KR102414552B1

KR102414552B1 - 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법

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Publication number: KR102414552B1
Application number: KR1020220025608A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 장수정; 김기원; 유은서; 신경림
Original assignee: (주)바이오액츠
Priority date: 2022-02-27
Filing date: 2022-02-27
Publication date: 2022-06-30
Anticipated expiration: 2042-02-27

Abstract

본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1로 표현되는 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 시아닌계 형광 화합물을 나타내는 구조식에서 중심부분에 페닐기로 치환된 링커를 도입하고, 상기 시아닌계 화합물의 한 쪽의 인돌구조에는 치환된 트리아진 구조의 링커를 도입함으로서 종래 구조에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 온도 및 수분에 대한 보관 안정성 및 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

Description

생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법{Fluorescent compound for detecting biological materials and the preparation method thereof}

본 발명은 형광 화합물에 관한 것으로서, 질병의 진단, 치료 및 예후를 예측할 수 있는 형광 진단조성물에 유용하게 사용될 수 있는 화합물이다.

본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 종래의 시아닌계열의 화합물의 형광 효율이 높지 않다는 것을 개선한 것으로서, 상기 시아닌계열 형광 화합물을 나타내는 구조식에서 중심부분에 페닐기로 치환된 링커를 도입하고, 상기 시아닌계 화합물의 한 쪽의 인돌구조에는 치환된 트리아진 구조의 링커를 포함하여 형성되는 형광 화합물에 관한 것이다.

본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 노이즈가 적고 형광효율이 높아 본 발명의 형광 진단조성물을 이용할 경우에는 목적하는 생체물질을 검출할 때에 형광 신호의 효율을 향상시킬 수 있어서 종래의 기술보다 정확하게 생체물질을 진단할 수 있다.

생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.

바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.

일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.

상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.

바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.

이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.

특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.

그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVD±등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 600 내지 800 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다

상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.

한국공개특허 10-2011-0033454

본 발명의 목적은 광학 및 pH 안정성 우수하고, 좁은 흡수 및 발광 파장의 범위를 가지면서도 600 내지 800 nm의 형광 영역, 특히 800nm 부근에서 형광 강도가 더욱 향상되어 조영제 조성물로 이용할 수 있는 형광 화합물 및 상기 화합물의 제조방법 또는 상기 화합물의 포함하는 형광 진단 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 개발하였다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서

X₁ 및 X₃는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO₃H, SO₃ ^- 중에서 선택되며, 상기 X₂ 는 -SO₃H 또는 SO₃ ^- 이고,

R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및

중에서 선택되고,

R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOZ 및

중에서 선택되며,

다만, R3 및 R4는 동시에 -(CH₂)_mCOZ 및

중에서 선택되는 어느 하나는 아니고, 상기 식에서

n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고, m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,

p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,

r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH₂)sSO₃H이고,

s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,

Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C_0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C_0-6알킬아미닐기 및 아미노C_0-6알킬 중에서 선택된다.

본 발명에 따른 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 종래의 형광 화합물에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2와 대조형광염료의 흡형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2와 대조형광염료의 광학특성을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 단백질 표지율을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물 1와 대조형광염료의 반응비별 단백질 표지율을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 반응비별 형광강도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 단백질 표지율에 따른 형광강도를 나타낸다.

본 발명의 형광 화합물은 종래의 시아닌계열의 화합물의 형광 효율이 높지 않다는 것을 개선한 것으로서, 상기 시아닌계열 형광 화합물을 나타내는 구조식에서 중심부분에 페닐기로 치환된 링커를 도입하고, 상기 시아닌계 화합물의 한 쪽의 인돌구조에는 치환된 트리아진 구조의 링커를 포함하여 형성되는 형광 화합물에 관한 것이다.

이하에서는 본 발명의 실시예를 이용하여, 본 발명의 형광 화합물 및 계면활성제 화합물의 제조방법 및 본 발명의 조성물의 형광효율 등을 구체적으로 살펴보도록 한다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서

X₁, X₂ 및 X₄는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO₃H, SO₃ ^- 중에서 선택되며, 상기 X₃ 는 -SO₃H 또는 SO₃ ^- 이고,

상기 Q는

의 구조를 가지는 치환기이며,

상기 Z는 OH 또는 NH(CH₂)_m4SO₃H이고.

n은 1 내지 7의 자연수이며, m1 및 m3는 3 내지 7의 자연수이5, m2는 2 내지 5의 자연수이며, m4는 2 내지 7의 자연수이다.

