WO2020186483A1 - 五甲川菁染料及其制备方法 - Google Patents

五甲川菁染料及其制备方法 Download PDF

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WO2020186483A1
WO2020186483A1 PCT/CN2019/078896 CN2019078896W WO2020186483A1 WO 2020186483 A1 WO2020186483 A1 WO 2020186483A1 CN 2019078896 W CN2019078896 W CN 2019078896W WO 2020186483 A1 WO2020186483 A1 WO 2020186483A1
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cyanine dye
preparing
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dye
pentamethine cyanine
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PCT/CN2019/078896
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杨志刚
李文
潘文慧
熊佳
屈军乐
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深圳大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials

Definitions

  • the invention belongs to the field of fluorescent probes, and in particular relates to a five methyl cyanine dye and a preparation method thereof.
  • Stochastic optical reconstruction super-resolution imaging method is a new type of super-resolution imaging method. This method is highly dependent on the performance of fluorescent materials. At present, Alexa647 is generally considered to be a fluorescent material with better STORM super-resolution imaging performance. However, such materials require a variety of additives (mercaptoethanol, TCEP, oxygen-consuming Enzymes, etc.), there are many problems in applying super-resolution imaging to living cells.
  • Pentamethine cyanine dye is a kind of excellent fluorescent probe precursor. Compared with trimethine cyanine dye, it has longer absorption and emission wavelengths, and has higher stability than heptamethine cyanine dye, so it has a wide range of applications.
  • the purpose of the present invention is to provide a pentamethyl cyanine dye and a preparation method thereof, so as to solve the technical problem that the existing pentamethyl cyanine dye is not rich in variety.
  • one aspect of the present invention provides a pentamethyl cyanine dye, which has a structure of the following general formula:
  • X and Y are O, S, C(CH3)2 or NR5
  • R1 is any one of -(CH2)nR6 or C5H5N, C6H5NO2
  • R2 and R3 are H, halogen, -COOH, -COOR7, respectively , -CONR7, tetrazine and derivatives (-C2HN4 or -C2HN4CH3), AsS2(CH2)2, SO3H, SO3NR7, SO3-, NO2, or any one of CN
  • R4 is -C6H4R8, -(CH2)n In any of R8, -CH2CH2SSR1, -CH2CH2SH, m and n are both integers of 1-18.
  • the R5 is -(CH2)n;
  • the R6 is hydrogen, -COOH, -COOR9, -CONR9, NH2, OH, amide group (-NCOR9), ester group (-OCOR9), naphthyl, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole, furan , Pyrrole heterocyclic ring, any one of C6H4R10;
  • the R7 is any one of -(CH2)nR11, -(CH2)n-CON-(CH2)n-NCO-CR11, -C6H4CONR11;
  • the R8 is any one of -COOH, -CONR7, -COOR7, NH2, OH, halogen.
  • the R9 is any one of biotin, folic acid, Cy3, rhodamine, camptothecin, paclitaxel, glibenclamide and derivatives, ceramide, triphenylphosphine, etc.;
  • the R10 is any one of -COOH, -COOR9, and -CONR9;
  • the R11 is any one of hydrogen, paclitaxel, phalloidin, cyclooctatetraene, Trolox, nitrobenzyl, glibenclamide and derivatives, ceramide, and triphenylphosphine.
  • the thioesters J, K, L, and M are deacylized to generate intramolecular six-membered heterocyclic compounds N, O, P, and Q;
  • the six-membered heterocyclic compounds N, O, P, and Q are ring-opened with a sulfide such as a disulfide-containing alcohol to form a disulfide bond to obtain target compounds T1, T2, T3, T4.
  • a sulfide such as a disulfide-containing alcohol
  • the halide used to form the quaternary ammonium salt includes one or more of bromide and iodide.
  • the solvent used to form the quaternary ammonium salt includes one or more of acetonitrile, ethyl acetate, ethanol, and methylene chloride.
  • the acid used in the first condensation includes one or more of acetic acid, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, and formic acid.
  • the base used in the second condensation includes one or more of triethylamine and diisopropylamine.
  • the base used for thioester deacylation and ring formation includes one or more of sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide, and potassium hydroxide.
  • the solvent used for thioester deacylation and ring formation includes one or more of methanol, ethanol, and acetonitrile.
  • the Pentamethine dye of the present invention enriches the types of the existing Pentamethine dye.
