CN114751907A - 一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法和用途，其结构式如下：
其中，M独立地选自H、Na和K。本发明通过利用有机全合成的方法制备了叶酸及其衍生物为主动靶向基团的主动靶向近红外荧光小分子。这种主动靶向近红外荧光分子具有主动靶向性高、特异性强，水溶性好和荧光量子产率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及近红外手术导航荧光分子及细胞标记成像等领域，具体涉及一种主动靶向近红外荧光小分子及其制备方法和用途。
背景技术
吲哚菁绿(Indocyanine green，ICG)是一种亲水性荧光示踪剂，其分子量约为776Da。在被用于荧光示踪之前，其还广泛的应用于肝功能的评估、心输出量的评估以及眼底血管造影。在波长780nm的近红外荧光的照射下其能发出波长为820nm的荧光，具备良好的穿透性，一些深层的组织都能利用ICG进行荧光探测。当ICG进入血液后，能迅速与血浆蛋白结合，形成蛋白包裹的ICG纳米分子，能够通过EPR效应在肿瘤组织中富集并且被网状内皮吞噬系统吞噬，从而参与肿瘤显影及淋巴结示踪。另外，研究显示ICG并不会提升患者短期及长期并发症的风险，生物安全性高。因此，利用ICG不仅能够实现非侵袭性的深部血管、淋巴管造影，还能用于即时的外科手术术中荧光示踪。但是根据文献报道近年在大量临床及动物活体实验所观察的结果，作为肿瘤荧光示踪剂，ICG还存在以下问题：
1)低荧光发射效率(量子产率在水溶液中<1％)，对设备灵敏度要求高。根据我国药监法规，人体ICG最大注射剂量应小于2mg/kg，在此剂量下，文献报道和我们自己检测数据发现，ICG在人体肿瘤的浓度在10-1000nM，而目前大多数设备有效检测范围在10-1000μM，两者相差1000倍。
2)临床实践中发现ICG在肿瘤及正常组织的代谢速率差别不大，至少需要等待12小时后才能产生足够的荧光对比度(肿瘤：正常组织)，增加了医院及病人的负担。
由此可见，研制高荧光量子产率、具有主动肿瘤靶向性、在正常组织可快速清除的新一代荧光示踪剂，可以弥补ICG在实际使用中的不足，具有很高的科研及临床应用价值。有研究表明叶酸受体在多种恶性肿瘤细胞表面或肿瘤组织新生血管内皮细胞上具有较高水平的表达，例如肺癌、卵巢癌及乳腺癌等，而正常组织的细胞或成熟血管内皮细胞则表达很少。靶向肿瘤组织高表达的叶酸受体或可实现药物的精准递送。目前叶酸分子作为一种成熟、安全的靶向基团能够同细胞表面的叶酸受体紧密结合。通过细胞膜介导的内吞作用，进入肿瘤细胞内部，特异性靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞和组织。叶酸及其衍生物在保证其良好靶向性的同时具备更佳的体内稳定性，在近红外荧光小分子的修饰中具备更大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法和用途，利用有机全合成的方法制备叶酸及其衍生物为主动靶向基团的主动靶向近红外荧光小分子。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子，其结构式如下：
其中，M独立地选自H、Na和K。
一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，S0456的合成，包括以下步骤：
步骤S11，将1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚、浓硫酸混合加热回流，在乙酸乙酯中沉淀后，以灰色固体的形式过滤和收集粗产物，所得产物溶解在甲醇中，溶解液滴加入以氢氧化钾和异丙醇的溶液中，粗混合物过滤洗涤，得到产物棕色固体，即为化合物1；
步骤S12，将化合物1和1,4-丁磺酸内酯在氮气氛加入甲苯溶液中加热反应，将混合料冷却至室温，粗产物析出，将粗混合物中加入甲醇搅拌；沉淀，过滤，收集，重新在水和甲醇的混合物中溶解，用滴液漏斗将混合溶液加入乙腈中；沉淀物被过滤并收集为粉红色固体产物，即为化合物2；
步骤S13，将化合物2、Vilsmeier-Haack试剂和无水乙酸钠在无水乙醇中，在氮气气氛下回流加热6-8h，反应混合物冷却至室温，然后过滤，用乙醇和甲醇洗涤，收集为绿色固体产物，即为化合物3；
步骤S2，叶酸衍生物的合成；包括以下步骤：
步骤S21，将叶酸水解酸溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-叔丁基-L-酪氨酸叔丁基酯盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)依次加入容器中，搅拌至完全溶解，氮气保护，反应，将反应后的溶液滴加在HCl溶液，产生淡黄色沉淀，干燥，得固体产物，即为化合物4；
步骤S22，将化合物4放入容器中，加入三氟乙酸，搅拌，加入甲基叔丁基醚中，沉淀过滤，真空干燥，得到化合物5；