본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1의 화합물은 생체물질을 표지하여 상기 생체물질을 검출하는 데에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공하는 형광 화합물이 생체물질을 표지할 때에는 생체물질에 존재하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 관능기와 결합함으로써 생체물질을 표지할 수 있다.

상기 <화학식 1>로 표시되는 형광 화합물을 표지하는 방법으로는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 <화학식 1>의 화합물과 상기 생체물질, 나노입자 또는 유기화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.

생체물질의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체물질의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체물질 표지용으로 사용하기에 적합하다.

상기 화학식 1에 포함되는 화합물의 제조방법을 설명한다.

실시예 1 : 본 발명의 상기 화학식 1에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물로서 화합물 a의 제조

(1) 화합물 1-1의 합성

p-히드라지노벤젠설폰산 (p-Hydrazinobenzenesulfonic acid) (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich)과 3-메틸-2-부탄온 (3-Methyl-2-butanone) (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI)을 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (11.34 g, 89%)

R_f = 0.68 (역상, C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)

수산화칼륨 (1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올(n-Propanol) 35 mL에 용해시키고, 앞에서 얻은 고체 물질 (5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올(Methanol) 35 mL에 용해시키고 적가한 후, 상온에서 24 시간 교반하고, 여과하여 노란색의 고체 입자 1-1을 얻었다. (5.35 g, 90%)

R_f = 0.68 (역상, C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)

(2) 화합물 1-2의 합성

1-1 (6 g, 21.6 mmol, 1 eq)과 1,4-부탄설톤(1,4-Butanesultone) (6.4 mL, 68.9 mmol, 3.01 eq, TCI), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) (2.1 g, 25.9 mmol, 1,2 eq)을 아세토나이트릴(Acetonitrile) 10 ml에 가한 후, 12 시간 동안 100℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매 제거 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조하여 1-2를 얻었다. (5 g, 61.6 %)

R_f = 0.31 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

(3) 화합물 1-3의 합성

1-1 (5 g, 20.9 mmol, 1 eq)과 6-브로모헥사노익 산(6-Bromohexanoic acid) (8.1 g, 41.8 mmol, 2 eq, TCI)을 1,2-다이클로로벤젠(1,2-Dichlorobenzene) 20 ml에 가한 후, 12 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매 제거 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조하여 1-3을 얻었다. (5.2 g, 70.3 %)

R_f = 0.23 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

(4) 화합물 1-4의 합성

N,N-다이메틸포름아마이드(DMF, N,N-Dimethylformamide) (60.8 ml, 2 mol, 5 eq, 덕산)와 디클로로메탄(Dichloromethane) 40 ml을 혼합하고 온도를 0 ℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄 40 ml에 포스포러스 옥시클로라이드(Phosphorus oxychloride) (45.2 ml, 1.5 mol, 3.7 eq, Aldrich)를 용해시킨 후 상기 냉각시킨 용액에 10분 동안 적가하였다. 상기 홍합액에 디클로로메탄 60 ml에 싸이클로헥사논(Cyclohexanone) (11.7 ml, 0.4 mol, 1 eq, Aldrich)을 용해시킨 용액을 10분 동안 적가하였다. 3시간 동안 가열 환류시킨뒤 상온으로 냉각시키고, 아닐린(Aniline) (31.0 ml, 1.0 mol, 2.7 eq, Aldrich)을 넣고 추가로 1시간 동안 상온에서 교반한다. 반응 종료 후, 50 ml의 증류수를 혼합 용액에 넣고 냉장 보관 한 후 생성된 어두운 보라색 침전을 여과하여 감압 건조하여 1-4를 얻었다. (38 g, 26 %)

R_f = 0.99 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

(5) 화합물 1-5의 합성

1-2 (941 mg, 2.67 mmol, 1 eq)과 1-3 (1 g, 2.67 mmol, 1 eq), 1-4 (862 mg, 2.67 mmol, 1 eq), 아세트산 나트륨(Sodium Acetate) (438 mg, 5.34 mmol, 2 eq, 덕산)을 에탄올(Ethanol) 20 ml에 가한 후, 2 시간 동안 50℃에서 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매 제거 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-5를 얻었다. (180 mg, 7.8 %)

R_f = 0.45 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₄₀H₄₉ClN₂O₁₁S₃ 864.22, 측정치 863.0