  • the dye is induced to dynamically open and close the ring at physiological pH, so as to realize the protection of the dye triggering scintillation.
  • the sulfhydryl group is protected by disulfide bonds, so that the dye can radiate and stabilize the fluorescence, which is convenient for confirming the dyeing effect.
  • the disulfide bond can be cut in the cell by the intracellular high-activity sulfhydryl protein to achieve flashing, and can be adjusted by chemical modification and regulation
  • the pH value of the open loop and closed loop is adapted to the application scenarios of different parts of the organism.
  • the preparation method of the five methyl cyanine dye of the present invention adopts mature process conditions and a simple design route, and efficiently completes the synthesis of the target product.
  • Fig. 1 is a synthetic route diagram of five methyl cyanine dyes according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a luminescence diagram of the Pentamethine cyanine dye after entering the cell according to an embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a bright-field image, a fluorescence imaging image and a partial enlarged view of the pentachlorocyanine dye according to an embodiment of the present invention
  • Fig. 4 is a graph showing changes in the fluorescence of the Pentamethine cyanine dye in cells over time according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the dyeing of mitochondria and the dynamic STORM imaging of mitochondria.
  • the embodiments of the present invention provide a pentamethine cyanine dye.
  • the dye By introducing a sulfhydryl group into the molecule, the dye is induced to dynamically open and close the ring at physiological pH to realize the function of protecting the dye to trigger blinking.
  • the sulfhydryl group is disulfide bond Protection, so that the dye can radiate and stabilize the fluorescence, which is convenient for confirming the dyeing effect.
  • the disulfide bond can be cut in the cell by the highly active sulfhydryl protein in the cell to realize the scintillation.
  • the pentomethine dye has the following general structure:
  • X and Y are O, S, C(CH3)2 or NR5
  • R1 is any one of -(CH2)nR6 or C5H5N, C6H5NO2
  • R2 and R3 are H, halogen, -COOH, -COOR7, respectively , -CONR7, tetrazine and derivatives (-C2HN4 or -C2HN4CH3), AsS2(CH2)2, SO3H, SO3NR7, SO3-, NO2, or any one of CN
  • R4 is -C6H4R8, -(CH2)n In any of R8, -CH2CH2SSR1, -CH2CH2SH, both m and n are integers of 1-18.
  • the selection of different atoms for X and Y will produce different p- ⁇ conjugation and electron induction effects.
  • the emission wavelength is red-shifted; at the same time, these atoms will also affect the pKa value of the mercapto group. Although they are a little far apart, the effect will not be too great, but they can also be used as an auxiliary means of adjustment.
  • Different heteroatoms can be selected according to specific needs.
  • R2 and R3 are directly connected to the benzene ring in the conjugated system, and the change of the substituent can adjust the absorption and emission wavelength.
  • R4 plays the same role as the disulfide bond on the left, but it can adjust the length of the carbon chain and the substituents, change the ring formation conditions, form a double response, and expand its application.
  • the R5 is -(CH2)n, and n is an integer of 1-5.
  • the R6 is hydrogen, -COOH, -COOR9, -CONR9, NH2, OH, amide group (-NCOR9), ester group (-OCOR9), naphthyl, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole, furan , Pyrrole heterocyclic ring, C6H4R10; in different application scenarios, the degree of stability required for the sulfhydryl group is different, so different substituents need to be selected to change the stability of the disulfide bond;
  • the R7 is any one of -(CH2)nR11, -(CH2)n-CON-(CH2)n-NCO-CR11, -C6H4CONR11; R1 and R7 play the same role as R6.
  • the R8 is any one of -COOH, -CONR7, -COOR7, NH2, OH, halogen. Play the same role as R4.
  • the R9 is any one of biotin, folic acid, Cy3, rhodamine, camptothecin, paclitaxel, glibenclamide and derivatives, ceramide, triphenylphosphine, etc.; it plays a functional role .
  • the modified drugs can be used for targeting, anti-cancer effects, or changing the cell environment to study the dynamic changes of pH in different scenarios.
  • the R10 is any one of -COOH, -COOR9, and -CONR9; it plays the same role as R4.
  • the R11 is any one of hydrogen, paclitaxel, phalloidin, cyclooctatetraene, Trolox, nitrobenzyl, glibenclamide and derivatives, ceramide, and triphenylphosphine. Play the same role as R9.
