KR102414554B1 - 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1로 표현되는 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 아미노설폰산기로 치환된 트리아진을 링커로 도입함으로써 종래 구조에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.
Description
본 발명은 형광 화합물에 관한 것으로서, 질병의 진단, 치료 및 예후를 예측할 수 있는 형광 진단조성물에 유용하게 사용될 수 있는 화합물이다.
본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 종래의 인도시아닌계열의 화합물의 형광 효율이 높지 않다는 것을 개선한 것으로서, 상기 인도시아닌계열의 치환기에 히드록시기 또는 아미노설폰산기가 치환된 트리아진 구조를 링커로서 포함하는 형광 화합물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 노이즈가 적고 형광효율이 높아 본 발명의 형광 진단조성물을 이용할 경우에는 목적하는 생체물질을 검출할 때에 형광 신호의 효율을 향상시킬 수 있어서 종래의 기술보다 정확하게 생체물질을 진단할 수 있다.
생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.
바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.
일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.
상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.
바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.
이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.
특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.
그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVD±등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 600 내지 800 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다
상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.
본 발명의 목적은 광학 및 pH 안정성 우수하고, 좁은 흡수 및 발광 파장의 범위를 가지면서도 600 내지 800 nm의 형광 영역에서 형광 강도가 더욱 향상되어 조영제 조성물로 이용할 수 있고, 특히 인도시아닌계 형광 화합물에 히드록시기 또는 아미노설폰산기로 치환된 트리아진 구조를 가지는 링커를 도입하여 형광을 증진시킬 수 있는 형광 화합물 및 상기 화합물의 제조방법 또는 상기 화합물의 포함하는 형광 진단 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 개발하였다.
<화학식 1>
상기 화학식 1에서
X1, X2, X3 및 X4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO3H, SO3 - 중에서 선택되며, 상기 X5는 -SO3H 또는 SO3 - 이고,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 - , -(CH2)mSO3H 및 
중에서 선택되고,
R3 및 R4 는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOZ 및 
중에서 선택되며,
다만, R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOZ 및 
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고, 상기 식에서
n1 및 n3는 2 내지 7의 자연수이며, n2는 1 내지 5의 자연수이고
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고, p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고, r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH2)sSO3H이고, s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,
Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0-6알킬아미닐기 및 아미노C0-6알킬 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 종래의 형광 화합물에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 흡형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 광학특성을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 4와 대조형광염료의 흡광특성을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물 4와 대조형광염료의 흡광특성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 흡광강도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 동일 몰농도에서의 형광강도를 나타낸다.
도 7는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 동일 무게농도에서의 형광강도를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율의 F/P 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율에 따른 형광강도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물 1과 대조형광염료의 광학특성을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 4와 대조형광염료의 흡광특성을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물 4와 대조형광염료의 흡광특성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 흡광강도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 동일 몰농도에서의 형광강도를 나타낸다.
도 7는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 동일 무게농도에서의 형광강도를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율의 F/P 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 화합물 6과 대조형광염료의 단백질 표지율에 따른 형광강도를 나타낸 것이다.
본 발명의 형광 화합물은 종래의 형광 화합물에서 주로 사용되었던 트리아진에 히드록시기 또는 아미노설폰산기를 포함하는 치환기를 도입하여 형광신호를 분석하는데 있어서 노이즈가 많고 형광 효율이 낮다는 점을 개선하기 위하여 발명된 것으로서, 상기 히드록시기 또는 아미노설폰산 치환기 를 포함하는 트리아진을 인도시아닌계열의 화합물의 링커로서 도입한 것이다.
이하에서는 본 발명의 실시예를 이용하여, 본 발명의 형광 화합물 및 계면활성제 화합물의 제조방법 및 본 발명의 조성물의 형광효율 등을 구체적으로 살펴보도록 한다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 제공한다.
