KR20110033763A - 물질 표지용 벤즈인도시아닌 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법 - Google Patents

물질 표지용 벤즈인도시아닌 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 분자 표지를 위한 다음 화학식 1로 표시되는 신규 벤즈인도시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00082

식 중에서, R1, R2, R3, R4, B, m 및 n은 각각 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

물질 표지용 벤즈인도시아닌 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법{Benzindocyanine compound for labeling material, intermediate therefore, and process for producing the same}
본 발명은 다양한 생체분자에 형광 표지가 가능한 신규 벤즈인도시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는 기본 구조가 되는 아미노산(amino acid)의 구조로부터 유추할 수 있다. 그 예로는 아미노산 잔기를 들 수 있는데, 구체적으로는 라이신(lysine)의 아미노기(-CH2CH2CH2CH2NH2), 시스테인(cystein)의 티올기(-CH2SH), 히스티딘(histidine)의 이미다졸 아민기(
Figure pat00001
), 트레오닌(threonine)의 2차 지방족 히드록시기(-CH2CH(OH)CH3), 세린(serine)의 1차 지방족 히드록시기(-CH2OH), 티로신(tyrosine)의 페놀 히드록시기(
Figure pat00002
) 등이 있다. 아미노산의 N-말단 아미노기(-COCHRNH2)와의 결합도 가능하다. 또한, 염료의 반응기는 당(sugar), 당단백(glycoprotein), 항체(antibody) 등의 생체 분자와 결합할 수도 있다.
현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다.
단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 아래와 같은 것들이 있다.
Figure pat00003
위와 같은 반응기 이외에도 많은 연구자들과 기업에서는 성능이 더 우수한 반응기 중간체를 설계하고 있다. 대부분 생체 분자와의 반응 시간이 빠르고 결합 성능이 우수하지만 수용액 상태에서 안정하지 않고, 열에 취약하거나 반응 후에 이탈기가 떨어져 나가면서 부산물이 발생하는 것이 일반적이다.
수용성 형광 염료는 최근에는 바이오 분야에서의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 수용성 형광 염료를 생체 분자에 도입하기 위해서는 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 한다. 그러나, 이와 같은 여러 가지 요구 조건들로 인하여 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.
모든 염료가 형광을 나타내는 것은 아니다. 다양한 분야의 연구자들이 형광을 나타낼 수 있는 발색단(chromophore)을 가진 염료를 개발하였다. 지금까지 알려진 형광 물질(fluorophore)의 대표적인 예로는 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 아크리딘(acridines), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 등을 들 수 있고, 이들과 유사한 구조의 유도체들도 연구되고 있다. 이러한 형광 물질들은 앞에서 기술한 다양한 생체 분자 결합용 반응기에 도입되어 다양한 상품으로 시판되고 있다.
상기와 같은 다수의 형광 염료 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광을 나타내도록 하기 위해서는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것이 중요하다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 형광 염료로는 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌을 들 수 있다.
여러 연구자들에 의하여 실험자의 목적에 따라 단백질의 친핵체, 즉, 아민기, 티올기, 히드록시기, 그리고 친전자체인 알데하이드기, 케톤기, 카르복실산기 등에 결합할 수 있는 반응기를 도입한 생체 분자 표지용 색소 및 형광 염료가 소개되었다.
시아닌 염료는 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수(absorption) 및 발광(emission) 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광 계수를 나타내는 등 많은 장점이 있다. 하기 화학식은 문헌에 나와 있는 시아닌 염료의 일반 구조와, 유도체로 알려져 있는 헤테로 화합물의 기본 구조이다.
Figure pat00004
시아닌 염료로서 상업적으로 가장 많이 활용되고 있는 것은 헤테로 고리로서 인돌(indole) 구조를 포함하고, 염료의 반응기로서 아미노산의 아미노기에 결합할 수 있는 숙신이미딜 에스터기를 갖는 화합물이 알려져 있다. 그 예로서 지이 헬스케어의 미국 특허 제5268486호, 제6043025호, 제6127134호와, 국제 공개 공보 제9633406호에서는 숙신이미딜 에스터를 다양한 시아닌 염료 구조에 도입하고, 항체, 펩타이드 등 결합 가능한 생체 분자에 대한 염색 방법도 예시하고 있다. 하기 화학식은 상품화되어 있는 대표적인 구조로서, 지이 헬스케어(GE Healthcare)에서 Cy3, Cy5 및 Cy7이라는 상품명으로 시판되는 것들이다.
Figure pat00005
그러나, 이러한 숙신이미딜 에스터의 경우는 수용액 중에서 안정하지 않아 오랜 반응 시간 동안 안정한 상태로 유지할 수 없다는 단점 이외에 염색 반응 시에 필수적으로 N-히드록시 숙신이미드가 부산물로서 생성된다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하는 것은 물론, 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상된 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보이는 표지 대상 물질, 그 제조방법 및 본 발명의 물질 표지용 물질을 포함하는 생체 분자 등 물질을 제공하고자 한다.
특히, 본 발명이 해결하고자 하는 과제 중 하나는 프로테오믹스(proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있으며, 수용액 상에서 안정하고 생체분자와의 반응시에 부산물이 발생하지 않는 신규한 벤즈인도시아닌 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 다음 화학식 1로 표시되는 신규 벤즈인도시아닌 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 의하여 달성된다.
Figure pat00006
상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;
상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH2)L1SO2CH=CH2, -CONH-p-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-m-(C6H4)SO2CH=CH2이고; 상기 L1은 1 내지 5의 정수이며;