  • S04 Deacylize the thioesters J, K, L, and M under alkaline conditions and generate intramolecular six-membered heterocyclic compounds N, O, P, Q;
  • S05 The six-membered heterocyclic compound N, O, P, Q is ring-opened with a sulfide such as a disulfide-containing alcohol to form a disulfide bond to obtain the target compounds T1, T2, T3, T4.
  • a sulfide such as a disulfide-containing alcohol
  • the halide used to form the quaternary ammonium salt in step S01 of the embodiment of the present invention includes one or more of bromide and iodide.
  • the reaction rate of iodide is the fastest, and the reaction of bromide is relatively slow.
  • potassium iodide is added as a catalyst. (The possible general structural formula or specific name of each reactant should be added)
  • the solvent used to form the quaternary ammonium salt in step S01 of the embodiment of the present invention includes one or more of acetonitrile, ethyl acetate, ethanol, and methylene chloride.
  • acetonitrile ethyl acetate
  • ethanol ethyl acetate
  • methylene chloride ethyl acetate
  • the choice of a large polar solvent is conducive to this reaction, but considering the solubility of the substrate, other solvents need to be added to adjust the solubility.
  • the acid used in the first condensation in step S02 of the embodiment of the present invention includes one or more of acetic acid, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, and formic acid.
  • Acetic anhydride can be selected as the solvent, and other acids can be used for better results.
  • the base used in the second condensation in step S03 of the embodiment of the present invention includes one or more of triethylamine and diisopropylamine.
  • a basic organic base is selected to achieve the purpose of condensation without causing the thioester to deacylize and form a ring due to too strong alkalinity, achieving the purpose of regioselectivity.
  • the alkali used for thioester deacylation and ring formation includes one or more of sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide, and potassium hydroxide.
  • the selection of a more basic inorganic base here is conducive to thioester deacylation and ring formation.