<화학식 1>
상기 화학식 1에서
X1, X2, X3 및 X4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO3H, SO3 - 중에서 선택되며, 상기 X5는 -SO3H 또는 SO3 - 이고,
상기 Y는
상기 Z는 OH 또는 NH(CH2)m4SO3H이고.
n1 및 n3는 2 내지 7의 자연수이며, n2는 1 내지 5의 자연수이고, m1 및 m3는 3 내지 7의 자연수이며, m2는 2 내지 5의 자연수이고, m4는 2 내지 7의 자연수이다.
본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1의 화합물은 생체물질을 표지하여 상기 생체물질을 검출하는 데에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 형광 화합물이 생체물질을 표지할 때에는 생체물질에 존재하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 관능기와 결합함으로써 생체물질을 표지할 수 있다.
상기 <화학식 1>로 표시되는 형광 화합물을 표지하는 방법으로는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 <화학식 1>의 화합물과 상기 생체물질, 나노입자 또는 유기화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.
생체물질의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체물질의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체물질 표지용으로 사용하기에 적합하다.
상기 화학식 1에 포함되는 화합물의 제조방법을 설명한다.
실시예 1 : 본 발명에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물로서 화합물 a, b의 제조
(1) 화합물 a-1의 합성
1,3-디아미노프로판 (1,3-Diaminopropane) (20 g, 270 mmol, 7.96 eq)를 1,4-다이옥산 (1,4-dioxane) 70 ml 에 용해하였다. 디-터트-부틸 디카보네이트 (di-tert-butyl dicarbonate) (7.4 g, 33.9 mmol, 1 eq)를 1,4-dioxane 70 ml 에 용해한 후 1,3-diaminopropane 용액에 세류하고, 상온에서 일야교반 진행한 후 감압건조 하였다. 건조된 물질을 증류수에 용해한 후 여과하여 얻어진 여과액에 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride) 로 3회 추출하였다. 추출 후 얻어진 유기층을 감압건조 하여 화합물 a-1을 얻었다. (6 g, 91.5%)
Rf = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)
(2) 화합물 a-2의 합성
화합물 a-1 (5.1 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 Acetone 150ml 와 증류수 50ml 혼합용액에 용해 후 4℃ 이하로 보관하였다. 시아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride, CNC) (5.4 g, 29.27 mmol, 1 eq) 를 Acetone 150 ml 에 완용한 후, 얼음 50g을 투입하여 4℃ 이하로 분산하였다. 화합물 3-1 용액을 CNC 용액에 세류한 후, 탄산수소나트륨 수용액 (2.46 g 탄산나트륨을 증류수 50ml에 완용) 을 세류한 후 4℃ 이하에서 2시간 반응을 진행하였다. 6-아미노헥사노익산 (6-Aminohexanoic acid, 1.42 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 증류수 50ml 에 녹인 후 상기 반응액에 세류하였다. 탄산수소나트륨 수용액을 세류하여 상온에서 2시간 반응을 진행한 후, 40℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 한 후, 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 화합물 a-2 를 얻었다. (9 g, 73.8%)
Rf = 0.7 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)
LC/MS, 계산치 C17H29ClN6O4 416.91, 측정치 415.2
(3) 화합물 a의 합성
화합물 a-2 (3 g, 7.2 mmol, 1 eq)를 아세토니트릴 (Acetonitrile, ACN) 40ml 에 완용 후 증류수 40ml를 투입하였다. 그 후, 6N 염산수용액 20ml를 투입한 후, 60℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 진행한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 a을 얻었다. (1.5 g, 69.8 %)
Rf = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)
LC/MS, 계산치 C12H22N6O3 298.35, 측정치 297.3
(4) 화합물 b의 합성
화합물 a-2 (4 g, 9.61 mmol, 1 eq)과 3-아미노-1-프로판설폰산 (3-Amino-1-propanesulfonic acid) (1.6 g, 11.53 mmol, 1.2eq)을 다이메틸포름아마이드 (Dimethylformamide, DMF) 6.7 ml 에 완용 후 증류수 40 ml를 투입하였다.
그 후, 30% 수산화나트륨 수용액 (2 ml)을 투입한 후, 100℃에서 4시간동안 교반을 진행하고, 반응액을 동결건조 진행하였다.
