺激，可以使得微胶囊的r2弛豫率相比中性条件(92.02mM-1S-1)提高37％到达125.71mM-1S-1。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法。
背景技术
癌症是目前全世界最严重的公共卫生问题之一，根据世界卫生组织的报告，在2020年前，有超过一千五百万的人会罹患癌症，并且每年其中三分之二的人会死亡。因为大部分的早期肿瘤目前都可以比较有效的被治疗，因此发展体内成像技术进行肿瘤诊断是十分重要的。磁共振成像(MRI)是一种通过检测不同部位的质子弛豫率不同的有效的对于肿瘤组织成像的医学影像学方法，并且造影剂的使用可以显著的增强其造影效果。但是，传统的基于钆类配合物的T1造影剂拥有较大的毒性并且十分昂贵。超顺磁性纳米四氧化三铁(SPION)是一种广泛使用的T2弛豫的造影剂。T2弛豫率可以被SPION周围的微环境的变化所影响，因此这类材料就拥有成为功能性造影剂的潜在价值。随着在MRI,CT,PET等医学影像学技术上取得的飞速进展，多重成像体系也显得尤为重要，因为他们可以对于病灶获得更多的信息。因此，基于SPION的多重影响系统例如荧光-MRI，MRI-光声成像以及MRI-CT成像体系日益引起人们的关注。进一步的，同时拥有MRI以及药物运输能力的体系也被人们所关注。
作为一种除了手术治疗以及放射治疗以为最有效的方法，化疗在临床上的应用仍然受到其有较大的副作用的限制。为了将高剂量的药物特异性的输送至肿瘤部位，药物载体(DDS)如聚合物胶束，囊泡，纳米球，水凝胶以及介孔硅等已经被研究。因为肿瘤部位的微酸性，高温度以及还原性微环境等的影响，许多拥有被动靶向能力的DDS被报道。Paul Ehrlichp等人提出魔弹概念以及MRI成像的功能在之前的报道之中均有提及。
如Avastin，Neocarzinostatin以及肿瘤坏死因子等的大分子抗肿瘤药物在之前已经引起了人们的广泛关注。近来，多重将光以及温度控制，MMP-2酶切等结合的体系已经有所报道，但是仍然鲜有文章报道三重响应(pH，光，磁性)的体系。
发明内容
本发明提供了一种拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法。通过层层自组装技术制备了一种四氧化三铁的微胶囊作为一种新型的多功能磁共振噪音以及药物治疗药剂。通过不同超分子聚合物的主客体作用以及库伦作用，药物分子通过非侵入性的紫外辐射印发的偶氮苯异构以及酸性响应的席夫碱从而被可控的释放出来。
本发明采用如下技术方案：
本发明的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法的具体步骤如下：
((1)乙二胺化的β-环糊精(EDA-β-CD)的制备：
将每10gβ-环糊精(β-CD)放入对应300mL0.4MNaOH的溶液中溶解，并对应将15g对甲基苯磺酰氯以1g/min的速率在冰浴下加入，在室温下高速搅拌约1h，过滤悬浮液之后滤液中加入盐酸调节PH到5-6，将合成的溶液放置与冰箱中沉淀过夜，过滤沉淀得到并用丙酮洗涤三次之后将得到的产物在60度下水中重结晶三次，在50度真空干燥箱中干燥48h,得到对甲基苯磺酰氯化的β-环糊精(TsO-B-CD)；
将每5.0g TsO-B-CD对应加入30mL的无水乙二胺中,反应在80度中进行12h，将溶液冷却至室温之后将溶液在甲醇之中沉淀，然后将沉淀溶重新溶解在水和醇的混合溶剂之中，沉淀溶解重复两次，然后充分洗涤产物，最后，将产物50度下真空干燥48h，得到白色粉末乙二胺化的β-环糊精；
(2)β-CD-g-Dex(O)的制备：
将每1.0g葡聚糖溶解在对应40mL的去离子水中，重复单元为6.28mmol，用N2将溶液净化30min。然后对应加入0.140g高碘酸钾，重复单元为0.628mmol,10％的葡萄糖单元，在25度的氮气保护环境下搅拌12h，用甲醇将溶液沉淀过滤得到白色沉淀，接着真空干燥24h，然后对应将0.5g氧化葡聚糖(PAD)，重复单元为3.09mmol，对应溶解在30mL的去离子水中，然后用氮气排除空气30min，之后，对应加入20mL的EDA-β-CD水溶液，PAD的重复单元为15％，在30度的氮气环境中搅拌24h，最后，将溶液在去离子水中渗析6天，截留分子量8000-12000，之后冻干3天，得到棕色β-CD-g-Dex(O)固体；
(3)β-CD-g-Dex(R)的制备：
将每0.5g的环糊精接枝葡聚糖溶解在40mL水中，之后对应加入1.9g的NaBH4反应，反应混合物在室温下搅拌48h,之后过滤去除不溶物在去离子水中渗析6天，截留分子量8000-12000，接着冻干3天，得到不含席夫碱的β-CD-g-Dex(R)，可以观察到棕色溶液变成无色溶液，即为β-CD-g-Dex(R)；
(4)金刚烷接枝的聚天冬氨酸的制备(AD-PASP)：
