JP2010505991A - フルオロ置換ベンゾオキサゾールポリメチン色素 - Google Patents
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- QTQWOOOXOQFXAD-UHFFFAOYSA-N Cc1nc2cc(F)cc(F)c2[o]1 Chemical compound Cc1nc2cc(F)cc(F)c2[o]1 QTQWOOOXOQFXAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
本発明の反応性ポリフルオロベンゾオキサゾールポリメチン色素は生物物質その他の物質を標識し検出するのに有用である。色素は式(I)で表される。
【化1】
式中、Xは−O−、−S−及び次の基からなる群から選択され、
【化2】
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rx又は−L−Rpであり、Lは連結基であり、Rxは本色素を成分に共有結合するのに適当な基であり、Rpは成分であり、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する。フッ素で置換され、さらにスルホン酸基で置換されたポリメチン色素を生物標的分子のラベリングに用いると、このような置換のないシアニン色素と比べて色素−色素凝集が少なく、光安定性が向上した標識生成物が得られる。
【選択図】 【化1】
【化1】
式中、Xは−O−、−S−及び次の基からなる群から選択され、
【化2】
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rx又は−L−Rpであり、Lは連結基であり、Rxは本色素を成分に共有結合するのに適当な基であり、Rpは成分であり、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する。フッ素で置換され、さらにスルホン酸基で置換されたポリメチン色素を生物標的分子のラベリングに用いると、このような置換のないシアニン色素と比べて色素−色素凝集が少なく、光安定性が向上した標識生成物が得られる。
【選択図】 【化1】
Description
本発明は、蛍光標識試薬、特に反応性フルオロベンゾオキサゾールポリメチン色素の分野に関し、またこのような色素での成分の標識及びこのような色素で標識された成分の検出に関する。
シアニン色素は、生物学的に重要な分子、例えばタンパク質、核酸、ホルモン及び薬物を蛍光標識する試薬として広く利用されている。実際に、シアニン色素は他の蛍光色素に比べて多数の利点を有する。例えば、シアニン色素の励起及び発光スペクトルは450nm〜800nmの可視から近赤外スペクトルに及ぶ。さらに、シアニン色素は非常に高い吸光係数及び好ましい量子収率を有することを特徴とする。例えば米国特許第6048982号、同第5268486号及び同第5569587号(A.S.Waggoner他)参照。しかし、シアニン色素構造によっては自己会合(即ち、凝集)する傾向があり、蛍光消光及び吸収波長の著しい浅色移動につながる。
近年、Waggoner他(Org.Letters, (2004), 6(6), 909−912)は、水性溶媒中で良好な光安定性を示すポリフルオロチアジカルボシアニン色素(化合物(i))を開示している。この色素は、フッ素を含まない類似体と比べ、凝集性が低く、量子収率が高く、耐光退色性が優れていた。
Waggoner et al, Org. Letters, (2004), 6(6), 909-912
本明細書に記載した通りの、ベンゾオキサシアニン発色団に1つ、好ましくは複数のフルオロ置換基が結合した反応性シアニン色素は、上記文献のどれにも開示されていない。本発明の色素は、さらに、標的材料、例えばタンパク質、抗体、核酸等の直接共有結合標識に適当な基を1つ以上有している。本発明は、光安定性が高く、色素−色素相互作用が小さい特性をもつシアニン色素誘導体を提供する。したがって、本色素は、例えば速度論的研究で、連続励起が必要条件となる蛍光検出を含む検定や、マイクロアレイスライドを数日間にわたって再解析しなければならないことがあるマイクロアレイ解析において特に有用である。
したがって、第1の発明によれば、式(I)の化合物が提供される。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rx又は−L−Rpであり、
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
Rpは成分であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるのが好ましい。
nが1又は2であるのが好ましく、即ち本発明の色素はトリメチン又はペンタメチン色素、特にトリメチン色素であるのが好ましい。
一実施形態では、Xは次式の基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
R11はCH3又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
別の実施形態では、Xが−O−であり、この場合第1の発明の化合物は式(III)で表される。
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
式(I)、(II)及び(III)の化合物において、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素であるのが好ましい。
第1の発明による化合物は対向イオンを含むのが適当であり、その対向イオンは色素発色団の形式電荷をバランスさせる正でも負でもよい。対向イオンの性質は本発明にとって重要ではなく、多数の既知のイオンのいずれか、例えばNH4 +、K+、Na+、トリフルオロ酢酸(F3C−CO2 −)、過塩素酸塩(ClO4 −)、Br−又はI−とすることができる。なお、本発明の文脈において、スルホン酸基(−SO3H)はスルホネート基(−SO3 −)も含む。スルホネートは元の酸のイオン化形態であるからである。
第1の発明による化合物は、少なくとも1つ、好ましくは2個又はそれ以上のフッ素原子が色素発色団上に直接又は間接的に置換しているのが適当である。一実施形態では、式(I)、(II)及び(III)の化合物は、R3、R4、R5及びR6位置及び/又はR7、R8、R9及びR10位置の1つ以上、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上でフッ素原子で置換されてよい。この実施形態で、1以上のフッ素原子での置換は、式(I)の対称又は非対称色素をもたらす。特に好ましい実施形態では、R3、R4、R5及びR6位置のそれぞれ及び/又はR7、R8、R9及びR10位置のそれぞれがフッ素で置換される。色素発色団のペルフルオロ置換が色素−色素凝集を抑制し、これにより蛍光量子収率及び色素光安定性を高めることを確かめた(A.Waggonerら前掲)。第2の実施形態では、式(I)、(II)及び(III)の化合物は、R3、R4、R5又はR6位置及び/又はR7、R8、R9又はR10位置の1つ、好ましくは2つ以下に、ペルフルオロC1−C4アルキル置換基を含むことができる。残りの基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は、H及びFからなる群から選択される。ペルフルオロC1−C4アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが好ましい。
所望に応じて、本発明の1、2、3、4個又はそれ以上のフッ素基が結合した色素は、さらに1つ以上のスルホン酸基で置換されてもよく、即ちスルホン酸基がフッ素で置換されていない残りのR3、R4、R5、R6、R7、R8、R9又はR10位置のどれにでも直接結合してよい。したがって、本発明の色素は1、2又は3個のスルホン酸基で直接又は間接的に置換されていてよい。フッ素置換され、さらに2個以上のスルホン酸基で置換されたシアニン色素を生物学的分子の標識(ラベリング)に用いると、このような置換のないシアニン色素と比べて、色素−色素凝集が少なく、光安定性が向上した標識生成物となる。このように本発明の好適な色素で標識された分子の蛍光発光強度は、共有結合した色素の数と共に増加する。さらに、複素環におけるN−スルホアルキル置換は、色素分子上の全体電荷を増加するのに加えて、立体的かさ高さを加え、これにより色素−色素凝集の低減に貢献する。
一実施形態では、連結基Lは色素発色団を、本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であるRxと連結する。第2の実施形態では、Lは色素をRpと直接連結する、即ち色素が成分に共有結合され、こうして成分にコンジュゲートされる。好適な実施形態では、本発明の色素は、R1又はR2位置のいずれかに結合した1つの基−L−Rx又は−L−Rpを含有する。残りの基R1又はR2は、C1−C4アルキル、好ましくはメチル、エチル又はプロピルからなる群から選択される。或いは、残りの基R1又はR2は−(CH2)k−SO3H(式中、kは1〜10の整数、好ましくは3又は4である。)でもよい。
Lは1〜20個の結合原子を含有するのが適当であり、直鎖状又は分岐状C1−C20アルキル鎖からなる群から選択され、所望に応じて−O−、−NR’−、−C(O)−NR’−及びフェニレンからなる群から選択される1以上の結合を含んでもよい。ここでR’は水素又はC1−C4アルキルである。連結基Lが5〜12個の原子を有するのが好ましい。Lが基−(CH2)p−Q−(CH2)r−(式中、Qは−CH2−又は−CO−NH−を示し、pは1〜5、rは0〜5である。)であるのがより好ましい。