그 후, 6N 염산수용액 40ml를 투입한 후, 상온에서 2시간동안 반응을 진행하였다. 반응액을 동결건조한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 b를 얻었다. (1.6 g, 40 %)
Rf = 0.23 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)
LC/MS, 계산치 C15H29N7O5S 298.35, 측정치 419.50
실시예 2 : 본 발명에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물로서 화합물 c의 제조
(1) 화합물 c-1의 합성
6-아미노-1,3-나프탈렌디설포닉 산 모노소듐 염 수화물) (6-Amino-1,3-naphthalene disulfonic acid monosodium salt hydrate, TCI) (15g)을 증류수 200mL에 가한 후 12 시간 동안 이온교환수지를 이용하여 이온교환 후 감압 건조 시킨다. (15g, 100%)
염화제일주석 (Tin(II) chloride)에 증류수 40ml, 염산(HCl) 8ml을 혼합하고 냉각시켰다. 앞에서 얻은 고체 물질(15 g, 49.5mmol, 1eq)에 증류수 120ml, 염산(HCl) 25ml을 가한 후 5분 동안 0℃에서 반응시킨다. 아질산나트륨 (Sodium nitrite) (3.4 g, 49.5mmol, 1 eq)에 증류수 50ml 가한 것을 상기 용매에 적가 후 30분 동안 반응시킨다. 상기 냉각시킨 용액을 혼합액에 적가 후 12 시간 동안 상온에서 반응시킨다. 회전농축기(evaporator)로 용매를 건조 후 다이에틸 이터로 입자를 잡은 뒤 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (18g, 114%)
(2) 화합물 c-2의 합성
c-1 (6 g, 18.8 mmol, 1 eq,)과 3-메틸-2-부탄온 (3-Methyl-2-butanone) (6.05 mL, 56.4 mmol, 3.02 eq, TCI), 포타슘 아세테이트(Potassium acetate) (3.7 g, 37.6 mmol, 2 eq, 덕산)을 아세트산 50 mL에 가한 후, 12 시간 동안 140℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고 용매를 감압 건조 후 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (7.4 g, 107%)
Rf = 0.57 정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
(3) 화합물 c-3의 합성
c-2 (7.4 g, 20.3 mmol, 1 eq)과 1,3-프로판설톤(1,3-Propanesultone) (7.9 mL, 90.5 mmol, 4.46 eq, TCI), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) (2 g, 40.6 mmol, 2 eq)을 아세토나이트릴(Acetonitrile) 20 ml에 가한 후, 12 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 감압 건조하였다. (15g, 153%)
(4) 화합물 c-4의 합성
c-3 (15 g, 30.4 mmol, 1 eq)과 말론알데하이드 다이아닐리드 하이드로클로라이드(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride) (7.8 g, 30.4 mmol, 1 eq, TCI), 트리에틸아민(Triethylamine) (4.2 mL, 30.4 mmol, 1 eq, TCI)를 아세트산(Acetic acid) 100ml에 가한 후 4 시간 동안 140℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다. (12 g, 60 %)
Rf = 0.5 정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
(5) 화합물 c-5의 합성
에틸 2-메틸아세토아세테이트(Ethyl 2-methylacetoacetate) (24.2 mL, 0.16 mol, 1 eq, TCI)과 에틸-6-브로모헥사노에이트(Ethyl 6-bromohexanoate) ( 34 mL, 0.17 mol, 1.1 eq, TCI), 소듐 에톡사이드(Sodium ethoxide) (64 mL, 0.77 mol, 4.8 eq, TCI)에 에탄올(Ethanol) 200ml을 가한 후 12 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 1M 염산을 소량 적가 후 pH를 중성(7)로 만든다. 클로로포름(Chloroform)과 증류수를 이용하여 추출 후 용매를 감압 건조한다. 그 후 핵산과 에틸아세테이트를 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다. (48g, 106.6%)
Rf = 0.4 (정상, 실리카겔, 핵산:에틸아세테이트=9:1 v/v)
(6) 화합물 c-6의 합성
c-5 (48 g, 0.16 mol, 1 eq)과 수산화나트륨(Sodium hydroxide) (21.4 g, 0.51 mol, 3.2 eq, 덕산)에 메탄올(Methanol) (165 mL, 3.9 mol, 24.4 eq)과 증류수 (54.6 mL, 2.89 mol, 18.1 eq)를 가한 후 12 시간 동안 50℃에서 가열하며 반응시켰다. 감압 건조 후 1M 염산을 200ml 적가하여 pH를 산성(1)로 만들었다. 에틸아세테이트와 증류수로 추출 후 용매를 감압 건조한다. (30g, 95.2%)