每15g的天冬氨酸和7.5g的磷酸被置于反应容器中，之后减压180度油浴加热2.5h，反应完成后将粗产物溶解在100mL的DMF中，并且将溶液滴加入水中，每5秒钟1滴，析出白色沉淀，之后过滤收集沉淀，用去离子水将沉淀洗涤两次之后在110℃真空干燥24h,得到聚琥珀酰亚胺；
每0.30g金刚烷胺盐酸盐溶解在10mL的DMF中，之后对应加入含1.0g聚琥珀酰亚胺的15mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，重复单元为10.3mmol，在氮气气氛下在70℃下搅拌24h，然后冷却至室温，向冰水浴中对应加入0.38g，20mL的氢氧化钠水溶液，加入速度为每20秒1滴，之后将悬浮液在室温下搅拌过夜，再用盐酸将pH调节到中性，接着在去离子水中渗析6天，冻干得到金刚烷接枝的聚天冬氨酸白色固体；
(5)偶氮苯接枝聚丙烯酸(Azo-g-PMAA)的制备：
将每1.61g对氨基偶氮苯和1.46mL三乙胺首先溶解在40mL的四氢呋喃中，之后对应将0.8mL丙烯酰氯在冰浴条件下滴加，之后室温时继续搅拌4小时，过滤反应液并用水洗涤三次，除去三乙胺盐酸盐以及反应去未反应的丙烯酰氯，减压蒸发溶剂并在真空器中干燥即可得到对氨基偶氮苯丙烯酰胺；
之后将每0.77g甲基丙烯酸和0.56g对氨基偶氮苯丙烯酰胺溶解在7.5ml的DMF中，对应加入100mg的AIBN作为引发剂，并在加热之前用氮气流置换空气20min,之后在氮气氛围下65℃搅拌24h，之后用氢氧化钠溶液洗涤沉淀，使得偶氮苯接枝聚甲基丙烯酸溶解在氢氧化钠溶液中，并向滤液中加入盐酸调节pH到8，之后将所得溶液过滤去除不溶物后在pH＝8的氢氧化钠水溶液中透析6天，截留分子量3500，然后冻干得到橙色固体偶氮苯接枝的聚甲基丙烯酸；
(6)层层自组装胶囊的制备：
层层自组装是以负载荧光素的碳酸钙纳米粒子为模板进行的，为了获得一个正电性的表面，每100mg的碳酸钙微球被分散在1ml浓度为1mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)溶液之中，这个乳液持续震荡15分钟来获得一层自组装膜，在完成了一层吸附之后，粒子通过4000转1分钟的离心分离，之后用2mL的去离子水洗涤三次；随后再将材料分散在1mg/ml的Azo-g-PMAA溶液之中，震荡15分钟之后离心并洗涤三次得到包覆了两层膜的材料；之后将材料再次分散于1mg/ml的β-CD-g-Dex(R)溶液之中，震荡15分钟后离心洗涤收集材料，在此之后，利用相同的方法，依次交替加入相同浓度的β-CD-g-Dex(R)与Azo-g-PMAA溶液各5次组装15分钟并离心洗涤，即可获得PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-Dex(R))5的多层膜结构；紧接着加入相同浓度的PAH将电势扭转为正，之后交替加入之后β-CD-g-Dex(O)与AD-PASP各三次，离心洗涤；随后再次加入1mg/ml的纳米四氧化三铁磁流体溶液，震荡20分钟之后离心洗涤至上清液无色透明；最后交替使用AD-PASP和β-CD-g-Dex(O)的溶液各组装四次，即可获得PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-Dex(R))5/PAH/AD-PASP/(β-CD-g-Dex(O)/AD-PASP)3/PAH/超顺磁纳米粒子磁流体/PAH/((AD-PASP/β-CD-g-Dex(O))2)的多层膜的自组装胶囊，在组装完成之后用0.4M的乙二胺四乙酸溶液洗涤复合胶囊三次除去碳酸钙的模板，然后用去离子水再洗涤胶囊两次，冻干后即获得所需产物胶囊。
步骤(1)中，水和醇的混合溶剂中水和醇的体积比为3:1。
步骤(6)中，所述的负载荧光素的碳酸钙纳米粒子的制备方法如下：将每0.5g的葡聚糖溶解在30ml的DMSO中，之后向溶液中对应加入15mg的异硫氰酸荧光素并在室温下搅拌24h，然后，在12-14kD透析袋中透析溶液，冻干后得到黄色粉末即为异硫氰酸荧光素接枝的葡聚糖；
之后将每0.228g K2CO3和10mg聚对苯乙烯磺酸钠(PSS)溶解在5mL水中，每0.183g CaCl2和5mg异硫氰酸荧光素接枝的葡聚糖溶解在5mL水中，之后向K2CO3溶液中加入CaCl2溶液并且剧烈搅拌30秒，将乳液静置2分钟，过滤收集碳酸钙微球，然后用去离子水与丙酮洗涤多次。
步骤(6)中，所述的纳米四氧化三铁磁流体的制备方法如下：将每13.10g的FeCl3.6H2O和6.65g的FeCl2.4H2O溶于80mL的去离子水之中，之后在氮气氛围下搅拌溶液0.5h后升温到80度，之后缓慢滴加45mL的NH3.H2O，同时观察到黑色纳米粒子的出现，80度反应半小时之后，对应加入15mL 0.5g/mL的柠檬酸水溶液，将温度上升至95℃之后继续搅拌90分钟，降温之后通过磁分离将纳米粒子用去离子水洗涤三次，之后透析3天去除杂质，得到了分散稳定的纳米四氧化三铁磁流体。
本发明的积极效果如下：