상기 B는(CH2)L2, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, 상기 L2는 1 내지 5의 정수이며; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1-8의 정수, 가장 바람직하게는 1-7의 정수이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 물질 표지용 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 염에서 이루어진 군에서 선택된다.
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
다른 구현예에 따르면, 본 발명의 물질 표지용 화합물의 형광 파장대는 500 내지 800 nm이다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 물질 표지용 화합물은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 표지된다. 본 발명에 있어서, 생체 분자의 예에는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 물질 표지용 화합물을 사용하여 물질을 표지하는 방법을 개시하며, 상기 표지 대상 물질은 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물이며 작용기로서 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 물질의 표지는 본 발명의 물질 표지용 화합물의 비닐 설폰기와, 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물의 아민기, 수산화기 또는 티올기가 반응하여 결합된다.
다른 구현예에 따르면, 상기 물질 표지 방법에서 사용되는 용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 이루어진 군에서 선택된 완충액이거나, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매이거나, 또는 물이다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 표지는 pH 5 내지 12에서 이루어진다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 표지는 본 발명의 물질 표지용 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 반응시키는 것에 의하여 이루어진다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 물질로서, 본 발명의 물질 표지용 화합물로 표지되어 있는 표지 물질을 개시한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 물질 표지용 화합물의 제조 중간체인 다음 화학식 10의 화합물을 개시한다.
Figure pat00010
식 중에서, 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기 또는 설폰산염기이고; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 벤즈인도시아닌 화합물의 제조 방법을 개시한다. 상기 제조방법은
(1) 다음 화학식 4의 화합물을 화학식 5 또는 7의 화합물과 반응시켜 화학식 6a의 화합물을 얻는 단계,
Figure pat00011
Figure pat00012
[화학식 6a]
Figure pat00013
Figure pat00014
(2) 상기 화학식 6a의 화합물을 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는 단계,
Figure pat00015
Figure pat00016
(3) 상기 화학식 9의 화합물을 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는 단계,
[화학식 6a]
Figure pat00017
[화학식 10]
Figure pat00018
(4) 상기 화학식 10의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는 단계, 및
[화학식 11a]
Figure pat00019
[화학식 11b]
Figure pat00020
(5) 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 휘니그 염기 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함한다.
Figure pat00021
[화학식 1]
Figure pat00022
상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;
상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH2)L1SO2CH=CH2, -CONH-p-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-m-(C6H4)SO2CH=CH2이고; 상기 L1은 1 내지 5의 정수이며;
R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기(-OSO3H)이고; A는 수소 또는 아세틸기이고; X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이고;
상기 B는(CH2)L2, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, 상기 L2는 1 내지 5의 정수이며; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법 및 이를 이용한 다양한 용매, 예를 들면 완충액(buffer solution) 내에서 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 상기 화학식 1의 화합물로 표지하는 방법(binding protocol)이 제공된다.
본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 특히 프로테오믹스(proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자 등 표지 대상 물질의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명품은 생체분자 연구자들이 표지 실험 수행 시 보다 안정적으로 염료를 다룰 수 있도록 하며 특히 생체분자와 염료의 결합 후 부산물이 발생하지 않아 부수적인 정제 작업을 피할 수 있게 된다. 또한 높은 안정성으로 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 고분자 생체 분자의 장시간 염색이나 보다 복잡한 생체 분자를 다루는 사용자들에게도 보다 효과적으로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 물질 표지 대상 물질은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상되는 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보인다.
도 1은 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이다.