Rf = 0.0 (정상, 실리카겔, 핵산:에틸아세테이트=9:1 v/v)
(7) 화합물 c-7의 합성
c-6 (15.8 g, 84.8 mmol, 1.5 eq)과 c-1 (18 g, 56.5 mmol, 1 eq)에 아세트산(Acetic acid) 87ml을 가한 후 5시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고 생성된 고체를 제거하기 위해 여과하였으며 여액을 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다. (30g, 115.3%)
Rf = 0.45 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
(8) 화합물 c-8의 합성
c-7 (30 g, 63.9 mmol, 1 eq) 1,3-프로판설톤(1,3-Propanesultone) (37.5 mL, 428.1 mmol, 6.7 eq, TCI), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) (7.2 g, 105.4 mmol, 1,65 eq)을 아세토나이트릴(Acetonitrile) 45 ml에 가한 후, 5 시간 동안 120℃에서 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 감압 건조하였다. 그 후 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하였다. (52g, 140%)
(9) 화합물 c의 합성
c-4 (15 g, 25.9 mmol, 1.5 eq)과 c-8 (11.5 g, 17.3 mmol, 1 eq)를 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide)에 완용한다. 상기 용액에 트리에틸아민(Triethylamine) (20.5 mL, 147 mmol, 8.5 eq, TCI)를 아세트산무수물(Acetic anhydride) (9 mL, 95.1 mmol, 5.5 eq, 덕산)를 가한 후 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v의 전개액으로 Silica gel 60 정상 크로마토그래피로 정제하였다. (12 g, 60 %)
Rf = 0.5 정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
실시예 3 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 1의 제조
(1) 화합물 1-1의 합성
c (500 mg, 0.5 mmol, 1 eq)와 N,N-다이석시니미딜 카보네이트(DSC, N,N-Disuccinmidyl carbonate) (384 mg, 1.5 mmol, 3 eq, TCI), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, N,N-Diisopropylethylamine) (870 μl, 5 mmol, 10 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 50 ml에 가한 후, 1 시간 동안 40℃에서 가열하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다 (500 mg, 91%)
Rf = 0.31 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
LC/MS, 계산치 1215.14, 측정치 1216.2
(2) 화합물 1-2의 합성
1-1 (133 mg, 0.11 mmol, 1eq), a (100 mg, 0.328 mmol, 3 eq), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, N,N-Diisopropylethylamine) (95.8 μl, 0.55 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 10 ml에 가한 후, 12시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그리고 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-2를 얻었다. (78 mg, 58.5 %)
Rf = 0.125 (이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3)
LC/MS, 계산치 1399.57, 측정치 1398.29
(3) 화합물 1의 합성
1-2 (78 mg, 0.056 mmol, 1 eq)와 N,N-테트라메틸-O-(N-석씨니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (TSTU, N,N,N’’tetrafluoroborate)(50 mg, 0.167 mmol, 3 eq, TCI), 트리에틸아민 (39 μl, 0.28 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 8 ml에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1를 얻었다. (43.85 mg, 51.8 %)
Rf = 0.175 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
LC/MS, 1496.64, 측정치 1495.31