本发明的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊通过封装超顺磁性纳米四氧化三铁颗粒，磁靶向的MRI造影剂可以被获得。通过微酸性(pH＝5.6)的刺激，可以使得微胶囊的r2弛豫率相比中性条件(92.02mM-1S-1)提高37％到达125.71mM-1S-1。作为一种pH响应的负向MRI造影剂，拥有酸性微环境的肿瘤组织可以被很好的观察到。pH响应的fMRI造影剂在肿瘤微环境之中增加弛豫率从而可以获得更好的造影效果。细胞实验证明我们的载体控制释放药物的能力，磁靶向能力证明我们的材料可以被磁场在体内控制分布。结合体外实验以及体内实验的结果，证明这个体系可以承担输送大分子药物以及fMRI成像的任务。简单的合成方法，赋予了我们的材料好的生物相容性，超顺磁性以及药物输送的能力。基于此，这个材料可以很好的将将药物载体与医学影像学结合，拥有很好的临床应用潜力。
附图说明
图1中，左上图为碳酸钙微球的SEM图片，右上为纳米四氧化三铁的TEM图片，左下与右下为组装完成的微胶囊的TEM图片。
图2是所制得的微胶囊的利用振动样品磁强计所测得的磁滞回线。
图3是所得胶囊的释药曲线。
图4是所得材料的细胞毒性测试。
图5是材料的MRI测试，其中a图为材料在pH＝5.6的缓冲液下的弛豫时间测试，b图为材料在pH＝7.4条件下的弛豫时间测试。C图为材料在不同时间点的体内造影。
图6是材料的组织切片。其中a为磁靶向后的普鲁士蓝切片，b为无磁靶向的普鲁士蓝切片，c为磁靶向后的HE染色，d为无磁靶向的HE染色。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
1、材料
聚烯丙基胺盐酸盐(PAH，Mw～15000),异硫氰酸荧光素(FITC)从Sigma-Aldrich公司购买。盐酸金刚烷胺(AD),聚对苯乙烯磺酸钠(PSS,Mw～70000)从J&K百灵威购买。氯化钙(CaCl2),碳酸钾(K2CO3),β-环糊精(β-CD)，对甲基苯磺酰氯(P-TsCl),丙酮，甲醇，三乙胺(TEA)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，磷酸(H3PO4)，L-天冬氨酸，氢氧化钠(NaOH)，盐酸(HCl)，氨水从国药试剂公司购买。罗丹明B,葡聚糖(MW～70000)，甲基丙烯酸(MAA),硼氢化钠(NaBH4)，偶氮二异丁腈(AIBN)，六水合氯化铁(FeCl.6H2O)，四水合氯化亚铁(FeCl.4H2O)，高碘酸钾(KIO4)，乙二胺(EDA)，乙二胺四乙酸钠(EDTA)从阿拉丁公司购买。
2、本发明的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备
2.1乙二胺化的β-环糊精的制备
乙二胺化-β-环糊精(EDA-β-CD)是通过对甲基苯磺酰氯化的β-环糊精(TsO-B-CD)和乙二胺(EDA)反应合成的。合成方法如下：将10gβ-CD放入300mL0.4MNaOH的溶液中溶解并将15g对甲基苯磺酰氯以一个非常低的速率(1g/min)在冰浴下加入，在室温下高速搅拌约1h。过滤悬浮液之后滤液中加入盐酸调节PH到5-6，将合成的溶液放置与冰箱中沉淀过夜。过滤沉淀得到并用丙酮洗涤三次之后将得到的产物在60度下水中重结晶三次，在50度真空干燥箱中干燥48h,得到5.2g TsO-β-CD，其产率为32％。将5.0g前一步所得产物加入30mL的无水乙二胺中,反应在80度中进行12h。将溶液冷却至室温之后将溶液在甲醇之中沉淀。然后将沉淀溶重新溶解在(水和醇的体积比为3:1)的混合溶剂之中。沉淀溶解重复两次，然后充分洗涤产物。最后，将产物50度下真空干燥48h，得到2.4g白色粉末乙二胺化的β-环糊精，产率为48％。
2.2、β-CD-g-Dex的制备
氧化葡聚糖是通过高碘酸盐氧化葡聚糖合成的。将1.0g葡聚糖溶解在40mL的DI水中(重复单元为6.28mmol),用N2将溶液净化30min。然后，加入0.140g高碘酸钾(重复单元为0.628mmol,10％的葡萄糖单元)，在25度的氮气保护环境下搅拌12h。用甲醇将溶液沉淀过滤得到白色沉淀，接着真空干燥24h。然后将0.5g PAD(重复单元为3.09mmol)溶解在30mL的去离子水水中.然后用氮气排除空气30min。之后，加入20mL的EDA-β-CD(0.54g，PAD的重复单元为15％)水溶液。在30度的氮气环境中搅拌24h。因为希夫碱的形成，溶液变为黄色。同时β-CD通过PH敏感的化学键的形成接枝到葡聚糖上。最后，将溶液在去离子水中渗析(截留分子量8000-12000)6天，之后冻干3天，得到0.47g棕色β-CD-g-Dex固体，该反应的产率为31％。
2.3、席夫碱的还原反应
将0.5g的环糊精接枝葡聚糖溶解在40mL水中，之后加入1.9g的NaBH4反应反应混合物在室温下搅拌48h,之后过滤去除不溶物在去离子水中渗析(MWCO:8000-12000Da)6天接着冻干3天，得到不含席夫碱的β-CD-g-Dex。可以观察到棕色溶液变成无色溶液，即为为β-CD-g-Dex(R)。