一実施形態では、Rxは成分の相補的基と反応し得る基であり、その結果色素と成分の間に共有結合が形成される。この実施形態では、結合性基の選択は、標識すべき成分上に存在する基に依存し、このような基は当業者によく知られている。例えば、Rxは、適当な条件下で成分の相補的官能基と反応し得る反応性基とすることができる。タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などの成分中に存在する官能基の例には、ヒドロキシル、アミノ、スルホヒドリル、カルボニル(アルデヒド及びケトンを含む)、カルボン酸及びチオホスフェートがある。或いは、Rxは官能基であり、成分が反応性要素を含有するか含有するよう誘導体化され、この場合色素の官能基が適当な条件下で成分の反応性基と反応できる関係にある。いずれの場合にも、成分が本発明の色素で標識される。Rxが反応性基である場合、その反応性基をスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選ぶのが適当である。反応性基がカルボン酸のスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド又はホスホルアミダイトであるのが好ましい。Rxが官能基である場合、その官能基をヒドロキシル、アミノ、スルホヒドリル、カルボニル(アルデヒド及びケトンを含む)、カルボン酸及びチオホスフェートから選ぶのが適当である。これらの反応性基及び官能基により、本発明の化合物は成分と反応させることができ、成分と共有結合した状態になる。
本発明の化合物のR1及び/又はR2位置にある反応性基Rx並びに基R1及び/又はR2が反応して共有結合を形成し得る基の好適な例を表1に示す。或いは、R1及び/又はR2が、表1に示す、成分の反応性基と反応する官能基であってもよい。
好適な実施形態では、残りのR1又はR2位置の1つを−(CH2)k−SO3H(式中、kは前記定義の通り)で置換することができる。好ましくはkは3又は4である。即ち、残りのR1又はR2位置を−(CH2)3−SO3H又は−(CH2)4−SO3Hで置換することができる。フッ素で直接又は間接的に置換され、さらに1以上のスルホン酸基で置換されているシアニン色素を生物分子を標識するのに用いる結果として、このような置換のないシアニンと比較して、色素−色素凝集が低減し、光安定性が向上した標識生成物が得られる。
アルキルは1〜4個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状アルキル基、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル及びt−ブチルである。
ハライド及びハロ基はクロリド及びクロロ(塩素)、ブロミド及びブロモ(臭素)、及びヨージド及びヨード(ヨウ素)からなる群から選択される。
本発明の化合物の具体例には下記のものがある。
i)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物1);
ii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物2);
iii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物3);
iv)4−[(2E)−2−((2E)−3−{3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−2−イル}プロパ−2−エニリデン)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−1−イル]ブタン−1−スルホネート(化合物4);
v)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物5);
vi)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−5,6−ジフルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物6);
vii)3−(5−カルボキシペンチル)−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物7);及び
viii)3−{6−[(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ]−6−オキソヘキシル}−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物8)
本発明はまた、蛍光標識成分(ラベルされた成分)及び標識方法(ラベルする方法)に関し、この場合前述した通りの少なくとも1つの基−L−RxがR1及び/又はR2位置に結合した本発明の化合物を用いて、成分を標識し、こうして成分に蛍光特性を付与することができる。特に、本発明の化合物を、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体などの生物分子の蛍光標識と検出に用いることができる。したがって、第2の観点によれば、成分を標識する方法が提供され、この方法は、
i)前記成分を下記式(I)の化合物と接触させ、
ii)前記化合物を前記成分とともに、化合物を成分に結合するのに適当な条件下でインキュベート(培養)し、これにより前記成分を標識する工程を含む。
i)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物1);
ii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物2);
iii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物3);
iv)4−[(2E)−2−((2E)−3−{3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−2−イル}プロパ−2−エニリデン)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−1−イル]ブタン−1−スルホネート(化合物4);
v)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物5);
vi)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−5,6−ジフルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物6);
vii)3−(5−カルボキシペンチル)−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物7);及び
viii)3−{6−[(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ]−6−オキソヘキシル}−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物8)
本発明はまた、蛍光標識成分(ラベルされた成分)及び標識方法(ラベルする方法)に関し、この場合前述した通りの少なくとも1つの基−L−RxがR1及び/又はR2位置に結合した本発明の化合物を用いて、成分を標識し、こうして成分に蛍光特性を付与することができる。特に、本発明の化合物を、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体などの生物分子の蛍光標識と検出に用いることができる。したがって、第2の観点によれば、成分を標識する方法が提供され、この方法は、
i)前記成分を下記式(I)の化合物と接触させ、
ii)前記化合物を前記成分とともに、化合物を成分に結合するのに適当な条件下でインキュベート(培養)し、これにより前記成分を標識する工程を含む。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
一実施形態では、式(I)の化合物におけるXは次式の基であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
別の実施形態では、式(I)の化合物におけるXは−O−であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
好適な実施形態では、式(I)及び(II)の化合物における基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素である。より好ましくは、基R3、R4、R5及びR6の2つ以上及び/又は基R7、R8、R9及びR10の2つ以上がフッ素である。残りの基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10はH又は−SO3Hからなる群から選択される。R3、R4、R5及びR6位置のそれぞれ及び/又はR7、R8、R9及びR10位置のそれぞれがフッ素で置換されている化合物が特に好適である。
第2の実施形態では、式(I)の化合物は、R3、R4、R5及びR6位置の1つ、好ましくは2つ以下及び/又はR7、R8、R9及びR10位置の1つ、好ましくは2つ以下にペルフルオロC1−C4アルキルを含むことができる。残りの基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10はH又はFからなる群から選択される。ペルフルオロC1−C4アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが好ましい。