도 2은 종양이 이종이식된 누드마우스를 Cy7.5 및 화합물 1-2가 각각 표지된 펩타이드를 혈관 내로 주입하고 이들의 생체 내 표적을 형광을 이용해 영상화한 것이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 벤즈인도시아닌 화합물에는 비닐 설폰기가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 비닐 설폰기의 비닐기는 생체 분자의 친핵체와 아래와 같은 반응으로 결합하므로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 생체 분자와의 반응 후에 부산물을 생성시키지 않는다.
Figure pat00023
본 발명에 따른 벤즈인도시아닌 염료 화합물은 대부분의 생체 분자에 적용 시의 매질인 물을 대상으로 하고 열에 대해서도 안정하도록 설계되었다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 벤즈인도시아닌 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 설명한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법에서는 다음 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응식 1a에 예시된 바와 같이 반응시켜 화학식 4의 화합물을 얻고, 이를 출발 물질로서 사용한다.
Figure pat00024
Figure pat00025
[화학식 4]
Figure pat00026
[반응식 1]
Figure pat00027
상기 화학식 2 내지 4 및 반응식 1에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 화합물을 제조함에 있어서는 먼저 상기 화학식 4의 화합물을 반응식 2 및 3에 예시된 바와 같이 다음 화학식 5 및 7의 화합물과 각각 반응시켜, 화학식 6a 및 6b의 화합물을 얻는다.
[화학식 5]
Figure pat00028
[화학식 6a]
Figure pat00029
[화학식 6b]
Figure pat00030
[화학식 7]
Figure pat00031
[반응식 2]
Figure pat00032
[반응식 3]
Figure pat00033
상기 화학식 5 내지 7과, 반응식 2 및 3에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 m은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이다.
상기 반응식 2는 R4가 수소 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기인 화학식 6a의 화합물을 제조하는 방법을, 반응식 3은 R4가 카르복시기인 화학식 6b의 화합물을 제조하는 방법을 각각 예시한 것이다.
다음으로, 상기 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응식 4에 예시된 바와 같이 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는다.
[화학식 8]
Figure pat00034
[화학식 9]
Figure pat00035
[반응식 4]
Figure pat00036
상기 화학식 8 및 9와, 반응식 4에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, A는 수소 또는 아세틸기이다.
상기 화학식 8의 화합물은 n이 1인 경우 N,N-디페닐 포름아미딘(DPF)이고, n이 2인 경우 말론알데히드 디아닐 히드로클로라이드(MDH)이고, n이 3인 경우 글루타콘알데히드 디아닐 히드로클로라이드(GDH)이다.
다음으로, 상기 화학식 9의 화합물을 반응식 5에 예시된 바와 같이 상기 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는다.
[화학식 10]
Figure pat00037
[반응식 5]
Figure pat00038
상기 화학식 10 및 반응식 5에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.
다음으로, 상기 화학식 10의 화합물을 반응식 6에 예시된 바와 같이 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI) 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는다.
[화학식 11a]
Figure pat00039
[화학식 11b]
Figure pat00040
상기 화학식 11a 및 11b에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.
[반응식 6]
Figure pat00041
상기 반응식 6에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R6은 이미다졸기 또는 숙신이미딜옥시기이다.
다음으로, 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 반응식 7에 예시된 바와 같이 휘니그 염기(Hunig's base) 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는다.
[화학식 12]
Figure pat00042
[반응식 7]
Figure pat00043
상기 화학식 12 및 반응식 7에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기(-OSO3H)이고, B는(CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, l은 1 내지 5의 정수이다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 신규 벤즈인도시아닌 화합물을 이용하여 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법(binding protocol)에 관한 것이다.
상기 생체 분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드(peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 글라이코프로틴(glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다.
상기 표지는 화학식 1 화합물에 존재하는 비닐 설폰기와 상기 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물, 구체적으로는 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존의 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.
따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 화학식 1의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질에 관한 것이다.
생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.
실시예
이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.
먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다.
FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 400을 사용하였고, MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다.