2.4、金刚烷接枝的聚天冬氨酸的制备(AD-PASP)
15g的天冬氨酸和7.5g的磷酸被置于250mL的圆底烧瓶中，之后减压180度油浴加热2.5h。反应完成后将粗产物溶解在100mL的DMF中，并且将溶液滴加入水中(每5秒钟1滴)析出白色沉淀，之后过滤手机沉淀。用去离子水将沉淀洗涤两次之后在110℃真空干燥24h,得到9.5g的聚琥珀酰亚胺。0.30g金刚烷胺盐酸盐(1.55mmol,15％的PSI重复单元)紧接着溶解在10mL of DMF中，之后加入含1.0g聚琥珀酰亚胺的15mL N,N-二甲基甲酰胺溶液(重复单元为10.3mmol)。氮气气氛下在70℃下搅拌24h，然后冷却至室温。非常慢的向冰水浴中加入0.38g，20mL的氢氧化钠水溶液(大约每20秒1滴)，之后，将悬浮液在室温下搅拌过夜，之后用盐酸将pH调节到中性。接着在去离子水中渗析6天，冻干得到1.04g的金刚烷接枝的聚天冬氨酸白色固体。
2.5、偶氮苯接枝聚丙烯酸(Azo-g-PMAA)的合成
对氨基偶氮苯(1.61g,8mmol)和三乙胺(1.46mL,10.4mmol)首先溶解在40mL的四氢呋喃中。之后将丙烯酰氯(0.8mL,9.5mmol)在冰浴条件下缓慢滴加，之后室温时继续搅拌4小时。过滤反应液并用水洗涤三次，除去三乙胺盐酸盐以及反应去未反应的丙烯酰氯。减压蒸发溶剂并在真空器中干燥即可得到产物。
之后将0.77g甲基丙烯酸(9mmol)和0.56g对苯基偶氮苯丙烯酰胺溶解在7.5ml的DMF中，加入100mg的AIBN作为引发剂，并在加热之前用氮气流置换空气20min,之后在氮气氛围下65℃搅拌24h。因为偶氮苯拥有很强的疏水性，因此该反应产物可用水沉淀。之后用氢氧化钠溶液洗涤沉淀，使得偶氮苯接枝聚甲基丙烯酸溶解在氢氧化钠溶液中，并向滤液中加入盐酸调节pH到8左右。之后将所得溶液过滤去除不溶物后在pH＝8的氢氧化钠水溶液中透析(MWCO:3500Da)6天，然后冻干得到橙色固体偶氮苯接枝的聚甲基丙烯酸。
2.6、纳米四氧化三铁的制备
在250mL三口烧瓶中，将13.10g的FeCl3.6H2O和6.65g的FeCl2.4H2O溶于80mL的去离子水之中。之后在氮气氛围下搅拌溶液0.5h后升温到80度，之后缓慢滴加45mL的NH3.H2O，同时可以观察到黑色纳米粒子的出现。80度反应半小时之后，加入15mL 0.5g/mL的柠檬酸水溶液，将温度上升至95℃之后继续搅拌90分钟。降温之后通过磁分离将纳米粒子用去离子水洗涤三次。之后透析3天去除杂质，得到了分散稳定的纳米四氧化三铁磁流体。
2.7、负载荧光素的碳酸钙微球的制备
在50ml烧瓶中，将0.5g的葡聚糖溶解在30ml的DMSO中，之后向溶液中加入15mg的异硫氰酸荧光素并在室温下搅拌24h。然后，在12–14kD透析袋中透析溶液，冻干后得到黄色粉末即为荧光素接枝的葡聚糖。之后将0.228g K2CO3和10mg PSS溶解在5mL水中，0.183g CaCl2和5mg异硫氰酸荧光素溶解在5mL水中。之后向K2CO3溶液中加入CaCl2溶液并且剧烈搅拌30秒。将乳液静置2分钟，过滤收集碳酸钙微球。然后用去离子水与丙酮洗涤多次。
2.8、层层自组装胶囊的制备
层层自组装是以碳酸钙纳米粒子为模板进行的，为了获得一个正电性的表面，100mg的碳酸钙微球被分散在1ml(1mg/mL)的PAH溶液之中。这个乳液持续震荡15分钟来获得一层自组装膜。在完成了一层吸附之后，粒子通过4000转1分钟的离心分离，之后用2mL的去离子水洗涤三次。随后再将材料分散在1mg/ml的Azo-g-PMAA溶液之中，震荡15分钟之后离心并洗涤三次得到包覆了两层膜的材料。之后将材料再次分散于1mg/ml的β-CD-g-DexR溶液之中，震荡15分钟后离心洗涤收集材料。在此之后，利用相同的方法，依次交替加入相同浓度的β-CD-g-DexR与Azo-g-PMAA溶液各5次组装15分钟并离心洗涤，即可获得PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-DexR)5的多层膜结构；紧接着加入相同浓度的PAH将电势扭转为正，之后交替加入之后β-CD-g-DexO与AD-PASP各三次，离心洗涤；随后再次加入1mg/ml的磁流体溶液，震荡20分钟之后离心洗涤至上清液无色透明；最后交替使用AD-PASP和β-CD-g-DexO的溶液各组装四次，即可获得我们获得PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-DexR)5/PAH/AD-PASP/(β-CD-g-DexO/AD-PASP)3/PAH/超顺磁纳米粒子磁流体/PAH/((AD-PASP/β-CD-g-Dex(O))2)的多层膜的自组装胶囊。在组装完成之后用0.4M的乙二胺四乙酸溶液洗涤复合胶囊三次除去碳酸钙的模板。然后用去离子水再洗涤胶囊两次。冻干后即获得所需产物胶囊。