(6) 화합물 a의 합성

1-5 (160 mg, 0.186 mmol, 1 eq)과 소듐 4-하이드로시벤젠-설포네이트(Sodium 4-Hydroxybenzene-sulfonate dihydrate, TCI) (146 mg, 0.74 mmol, 4 eq), 포타슘 카보네이트(Potassium carbonate) (51 mg, 0.372 mmol, 2 eq, 덕산)를 다이메틸포름아마이드 5 ml에 가한 후 12 시간 동안 50℃에서 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 다이에틸 이터로 입자를 잡은 뒤 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (5 g, %) 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 a를 얻었다. (83 mg, 44.6 %)

R_f = 0.21 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₄₀H₅₄N₂O₁₅S₄ 1002.24, 측정치 1001.6

¹H NMR (500 MHz, D₂O) : δ 8.110-8.079 (t, 4H, J = 8Hz), δ 7.969-7.918 (t, 1H), δ 7.890-7.859 (t, 1H), δ 7.833-7.734 (m, 3H), δ 7.656-7.629 (t, 1H), δ 7.610-7.578 (t, 1H, J = 8Hz), δ 7.377-7.318 (m, 2H), δ 6.292-6.204 (q, 1H, J = 14Hz), δ 4.144 (s, 3H), δ 3.790-3.765 (t, 4H), δ 3.376 (s, 2H), δ 3.002-2.971 (t, 1H), δ 2.940 (s, 1H), δ 2.884 (s, 1H), δ 2.753 (s, 3H), δ 2.090 (s, 1H), δ 1.965-1.832 (m, 8H), δ 1.656-1.626 (t, 2H, J = 7Hz), δ 1.382-1.271 (m, 8H), δ 1.182 (s, 1H), δ 1.144-1.119 (t, 1H, J = 6.5Hz)

실시예 2 : 본 발명에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물로서 화합물 b-3, b-4의 제조

(1) 화합물 b-1의 합성

1,3-디아미노프로판 (1,3-Diaminopropane) (20 g, 270 mmol, 7.96 eq)를 1,4-다이옥산 (1,4-dioxane) 70 ml 에 용해하였다. 디-터트-부틸 디카보네이트 (di-tert-butyl dicarbonate) (7.4 g, 33.9 mmol, 1 eq)를 1,4-dioxane 70 ml 에 용해한 후 1,3-diaminopropane 용액에 세류하고, 상온에서 일야교반 진행한 후 감압건조 하였다. 건조된 물질을 증류수에 용해한 후 여과하여 얻어진 여과액에 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride) 로 3회 추출하였다. 추출 후 얻어진 유기층을 감압건조 하여 화합물 b-1을 얻었다. (6 g, 91.5%)

R_f = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

(2) 화합물 b-2의 합성

화합물 b-1 (5.1 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 Acetone 150ml 와 증류수 50ml 혼합용액에 용해 후 4℃ 이하로 보관하였다. 시아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride, CNC) (5.4 g, 29.27 mmol, 1 eq) 를 Acetone 150 ml 에 완용한 후, 얼음 50g을 투입하여 4℃ 이하로 분산하였다. 화합물 3-1 용액을 CNC 용액에 세류한 후, 탄산수소나트륨 수용액 (2.46 g 탄산나트륨을 증류수 50ml에 완용) 을 세류한 후 4℃ 이하에서 2시간 반응을 진행하였다. 6-아미노헥사노익산 (6-Aminohexanoic acid, 1.42 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 증류수 50ml 에 녹인 후 상기 반응액에 세류하였다. 탄산수소나트륨 수용액을 세류하여 상온에서 2시간 반응을 진행한 후, 40℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 한 후, 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 화합물 b-2 를 얻었다. (9 g, 73.8%)

R_f = 0.7 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

LC/MS, 계산치 C₁₇H₂₉ClN₆O₄ 416.91, 측정치 415.2

(3) 화합물 b-3의 합성

화합물 b-2 (3 g, 7.2 mmol, 1 eq)를 아세토니트릴 (Acetonitrile, ACN) 40ml 에 완용 후 증류수 40ml를 투입하였다. 그 후, 6N 염산수용액 20ml를 투입한 후, 60℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 진행한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 b-3을 얻었다. (1.5 g, 69.8 %)

R_f = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

LC/MS, 계산치 C₁₂H₂₂N₆O₃ 298.35, 측정치 297.3

(4) 화합물 b-4의 합성

화합물 b-2 (4 g, 9.61 mmol, 1 eq)과 3-아미노-1-프로판설폰산 (3-Amino-1-propanesulfonic acid) (1.6 g, 11.53 mmol, 1.2eq)을 다이메틸포름아마이드 (Dimethylformamide, DMF) 6.7 ml 에 완용 후 증류수 40 ml를 투입하였다.