실시예 4 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 2의 제조
(1) 화합물 2-1의 합성
1-1 (120 mg, 0.099 mmol, 1eq), b (124 mg, 2.97 mmol, 3 eq), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, N,N-Diisopropylethylamine) (86.2 μl, 0.495 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 12 ml에 가한 후, 12시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2-1를 얻었다. (89 mg, 59.3 %)
Rf = 0.13 (이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3)
LC/MS, 계산치 1520.72, 측정치 1519.31
(3) 화합물 2의 합성
2-1 (89 mg, 0.059 mmol, 1 eq)와 N,N-테트라메틸-O-(N-석씨니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (TSTU, N,N,N’’tetrafluoroborate)(53 mg, 0.176 mmol, 3 eq, TCI), 트리에틸아민 (41.1 μl, 0.295 mmol, 5 eq, TCI)을 다이메틸포름아마이드 9 ml에 가한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이에틸 이터를 이용하여 입자를 잡은 뒤 생성된 고체 입자를 감압 건조시켰다. 그 후 아세토나이트릴 수용액을 전개액으로 이용하는 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2를 얻었다. (34 mg, 35.8 %)
Rf = 0.152 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
LC/MS, 1617.80, 측정치 1616.33
실시예 5 내지 8 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 3 내지 6의 합성
상기 실시예 2 내지 4에서 설명된 것과 유사한 방법으로, 실시예 5 내지 8을 진행하였다.
실시예 5: 화합물 3의 제조
(34 mg, 12 %)
Rf = 0.65 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
LC/MS, 계산치 1109.38, 측정치 1108.53
실시예 6: 화합물 4의 제조
(40.5 mg, 48.1 %)
Rf = 0.65 (정상, 실리카겔, 이소부탄올:프로판올:에틸아세테이트:증류수=2:4:1:3 v/v)
LC/MS, 계산치 1130.53, 측정치 1228.70
실시예 7. 화합물 5의 합성
(3.5 mg, 13.21%)
Rf = 0.375 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 1306.46, 측정치 1305.35
실시예 8. 화합물 6의 합성
(11.6 mg, 62.7%)
Rf = 0.29 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 1427.61, 측정치 1426.37
상기 본 발명의 화합물에 포함되는 화합물과 종래의 화합물에 대한 비교실험을 통하여 본 발명에서 제공하는 화합물이 형광신호를 이용하여 생체물질을 검출하는 데에 유용하다는 것을 입증하였다.
비교예 1: 화합물 1의 광학특성 평가
(1) 흡광 및 형광 분석
본 발명에서 제공하는 화합물 1 과 대조형광염료 (Invitrogen, Alexa Fluor™ 680 NHS ester) 의 흡광 및 형광 분석을 진행하고 그 특성을 확인하였다.
상기 두 가지의 형광염료에 DMF를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조하고 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline (이하 1X PBS) 을 이용하여 희석 후 측정을 진행하였다.
흡광은 Agilent 의 Cary 3500 UV-Vis 분광 광도계를 사용하였고, 형광은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였으며, 도 1에는 흡형광 스펙트럼을 제시하였고, 도 2에는 광학특성을 제시하였다.
비교예 2: 화합물 4의 광학특성 평가
(1) 흡광 및 형광 분석
본 발명에서 제공하는 화합물 4와 대조형광염료 I (ICG NHS ester)및 대조형광염료 II (LI-COR, IRDye® 800CW NHS ester) 의 흡광 및 형광 분석을 진행하고 그 특성을 확인하였다.
상기 세가지 형광염료에 각각 용해하기가 쉬운 용매 (DMSO/DMF)를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조하고 MeOH로 희석 후 측정하였다.
흡광은 Agilent의 Cary 3500 UV-Vis 분광 광도계를 사용하였고, 형광은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다.
도 3에는 흡형광 스펙트럼 결과를 제시하였고, 도 4에는 광학특성(최대 흡, 형광 파장) 결과를 나타내었다.
비교예 3: 화합물 6의 광학특성 평가
(1) 흡광 분석
본 발명에서 제공하는 화합물 6 과 대조형광염료 (Flamma®774 NHS ester)의 흡광 특성을 비교하였다.