3、检测方法
3.1、不同刺激条件下的体外模拟释药
微胶囊的体外实验被分成四组并且每组有30mg的微胶囊。其中的两组被溶解在pH为7.4的4ml PBS之中，另外两组则被溶解在pH为5.6的4ml PBS之中。其中一组酸性组和一组中性组被暴露在365nm的紫外灯照射下，另外两组则避光。溶液被放置于透析袋之中，然后置于相同浓度以及pH的200ml缓冲液之中。每隔一段时间从外部缓冲液中取出4ml的溶液并补加4ml的缓冲液。通过测量取出溶液在543nm激发下的荧光强度，即可定量判断溶液浓度并计算出释药曲线。
3.2、材料的表征
PMAA-g-Azo,Dex-g-β-CD(O),Dex-g-β-CD(R),AD-PASP的化学结构可以用1H-NMR鉴定(UNITY INVOA 600MHz spectrometer(Varian,USA))。微胶囊，碳酸钙以及超顺磁纳米粒子被透射电镜(Tecnai G20,FEI Corp.,USA)和扫描电镜，荧光共聚焦显微镜(Nikon C1-si,Japan)所观察。微胶囊的铁含量通过原子分光光度计(Varian SpectrAA-240FS)测定。纳米四氧化三铁的表面状态通过FTIR进行表征(Perkin Elmer Spectrum)。胶囊的磁性质则通过振动试样磁力计(VSM,HH-15,China)表征。
3.3、细胞毒性测试
人源子宫癌细胞(HeLa)用含有10％胎牛血清和100U/mL双抗(1％的青霉素-链霉素10000U/mL)的DMEM培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养。微胶囊与细胞的共培养实验以HeLa细胞作为对象细胞进行。在96孔细胞培养板的每个孔中加入100μL含5000个细胞的细胞悬浮液，培养24h。然后细胞与设定浓度梯度的材料分别在7.4的含10％FBS的培养基中于37℃下共培养24h。培养结束后，移除孔中所有的溶液，然后加入200μL新鲜培养基和20μL MTT溶液(PBS，5mg/mL)，在培养箱中继续培养4h。小心移除孔中溶液，补入100μL DMSO溶解生成的紫色晶体，混匀，在酶标仪上记录(Multiskan GO,Thermo Fisher)每个孔在570nm的吸光度。细胞的相对存活率由公式算出：细胞相对存活率(％)＝(OD570(sample)/OD570(control))×100，其中OD570(control)是未加入材料时测定的吸光值，OD570(sample)是加入材料后测得的吸光值。OD值的测定基于4个独立平行样取平均值，结果表示为平均值±标准偏差(SD)。
3.4、微胶囊与细胞在不同条件下的共孵化
人源子宫癌细胞(HeLa)用含有10％胎牛血清和100U/mL双抗(1％的青霉素-链霉素10000U/mL)的DMEM培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养。微胶囊与细胞的共培养实验以HeLa细胞作为对象细胞进行。将HeLa细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，每孔加入1mL含有10％FBS和1％抗生素的DMEM培养基，然后在含5％CO2的培养箱中于37℃下培养24h。10mg包裹有(PASP-g-AD/Dex-g-β-CD)8的CaCO3微球用EDTA(0.4M，pH 7.4)溶核后分散于含有10％FBS和1％抗生素的DMEM培养基中，将此溶液平均分成四份，分别加入到细胞培养板中，分别以pH＝5.5，紫外光照；pH＝5.5，无光照；pH＝7.4紫外光照以及pH＝7.4无光照的条件下用含10％FBS的培养基于37℃下共培养4h后，弃去孔中的培养基并用1mL PBS清洗5次，之后用CLSM观察。
3.5、磁共振造影以及动物切片观察
为了检测胶囊的弛豫率，微胶囊的悬浮液首先被溶解在去pH为5.5以及7.4的缓冲液之中之中，然后加入1％(w/v)的琼脂糖溶液之中获得一个最终贴浓度从0到0.1mmol/L(Fe)的数个梯度组分。样品之后被放置在核磁管之中，通过小动物9.4T磁共振成像系统测量样品的弛豫时间。之后通过弛豫时间的倒数拟合计算出不同样品的弛豫率。
3.6、体内实验
体内MRI造影实验以KM小鼠作为实验动物。实验过程实现被湖北大学动物保护协会的允许。小鼠在以12.5mg Fe/kg的剂量注射微胶囊前后以及15分钟以及30分钟注射后被成像。
在以12.5mg Fe/kg的剂量给小鼠皮下注射微胶囊之后，磁铁被直接放置于小鼠肿瘤上方。在磁靶向48小时之后，小鼠被处死，解剖得肿瘤之后利用HE染色以及普鲁士蓝染色进行染色。
4、实验结果
4.1、Dex-g-β-CD,PASP-g-AD,Dex-g-β-CD(R)和PMAA-g-Azo、EDA-β-CD的合成