합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Hewlett-Packard사의 HP 8452 배열 분광 광도계(diode array spectrophotometer)로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 얻었다.
유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)에는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)(PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4를 사용하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18(40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다. HPLC는 Agilent사의 1100 시리즈에 Waters사의 Bondapak C18 10 μm 125A를 장착하여 사용하였다.
겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치(mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply(Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels(Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액(running buffer) 및 로딩 완충액(loading buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다.
- 5 x running buffer 제조
· 3 g Tris(Trizma base, Sigma)
· 14.4 g Glycine(Sigma)
· 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관
- 5 x loading buffer 제조
· 0.6 mL의 1 M Tris(Trizma base, Sigma)
5 mL의 50% 글리세롤(glycerol)
· 2 mL의 10% SDS
· 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올(mercaptanethanol)
· 1.9 mL의 10% 증류수(bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)
단백질은 GE Healthcare사와 Takara에서 시판 중인 Size Marker들을 사용하였다. 표지된 생체 분자의 관찰 및 형광 강도(intensity)의 측정에는 Perkin Elmer사의 Geliance 600 장비를 이용하였고, 광원은 Geliance UV Epi(Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi(Catalog No. L7110027)이었고, 필터는 UV Filter, Geliance Short Pass Filter(500∼600 nm), Geliance Long Pass Filter(580 내지 660 nm), Geliance Blue Light Filter(550∼600 nm)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.
시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d 6 또는 D2O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이(chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도(chemical shift multiplicity)(s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant(Hz)의 순으로 기록하였다.
실시예 1: 화합물 1-1의 제조
(1) 화합물 2-1의 합성
Figure pat00044
6-아미노-1,3-나프탈렌 디설포네이트 디소디움염(6-amino-1,3-naphthalene disulfonate disodium salt)(10 g, 29 mmol, 1 eq, TCI)을 30 mL 물에 넣고 완용한 후 50 mL의 물과 진한염산 15 mL을 투입하였다. 반응액을 섭씨 0 ℃ 이하로 냉각한 후 아초산(sodium nitrite)(2.2 g, 32 mmol, 1.1 eq)을 물 40 mL로 용해하여 1 시간동안 주가하였다. 스태노스 클로라이드(stannous chloride)(11 g, 58 mmol, 2 eq, Aldrich)를 30 mL의 물에 완용하고, 6 mL의 진한염산을 투입하여 20 분동안 반응액에 주가한 후 상온에서 일야교반 하였다. 반응액을 감압건조 한 후 이소프로필 알코올을 투입하여 입자를 생성하였다. 생성된 입자를 여과하고 이소프로필 알코올을 사용하여 세척한 후 감압건조 하였다.(9 g, 97 %)
Rf = 0.95(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(2) 화합물 4-1의 합성
Figure pat00045
화합물 2-1(10 g, 25 mmol, 1 eq)과 이소프로필 메틸 케톤(isopropyl methyl ketone)(12 g, 140 mmol, 5.6 eq), 포타슘 아세테이트( 6g, 61 mmol, 2.4 eq)를 75 mL의 빙초산에 함께 투입하여 24 시간동안 가열 환류하여 반응시켰다. 반응액을 상온으로 냉각하여 감압건조를 통해 빙초산을 제거하였다. 반응물을 메탄올에 완용시킨 후 여과하였다. 여과액을 농축시킨 후 이소프로필 알코올을 사용하여 수차례 세척한 후 감압 건조하였다.(9.6 g, 100 %)
Rf = 0.80(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(3) 화합물 6a-1의 합성
Figure pat00046
화합물 4-1(4.6 g, 12.5 mmol, 1 eq)과 에틸 아이오다이(ethyl iodide)(3.6 g, 23 mmol, 1.84 eq)를 DMF 25 mL에 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 에틸 아이오다이드를 제거하고, 100 mL의 아세톤으로 3, 4회 세정하고, 여과한 후, 40 ℃에서 감압 건조시켜, 분홍색의 고체를 얻었다.(3.6 g, 73 %)
Rf = 0.55(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(4) 화합물 6b-1의 합성
Figure pat00047
화합물 4-1(5 g, 13.6 mmol, 1 eq)과 6-브로모-n-헥산산(6-bromo-n-hexanoic acid)(4.9 g, 25 mmol, 1.84 eq, Aldrich)을 20 mL의 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다.(6.5 g, 98 %)
Rf = 0.60(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(5) 화합물 9-1의 합성
Figure pat00048
화합물 6a-1(6.53 g, 15 mmol, 1 eq)과 MDH(4.4 g, 17 mmol, 1.13 eq, TCI)를 30 mL의 아세트산과 30 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 입자를 생성시켜 여과하고 감압 건조시켜 적색의 고체를 얻었다.(2.57 g, 30 %)
Rf = 0.48(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(5) 화합물 10-1의 합성
Figure pat00049