  • inorganic bases have very low solubility in organic solvents and can be easily removed by extraction.
  • the solvent used for thioester deacylization and ring formation includes one or more of methanol, ethanol, and acetonitrile. Choosing a solvent with greater polarity is conducive to the reaction. At the same time, considering the post-processing, selecting a compound with a lower non-point is easy to extract the desired intermediate.
  • disulfide compounds can also be selected to form disulfide bonds in step S05 in the embodiment of the present invention.

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Abstract

本发明公开了一种五甲川菁染料及其制备方法，利用了其波长较长且稳定性较好的优势，通过在分子内引入巯基诱导染料在生理pH下动态开、关环，实现保护染料引发闪烁的功能，将巯基以二硫键保护，使染料能够辐射稳定荧光，便于确认染色效果，二硫键在细胞内可以通过细胞内高活性巯基蛋白切断，从而实现闪烁。

Description

五甲川菁染料及其制备方法 技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种一种五甲川菁染料及其制备方法。
背景技术
近年来，分子荧光检测与成像技术的发展为生命科学的发展提供了强有力的研究检测工具，例如利用分子荧光成像分析技术的检测仪器，共聚焦荧光成像显微镜、荧光光谱/寿命仪等。在上述理论的基础上，迅速崛起的超分辨成像技术更突破光学衍射极限的限制，获得尺寸小于200nm的微小目标的精细结构成像。
随机光学重构超分辨成像方法(STORM)是一种新型的超分辨成像方法。这种方法对荧光材料性能具有较大依赖性，目前Alexa647普遍认为是用于STORM超分辨成像性能较好的荧光材料，但是这类材料使用时需要多种添加剂(巯基乙醇、TCEP、消耗氧气的酶等)，在将超分辨成像用于活细胞方面存在很多问题。
五甲川菁染料是一类优秀的荧光探针母体，相比于三甲川菁染料具有更长的吸收和发射波长，相对于七甲川菁染料具有更高的稳定性，因此应用面十分广泛。
但是如何利用五甲川菁染料这个母体经过适当修饰使其功能更多样，应用更广泛还需要经过更多的设计与挖掘。
技术问题
本发明的目的在于提供一种五甲川菁染料及其制备方法，以解决现有的五甲川菁染料种类不够丰富的技术问题。
技术解决方案
为了实现上述发明目的，本发明一方面提供了一种五甲川菁染料，所述五甲川菁染料具有如下通式的结构：
Figure PCTCN2019078896-appb-000001
其中，X和Y为O、S、C(CH3)2或NR5，R1为-(CH2)nR6或C5H5N，C6H5NO2,中的任一种；R2和R3分别为H、卤素、-COOH、-COOR7、-CONR7、四嗪及衍生物(-C2HN4或-C2HN4CH3)、AsS2(CH2)2、SO3H、SO3NR7、SO3-、NO2、或CN中的任意一种；R4为-C6H4R8、-(CH2)n R8、-CH2CH2SSR1、-CH2CH2SH的任一种其中，m和n均为1～18的整数。
优选地，所述R5为-(CH2)n；
优选地，所述R6为氢、-COOH、-COOR9、-CONR9、NH2、OH、酰胺基(-NCOR9)、酯基(-OCOR9)、 萘基、咪唑、吡唑、噁唑、噻唑、呋喃、吡咯杂环、C6H4R10中的任意一种；
优选地，所述R7为-(CH2)nR11、-(CH2)n-CON-(CH2)n-NCO-CR11、-C6H4CONR11中的任意一种；
优选地，所述R8为-COOH、-CONR7、-COOR7、NH2、OH、卤素、中的任意一种。
优选地，所述R9为生物素、叶酸、Cy3、罗丹明、喜树碱、紫杉醇、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦等中的任意一种；
优选地，所述R10为-COOH、-COOR9、-CONR9中的任意一种；
优选地，所述R11为氢、紫杉醇、鬼笔环肽、环辛四烯、Trolox、硝基苄基、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦中的任意一种。
本发明另一方面还提供了一种所述的五甲川菁染料的制备方法，包括如下步骤：
将包含取代基如通式A、B、C的与硫酯的烷基卤代物反应得到如通式D、E、F的季铵盐；
Figure PCTCN2019078896-appb-000002
将所述通式D、E、F的季铵盐与丙二醛二苯胺盐酸盐在酸催化下加热缩合反应生成如通式G、H、I的中间体；