根据核磁共振的结果，出现在化学位移为4.9、2.4、2.6和3.1的峰归属于EDA-β-CD中4位和1位的氢质子。5到5.7之间没有峰则说明PAD里的醛基基团已经和EDA-β-CD全部反应。在4.8处的峰归属于1位的异头碳上的氢。在4.0到3.2间的三组峰显示的是2到6位的氢。化学位移4.7处的信号是水峰。从Dex-g-β-CD的紫外光谱我们可以发现，在还原反应之后，位于334nm的峰消失了这意味着C＝N键被全部被还原成C-N键。
4.2、四氧化三铁纳米粒子的合成
通过透射电镜，可以很容易地观测到直径小于10nm的单分散铁纳米颗粒。出现在3400nm左右的宽峰证明了铁纳米颗粒的表面已经被羧基修饰。铁纳米颗粒的表面电势是-18.8mV，这说明纳米四氧化三铁的表面被带有负电荷的柠檬酸所修饰。
4.3、微胶囊的构成和形态
微胶囊可以通过扫描电子显微镜(SEM)和投射电子显微镜(TEM)进行观察。从TEM中我们看到，在碳酸钙核移除后，微胶囊的壁就发生了坍塌。四氧化三铁纳米颗粒均匀地分散在壁上而因为铁纳米颗粒形状较大，并且在层与层形成的过程中可能发生团聚，所以导致微胶囊的表面比较粗糙。通过动态光散射，我们可以测量出未损坏胶囊水力学直径大约是3477nm。微胶囊的表面电势高达-34.5Mv,主要是因为PASP和PMAA都是聚阴离子，这种聚阴离子的积累给了微胶囊非常负的表面电势。
4.4、微胶囊的铁含量和磁靶向测试
根据原子吸收分光光度计的结果，基于铁元素在248.3nm的吸收峰，我们计算出样品铁含量是74.1mg/L，因而在我们微胶囊中铁的质量含量大约为5.7％。尽管只有一层四氧化三铁纳米颗粒被胶囊包裹，我们仍可以在体外用磁铁对于微胶囊进行靶向。在室温下通过震动样品磁强计进行测量,可以发现一个拥有超顺磁性的典型磁滞曲线，即在外部磁场存在条件下我们的材料也拥有较大的大磁矩，体现出了铁磁性的特点。但是当场强为零的时候磁矩消失，又体现出了顺磁性的特点并且尽管铁微粒被包裹在微胶囊中，微胶囊的饱和磁化量依旧高达18.94emu.
4.5、微胶囊的酸响应和光降解
在微胶囊的降解过程之中，在酸性条件的刺激下会出现絮状的沉淀物，这主要是因为强的非共价键作用，例如主客体作用和库仑力是高分子链相互交联并使得瓦解的材料成为一种类似于水凝胶的组合体。我们收集了第1、2、4、8、21、25、41h时的药物释放溶液。通过荧光分光仪测定在520nm的荧光激发峰，我们可以得到微胶囊的药物释放曲线。而利用超声波，我们可以破坏胶囊的结构从而使得模型药物完全得到释放从而测定载药量为0.4％。药物释放行为受酸性条件和光照影响很大。在没有紫外光照射的中性环境，胶囊中只有1.1％的药物在两小时内被释放。然而，当pH降到5.6的时候，有大约19％的药物被释放。当在中性条件下用紫外光刺激微胶囊，2％的药物在同等时间下被释放。然而如果同时利用紫外光和低pH进行刺激，药物很快地在两小时就释放了44％。因此我们发现紫外光和低pH都是控制我们的多功能微胶囊释放药物的有效刺激手段。但是，低pH刺激相比紫外线更加有效，这是因为当Dex-g-β-CD的碳氮双键被水解时，自由的环糊精分子被释放。因为自由环糊精相比负载在大分子上的环糊精拥有更大的主客体络合物离解常数，因此内层分子链上的环糊精将会被自由环糊精取代，这样就削弱了内层中层与层之间作用力。而当微胶囊的内外层都同时被光和pH刺激破坏时，药物可被更加快速的释放。这个现象肯定了我们的分子设计的合理性。
4.6、体外细胞毒性
为了测试微囊体的体外细胞毒性，我们对海拉细胞系做了MTT测试。这些细胞在不同的微胶囊浓度下培养了24h,在培养过程中我们观测到了良好的相容性，发现在90mg/L的浓度下细胞活性超过90％。这项结果说明我们的微胶囊在普通浓度下无毒。
4.7、在不同酸碱度下多重刺激微胶囊与细胞的共同培养
由于酸碱度和紫外光对微胶囊都有刺激作用，所以我们设计了四组实验来测试不同情况下它们的释放能力。将海拉细胞和微胶囊在37℃下共同培养四小时。因为药物从微胶囊中到进入细胞可以分为两步，第一步是药物从胶囊里释放，第二步是细胞胞吞药物。然而，由于模型药物分子量太大，所以第二步很难进行。但是共同培养后模型药物的荧光性依旧可见，在低酸碱度和紫外光下培养的海拉细胞在共焦荧光显微镜下比其它组有更多的绿荧光，这说明更多的模型药物被释放并在细胞中积累。在只有紫外光的和其它对照组，模型药物沉积较少。酸碱度刺激组比紫外光组有更多的模型药物这是因为自由环糊精分子可以和内部的偶氮苯接枝聚甲基丙烯酸结合去破坏微胶囊的结构。
4.8、体外弛豫性能测量
磁共振成像是一种重要的非侵入性的肿瘤成像手段。SPION自身有一种超顺磁性的特点。他的磁矩向量可以在外加磁场撤去后发生一个快速的弛豫，而这就是作为MRI负向造影剂所必须的条件之一。在MRI成像机理之中，类似于SPION的T2造影剂可以显著的降低信号强度并且使得改变水分子的自旋-自旋弛豫过程，因此产生了一个负向弛豫的效果。这类负向造影剂的效果可以通过r2弛豫率进行衡量，r2弛豫率是一个用来表征造影剂缩短水分子弛豫时间的物理参数。一台临床9.4T MRI仪被用来检测T2权重MRI中的弛豫率。