화합물 9-1(3.5 g, 11.8 mmol, 1 eq)와 화합물 6b-1(3.08 g, 11.8 mmol, 1 eq)을 30 mL의 무수 아세트산과 30 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 110 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15 % 메탄올 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 청색 고체의 화합물 10-1을 얻었다.(0.54 g, 5 %)
Rf = 0.75(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.98(t, 2H), 8.43(t, 4H), 8.23(s, 2H), 7.72(d, 2H), 6.62(t, 1H), 6.35(d, 2H), 4.38-4.20(m, 4H), 2.19(t, 2H), 2.11-1.20(m, 21H)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C41H45N2O14S4 917.17, 측정치 917.53
λabs (물) : 675 nm, λfl (물) : 695 nm
(6) 화합물 1-1의 합성
Figure pat00050
화합물 10-1(100 mg, 0.109 mmol, 1 eq)을 DMF 2 mL에 녹이고 60 ℃로 승온하였다. 0.1 mL의 피리딘에 용해시킨 후 DSC(81.8 mg, 0.327 mmol, 3 eq)를 DMF 0.8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 2 mL에 녹이고, 141 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(22.7 mg, 0.109 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 청색 고체 화합물 1-1 을 얻었다.(23 mg, 20 %)
Rf = 0.54(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.02(t, 2H), 8.45(m, 4H), 8.21(s, 2H), 7.72(m, 2H), 6.97(m, 1H), 6.65(t, 1H), 6.52(t, 1H), 6.38(d, 2H), 6.26(m, 1H), 4.17-4.09(m, 4H), 3.12(m, 2H), 2.93(m, 2H), 2.01(t, 2H, J = 7.13 Hz), 1.68-1.23(m, 21H)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C45H52N3O15S5 1034.19, 측정치 1034.52
λabs (물) : 675 nm, λfl (물) : 695 nm
실시예 2: 화합물 1-2의 제조
(1) 화합물 9-2의 합성
Figure pat00051
화합물 1-3(4.35 g, 10 mmol, 1 eq)과 GDH(3.23 g, 11 mmol, 1.1 eq, TCI)를 40 mL의 무수 아세트산에 넣고 100℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 이용하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압 건조시켰다.(4.96 g, 83 %)
Rf = 0.44(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(2) 화합물 10-2 합성
Figure pat00052
화합물 9-3(1.70 g, 2.68 mmol, 1 eq)과 화합물 1-4(1.4 g, 2.68 mmol, 1 eq)을 30 mL의 피리딘에 용해시킨 후 40℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 가하여 녹색의 고체를 생성시킨 후, 여과하고 감압 건조시켰다. 30% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-3을 얻었다.
Rf = 0.54(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.02(d, 2H), 8.42-8.34(m, 2H), 8.28(s, 2H), 8.03(t, 2H), 7.70(d, 2H), 6.61(t, 3H), 6.41(d, 2H), 4.30-4.11(m, 4H), 2.02(t, 2H), 2.11-1.20(m, 21H)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C43H47N2O14S4 942.18, 측정치 942.68
λabs (물) : 777 nm, λfl (물) : 803 nm
(3) 화합물 1-2의 합성
Figure pat00053
화합물 3-2(100 mg, 0.106 mmol, 1 eq)을 DMF 2 mL에 녹이고 60℃로 승온하였다. 0.1 mL의 피리딘에 용해시킨 후 DSC(79.6 mg, 0.318 mmol, 3 eq)를 DMF 0.8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이르를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 2 mL에 녹이고, 137 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(22.1 mg, 0.106 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 3-3 을 얻었다.
Rf = 0.71(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C47H54N3O15S5 1060.21, 측정치 1060.79
λabs (물) : 777 nm, λfl (물) : 803 nm
실시예 3: 화합물 1-3의 제조
(1) 화합물 9-3의 합성
Figure pat00054
화합물 1-3(6.53 g, 15 mmol, 1 eq)과 DPF(3.3 g, 17 mmol, 1.13 eq, TCI)를 30 mL의 아세트산과 30 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고, 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용액을 제거한 후, 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압 건조시켰다.(4.33 g, 53 %)
Rf = 0.65(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(2) 화합물 10-3의 합성
Figure pat00055
화합물 1-5(4.4 g, 7.5 mmol, 1 eq)과 화합물 1-4(3.9 g, 7.5 mmol, 1 eq)을 30 mL의 무수 아세트산과 30 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-1을 얻었다.(0.4 g, 6 %)
Rf = 0.52(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.1(t, 1H), 8.92-8.74(m, 4H), 8.43(m, 2H), 7.76(d, 2H), 6.24(d, 2H), 4.03(m, 4H), 2.45(t, 2H), 1.99-1.14(m, 21H)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C39H43N2O14S4 891.15, 측정치 891.51
λabs (물) : 579 nm, λfl (물) : 594 nm
(3) 화합물 1-3의 합성
Figure pat00056