基Rxは、前述したように、式(I)の化合物と反応性又は官能基を有する成分との間に共有結合を形成するのに適当な基である。本方法は、標識すべき成分を適当量の本発明の化合物とともに色素が成分に共有結合状態となるような条件下でインキュベートする工程を含む。成分との色素コンジュゲート又は複合体を形成する方法は、当業者に周知である。例えば、タンパク質の共有結合標識は、通例、水性緩衝媒体、好ましくは重炭酸塩緩衝媒体中でpH9.0周囲温度で代表的には1時間の期間行う。反応は通常暗所で行う。標識タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィにより、例えば固定相としてSephadex(登録商標)を、溶離液としてpH7.0のリン酸塩緩衝液を用いることにより、未反応色素から分離することができる。生物分子の多重標識のためには、生物分子に対する色素の量又は濃度の比を調節しなければならない。
第3の観点によれば、式(I)で表される、成分の蛍光標識色素コンジュゲートが提供される。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rpであり、
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rpは成分であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
好ましくは、Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択される。Xが−O−であるのが特に好ましい。
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素であるのが好ましい。
色素コンジュゲートの成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)ヌクレオチド、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択されるのが適切である。
一実施形態では、式(I)の色素が生物学的標的分子を含む成分にコンジュゲートされる。用語「生物学的標的部分」(biological targeting moiety = BTM)は、哺乳動物体に投与後に、in vivoで哺乳動物体の特定の部位に選択的に捕集されるか局在化する化合物を意味する。このような部位(サイト)は、例えば、特定の疾患状態に関与したり、器官又は代謝プロセスがどのように機能しているかを表示する。BTMは合成起源のものでも天然起源のものでもよいが、合成であるのが好ましい。用語「合成」は普通の意味で、即ち天然ソース、例えば哺乳動物体から単離されたものではなく、人造である。このような化合物には、その製造及び不純物プロファイルを十全に制御できるという利点がある。BTMは、3〜100merのペプチド又はペプチド類似体(線状ペプチド、環状ペプチド又はその組合せとすることができる);又は酵素基質、酵素拮抗体又は酵素阻害剤;合成受容体結合化合物;オリゴヌクレオチド、又はオリゴDNAもしくはオリゴRNA片からなるのが好ましい。BTMがペプチドである場合、4〜30merのペプチドが好ましく、5〜28merのペプチドが特に好ましい。
第4の観点によれば、第3の観点のコンジュゲートを生体適合性キャリヤとともに哺乳動物への投与に適当な形態で含有する、製剤(医薬組成物)が提供される。蛍光色素が前記定義の通りのBTMを含有する成分にコンジュゲートしているのが好ましい。
「生体適合性キャリヤ」は、コンジュゲートを懸濁もしくは溶解することのできる、流体、特に液体であるのが好ましく、そうすれば組成物は生理学的に許容できる、即ち毒性や過度の不快感なしで哺乳動物体に投与することができる。生体適合性キャリヤとしては、注入可能なキャリヤ液体、例えば注射用の無菌の発熱性物質なし水;生理的食塩水のような水溶液(最終の注射液が等張液となるようなバランスとするのが有利である。);張度調節剤(例えば血漿カチオンと生体適合性対向イオンとの塩)、糖(例えばブドウ糖又は蔗糖)、糖アルコール(例えばソルビット又はマンニット)、グリコール(例えばグリセリン)、その他の非イオン性ポリオール物質(例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど)の1種又は2種以上の水溶液が適当である。生体適合性キャリヤが、注射用の発熱性物質なし水又は等張生理的食塩水であるのが好ましい。
本発明による蛍光色素標識成分は、その後、例えばミクロウェルプレート、ゲルに、また細胞検定に、分析又は検出用試薬として使用することができる。用語「光イメージング」は、例えば電荷結合素子(CCD)イメージャ(例えば走査型イメージャ又は面積型イメージャ)によって、検出用のイメージを形成する方法を意味する。LEADseeker(登録商標)システムは、CCDカメラを搭載し、高密度ミクロウェルプレートで行われる検定の蛍光イメージ形成を単一パスにて可能にしている。イメージ形成は定量的かつ迅速であり、イメージ形成用途に適当な計器は現在マルチウェルプレートの全部を同時にイメージ形成することができる。
或いはまた、BTMのような成分の蛍光色素標識コンジュゲートを適当な動物モデルにin vivo投与することができる。したがって、一実施形態では、BTMの色素コンジュゲート又はその製剤を使用して、緑から近赤外領域(波長500〜1200nm)の光との相互作用に基づいて、in vivoなBTMの局在化部位のイメージを得る工程を含む、哺乳動物体のin vivo光イメージング方法が提供される。光イメージングは、なんの装置も使用しない直接可視化から、種々のスコープ、カテーテル及び光イメージング機器(例えばトモグラフィ表示用のコンピュータ支援機器)などの装置の使用までに及ぶあらゆる方法を包含する。使用法及び測定法としては、ルミネセンスイメージング;内視鏡;蛍光内視鏡;光学的コヒーレンストモグラフィ;透過イメージング;時間分解透過イメージング;共焦点イメージング;非線形顕微鏡;光音響イメージング;音響光学イメージング;分光法;反射分光法;干渉法(インターフェロメトリ);コヒーレンス干渉法;拡散光学トモグラフィ及び蛍光媒介拡散光学トモグラフィ(連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム)、及び光散乱、吸収、偏光、ルミネセンス、フルオレセンス寿命、量子収率及び消光の測定などがあるが、これらに限らない。これらの技術についての詳細は、下記を参照されたい。Tuan Vo-Dinh (Editor): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (Editors): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC
上述した1工程標識プロセスのほかに、本発明は2工程標識及び検出プロセスにも関する。プロセスの第1工程で、上述したように少なくとも1つの基−L−RxがR1及び/又はR2位置に結合した本発明の化合物を使用して一次成分(例えば抗体、タンパク質、DNAプローブなど)に標識し、これにより一次成分に蛍光特性を付与する。プロセスの第2工程では、蛍光標識一次成分を二次成分(例えば上記抗体が特異的である抗原)を検出するプローブとして使用する。したがって、第5の観点によれば、サンプル中の二次成分を検出する方法が提供され、本方法は、
i)検出すべき二次成分を含有するか含有すると推測されるサンプルを一次成分と、相補的な特異的結合対を形成するのに適当な条件下で接触させ、ここで前記一次成分が下記式(I)の化合物で標識されており、
ii)前記標識一次成分を前記二次成分に結合して標識二次成分を形成し、
iii)前記標識二次成分を光学的方法で検出する
工程を含む。
上述した1工程標識プロセスのほかに、本発明は2工程標識及び検出プロセスにも関する。プロセスの第1工程で、上述したように少なくとも1つの基−L−RxがR1及び/又はR2位置に結合した本発明の化合物を使用して一次成分(例えば抗体、タンパク質、DNAプローブなど)に標識し、これにより一次成分に蛍光特性を付与する。プロセスの第2工程では、蛍光標識一次成分を二次成分(例えば上記抗体が特異的である抗原)を検出するプローブとして使用する。したがって、第5の観点によれば、サンプル中の二次成分を検出する方法が提供され、本方法は、
i)検出すべき二次成分を含有するか含有すると推測されるサンプルを一次成分と、相補的な特異的結合対を形成するのに適当な条件下で接触させ、ここで前記一次成分が下記式(I)の化合物で標識されており、
ii)前記標識一次成分を前記二次成分に結合して標識二次成分を形成し、
iii)前記標識二次成分を光学的方法で検出する
工程を含む。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
一実施形態では、式(I)の化合物におけるXは次式の基であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
別の実施形態では、式(I)の化合物におけるXは−O−であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
本発明の2工程標識及び検出方法は、互いに特異的結合親和性を有する分子であればどのような分子にも適用することができる。したがって、本発明の色素を用いて相補的な特異的結合対の一方の成分を標識することができ、そしてこの標識成分を相補的な特異的結合対の他方の成分への結合の検出に使用することができる。相補的な特異的結合対の例には、抗体/抗原、レクチン/糖タンパク質、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ホルモン/受容体、酵素/基質又は補因子、DNA/DNA、DNA/RNA及びDNA/結合タンパク質があるが、これらに限らない。