步骤S3，F808的制备；包括以下步骤：
步骤S31，向化合物3的水溶液中，滴加叶酸衍生物三阴离子溶液；
步骤S32，将步骤S31所得的反应混合物的升温，搅拌，并通过TLC监测产物的形成；
步骤S33，产物形成完成后，将反应混合物冷却至室温，并通过套管作为稳定流转移至搅拌的丙酮中，得到绿色沉淀；
步骤S34，沉淀物在抽气机真空下在烧结漏斗上过滤，用丙酮洗涤；
步骤S35，将绿色粉末状固体干燥，获得产物F808；
所述步骤S11中，加热到120℃在氮气氛下回流16-20h。
所述步骤S12中，加热温度100-120℃，时间72h，搅拌30分钟，水和甲醇的混合物中，水和甲醇的体积比为2:1。
所述步骤S13中，加热温度为65℃，时间为6-8h。
所述步骤S21中，反应温度为室温，时间为25-35min。
所述步骤S22中，搅拌时间为两小时。
所述步骤S31中，在18-28℃下向化合物3的水溶液中，滴加pH 10-12的叶酸衍生物三阴离子溶液。
所述步骤S32中，温度升至85-95℃，搅拌40-55分钟。
所述主动靶向叶酸受体近红外荧光分子在制备肿瘤手术导航成像及医学细胞标记的试剂中的用途。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明的一种主动靶向近红外荧光分子的制备方法，利用有机全合成的方法制备了叶酸及其衍生物为主动靶向基团的主动靶向近红外荧光小分子。这种主动靶向近红外荧光分子具有主动靶向性高、特异性强，水溶性好和荧光量子产率高等优点，在肿瘤手术导航成像及医学细胞标记领域具有巨大的发展潜力。
附图说明
图1是制备主动靶向近红外荧光分子的合成流程图；
图2是F808荧光性能图；
图3近红外荧光分子3质谱图；
图4叶酸衍生物的质谱图；
图5终产物F808的质谱图；
图6是F808主动靶向叶酸受体高表达细胞H1299；
图7是F808主动靶向叶酸受体高表达肿瘤H1299共聚焦成像效果图；
图8是术中活体成像效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明以
为母体，结构上通过酪氨酸将荧光分子3和叶酸连接在一起最终形成主动靶向近红外荧光分子。M独立地选自H、Na和K。
本实施例中，以如下结构式为例：
其合成步骤如下：
如图1所示，本发明的主动靶向近红外荧光分子的合成流程，包括以下步骤：
荧光分子3的合成：
(1)将1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚(1g，4.78mmol)、浓硫酸8ml混合加热到120℃在氮气氛下回流16-20h，在乙酸乙酯中沉淀后，以灰色固体的形式过滤和收集粗产物，所得产物溶解在甲醇10mL中，在温和的条件下，溶解液滴加至氢氧化钾(267mg，4.78mmol)的异丙醇10mL的溶液中，粗混合物过滤洗涤，得到产物棕色固体，即为化合物1。产率97％，其结构式如下：
(2)将化合物1(950mg，2.9mmol)和1,4-丁磺酸内酯(1.1g，8.2mmol)在氮气氛加入甲苯溶液中加热110℃，48h。将混合料冷却至室温，溶剂析出。在粗混合物中加入甲醇(10mL)搅拌30分钟，粗混合物过滤，收集，在2:1(v/v)水混合物中溶解(10mL)和甲醇(50mL)。用滴液漏斗将混合溶液慢慢加入乙腈(160mL)中。沉淀物被过滤并收集为粉红色固体，即化合物2，产率40％，其结构式如下：
(3)将化合物2(1.5g，3.24mmol)、Vilsmeier-Haack试剂(2.1g，6.5mmol)和无水乙酸钠(0.64g，7.8mmol)在20mL的无水乙醇中，在氮气气氛下回流加热65℃，6h。反应混合物冷却至室温，然后过滤，用乙醇和甲醇洗涤，收集为棕绿色固体，即化合物3，产率90％，其结构式如下：
(4)将叶酸水解酸(1.1g，3.52mmol)溶于DMF中，搅拌至溶解，将HATU(2.007g，5.28mmol)O-叔丁基-L-酪氨酸叔丁基酯盐酸盐(1.161g，3.52mmol)DIEA(1.364g，10.56mmol)依次加入烧瓶中，搅拌至完全溶解，氮气保护，室温反应30min将反应后的溶液滴加在0.1N aq.HCl(1.0L，0.14M)，产生淡黄色沉淀，抽滤真空干燥，得2.04g固体，即化合物4，产率95％，其结构式如下：
将化合物4(2.04g，3.34mmol)放入圆底烧瓶中，加入TFA：H2O(体积比95：5 10mL),搅拌两小时，加入甲基叔丁基醚中，沉淀过滤，真空干燥。得1.507g化合物5，产率98％，其结构式如下：
F808的制备：在23℃下向化合物3(1.053g，1mmol)的水(10mL)溶液中，滴加pH 11的叶酸衍生物(570mg，1.2mmol)三阴离子溶液。将反应混合物的温度升至90℃，在90℃下搅拌45分钟，并通过TLC监测产物的形成。产物形成完成后，将反应混合物冷却至室温，并通过套管作为稳定流转移至搅拌的丙酮(0.5L)中，得到绿色沉淀。沉淀物在抽气机真空下在烧结漏斗上过滤，用丙酮(3×500mL)洗涤。将绿色粉末状固体在高真空下干燥12h，定量获得F808(1.5g)。