화합물 3-2(100 mg, 0.112 mmol, 1 eq)을 DMF 2 mL에 녹이고 60℃로 승온하였다. 0.1 mL의 피리딘에 용해시킨 후 DSC(84.1 mg, 0.336 mmol, 3 eq)를 DMF 0.8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이르를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 2 mL에 녹이고, 145 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(23.3 mg, 0.112 mmol, 1 eq)을 0.5 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-7 을 얻었다.(12 mg, 12 %)
Rf = 0.58(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
MALDI-TOF/MS, 계산치 C43H50N3O15S5 1008.18, 측정치 1008.69
λabs (물) : 579 nm, λfl (물) : 594 nm
실시예 4 : 화합물 1-4의 제조
(1) 화합물 6a-2의 합성
Figure pat00057
2,3,3-트리메틸-4,5-벤조-3H-인돌(18.75 g, 90 mmol, 1 eq, TCI)과 에틸 아이오다이드(ethyl iodide)(36 mL, 450 mmol, 5 eq, TCI)를 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene) 225 mL에 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 용매를 제거한 뒤, 1 L의 아세톤으로 3, 4회 세정하고, 여과하여 에틸 아이오다이드를 제거한다. 40℃에서 감압 건조시켜, 분홍색의 고체를 얻었다. (17.1 g, 80%)
Rf = 0.25(normal phase, N-프로판올/2-부탄올/에틸아세테이트/물 4:2:1:3 v/v)
(2) 화합물 6b-2의 합성
Figure pat00058
2,3,3-트리메틸-4,5-벤조-3H-인돌(12.5 g, 60 mmol, 1 eq, TCI)과 6-브로모-n-헥산산(6-bromo-n-hexanoic acid)(23.4 g, 120 mmol, 2 eq, Aldrich)을 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene) 135 mL에 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 흰색 고체를 얻었다. (14.9 g, 77%)
Rf = 0.19(N-프로판올/2-부탄올/에틸아세테이트/물 4:2:1:3 v/v)
(3) 화합물 9-4의 합성
Figure pat00059
화합물 6a-2(5 g, 21 mmol, 1 eq)과 MDH(5 g, 21 mmol, 1eq, TCI)를 25 mL의 아세트산과 25 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 입자를 생성시켜 여과하고 감압 건조시켜 적색의 고체를 얻었다. (4.2 g, 49%)
Rf = 0.58(normal phase, N-프로판올/2-부탄올/에틸아세테이트/물 4:2:1:3 v/v)
(4) 화합물 10-4의 합성
Figure pat00060
화합물 9-4(1.3g, 2.5 mmol, 1eq)와 화합물 6b-2(1 g, 2.5 mmol, 1eq)을 피리딘 6.2 mL에 넣은 후 80℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시켜 여과한 후, 감압 건조시켰다. 메틸렌클로라이드, 메탄올, n-헥산 (5:1:1 v/v) 전개액을 사용하여 정상 크로마토그래피로 정제하여 청색 고체의 화합물 10-4를 얻었다. (432 mg, 29 %)
Rf = 0.57(normal phase, 메틸렌클로라이드/메탄올/n-헥산 5:1:1 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.44 (t, 2H), 8.24 (d, 2H), 8.09-8.03 (m, 4H), 7.73 (d, 2H), 7.69-7.64 (m, 2H), 7.52-7.47 (m, 2H), 6.63 (t, 1H), 6.38-6.32 (m, 2H), 4.27-4.21 (m, 4H), 2.12 (t, 2H), 1.95-1.30 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C41H45N2O2 597.35 , 측정치 597.16
λabs(메탄올) : 697 nm, λfl(메탄올) : 713 nm
(5) 화합물 1-4의 합성
Figure pat00061
화합물 10-4(240 mg, 0.44 mmol, 1eq)을 DMF 10 mL에 녹이고 60℃로 승온하였다. 0.44 mL의 피리딘을 적가한 후 DSC(225 mg, 0.76 mmol 1.7 eq, Aldrich)를 DMF 2 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 10 mL의 DMF에 녹이고, 0.42 uL의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2‘-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(130 mg, 0.48 mmol, 1eq)을 1 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. N-프로판올, 2-부탄올, 에틸아세테이트, 물 혼합 전개액(4:2:1:3 v/v)을 사용하여 NP-Silicagel 크로마토그래피로 정제하여 고체 화합물 1-4를 얻었다.(27 mg, 7.9 %)
Rf = 0.59(NP-Silicagel, N-프로판올/2-부탄올/에틸아세테이트/물 4:2:1:3 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.45 (t, 2H), 8.24 (d, 2H), 8.09-8.00 (m, 4H), 7.75-7.72 (m, 2H), 7.69-7.65 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 2H), 6.99-6.93 (m, 1H), 6.63 (t, 1H), 6.37-6.33 (m, 2H), 6.25-6.21 (m, 2H), 4.28-4.21 (m, 4H), 3.36-3.33 (m, 2H), 3.23-3.12 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.96-1.30 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C45H52N3O3S 714.37, 측정치 714.7
λabs(메탄올) : 680 nm, λfl(메탄올) : 710 nm
실시예 5 : 화합물 1-5의 제조
(1) 화합물 6b-3의 합성
Figure pat00062
화합물 4-1(5 g, 13.6 mmol, 1 eq)과 8-브로모-n-옥탄산(8-bromo-n-octanoic acid)(5.6 g 25 mmol, 1.84 eq, TCI)을 20 mL의 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다.(5.9 g 82 %)
Rf = 0.52(RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
(2) 화합물 10-5의 합성
Figure pat00063
화합물 9-1(2.3 g 4 mmol, 1 eq)와 화합물6b-3(3.6 g 7 mmol, 1.8 eq)을 30 mL 피리딘에 넣은 후 100℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 18% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 청색 고체의 화합물 10-5을 얻었다.(0.52 g, 14 %)