그 후, 30% 수산화나트륨 수용액 (2 ml)을 투입한 후, 100℃에서 4시간동안 교반을 진행하고, 반응액을 동결건조 진행하였다.

그 후, 6N 염산수용액 40ml를 투입한 후, 상온에서 2시간동안 반응을 진행하였다. 반응액을 동결건조한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 b-4을 얻었다. (1.6 g, 40 %)

R_f = 0.23 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

LC/MS, 계산치 C₁₅H₂₉N₇O₅S 298.35, 측정치 419.50

실시예 3 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 1의 합성

(1) 화합물 a-1의 합성

a (200 mg, 0.2 mmol, 1 eq)와 N,N-테트라메틸-O-(N-석씨니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (TSTU, N,N,N’’tetrafluoroborate) (180 mg, 0.6 mmol, 3 eq, TCI), 트리에틸아민(TEA, Triethylamine) (138.7 μl, 1.0 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 20 ml에 가한 후, 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켜 a-1을 얻었다. (218 mg, 100%)

LC/MS, 계산치 C₅₀H₅₇N₃O₁₇S₄ 1099.26, 측정치 1100.5

(2) 화합물 a-2의 합성

화합물 a-1 (218 mg, 0.2 mmol, 1 eq)과 화합물 3-3 (178 mg, 0.597 mmol, 3 eq)을 디엠에프(DMF) 20 mL에 가하고 N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, N,N-Diisopropylethylamine) (173.3 ul, 1mmol, 5eq)을 천천히 가한다. 상온에서 1시간 동안 반응시키고 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 a-2를 얻었다. (108mg, 42.4%)

R_f = 0.13 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₅₈H₇₄N₈O₁₇S₄ 1283.51 측정치 1385.42

(3) 화합물 1의 합성

a-2 (100 mg, 0.078 mmol, 1 eq)와 N,N-테트라메틸-O-(N-석씨니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (TSTU, N,N,N’’tetrafluoroborate) (70 mg, 0.233 mmol, 3 eq, TCI), 트리에틸아민(TEA, Triethylamine) (54.4 μl, 0.39 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 10 ml에 가한 후, 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그리고 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1을 얻었다. (27mg, 25.2%)

R_f = 0.25 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₆₂H₇₇N₉O₁₉S₄ 1380.58 측정지 1382.43

실시예 4 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 2의 합성

(1) 화합물 c-1의 합성

화합물 a-1 (55 mg, 0.05 mmol, 1 eq)과 화합물 b-4 (63 mg, 0.15 mmol, 3 eq)을 디엠에프(DMF) 5 mL에 가하고 N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, N,N-Diisopropylethylamine) (43.5 ul, 0.25mmol, 5eq)을 천천히 가한다. 상온에서 1시간 동안 반응시키고 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 c-1를 얻었다. (12mg, 17.14%)

R_f = 0.145 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₆₁H₈₁N₉O₁₉S₅ 1404.66 측정치 1406.83

(2) 화합물 2의 합성

c-1 (12 mg, 0.0086 mmol, 1 eq)와 N,N-테트라메틸-O-(N-석씨니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (TSTU, N,N,N’’tetrafluoroborate) (7.7 mg, 0.0257 mmol, 3 eq, TCI), 트리에틸아민(TEA, Triethylamine) (6 μl, 0.043 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 1.2 ml에 가한 후, 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그리고 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2을 얻었다. (0.73mg, 5.6%)

R_f = 0.12 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C₆₅H₈₄N₁₀O₂₁S₅ 1501.74 측정치 1503.42

상기 본 발명의 화합물에 포함되는 화합물과 종래의 화합물의 형광특성, 단백질 표지 특성 등을 대비하여 실험한 결과로부터 본 발명에서 제공하는 화합물이 형광신호를 이용하여 생체물질을 검출하는 데에 유용하게 적용될 수 있다는 확인할 수 있다.

비교예 1: 화합물의 광학특성 평가

(1) 흡광 및 형광 분석을 통한 화합물의 광학특성 확인

화합물 1 과 화합물 2 및 대조형광염료 (LI-COR, IRDye®800CW NHS ester) 의 흡광 및 형광 분석을 진행하고 그 특성을 확인하였다.

상기 세 가지의 화합물에 DMF를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조하고 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline (이하 1X PBS) 을 이용하여 희석 후 측정을 진행하였다.