Figure PCTCN2019078896-appb-000003
将所述缩合反应的目标产物G、H、I与通式A、B、C的化合物缩合，得到菁染料的硫酯J、K、L、M；
Figure PCTCN2019078896-appb-000004
在碱性条件下将所述硫酯J、K、L、M脱去酰基并生成分子内六元杂环化合物N、O、P、Q；
Figure PCTCN2019078896-appb-000005
将所述六元杂环化合物N、O、P、Q用含二硫的醇等硫化物开环形成二硫键，得到目标化合物T1、T2、T3、T4。
优选地，形成所述季铵盐采用的卤代物包括溴化物和碘化物其中的一种或多种。
优选地，形成季铵盐所采用的溶剂包括乙腈，乙酸乙酯，乙醇，二氯甲烷中的一种或多种。
优选地，第一次缩合采用的酸包括醋酸，稀盐酸，稀硫酸，甲酸中的一种或多种。
优选地，第二次缩合采用的碱包括三乙胺，二异丙胺其中的一种或多种。
优选地，硫酯脱去酰基成环所采用的碱包括碳酸钠，碳酸钾，氢氧化钠，氢氧化钾其中的一种或多种。
优选地，硫酯脱去酰基成环所采用溶剂包括甲醇，乙醇，乙腈中的一种或多种。
有益效果
与现有技术相比本发明所述的五甲川菁染料丰富了现有五甲川菁染料的种类，通过在分子内引入巯基诱导染料在生理pH下动态开、关环，实现保护染料引发闪烁的功能，将巯基以二硫键保护，使染料能够辐射稳定荧光，便于确认染色效果，二硫键在细胞内可以通过细胞内高活性巯基蛋白切断，从而实现闪烁，并且经过化学修饰与调控可以调节开环关环的pH值，适应生物体不同部位的应用场景。
本发明所述的五甲川菁染料的制备方法，采用了成熟的工艺条件与简洁的设计路线，高效的完成了目标产物的合成。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明一实施例的五甲川菁染料的合成路线图；
图2为本发明一实施例的五甲川菁染料进入细胞后的发光图；
图3为本发明一实施例的五甲川菁染料明场图、荧光成像图和局部放大图；
图4为本发明一实施例的五甲川菁染料在细胞中的荧光随时间变化图。
本发明的最佳实施方式
实施例1其中一种探针的制备方法
合成路线如图1
具体步骤如下：
化合物1的制备
1-溴3-氯丙烷以及硫代乙酸钾溶(1:1)加入到THF中回流1h,室温搅拌24h，过滤无机盐，有机相蒸干后用丙酮溶解，加入等当量NaI常温搅拌6天，有机相用乙酸乙酯稀释，硫代硫酸钠洗涤，干燥有机相蒸干得到浅黄色油状物。
化合物2的制备
取3.66g 2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉和2.38g化合物1于20ml乙腈，加入，在氮气气氛下，加热回流6h，冷却至室温，加入乙醚洗涤，倾倒流体有机相，得到紫红色油状物(产率40％)。
化合物3的制备
1.2g化合物2以及0.8g丙二醛二苯胺盐酸盐加入到乙酸和醋酸酐1:1的混合溶剂中回流1h，冷 却到室温蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和乙醚1；1的混合溶剂洗涤，倾倒有机相，残余物柱层析得到暗黄色固体0.86g
化合物4的制备
3g 1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚悬浮于20ml乙腈中，加入5ml碘甲烷回流3h，冷却到室温，过滤，乙酸乙酯洗涤得到粉白色固体3g。
化合物5的制备
0.574g化合物3及0.4g化合物4溶解于10毫升乙醇，加入1毫升三乙胺，回流至原料完全消耗，蒸干溶剂，柱层析得到蓝色固体0.4g，产率60％。
化合物6的制备
0.1g化合物6溶解于5ml甲醇，加入0.13g无水碳酸钾室温搅拌30min,饱和碳酸氢钠洗涤，二氯甲烷萃取，干燥，蒸干溶剂，产物直接用于下一步。
化合物7的制备
0.33g化合物6,0.2g甲基硫代磺酸甲酯溶解于二氯甲烷和甲醇1:1的混合溶剂中，加入0.14ml三乙胺后室温搅拌过夜，有机相用水洗涤3次，二氯甲烷萃取，干燥，蒸干溶剂。产物用二氯甲烷/乙醚沉淀三次，柱层析后得到0.17g蓝色固体，产率50％。
实施例2
染料的生物荧光成像检测
1)、染料母液的制备
称取1mol实施例18～19制备得到的染料置于茶色玻璃瓶中，加入100mL的HPLC的DMSO溶剂，混合均匀，得到1mM的染料母液。
2)、将HeLa细胞种植于活细胞培养皿中，48小时后，更换培养基，并将1)中制备的染料母液加入到培养皿中，使得染料的最终浓度为1uM，并置于三十七度下培养10min，倒掉培养基，用PBS缓冲液洗涤3次，置于激光共聚焦显微镜载物台上，选取激发波长为633nm，发射波长为645nm的长通滤光片，进行观测，由图2所示，该染料可以进入细胞中，并且在细胞内有不同的选择性，可以应用于活细胞荧光染料的应用中。
实施例3
将染料加入活细胞中进行培养1h，保证二硫键被有效还原为自由巯基，进行活细胞STORM超分辨成像检测，如图3所示，图分别为宽场叠加的图以及运用算法计算得到的STOM超分辨成像图，染料在较低功率密度即可闪烁，得到的分辨率约60nm。
利用染料的较长时间闪烁特点，可以对细胞器进行动态STORM成像。如图4所示展现了染料对线粒体的染色以及对线粒体的动态STORM成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围