Rf = 0.6(RP-C18, 아세토니트릴/물 2.5:7.5 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.90-8.88 (m, 2H), 8.43 (s, 2H), 8.19 (s, 2H), 8.02-7.99 (m, 2H), 7.73 (d, 2H), 6.63 (t, 1H), 6.38-6.34 (d, 2H), 4.30-4.11 (m, 4H), 2.02 (t, 2H), 2.11-1.20 (m, 25H)
λabs(물) : 675 nm, λfl(물) : 704 nm
(3) 화합물 1-5의 합성
Figure pat00064
화합물 10-5(500 mg, 0.53 mmol, 1eq)을 DMF 25 mL에 녹이고 60 ℃로 승온하였다. 450 uL의 휘니그 베이스를 적가한 후 DSC(696 mg, 628 mg 2.12 mmol, 4 eq, Aldrich)를 DMF 3 mL에 용해시킨 후 적가혀였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 25 mL에 녹이고, 450 uL의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2‘-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(141 mg, 0.53 mmol, 1eq)을 3mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 16 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 청색 고체 화합물 1-5을 얻었다.(260 mg, 44 %)
Rf = 0.58(RP-C18, 아세토니트릴/물 2.5:7.5 v/v)
1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.02 (m, 2H), 8.43 (s, 2H), 8.18 (s, 2H), 7.96 (t, 1H), 7.75-7.72 (m, 2H), 6.98-6.92 (m, 1H), 6.62 (t, 1H), 6.52 (t, 1H), 6.38-6.33 (m, 2H), 6.23-6.20 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 4H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.14-3.11 (m, 2H), 2.01 (t, 2H), 1.94-1.20 (m, 25H)
LC/MS, 계산치 C47H55N3O15S5 1061.22 , 측정치 1061.41
λabs(물) : 675 nm, λfl(물) : 704 nm
실시예 6: 단백질에 대한 염색 실험
지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 AmershameTM LMW Calibration 키트(17-0446-01)의 1개의 팩(pack) 중 1개의 바이알(vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b(phosphorylase b)(97 kD, 67 μg), 알부민(albumin)(66 kD, 83 μg), 오발부민(ovalbumin)(45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈(carbonic anhydrase)(30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터(trypsin inhibitor)(20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민(α-lactalbumin)(14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있다.
상온(20℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 1개의 바이알에 250 μl의 pH 9.0 0.1 M 포스페이트 완충액을 가하여 용해시키고, 2개의 e-튜브에 25 μl를 분취하였다(25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9x10-5 μmol in 25 μl buffer solution). 화합물 1-1, 1-2를 각각 1 mg씩을 e-tube에 넣고 100 μl의 DMF에 용해시킨 후, 1 μl씩을 분취하여 앞서의 단백질이 들어 있는 e-튜브에 각각넣은 후, 볼텍스(vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 반응액에 5X 로딩버퍼를 6μl를 넣은 후 15 μl를 분취하여 겔에 로딩(loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 1에 나타내었다. 전기영동은 125V에서 2시간 동안 진행하였다. 도 1은 형광사진을 나타내며 ①은 화합물 1-1, ②는 화합물 1-2의 결과이다. 육안으로 보면 염색된 단백질들을 관찰할 수 있다.
실시예 7 : 펩타이드 표지 및 생체 내 분자 영상 시험
사멸 세포 및 종양 세포를 탐지하는 기능이 있는 것으로 알려진 펩타이드인 apopep-1 (시퀀스 : CQRPPR, 분자량 : 740.88, 제조사 : 펩트론, 대한민국)를 대상으로, 4mM의 apopep-1을 각각 같은 당량으로 지이헬스케어사의 Cy7.5와 상기 화학식 1-2 화합물과 DMSO에 용해 후 (염료 용액 농도 1mg/100 uL) DMSO 용매하에서 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 각각의 표지된 펩타이드는 PBS 버퍼를 사용하여 50uM의 용액으로 준비한다.
MDA231 종양 세포주로 종양이 이종이식된 누드마우스 2마리를 준비하고 각각의 마우스에 표지된 Cy7.5 및 1-2 화합물로 표지된 펩타이드들을 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 최종 50 μM 농도로 주입하였다. 30분이 지난 후 Optix exPlore 기기(GE Healthcare사)를 사용하여 생체 형광영상을 촬영하였다. 또한 기기 자체의 소프트웨어를 사용하여 각 영상을 표준화하였다.
도 2에서 보듯이 종양이 이식된 동일한 부위에서 형광이 나타나고 있고 표지 후에도 형광이 손실되지 않으며 펩타이드의 종양 인식 기능에도 영향이 끼치지 않고 있음을 보여주고 있다.
상기 실시예에서 확인한 바와 같이(혹은 상기 실시예에서 명시적으로 기재하고 있지는 않다고 하더라도), 본 발명에 따른 화합물은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 또는 이들의 물성이 현저하게 향상었음을 확인하였고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능하다는 점을 확인하였다.
또한, 본 발명에 속하는 화합물에 있어서 치환기의 종류 및 구조에 따라서 화합물의 물성이 차이를 보이기는 하나, 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위에 속하면서 본 발명의 실시예에 명시적으로 기재되어 있지 않은 치환기를 포함하는 화합물에 대해서도 본 발명의 실시예의 반응 원리 및 조건이 그에 준하여 적용될 수 있으며, 따라서 통상의 기술자라면 본 발명의 실시예의 개시내용 및 본 발명의 출원 당시의 당업계 상식에 기초하여 본 발명의 실시예에 명시적으로 개시되어 있지 않은 본 발명의 화합물 역시 용이하게 실시할 수 있다는 점은 자명하다.