ある適用例では、本発明の色素をウェスタンブロット法に使用でき、この場合色素を蛍光色素ラベル(Cy3(登録商標)λmax570nm及びCy5 λmax670nm)と組み合わせて使用し、これにより三色多重波長蛍光検出を可能にする。この技法の1例では、ECL Plex蛍光ウェスタンブロット・システム(GE Healthcare社)を用いて多重タンパク質検出が可能である。本方法によれば、電気泳動分離後に、例えばポリアクリルアミドゲルによって、タンパク質を検出することができ、そのためにゲルを低蛍光性ニトロセルロース・メンブラン上にブロットする。次にブロットをタンパク質に特異な抗体とともにインキュベート(培養)し、その後蛍光色素標識種に特異な二次抗体を用いて、検出する。例えば、Ausubel et al (Eds), (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., 10.8.1-10.8.16参照。別の例では、本発明の適度に反応性の蛍光化合物をDNA又はRNA片にコンジュゲートし、次いで得られた蛍光標識コンジュゲートをDNA又はRNAの相補的鎖に結合させる。色素標識成分を、光学手段によって、好ましくはCCDカメラ、蛍光スキャナ又は共焦点イメージャなどのイメージャを用いる蛍光顕微鏡法により検出及び/又は定量することができる。
本発明はさらに、式(I)の色素を製造するのに適当な中間体及び方法に関する。したがって、第6の観点によれば、式(A)の化合物が提供される。
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rxは前記化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
Rpは成分であり、
基R3、R4、R5及びR6は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるが、基R3、R4、R5及びR6の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
基R3、R4、R5及びR6の少なくとも1つがフッ素であるのが好ましい。基R3、R4、R5及びR6の2つ以上がフッ素であるのがより好ましい。残りの基R3、R4、R5及びR6はH又は−SO3Hからなる群から選択される。R3、R4、R5及びR6位置のそれぞれがフッ素で置換されている式(A)の化合物が特に好適である。
或いは、式(A)の化合物は、R3、R4、R5及びR6位置の1つ、好ましくは2つ以下にペルフルオロC1−C4アルキル置換基を含んでよい。その残りの基R3、R4、R5及びR6はH又はFからなる群から選択される。ペルフルオロC1−C4アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが特に好ましい。
第7の観点によれば、本発明の化合物の製造方法が提供され、本方法は、a)式(A)の第1化合物をb)第1化合物と同じでも異なってもよい式(B)の第2化合物及びc)第1化合物と第2化合物との間にコンジュゲート結合を形成するのに適当な第3化合物(C)と反応させる工程を含む。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、
Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
好ましくは、Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択される。
−(CH2)k−SO3Hが−(CH2)3−SO3H又は−(CH2)4−SO3Hであるのが好ましい。
上記方法によれば、中間化合物(A)、(C)及び(B)を、1工程で又は複数工程プロセスにて反応させて、式(I)の化合物を形成することができる。構造(A)と(B)が同一である式(I)の対称な化合物は、式(A)(又は(B))の化合物を2モルの割合で1、3又は5個の炭素原子を有する適当な二官能性メチン片と反応させることにより、製造できる。例えば、置換N,N’−ジフェニルホルムアミジン又はオルトエステルを第3化合物(C)として用いて、トリメチンシアニン色素類似物を製造することができる。同様に、ペンタメチンシアニン色素類似物を製造するのに、適当に置換されたマロンジアルデヒドジアニルを用いることができ、ヘプタメチンシアニン色素類似物を製造するのに、グルタコン酸アルデヒドを用いることができる。反応は通常有機溶剤、例えばピリジン中で行い、加熱還流する。その後混合物を冷却し、エーテルなどの有機溶剤中に注ぐ。得られる固体又は半固体を、一連のメタノール/クロロホルム溶媒を用いてシリカゲルカラムでのクロマトグラフィにより精製することができる。
構造(A)と(B)が異なる式(I)の非対称な化合物は、2工程プロセスで製造するのが好都合である。本プロセスでは、まず中間化合物を形成するため、式(A)のインドリウム化合物を結合の形成に適当な化合物、例えば適当に置換されたN,N’−ジフェニルホルムアミジン又又はマロンアルデヒドジアニルと無水酢酸の存在下で反応させて、2−アニリノビニル又は4−アニリノ−1,3−ブタジエニル四級塩を形成する。中間の四級塩を第2の2−メチルインドリウム四級塩と反応させて、式(I)の化合物を得ることができる。複素環式環系を接合するポリメチン連結基を形成する別の中間体が既知であり、例えばHamer, F.M., "The Cyanine Dyes and Related Compounds", Interscience (1964)に記載されている。
CyはGE Healthcare UK社の登録商標である。
以下に実施例に言及して本発明を詳細に説明する。
フッ素化2−メチルベンゾオキサゾールを製造する一般手順
置換2−アミノフェノールとトリアルキルオルトエステルからベンゾオキサゾール誘導体を製造する一般的な方法はIraj Mohammadpoor-Baltork, Ahmad R. Khosropour, and Seyedeh F. Hojati, Monatshefte fur Chemie (2007), 138, 663-667に記載されている。以下の実施例は、フッ素化2−メチルベンゾオキサゾールの製造に上記方法を適用したものである。
置換2−アミノフェノールとトリアルキルオルトエステルからベンゾオキサゾール誘導体を製造する一般的な方法はIraj Mohammadpoor-Baltork, Ahmad R. Khosropour, and Seyedeh F. Hojati, Monatshefte fur Chemie (2007), 138, 663-667に記載されている。以下の実施例は、フッ素化2−メチルベンゾオキサゾールの製造に上記方法を適用したものである。
1. 6−フルオロ−2−メチルベンゾオキサゾール
2. 5−フルオロ−2−メチルベンゾオキサゾール
MS(MALDI−TOF):MH+=152
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=282、276、230nm
δH/ppm(400MHz,CDCl3):2.60(s,3H)、7.02(1H,td)、7.33(1H,dd)、7.39(1H,dd)
3. 5,6−ジフルオロ−2−メチルベンゾオキサゾール
MS(MALDI−TOF):MH+=170
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=282、278、273、227nm
δH/ppm(400MHz,CDCl3):2.65(s,3H)、7.33(1H,dd)、7.44(1H,dd)
4. 5,7−ジフルオロ−2−メチルベンゾオキサゾール
MS(MALDI−TOF):MH+=170
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=278、268、231nm
δH/ppm(400MHz,CDCl3):2.66(s,3H)、6.85(1H,td)、7.16(1H,ddd)
5−フルオロ及び6−フルオロ−2−メチルベンゾオキサゾールのN−アルキル化によるN−カルボキシアルキル及びN−スルホアルキル誘導体を生成する一般的な方法
5(6)−フルオロ−2−メチルベンゾオキサゾールのN−アルキル化によるN−カルボキシアルキル及びN−スルホアルキル誘導体の生成は、インドレニン類似体について文献に記載された方法(例えば、Mujumdar, R.B. et al, Bioconjugate Chemistry, (1993), 4, 105-111参照)に類似の方法により行うことができる。
5. 3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウムブロミド
6. 4−(6−フルオロ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
7. 4−(5−フルオロ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
8. 4−(5,6−ジフルオロ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
9. 4−(5,7−ジフルオロ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
10. 4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート
水素化ナトリウム(60wt%、NaH、12g=0.3mol)を乾燥DMF(100ml)でスラリーにした。得られた懸濁液を撹拌しながら0℃に冷却した。ここに2−メチルアセト酢酸エチル(50g、0.346mol)のDMF(25ml)溶液を、温度を10℃未満に保ち、かつ沸騰を抑制しながら滴下した。添加が完了し、水素の発生が終わったら、混合物を湯浴中で温めて透明淡黄色の溶液を得た。これを再び0℃に冷却した。温度を10℃未満に保ちながら、1,4−ブタンスルトン(45g、0.33mol)のDMF(25ml)溶液を15分間かけて添加した。添加完了後、混合物を50℃で16時間加熱した。次いで溶媒を真空下で蒸発乾固させ、残留物を水とジエチルエーテル間で分配した。水層は取っておき、有機層は新しい水で抽出した後に処分した。水抽出物を合わせて新しいエーテルで洗浄し、その後真空下で蒸発を行い生成物をワックス状の固体として得た。
δH/ppm(270MHz;D2O)4.23(2H,q)、2.9(2H,t様)、2.26(3H,s)、2.0〜1.6(6H,m)、1.36(3H,s)、1.26(3H,t)
10.2 5−メチル−6−オキソヘプタン−1−スルホン酸
5−(エトキシカルボニル)−5−メチル−6−オキソヘプタン−1−スルホン酸ナトリウム塩(実施例10.1)を濃塩酸(200ml)中で、TLCにより反応の終了が示されるまで(約3時間)90℃に加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、エタノール/ジクロロメタン混合溶離液)により精製し、5−メチル−6−オキソヘプタン−1−スルホン酸を49.6g得た。
δH/ppm(270MHz;D2O)2.9(2H,t様)、2.68(1H,m)、2.2(3H,s)、1.8〜1.3(6H,m)、1.18(3H,d)
10.3 2,3−ジメチル−3−(4−スルホブチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3H−インドール二ナトリウム塩
2,3,4,5−テトラフルオロアニリン(1.75g、0.01M)を濃HCl(280ml)に溶解した。フラスコを−10℃に保ち、そこにNaNO2(1当量)の水溶液(10ml)を滴下し、その後塩化スズ(II)(3.4g)の濃HCl溶液(40ml)を滴下した。反応を周囲温度に戻し、1時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を黄色塩として得た(7g)。
ヒドラジン塩及び粗生成物をスルホン化ケトン、即ち5−メチル−6−オキソヘプタン−1−スルホン酸(6g)とともに酢酸(50ml)に溶解した。この溶液を140℃で2時間加熱してオレンジ色の微細析出物の生じたオレンジ色の溶液を得た。溶媒を蒸発させ、茶色のガムを得た。逆相HPLC(0.1%TFA、水/アセトニトリル グラジエント)により生成物を単離した。
MS(MALDI−TOF):MH+=354
10.4 4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート
テトラフルオロインドール(実施例10.3)(150mg、4.2x10−4mol、1当量)をブロモヘキサン酸(15g、0.073mol、260当量)とともに窒素下140℃で24時間加熱した。生成物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、真空下で乾燥して茶色の塊を得た。LC−MSより主成分を4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネートであると確認し、これ以上精製せずに使用した。
MS(MALDI−TOF):MH+=470
11. 4−[4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3−(4−スルホブチル)−3H−インドリウム−1−イル]ブタン−1−スルホネート
MS(MALDI−TOF):MH+=354
10.4 4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート
テトラフルオロインドール(実施例10.3)(150mg、4.2x10−4mol、1当量)をブロモヘキサン酸(15g、0.073mol、260当量)とともに窒素下140℃で24時間加熱した。生成物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、真空下で乾燥して茶色の塊を得た。LC−MSより主成分を4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネートであると確認し、これ以上精製せずに使用した。
MS(MALDI−TOF):MH+=470
11. 4−[4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3−(4−スルホブチル)−3H−インドリウム−1−イル]ブタン−1−スルホネート
MS(MALDI−TOF):MH+=490
12. 4−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート
12.1 5,7−ジフルオロ−2,3−ジメチル−3−(4−スルホブチル)−3H−インドール
MS(MALDI−TOF)、MH+=317
12.2 4−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート
MS(MALDI−TOF)、MH+=432
13. 3−(5−カルボキシペンチル)−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート
濃硫酸(37.5g)を氷浴中で4℃に冷却した。2−メチルベンゾオキサゾール(Aldrich社製、コードNo.27,097−0)(22.5ml、25g)をゆっくり滴下し、それに伴い白色結晶が形成した。冷却した混合物に20%発煙硫酸(Aldrich社製、コードNo.32,355−1)(37.5ml)をゆっくり滴下し、次いで塩化第二鉄(125mg)を添加した。反応混合物を油浴中125℃で1.75時間加熱した。続いて、反応混合物を4℃に冷却したアセトンに滴下し、混合物を4℃で15分間撹拌した。茶色〜紫色固体を濾過により回収し、アセトン(100ml 2回)で洗浄し、乾燥した。KOHの2−プロパノール溶液での中和により生成物である2−メチル−6−スルホベンゾオキサゾールを薄茶色固体のカリウム塩に転化した。
13.2 3−(5−カルボキシペンチル)−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート
30℃に加温したテトラメチレンスルホン(25g)中の2−メチル−6−スルホベンゾオキサゾール(5g)に6−ブロモヘキサン酸(15g)を同量ずつ、3回に分けて添加した。反応混合物を140℃で終夜加熱し、その後約40℃に冷却し、続いて酢酸エチル(200ml)に添加した。濾過により生成物である2−メチル−3−カルボキシペンチル−6−スルホベンゾオキサゾールを集め、酢酸エチル(50ml 2回)で洗浄し、真空下で乾燥した。
30℃に加温したテトラメチレンスルホン(25g)中の2−メチル−6−スルホベンゾオキサゾール(5g)に6−ブロモヘキサン酸(15g)を同量ずつ、3回に分けて添加した。反応混合物を140℃で終夜加熱し、その後約40℃に冷却し、続いて酢酸エチル(200ml)に添加した。濾過により生成物である2−メチル−3−カルボキシペンチル−6−スルホベンゾオキサゾールを集め、酢酸エチル(50ml 2回)で洗浄し、真空下で乾燥した。
色素合成
14. 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物1)
14. 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物1)
MS(MALDI−TOF):MH+=391
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=385nm
14.2 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
4−{2−[(E)−2−アニリノビニル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル}ブタン−1−スルホネート(実施例14.1、60mg)及び4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホネート(実施例10、50mg)をピリジン(900μl)及び酢酸(900μl)に溶解し、その後無水酢酸(200μl)を添加した。混合物を100℃で3時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後HPLC(C18、水+0.1%TFAを含むアセトニトリル)により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物(色素)を得た。
MS(MALDI−TOF):MH+=765
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=504nm
蛍光(MeOH):励起λmax=503nm;発光λmax=529nm
精密質量:MH+=C33H38N2F5O9S2 +理論値765.1939、実測値MH+=765.1981(5.5ppm)
15. 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物2)
MS(MALDI−TOF):MH+=729
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=511nm
蛍光(MeOH):励起λmax=511nm;発光λmax=535nm
16. 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物3)
MS(MALDI−TOF):MH+=391