如图5所示。铁含量较小的组分表现出一种相对白色的MIR信号，并且随着铁含量的增加，图像的颜色变黑，这证明了我们的微胶囊有着增加质子弛豫率的能力。经过计算，在中性条件下，r2弛豫率为92.02mM-1S-1，但是在pH为5.6的酸性条件下，r2弛豫率显著的增强了37％到达了125.71mM-1S-1。因为肿瘤部位的pH相比正常组织要低，因此酸性响应的fMRI就提供了对于肿瘤进行更好成像的能力。这种pH响应的能力主要是由于聚电解质的质子化作用导致的。因为SPION处于一种富含羧基的微环境之中，在酸性条件下，羧基质子化从而与水分子之间重新形成氢键而使得水分子运动受阻，弛豫率因此得到提高。
为了进一步的去研究材料的T2权重MRI能力，昆明小鼠被皮下注射了SPION封装的微胶囊之后在不同的时间段进行成像。在注射之后，图像明显变黑，这是由于造影剂的造影效果导致的。因为肿瘤在T1以及T2权重造影之中都是有高信号强度的，因此亮白色可以被观察。在测试之中，一个明显的小的转移肿瘤可以在造影剂使用之后被发现。肿瘤之中微小的白点则是由于肿瘤部分坏死。
总的来说，得益于肿瘤快的代谢速度以及无氧呼吸特点乳酸以及碳酸等代谢产物聚集从而导致一个酸性的肿瘤微环境。在这一点上，这种低pH响应的fMRI造影剂就十分适用于肿瘤的检测。37％的弛豫率提升可以在体外实验中被很明显的发现，因此提供了一种酸性微环境的选择性成像方法。
4.9、体内磁靶向
影剂48h之后的普鲁士蓝以及HE染色结果如图6示。只有很少一部分的肿瘤被染成蓝色。然而，在磁靶向组的小鼠之中，更多的蓝色斑点可以被观察到，这是由于磁靶向使得微胶囊更多的聚集在肿瘤内部。这种磁靶向能力提供了一个非侵入的方法将微胶囊聚集在肿瘤内部。因为大部分原发性肿瘤侵入性以及转移性规律已经被人们所研究，因此磁靶向是一种有潜力对原发性与转移性肿瘤进行治疗的靶向手段。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)乙二胺化的β-环糊精(EDA-β-CD)的制备：
将每10gβ-环糊精(β-CD)放入对应300mL0.4MNaOH的溶液中溶解，并对应将15g对甲基苯磺酰氯以1g/min的速率在冰浴下加入，在室温下高速搅拌约1h，过滤悬浮液之后滤液中加入盐酸调节PH到5-6，将合成的溶液放置与冰箱中沉淀过夜，过滤沉淀得到并用丙酮洗涤三次之后将得到的产物在60度下水中重结晶三次，在50度真空干燥箱中干燥48h,得到对甲基苯磺酰氯化的β-环糊精(TsO-B-CD)；
将每5.0g TsO-B-CD对应加入30mL的无水乙二胺中,反应在80度中进行12h，将溶液冷却至室温之后将溶液在甲醇之中沉淀，然后将沉淀溶重新溶解在水和醇的混合溶剂之中，沉淀溶解重复两次，然后充分洗涤产物，最后，将产物50度下真空干燥48h，得到白色粉末乙二胺化的β-环糊精；
(2)β-CD-g-Dex(O)的制备：
将每1.0g葡聚糖溶解在对应40mL的去离子水中，重复单元为6.28mmol，用N2将溶液净化30min；然后对应加入0.140g高碘酸钾，重复单元为0.628mmol,10％的葡萄糖单元，在25度的氮气保护环境下搅拌12h，用甲醇将溶液沉淀过滤得到白色沉淀，接着真空干燥24h，然后对应将0.5g氧化葡聚糖(PAD)，重复单元为3.09mmol，对应溶解在30mL的去离子水中，然后用氮气排除空气30min，之后，对应加入20mL的EDA-β-CD水溶液，PAD的重复单元为15％，在30度的氮气环境中搅拌24h，最后，将溶液在去离子水中渗析6天，截留分子量8000-12000，之后冻干3天，得到棕色β-CD-g-Dex(O)固体；
(3)β-CD-g-Dex(R)的制备：
将每0.5g的环糊精接枝葡聚糖溶解在40mL水中，之后对应加入1.9g的NaBH4反应，反应混合物在室温下搅拌48h,之后过滤去除不溶物在去离子水中渗析6天，截留分子量8000-12000，接着冻干3天，得到不含席夫碱的β-CD-g-Dex(R)，可以观察到棕色溶液变成无色溶液，即为β-CD-g-Dex(R)；
(4)金刚烷接枝的聚天冬氨酸的制备(AD-PASP)：
每15g的天冬氨酸和7.5g的磷酸被置于反应容器中，之后减压180度油浴加热2.5h，反应完成后将粗产物溶解在100mL的DMF中，并且将溶液滴加入水中，每5秒钟1滴，析出白色沉淀，之后过滤收集沉淀，用去离子水将沉淀洗涤两次之后在110℃真空干燥24h,得到聚琥珀酰亚胺；
每0.30g金刚烷胺盐酸盐溶解在10mL的DMF中，之后对应加入含1.0g聚琥珀酰亚胺的15mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，重复单元为10.3mmol，在氮气气氛下在70℃下搅拌24h，然后冷却至室温，向冰水浴中对应加入0.38g，20mL的氢氧化钠水溶液，加入速度为每20秒1滴，之后将悬浮液在室温下搅拌过夜，再用盐酸将pH调节到中性，接着在去离子水中渗析6天，冻干得到金刚烷接枝的聚天冬氨酸白色固体；