本发明的实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附表，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了提供了一种五甲川菁染料，通过在分子内引入巯基诱导染料在生理pH下动态开、关环，实现保护染料引发闪烁的功能，将巯基以二硫键保护，使染料能够辐射稳定荧光，便于确认染色效果，二硫键在细胞内可以通过细胞内高活性巯基蛋白切断，从而实现闪烁，其中，五甲川菁染料具有如下通式的结构：
Figure PCTCN2019078896-appb-000006
其中，X和Y为O、S、C(CH3)2或NR5，R1为-(CH2)nR6或C5H5N，C6H5NO2,中的任一种；R2和R3分别为H、卤素、-COOH、-COOR7、-CONR7、四嗪及衍生物(-C2HN4或-C2HN4CH3)、AsS2(CH2)2、SO3H、SO3NR7、SO3-、NO2、或CN中的任意一种；R4为-C6H4R8、-(CH2)n R8、-CH2CH2SSR1、-CH2CH2SH 的任一种其中，m和n均为1～18的整数。
具体的，X和Y选用不同的原子，会产生不同的p-π共轭与电子诱导效应，O，N,S,C,随着电负性逐渐减弱，诱导效应逐渐减弱，会使探针的发射波长红移；同时这些原子也会影响巯基的pKa值，虽然相隔有点远，影响不会太大，但也可以作为调节的辅助手段，根据具体的需要可以选取不同杂原子。
同样的，R2和R3与共轭体系中的苯环直接连接，取代基变化可以调节吸收和发射波长。R4起到与左边二硫键相同的作用，但是却可以调节碳链长度以及取代基，改变成环条件，形成双响应，拓展其应用面。
具体的，所述R5为-(CH2)n，n为1-5的整数。
具体的，所述R6为氢、-COOH、-COOR9、-CONR9、NH2、OH、酰胺基(-NCOR9)、酯基(-OCOR9)、萘基、咪唑、吡唑、噁唑、噻唑、呋喃、吡咯杂环、C6H4R10中的任意一种；在不同的应用场景下，对巯基的稳定性需要的程度不同，因此需要选取不同的取代基来改变二硫键的稳定性；
具体的，所述R7为-(CH2)nR11、-(CH2)n-CON-(CH2)n-NCO-CR11、-C6H4CONR11中的任意一种；R1和R7起到与R6相同的作用。
具体的，所述R8为-COOH、-CONR7、-COOR7、NH2、OH、卤素、中的任意一种。起到与R4相同的作用。
具体的，所述R9为生物素、叶酸、Cy3、罗丹明、喜树碱、紫杉醇、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦等中的任意一种；起到功能性作用，可以利用修饰的药物起到靶向作用，起到抗癌作用，或者改变细胞环境作用，以此来研究不同场景下的pH值的动态变化。
具体的，所述R10为-COOH、-COOR9、-CONR9中的任意一种；起到与R4相同的作用。
具体的，所述R11为氢、紫杉醇、鬼笔环肽、环辛四烯、Trolox、硝基苄基、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦中的任意一种。起到与R9相同的作用。
本发明另一方面还提供了一种所述的五甲川菁染料的制备方法，包括如下步骤：
S01：将包含取代基如通式A、B、C的与硫酯的烷基卤代物反应得到如通式D、E、F的季铵盐；
Figure PCTCN2019078896-appb-000007
Figure PCTCN2019078896-appb-000008
S02：将所述通式D、E、F的季铵盐与丙二醛二苯胺盐酸盐在酸催化下加热缩合反应生成如通式G、H、I的中间体；
Figure PCTCN2019078896-appb-000009
S03:将所述缩合反应的目标产物G、H、I与通式A、B、C的化合物缩合，得到菁染料的硫酯J、K、L、M；
Figure PCTCN2019078896-appb-000010
S04：在碱性条件下将所述硫酯J、K、L、M脱去酰基并生成分子内六元杂环化合物N、O、P、Q；
Figure PCTCN2019078896-appb-000011
S05:将所述六元杂环化合物N、O、P、Q用含二硫的醇等硫化物开环形成二硫键，得到目标化合物T1、T2、T3、T4。
本发明实施例的步骤S01中形成所述季铵盐采用的卤代物包括溴化物和碘化物其中的一种或多种。碘化物的反应速率最快，溴代物反应相对慢一些，一般会加入碘化钾作为催化剂。(应该增加各反应物的可能的结构通式或者具体名称)
本发明实施例的步骤S01中形成季铵盐所采用的溶剂包括乙腈，乙酸乙酯，乙醇，二氯甲烷中的一种或多种。选取大极性的溶剂有利于此反应，但是考虑到底物的溶解性，需要加入其它溶剂来调整溶解性，
本发明实施例的步骤S02中第一次缩合采用的酸包括醋酸，稀盐酸，稀硫酸，甲酸中的一种或多种。可以选取醋酸酐做溶剂，配合其他的酸起到更好的效果。
本发明实施例的步骤S03中第二次缩合采用的碱包括三乙胺，二异丙胺其中的一种或多种。这里选取碱性一般的有机碱，达到缩合目的得同时不会因为碱性太强而导致硫酯脱去酰基成环，达到区域选择性的目的。