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=386nm
16.2 4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート
4−{2−[(E)−2−アニリノビニル]−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル}ブタン−1−スルホネート(実施例16.1、50mg)及び4−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3H−インドリウム−3−イル]ブタン−1−スルホン酸(実施例10、50mg)をピリジン(900μl)及び酢酸(900μl)に溶解し、その後無水酢酸(200μl)を添加した。混合物を100℃で3時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後HPLC(C18、水+0.1%TFAを含むアセトニトリル)により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物(色素)を得た。
MS(MALDI−TOF):MH+=765
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=506nm
蛍光(MeOH):励起λmax=508nm;発光λmax=531nm
17. 4−[(2E)−2−((2E)−3−{3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−2−イル}プロパ−2−エニリデン)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−1−イル]ブタン−1−スルホネート(化合物4)
MS(MALDI−TOF):MH+=403
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=385nm
17.2 4−[(2E)−2−((2E)−3−{3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−2−イル}プロパ−2−エニリデン)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−1−イル]ブタン−1−スルホネート
2−[(E)−2−アニリノビニル]−3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム=アセテート(実施例17.1、30mg)及び4−[4,5,6,7−テトラフルオロ−2,3−ジメチル−3−(4−スルホブチル)−3H−インドリウム−1−イル]ブタン−1−スルホネート(実施例11、60mg)をピリジン(900μl)及び酢酸(900μl)に溶解し、その後無水酢酸(200μl)を添加した。混合物を100℃で3時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後HPLC(C18、水+0.1%TFAを含むアセトニトリル)により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物(色素)を得た。
MS(MALDI−TOF):MH+=799
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=508nm
蛍光(MeOH):励起λmax=509nm;発光λmax=532nm
18. 4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物5)
MS(MALDI−TOF):MH+=597
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=488nm
蛍光(MeOH):励起λmax=487nm;発光λmax=504nm
精密質量:MH+=C30H27N2F2O7S+理論値597.1507、実測値MH+=597.1510(0.5ppm)
19. 4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−5,6−ジフルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物6)
MS(MALDI−TOF):MH+=615
UV/VIS(MeOH):吸収λmax=490nm
蛍光(MeOH):励起λmax=490nm;発光λmax=505nm
精密質量:MH+=C30H26N2F3O7S+理論値615.1413、実測値MH+=615.1421(1.3ppm)
20. 3−(5−カルボキシペンチル)−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物7)
MS(MALDI−TOF):MH+=827
21. カルボキシ色素の活性化:3−{6−[(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ]−6−オキソヘキシル}−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物8)の製造
22. 抗体コンジュゲート形成
サイズ排除クロマトグラフィー(Biorad社製、脱塩カラムEcono−Pac10DG)を使用して、ヤギ抗マウスIgG(Rockland社製;PBS/アジド中0.5mg)をNaHCO3バッファ(0.1M;pH9.2)でバッファ交換した。溶液の濃度はUV分光法で測定した。化合物8(8モル当量)をDMFに溶解し、次いでIgG溶液に添加し、室温で1時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィーによりPBS(0.1M;pH7.2)を用いて、反応混合物を精製した。色素/タンパク質の比をUV分光法により求めた。生成物を凍結乾燥により単離した。
サイズ排除クロマトグラフィー(Biorad社製、脱塩カラムEcono−Pac10DG)を使用して、ヤギ抗マウスIgG(Rockland社製;PBS/アジド中0.5mg)をNaHCO3バッファ(0.1M;pH9.2)でバッファ交換した。溶液の濃度はUV分光法で測定した。化合物8(8モル当量)をDMFに溶解し、次いでIgG溶液に添加し、室温で1時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィーによりPBS(0.1M;pH7.2)を用いて、反応混合物を精製した。色素/タンパク質の比をUV分光法により求めた。生成物を凍結乾燥により単離した。
23. 光安定性試験
光安定性試験を以下のように行った。すべての蛍光色素を水に溶解し、強い光源に露光した。
光安定性試験を以下のように行った。すべての蛍光色素を水に溶解し、強い光源に露光した。
強い光源としてWallac light box(1295−013)を用いた。サンプルを光源より22cm上に保持し、連続露光した。各サンプルのUV/可視スペクトルを24時間毎に測定した。各測定ポイントで同じキュベット及び分光光度計を使用した。以下の実験を行った。
抗マウスIgG:化合物8コンジュゲートの光安定性を非フッ素化類似物Cy2:IgGコンジュゲートと比較して試験した。各実験データを正規化し、図1にプロットした。結果から、フッ素化色素が非フッ素化色素類似物と比べてより優れた耐光退色性を有することがわかる。
24. ウェスタンブロッティング
アクチン(Sigma社製;A3653)をサンプルローディングバッファSLB(0.5Mトリス−HCl、SDS、グリセリン、ブロモフェノールブルー)で希釈して、1μg/μlの原液を作製した。このタンパク質をさらにSLBで1/30に希釈し、12%トリスグリシンゲル(Invitrogen社製Novex(登録商標);EC60055BOX)上にのせ、100Vで約2時間泳動させた。終夜でタンパク質をHybond LFPメンブレン(GE Healthcare社製)に移動し、固定化した後、メンブレンを一次抗体(Sigma社製;モノクローナル抗アクチン;A4700)で処理した。一連の洗浄工程後、メンブレンを、洗浄/固定化溶液(PBS、0.1%Tween−20)で1/2500に希釈したヤギ抗マウスIgG:化合物8コンジュゲート(実施例22)と1時間インキュベートした。さらに一連の洗浄工程後、メンブレンを37℃で1時間乾燥し、Typhoon8600(フィルター・セット=フルオレセイン;PMT=550V;画素サイズ=100μm)により分析した。結果を図2に示す。
アクチン(Sigma社製;A3653)をサンプルローディングバッファSLB(0.5Mトリス−HCl、SDS、グリセリン、ブロモフェノールブルー)で希釈して、1μg/μlの原液を作製した。このタンパク質をさらにSLBで1/30に希釈し、12%トリスグリシンゲル(Invitrogen社製Novex(登録商標);EC60055BOX)上にのせ、100Vで約2時間泳動させた。終夜でタンパク質をHybond LFPメンブレン(GE Healthcare社製)に移動し、固定化した後、メンブレンを一次抗体(Sigma社製;モノクローナル抗アクチン;A4700)で処理した。一連の洗浄工程後、メンブレンを、洗浄/固定化溶液(PBS、0.1%Tween−20)で1/2500に希釈したヤギ抗マウスIgG:化合物8コンジュゲート(実施例22)と1時間インキュベートした。さらに一連の洗浄工程後、メンブレンを37℃で1時間乾燥し、Typhoon8600(フィルター・セット=フルオレセイン;PMT=550V;画素サイズ=100μm)により分析した。結果を図2に示す。
Claims (42)