상기 두 가지의 형광염료에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조한다. 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다. 우선 동일 몰 농도로 흡광 특성을 비교하기 위해 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline (이하 1X PBS)을 이용하여 각각 6.51 uM 농도까지 희석한 후 흡광도를 측정하였다.
상기 측정은 Agilent 사의 Cary 3500 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 진행하였고, 도 5에 그 결과를 제시하였다. 도 5의 결과로부터 두 형광염료가 유사한 흡광 스펙트럼을 나타내고, 흡광 세기 및 몰 흡광계수에서는 화합물 6 이 대조형광염료보다 높음을 확인할 수 있다.
(2) 형광특성 및 강도 비교
본 발명에서 제공하는 화합물 6 과 대조형광염료(Flamma®774 NHS ester)의 형광특성 및 강도를 비교하였다. 2 종의 형광염료에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하였다. 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다.
우선 동일 몰농도로 형광강도를 비교하기 위해 pH 7.4 1X PBS를 이용하여 각각 0.407 uM의 농도까지 희석한 후 두 염료의 실제 Excitation (nm) 값을 적용하여 형광을 측정하였다.
측정은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였고, 결과를 도 6에 나타내었다.
이후 추가로, 동일 무게농도로 형광강도를 비교 분석하기 위해 두 염료의 Stock solution을 1X PBS로 각 0.625 mg/mL 농도까지 희석한 후 형광을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 제시하였다.
동일 몰농도 및 동일 무게농도 분석 모두에서 화합물 6 의 형광강도가 대조형광염료보다 높은 것으로 측정되었고, 각 물질의 1X PBS 용매 내에서 최대 형광 파장은 화합물 6 이 803 nm, 대조형광염료는 800 nm로 유사한 것으로 확인되었다.
비교예 4: 단백질 표지(labeling) 후 성능 비교
(1) 반응비 별 표지율
본 발명에서 제공하는 화합물 6과 대조형광염료(Flamma®774 NHS ester) 에 대하여 항체(Invitrogen, Goat anti Rabbit IgG H+L Secondary Ab, 150 kDa)에 표지를 진행하고, 표지율 (F/P molar ratio)을 비교하였다.
표지전 화합물 6과 대조형광염료는 모두 DMF에 10 mg/mL로 녹여 Stock solution을 만들어 사용하였고, 항체 0.1 mg에 각 염료를 반응비 (5, 15, 25, 33 Fold) 별로 반응시켰다. 반응 버퍼는 최종 pH 8.3~8.5 가 되도록 제조하였으며, 항체의 최종 반응 농도는 2 mg/mL이 되게 하였다. 반응은 상온, 암실 환경에서 1 시간 교반하며 진행하였고, Sephadex G-25 레진 (Cytiva)이 채워진 컬럼관 정제를 통해 반응물을 분리, 획득하였다. 레진은 1X PBS로 미리 버퍼 평형시켜 사용한다.
각 반응물에 대하여 280 nm 및 각각의 최대 흡광 파장에서 흡광도를 측정(Agilent, Cary 3500 UV-Vis spectrophotometer)하였고, 보편적으로 알려진 수식에 따라 표지율을 산출하여, 그 결과를 도 8과 도 9에 지시하였다. F/P ratio는 두 형광염료의 Extinction coefficient, CF280 실제 분석치를 대입하여 산출하였다.
도 8 및 도 9로부터 반응비 별 표지율은 모든 반응비에서 화합물 6 의 표지율이 대조형광염료의 표지율 대비 높은 것으로 확인되었고, 또한 화합물 6을 15 Fold 표지하였을 때 대조형광염료를 33 Fold 표지한 것과 유사한 표지율을 보이는 것을 알 수 있다.
(2) 표지율에 따른 형광강도 비교
상기 비교예 4-(1)에서의 반응비 별 반응물들에 대하여 형광강도를 측정하고, 표지율에 따른 형광강도를 비교하였다.
도 10에 그 결과를 나타내었으며, 형광측정은 앞서 언급했던 PerkinElmer 사의 장비를 활용하였다.