本发明实施例的步骤S04中硫酯脱去酰基成环所采用的碱包括碳酸钠，碳酸钾，氢氧化钠，氢氧化钾其中的一种或多种。此处选取碱性较强的无机碱有利于硫酯脱去酰基成环。而且无机碱在有机溶剂中溶解度很低，可以利用萃取轻易除去。
本发明实施例的步骤S04中硫酯脱去酰基成环所采用溶剂包括甲醇，乙醇，乙腈中的一种或多种。选极性较大的溶剂利于反应进行，同时考虑到后处理，选取非点较低的化合物，容易提取出所需中间体。
本发明实施例的步骤S05中形成二硫键也可以选取其他二硫化合物。
本发明实施例的制备方法，一方面设计了简洁的反应路线；另一方面在每步反应中都没有复杂危险的操作，所用溶剂和条件都是较为温和可控的，可实施性非常高。
现结合具体实例，对本发明的聚合物及其制备方法和聚合物薄膜及其制备方法进行进一步详细说明。
代表性探针结构示意图：
Figure PCTCN2019078896-appb-000012

Claims (10)

  1. 一种五甲川菁染料，其特征在于，所述五甲川菁染料的分子结构通式为下述中通式的至少一种：
    Figure PCTCN2019078896-appb-100001
    其中，X和Y为O、S、C(CH3)2或NR5，R1为-(CH2)nR6或C5H5N、C6H5NO2中的任一种；R2和R3分别为H、卤素、-COOH、-COOR7、-CONR7、四嗪及衍生物、AsS2(CH2)2、SO3H、SO3NR7、SO3-、NO2、或CN中的任意一种；R4为-C6H4R8、-(CH2)n R8、-CH2CH2SSR1、-CH2CH2SH的任一种其中，m和n均为1～18的整数。
  2. 根据权利要求1所述的五甲川菁染料，其特征在于，R5为-(CH2)n；和/或
    R6为氢、-COOH、-COOR9、-CONR9、NH2、OH、酰胺基(-NCOR9)、酯基(-OCOR9)、萘基、咪唑、吡唑、噁唑、噻唑、呋喃、吡咯杂环、C6H4R10中的任意一种；和/或
    R7为-(CH2)nR11、-(CH2)n-CON-(CH2)n-NCO-CR11、-C6H4CONR11中的任意一种；和/或
    R8为-COOH、-CONR7、-COOR7、NH2、OH、卤素、中的任意一种。
  3. 根据权利要求2所述的五甲川菁染料，其特征在于，R9为生物素、叶酸、Cy3、罗 丹明、喜树碱、紫杉醇、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦等中的任意一种；和/或
    R10为-COOH、-COOR9、-CONR9中的任意一种；和/或
    R11为氢、紫杉醇、鬼笔环肽、环辛四烯、Trolox、硝基苄基、格列本脲及衍生物、神经酰胺、三苯基膦中的任意一种。
  4. 一种如权利要求1所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    将包含取代基如通式A、B、C的与硫酯的烷基卤代物反应得到如通式D、E、F的季铵盐；
    Figure PCTCN2019078896-appb-100002
    将所述通式D、E、F的季铵盐与丙二醛二苯胺盐酸盐在酸催化下加热缩合反应生成如通式G、H、I的中间体；
    Figure PCTCN2019078896-appb-100003
    将所述缩合反应的目标产物G、H、I与通式A、B、C的化合物缩合，得到菁染料的硫酯J、K、L、M；
    Figure PCTCN2019078896-appb-100004
    在碱性条件下将所述硫酯J、K、L、M脱去酰基并生成分子内六元杂环化合物N、O、P、Q；
    Figure PCTCN2019078896-appb-100005
    将所述六元杂环化合物N、O、P、Q用含二硫的醇等硫化物开环形成二硫键，得到目标化合物T1、T2、T3、T4。
  5. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：形成季铵盐采用的卤代物包括溴化物和碘化物其中的一种或多种。
  6. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：形成季铵盐所采用的溶剂包括乙腈，乙酸乙酯，乙醇，二氯甲烷中的一种或多种。
  7. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：第一次缩合采用的酸包括醋酸，稀盐酸，稀硫酸，甲酸中的一种或多种。
  8. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：第二次缩合采用的碱包括三乙胺，二异丙胺其中的一种或多种。
  9. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：硫酯脱去酰基成环所采用的碱包括碳酸钠，碳酸钾，氢氧化钠，氢氧化钾其中的一种或多种。
  10. 根据权利要求4所述的五甲川菁染料的制备方法，其特征在于：硫酯脱去酰基成环所采用溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种。
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