흡광은 Agilent 의 Cary 3500 UV-Vis 분광 광도계를 사용하였고, 형광은 PerkinElmer 의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다.

도 1에는 흡형광 스펙트럼을 제시하였고, 도 2에는 광학특성을 나타내었다. 도 1 및 도 2의 결과로부터 화합물 1 및 화합물 2가 대조형광염료와 유사한 광학특성을 가짐을 확인하였다.

시험예 2 : 단백질 표지(labeling) 후 성능 비교

(1) 화합물의 반응비 별 표지율 및 형광강도

화합물 1 과 대조형광염료 (LI-COR, IRDye®800CW NHS ester) 에 대하여 항체(Invitrogen, Goat anti Rabbit IgG H+L Secondary Ab, 150 kDa)에 표지를 진행하고, 표지율 (F/P molar ratio)을 비교하였다. 표지에 앞서 화합물 1 과 대조형광염료는 모두 DMF에 10 mg/mL로 녹여 Stock solution을 만들어 사용하였고, 항체 0.1 mg에 각 염료를 반응 비 (2, 5, 15, 25, 33 Fold) 별로 반응시켰다. 반응 버퍼는 최종 pH 8.3~8.5 가 되도록 제조하였으며, 항체의 최종 반응 농도는 2 mg/mL이 되게 하였다. 반응은 상온, 암실 환경에서 1 시간 교반하며 진행하였고, Sepha dex G-25 레진(Cytiva)이 채워진 컬럼관 정제를 통해 반응물을 분리, 획득하였다. 레진은 1X PBS로 미리 버퍼 평형시켜 사용한다. 각 반응물에 대하여 280, 775 nm 파장에서 흡광도를 측정(Agilent, Cary 3500 UV-Vis spectrophotometer) 하였고, 보편적으로 알려진 수식에 따라 표지율을 산출하였다.

상기 결과를 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6에 그 결과를 나타냈다. F/P ratio는 대조형광염료 (IRDye®800CW NHS ester) 의 제시 기준인 Extinction coefficient 240,000/M·CF280 0.03 을 적용하여 산출하였다.

반응비 별 표지율은 화합물 1 이 약간 낮으나, 반응물의 형광강도는 동일 반응 비 간에 비교를 해볼 때 모든 반응 비에서 화합물 1 의 항체 반응물이 대조형광염료의 항체 반응물보다 높게 측정됨에 따라, 형광 성능은 화합물 1 이 더 우수한 것으로 판단된다. 또한 화합물 1 을 적은 반응 비로 표지 시에도, 대조형광염료를 동일 반응 비 혹은 그 이상의 반응 비로 표지할 때에 비하여 더 높은 형광을 관찰할 수 있을 것으로 보인다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 히드록시기로 치환된 트리아진을 도입한 형광 화합물은 동일한 농도에서 종래의 형광 화합물에 비하여 형광 강도 등 형광 효율이 높아서, 미량의 생체치료에서도 목적물질을 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명은 상기에서 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그 외에 다양한 생물학적, 화학적 분야에서 이용될 수 있고, 이러한 적용영역도 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

본 발명은 산업상 이용가능하ㄷ.

Claims

하기의 화학식 1로 표현되는 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물
<화학식 1>

상기 화학식 1에서
X₁ 및 X₃는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO₃H, SO₃ ^- 중에서 선택되며, 상기 X₂ 는 -SO₃H 또는 SO₃ ^- 이고,
R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및
중에서 선택되고,
R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOZ 및
중에서 선택되며,
다만, R₁ 내지 R₄중 하나 이상은 반드시
이며 R₃ 와 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고, m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH₂)sSO₃H이고,
s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,
Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C_0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C_0-6알킬아미닐기 및 아미노C_0-6알킬 중에서 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
하기의 화학식 1로 표현되는 형광 화합물을 포함하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물 :
<화학식 1>

상기 화학식 1에서
X₁ 및 X₃는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO₃H, SO₃ ^- 중에서 선택되며, 상기 X₂ 는 -SO₃H 또는 SO₃ ^- 이고,
R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및
중에서 선택되고,
R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOZ 및
중에서 선택되며,
다만, R₁ 내지 R₄중 하나 이상은 반드시
이며 R₃ 와 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고, m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH₂)sSO₃H이고,
s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,
Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C_0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C_0-6알킬아미닐기 및 아미노C_0-6알킬 중에서 선택된다.
제4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물