Claims (15)

  1. 다음 화학식 1로 표시되는 벤즈인도시아닌 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00065

    상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;
    상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH2)L1SO2CH=CH2, -CONH-p-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-m-(C6H4)SO2CH=CH2이고; 상기 L1은 1 내지 5의 정수이며;
    상기 B는(CH2)L2, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, 상기 L2는 1 내지 5의 정수이며; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벤즈인도시아닌 화합물:
    Figure pat00066

    Figure pat00067

    Figure pat00068
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 형광 파장대는 500 내지 800 nm인 것을 특징으로 하는 벤즈인도시아닌 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 표지되는 것을 특징으로 하는 벤즈인도시아닌 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벤즈인도시아닌 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 사용하여 물질을 표지하는 방법으로서, 상기 물질은 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물이며 작용기로서 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 물질의 표지는 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 비닐 설폰기와, 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물의 아민기, 수산화기 또는 티올기가 반응하여 결합하는 것에 의하는 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 물질 표지 방법에서 사용되는 용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 이루어진 군에서 선택된 완충액이거나, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매이거나, 또는 물인 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 표지는 pH 5 내지 12에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 표지는 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 반응시키는 것에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
  12. 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 물질로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 표지 물질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표지 물질.
  14. 제1항에 따른 화합물의 제조 중간체인 다음 화학식 10의 화합물:
    [화학식 10]
    Figure pat00069

    식 중에서, 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기 또는 설폰산염기이고; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
  15. (1) 다음 화학식 4의 화합물을 화학식 5 또는 7의 화합물과 반응시켜 화학식 6a의 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 4]
    Figure pat00070

    [화학식 5]
    Figure pat00071

    [화학식 6a]
    Figure pat00072

    [화학식 7]
    Figure pat00073

    (2) 상기 화학식 6a의 화합물을 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 8]
    Figure pat00074

    [화학식 9]
    Figure pat00075

    (3) 상기 화학식 9의 화합물을 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 6b]
    Figure pat00076

    [화학식 10]
    Figure pat00077

    (4) 상기 화학식 10의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는 단계, 및
    [화학식 11a]
    Figure pat00078

    [화학식 11b]
    Figure pat00079

    (5) 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 휘니그 염기 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 1로 표시되는 벤즈인도시아닌 화합물의 제조 방법:
    [화학식 12]
    Figure pat00080

    [화학식 1]
    Figure pat00081

    상기 4개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;
    상기 R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH2)L1SO2CH=CH2, -CONH-p-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-m-(C6H4)SO2CH=CH2이고; 상기 L1은 1 내지 5의 정수이며;
    R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기(-OSO3H)이고; A는 수소 또는 아세틸기이고; X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이고;
    상기 B는(CH2)L2, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, 상기 L2는 1 내지 5의 정수이며; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
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