- 次の式(I)の化合物。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rx又は−L−Rpであり、Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、Rpは成分であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
- 次の式(II)で表される、請求項1記載の化合物。
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
R11はCH3又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - 次式(III)で表される、請求項1又は請求項2記載の化合物。
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rx又は−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - 基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素である、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の化合物。
- 基R3、R4、R5及びR6の2つ以上及び/又はR7、R8、R9及びR10の2つ以上がFであり、残りの基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9又はR10がH又は−SO3Hからなる群から選択される、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の化合物。
- 基R3、R4、R5及びR6及び/又はR7、R8、R9及びR10がFである、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の化合物。
- 基R3、R4、R5及びR6の1つ以上及び/又はR7、R8、R9及びR10の1つ以上がペルフルオロC1−C4アルキルであり、残りの基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10がH又はFからなる群から選択される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の化合物。
- R3、R4、R5又はR6位置の2つ以下及び/又はR7、R8、R9又はR10位置の2つ以下がペルフルオロC1−C4アルキルで置換されている、請求項8記載の化合物。
- ペルフルオロC1−C4アルキルがトリフルオロメチルである、請求項8又は請求項9記載の化合物。
- −(CH2)k−SO3Hが−(CH2)3−SO3H又は−(CH2)4−SO3Hである、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の化合物。
- 基Rxがターゲット物質上の官能基と反応する反応性基又はターゲット物質上の反応性基と反応する官能基を含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の化合物。
- 前記反応性基がスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項12記載の化合物。
- 前記官能基がヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートからなる群から選択される、請求項12記載の化合物。
- 基Rxが親和性タグを含む、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の化合物。
- 連結基Lが直鎖状又は分岐状C1−C20アルキル鎖からなる群から選択され、−O−、−NR’−、−C(O)−NR’−及びフェニレンからなる群から選択される結合を1以上含んでもよく、式中、R’は水素又はC1−C4アルキルである、請求項1乃至請求項15のいずれか1項記載の化合物。
- Lが5〜12個の原子を含む、請求項16記載の化合物。
- Lが基−(CH2)p−Q−(CH2)r−(式中、Qは−CH2−又は−CO−NH−を示し、pは1〜5、rは0〜5である。)である、請求項16又は請求項17記載の化合物。
- i)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物1);
ii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−5,7−ジフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物2);
iii)4−(2−{(1E,3E)−3−[1−(5−カルボキシペンチル)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−5−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物3);
iv)4−[(2E)−2−((2E)−3−{3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−2−イル}プロパ−2−エニリデン)−4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−3−(4−スルホブチル)−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−1−イル]ブタン−1−スルホネート(化合物4);
v)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物5);
vi)4−(2−{(1E,3Z)−3−[3−[4−(カルボキシメチル)ベンジル]−6−フルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−2(3H)−イリデン]プロパ−1−エニル}−5,6−ジフルオロ−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−3−イル)ブタン−1−スルホネート(化合物6);
vii)3−(5−カルボキシペンチル)−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物7);及び
viii)3−{6−[(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ]−6−オキソヘキシル}−2−{(1E,3E)−3−[4,5,6,7−テトラフルオロ−3−メチル−1,3−ビス(4−スルホブチル)−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−イリデン]プロパ−1−エニル}−1,3−ベンゾオキサゾール−3−イウム−6−スルホネート(化合物8)
からなる群から選択される化合物。 - 成分の標識方法であって、
i)前記成分を下記式(I)の化合物と接触させ、
ii)前記化合物を前記成分とともに、化合物を成分に結合するのに適当な条件下でインキュベートし、これにより前記成分を標識する
工程を含む方法。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 式(I)の化合物におけるXが次式の基であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する、
請求項20記載の方法。 - Xが−O−であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する、
請求項20又は請求項21記載の方法。 - 基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素である、請求項20乃至請求項23のいずれか1項記載の方法。
- 基R3、R4、R5及びR6の2つ以上がF及びCF3からなる群から選択され、残りの基R3、R4、R5又はR6がHである、請求項20乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。
- R3、R4、R5及びR6位置それぞれ及び/又はR7、R8、R9及びR10位置それぞれがフッ素置換されている、請求項20乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。
- 前記成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)ヌクレオチド、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択される、請求項20乃至請求項26のいずれか1項記載の方法。
- 式(I)で表される、成分の蛍光標識色素コンジュゲート。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rpであり、Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Rpは成分であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rpでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - Xが−O−又は−S−であるとき、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択される、請求項28記載の色素コンジュゲート。
- Xが次式の基であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する、
請求項28記載の色素コンジュゲート。 - Xが−O−であり、