(5)偶氮苯接枝聚丙烯酸(Azo-g-PMAA)的制备：
将每1.61g对氨基偶氮苯和1.46mL三乙胺首先溶解在40mL的四氢呋喃中，之后对应将0.8mL丙烯酰氯在冰浴条件下滴加，之后室温时继续搅拌4小时，过滤反应液并用水洗涤三次，除去三乙胺盐酸盐以及反应去未反应的丙烯酰氯，减压蒸发溶剂并在真空器中干燥即可得到对氨基偶氮苯丙烯酰胺；
之后将每0.77g甲基丙烯酸和0.56g对氨基偶氮苯丙烯酰胺溶解在7.5ml的DMF中，对应加入100mg的AIBN作为引发剂，并在加热之前用氮气流置换空气20min,之后在氮气氛围下65℃搅拌24h，之后用氢氧化钠溶液洗涤沉淀，使得偶氮苯接枝聚甲基丙烯酸溶解在氢氧化钠溶液中，并向滤液中加入盐酸调节pH到8，之后将所得溶液过滤去除不溶物后在pH＝8的氢氧化钠水溶液中透析6天，截留分子量3500，然后冻干得到橙色固体偶氮苯接枝的聚甲基丙烯酸；
(6)层层自组装胶囊的制备：
层层自组装是以负载荧光素的碳酸钙纳米粒子为模板进行的，为了获得一个正电性的表面，每100mg的碳酸钙微球被分散在1ml浓度为1mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)溶液之中，这个乳液持续震荡15分钟来获得一层自组装膜，在完成了一层吸附之后，粒子通过4000转1分钟的离心分离，之后用2mL的去离子水洗涤三次；随后再将材料分散在1mg/ml的Azo-g-PMAA溶液之中，震荡15分钟之后离心并洗涤三次得到包覆了两层膜的材料；之后将材料再次分散于1mg/ml的β-CD-g-Dex(R)溶液之中，震荡15分钟后离心洗涤收集材料，在此之后，利用相同的方法，依次交替加入相同浓度的β-CD-g-Dex(R)与Azo-g-PMAA溶液各5次组装15分钟并离心洗涤，即可获得PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-Dex(R))5的多层膜结构；紧接着加入相同浓度的PAH将电势扭转为正，之后交替加入之后β-CD-g-Dex(O)与AD-PASP各三次，离心洗涤；随后再次加入1mg/ml的纳米四氧化三铁磁流体溶液，震荡20分钟之后离心洗涤至上清液无色透明；最后交替使用AD-PASP和β-CD-g-Dex(O)的溶液各组装四次，即可获得
PAH(Azo-g-PMAA/β-CD-g-Dex(R))5/PAH/AD-PASP/(β-CD-g-Dex(O)/AD-PASP)3/PAH/超顺磁纳米粒子磁流体
/PAH/((AD-PASP/β-CD-g-Dex(O))2)的多层膜的自组装胶囊，在组装完成之后用0.4M的乙二胺四乙酸溶液洗涤复合胶囊三次除去碳酸钙的模板，然后用去离子水再洗涤胶囊两次，冻干后即获得所需产物胶囊。
2.如权利要求1所述的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，水和醇的混合溶剂中水和醇的体积比为3:1。
3.如权利要求1所述的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的负载荧光素的碳酸钙纳米粒子的制备方法如下：将每0.5g的葡聚糖溶解在30ml的DMSO中，之后向溶液中对应加入15mg的异硫氰酸荧光素并在室温下搅拌24h，然后，在12-14kD透析袋中透析溶液，冻干后得到黄色粉末即为异硫氰酸荧光素接枝的葡聚糖；
之后将每0.228g K2CO3和10mg聚对苯乙烯磺酸钠(PSS)溶解在5mL水中，每0.183g CaCl2和5mg异硫氰酸荧光素接枝的葡聚糖被溶解在5mL水中，之后向K2CO3溶液中加入CaCl2溶液并且剧烈搅拌30秒，将乳液静置2分钟，过滤收集碳酸钙微球，然后用去离子水与丙酮洗涤多次。
4.如权利要求1所述的拥有多重刺激药物释放以及MRI造影能力的超分子胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的纳米四氧化三铁磁流体的制备方法如下：将每13.10g的FeCl3.6H2O和6.65g的FeCl2.4H2O溶于80mL的去离子水之中，之后在氮气氛围下搅拌溶液0.5h后升温到80度，之后缓慢滴加45mL的NH3.H2O，同时观察到黑色纳米粒子的出现，80度反应半小时之后，对应加入15mL0.5g/mL的柠檬酸水溶液，将温度上升至95℃之后继续搅拌90分钟，降温之后通过磁分离将纳米粒子用去离子水洗涤三次，之后透析3天去除杂质，得到了分散稳定的纳米四氧化三铁磁流体。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20180921 Termination date: 20200326 |
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