为了验证本发明的效果，进行了如下验证实验：
用1x10-7 mol/L的F808孵育H1299(叶酸受体高表达)和A549(叶酸受体低表达)细胞2h，用PBS清洗细胞2-3遍，然后用实验室自制近红外荧光显微镜对H1299以及A549细胞进行成像，得到白光、荧光图像，用Image-J融合图像，如图6所示。亮光的H1299细胞表示小分子靶向到H1299细胞的叶酸受体，在激发光的激发下检测出荧光强度，而对A549细胞则无特异性靶向作用。
裸鼠接种叶酸受体高表达肿瘤类型H1299,尾静脉注射10nmol剂量F808,24小时后通过小动物成像仪和手术导航仪分别检测其靶向效果，可以看到F808对叶酸受体高表达肿瘤细胞具有较好的靶向效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子，其特征在于：其结构式如下：
其中，M独立地选自H、Na和K。
2.一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，S0456的合成，包括以下步骤：
步骤S11，将1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚、浓硫酸混合加热回流，在乙酸乙酯中沉淀后，以灰色固体的形式过滤和收集粗产物，所得产物溶解在甲醇中，溶解液滴加入以氢氧化钾和异丙醇的溶液中，粗混合物过滤洗涤，得到产物棕色固体，即为化合物1；
步骤S12，将化合物1和1,4-丁磺酸内酯在氮气氛加入甲苯溶液中加热反应，将混合料冷却至室温，粗产物析出，将粗混合物中加入甲醇搅拌；沉淀，过滤，收集，重新在水和甲醇的混合物中溶解，用滴液漏斗将混合溶液加入乙腈中；沉淀物被过滤并收集为粉红色固体产物，即为化合物2；
步骤S13，将化合物2、Vilsmeier-Haack试剂和无水乙酸钠在无水乙醇中，在氮气气氛下回流加热6-8h，反应混合物冷却至室温，然后过滤，用乙醇和甲醇洗涤，收集为绿色固体产物，即为化合物3；
步骤S2，叶酸衍生物的合成；包括以下步骤：
步骤S21，将叶酸水解酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、O-叔丁基-L-酪氨酸叔丁基酯盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺依次加入容器中，搅拌至完全溶解，氮气保护，反应，将反应后的溶液滴加在HCl溶液，产生淡黄色沉淀，干燥，得固体产物，即为化合物4；
步骤S22，将化合物4放入容器中，加入三氟乙酸，搅拌，加入甲基叔丁基醚中，沉淀过滤，真空干燥，得到化合物5；
步骤S3，F808的制备；包括以下步骤：
步骤S31，向化合物3的水溶液中，滴加叶酸衍生物三阴离子溶液；
步骤S32，将步骤S31所得的反应混合物的升温，搅拌，并通过TLC监测产物的形成；
步骤S33，产物形成完成后，将反应混合物冷却至室温，并通过套管作为稳定流转移至搅拌的丙酮中，得到绿色沉淀；
步骤S34，沉淀物在抽气机真空下在烧结漏斗上过滤，用丙酮洗涤；
步骤S35，将绿色粉末状固体干燥，获得产物F808；
3.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S11中，加热到120℃在氮气氛下回流16-20h。
4.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S12中，加热温度100-120℃，时间48h，搅拌30分钟，水和甲醇的混合物中，水和甲醇的体积比为2:1。
5.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S13中，加热温度为65℃，时间为6-8h。
6.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S21中，反应温度为室温，时间为25-35min。
7.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S22中，搅拌时间为两小时。
8.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S31中，在18-28℃下向化合物3的水溶液中，滴加pH 10-12的叶酸衍生物三阴离子溶液。
9.根据权利要求2所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子的制备方法，其特征在于：所述步骤S32中，温度升至85-95℃，搅拌40-55分钟。
10.权利要求1所述的主动靶向叶酸受体近红外荧光分子在制备肿瘤手术导航成像及医学细胞标记的试剂中的用途。
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