반응물의 형광강도는 모든 표지율에서 상기 화합물 6이 대조형광염료와 대비하여 높은 것으로 측정되었다. 즉 화합물 6 의 표지율 0.69와 대조형광염료의 표지율 0.86에서는 화합물 6이 약 2 배의 형광강도를 보이고, 화합물 6 의 표지율 1.52와 대조형광염료의 표지율 1.39에서는 화합물 6이 약 7 배의 형광강도를 보이는 것을 확인되어, 본 발명에서 제공하는 화합물 6이 대조형광염료와 대비하여 우수한 성능을 보임을 확인하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 히드록시기로 치환된 트리아진을 도입한 형광 화합물은 동일한 농도에서 종래의 형광 화합물에 비하여 형광 강도 등 형광 효율이 높아서, 미량의 생체치료에서도 목적물질을 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명은 상기에서 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그 외에 다양한 생물학적, 화학적 분야에서 이용될 수 있고, 이러한 적용영역도 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.
본 발명은 산업상 이용가능하다.
Claims (6)
- 하기의 화학식 1로 표현되는 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물
<화학식 1>
상기 화학식 1에서
X1, X2, X3 및 X4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO3H, SO3 - 중에서 선택되며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 - , -(CH2)mSO3H 및중에서 선택되고,
R3 및 R4 는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOZ 및중에서 선택되며,
다만, R1 내지 R4중 하나 이상은 반드시이며 R3 와 R4는 동시에 -(CH2)mCOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n1 및 n3는 2 내지 7의 자연수이며, n2는 1 내지 5의 자연수이고
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고, p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고, r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH2)sSO3H이고, s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,
Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0-6알킬아미닐기 및 아미노C0-6알킬 중에서 선택된다.
- 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
- 하기의 화학식 1로 표현되는 형광 화합물을 포함하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물 :
<화학식 1>
상기 화학식 1에서
X1, X2, X3 및 X4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, SO3H, SO3 - 중에서 선택되며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 - , -(CH2)mSO3H 및중에서 선택되고,
R3 및 R4 는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOZ 및중에서 선택되며,
다만, R1 내지 R4중 하나 이상은 반드시이며 R3 와 R4는 동시에 -(CH2)mCOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n1 및 n3는 2 내지 7의 자연수이며, n2는 1 내지 5의 자연수이고
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고, p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고, q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고, r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고, Z는 OH 또는 NH(CH2)sSO3H이고, s는 1내지 7 중 하나의 정수이고,
Y는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0-6알킬아미닐기 및 아미노C0-6알킬 중에서 선택된다.
- 제4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220025607A KR102414554B1 (ko) | 2022-02-27 | 2022-02-27 | 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220025607A KR102414554B1 (ko) | 2022-02-27 | 2022-02-27 | 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102414554B1 true KR102414554B1 (ko) | 2022-06-30 |
Family
ID=82214936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220025607A KR102414554B1 (ko) | 2022-02-27 | 2022-02-27 | 생체물질을 검출하기 위한 형광 화합물 및 이의 제조방법 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102414554B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03224793A (ja) * | 1989-12-22 | 1991-10-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | 情報記録媒体および光情報記録方法 |
| WO2000016810A1 (en) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Schering Aktiengesellschaft | Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging |
| KR20110033454A (ko) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | 주식회사 디케이씨코포레이션 | 친유성 나노 입자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 |
| WO2021125295A1 (ja) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | 富士フイルム株式会社 | 化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質 |
-
2022
- 2022-02-27 KR KR1020220025607A patent/KR102414554B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03224793A (ja) * | 1989-12-22 | 1991-10-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | 情報記録媒体および光情報記録方法 |
| WO2000016810A1 (en) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Schering Aktiengesellschaft | Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging |
| KR20110033454A (ko) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | 주식회사 디케이씨코포레이션 | 친유성 나노 입자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 |
| WO2021125295A1 (ja) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | 富士フイルム株式会社 | 化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質 |
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