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、L及びRxは前記定義の通り、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択され、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つはフッ素を含有する、
請求項28記載の色素コンジュゲート。 - 基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素である、請求項28乃至請求項31のいずれか1項記載の色素コンジュゲート。
- 前記成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)ヌクレオチド、(アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の1以上を含有するか含有するよう誘導体化された)オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択される、請求項28乃至請求項32のいずれか1項記載のコンジュゲート。
- 請求項28乃至請求項33のいずれか1項記載の色素コンジュゲートを生体適合性キャリヤとともに哺乳動物への投与に適当な形態で含有する、製剤。
- 蛍光色素が前記定義の通りのBTMを含有する成分にコンジュゲートしている、請求項34記載の製剤。
- 請求項28乃至請求項33のいずれか1項記載の蛍光標識成分の分析又は検出用試薬としての使用。
- 請求項34記載のBTMの色素コンジュゲート又は請求項35記載の製剤を使用して、in vivoでBTMの局在化部位のイメージを得る工程を含む、哺乳動物体のin vivo光イメージング方法。
- 請求項34記載の色素コンジュゲート又は請求項35記載の製剤を予め哺乳動物体に投与しておく、請求項37記載の方法。
- サンプル中の二次成分の検出方法であって、
i)検出すべき二次成分を含有するか含有すると推測されるサンプルを一次成分と、相補的な特異的結合対を形成するのに適当な条件下で接触させ、ここで前記一次成分が下記式(I)の化合物で標識されており、
ii)前記標識一次成分を前記二次成分に結合して標識二次成分を形成し、
iii)前記標識二次成分を光学的方法で検出する
工程を含む方法。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数であり、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。 - 前記相補的な特異的結合対が、抗体/抗原、レクチン/糖タンパク質、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ホルモン/受容体、酵素/基質又は補因子、DNA/DNA、DNA/RNA及びDNA/結合タンパク質よりなる群からなる群から選択される、請求項39記載の方法。
- a)式(A)の第1化合物をb)第1化合物と同じでも異なってもよい式(B)の第2化合物及びc)第1化合物と第2化合物との間にコンジュゲート結合を形成するのに適当な第3化合物と反応させる工程を含む方法。
基R1及びR2の少なくとも1つは基−L−Rxであり、Lは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される1〜20個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Rxは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基R1及びR2のいずれかが前記基−L−Rxでないとき、その残りの基R1又はR2はC1−C4アルキル又は−(CH2)k−SO3Hであり、
基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は各々独立に水素、−SO3H及び基−(CF2)m−F(式中、mは0又は1〜4の整数である。)からなる群から選択されるか、R3とR4又はR5とR6及び/又はR7とR8又はR9とR10は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、1以上の−SO3H又は−(CF2)m−F(mは前記の通り)で置換されていてもよく、
kは1〜10の整数、nは1〜3の整数であるが、基R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10の少なくとも1つがフッ素を含有することを条件とする。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63259654A (ja) * | 1987-04-17 | 1988-10-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
JPH0728185A (ja) * | 1993-05-11 | 1995-01-31 | Fuji Photo Film Co Ltd | メチン化合物および該化合物を含有するハロゲン化銀感光材料 |
JPH1180140A (ja) * | 1997-09-09 | 1999-03-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | ベンゾオキサゾリウム誘導体の製造方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5569587A (en) * | 1986-04-18 | 1996-10-29 | Carnegie Mellon University | Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes |
US6048982A (en) * | 1986-04-18 | 2000-04-11 | Carnegie Mellon University | Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods |
US5268486A (en) * | 1986-04-18 | 1993-12-07 | Carnegie-Mellon Unversity | Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes |
EP0287100B1 (en) * | 1987-04-17 | 1995-07-19 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Silver halide photographic material |
US5534403A (en) * | 1993-04-16 | 1996-07-09 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Silver halide photographic material |
US5439789A (en) * | 1993-05-11 | 1995-08-08 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Methine compound and silver halide photographic material comprising the same |
EP0821266A1 (en) * | 1996-07-24 | 1998-01-28 | Agfa-Gevaert N.V. | Photothermographic recording material comprising sensitizing dyes and a recording process therefor |
AU2001294859A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
US6824968B2 (en) * | 2002-10-11 | 2004-11-30 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Silver halide color reversal photographic light-sensitive material |
WO2005056687A2 (en) * | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Molecular Probes, Inc. | Methine-substituted cyanine dye compounds |
CA2605114C (en) * | 2005-04-22 | 2013-10-29 | Ge Healthcare Uk Limited | Water-soluble fluoro-substituted cyanine dyes as reactive fluorescence labelling reagents |
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JPH0728185A (ja) * | 1993-05-11 | 1995-01-31 | Fuji Photo Film Co Ltd | メチン化合物および該化合物を含有するハロゲン化銀感光材料 |
JPH1180140A (ja) * | 1997-09-09 | 1999-03-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | ベンゾオキサゾリウム誘導体の製造方法 |
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