KR102550713B1

KR102550713B1 - 히드록시 치환된 트리아진을 포함하는 형광 화합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102550713B1
Application number: KR1020210006771A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 김기원; 신경림; 유은서
Original assignee: (주)바이오액츠
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2023-07-03
Also published as: KR20220104454A; CN114805310A; US20220229063A1

Abstract

본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1로 표현되는 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 히드록시기로 치환된 트리아진을 링커로 도입함으로써 종래 구조에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

Description

히드록시 치환된 트리아진을 포함하는 형광 화합물 및 이의 제조방법{Fluorescent compound with cyanuric-hydroxide and the preparation method thereof}

본 발명은 형광 화합물에 관한 것으로서, 질병의 진단, 치료 및 예후를 예측할 수 있는 형광 진단조성물에 유용하게 사용될 수 있는 화합물이다.

본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 종래의 시아닌계열의 화합물의 형광 효율이 높지 않다는 것을 개선한 것으로서, 상기 시아닌계열의 치환기에 히드록시기가 치환된 트리아진 구조를 링커로서 포함하는 형광 화합물에 관한 것이다.

본 발명에서 제공하는 형광 화합물은 노이즈가 적고 형광효율이 높아 본 발명의 형광 진단조성물을 이용할 경우에는 목적하는 생체물질을 검출할 때에 형광 신호의 효율을 향상시킬 수 있어서 종래의 기술보다 정확하게 생체물질을 진단할 수 있다.

생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.

바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.

일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.

상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.

바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.

이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.

특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.

그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVD±등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 480~500 nm 및 540~560 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다

상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.

한국공개특허 10-2011-0033454

본 발명의 목적은 광학 및 pH 안정성 우수하고, 좁은 흡수 및 발광 파장의 범위를 가지면서도 400 내지 900 nm의 형광 영역에서 형광 강도가 더욱 향상되어 조영제 조성물로 이용할 수 있고, 특히 시아닌계 형광 화합물에서 히드록시기로 치환된 트리아진 구조를 가지는 링커를 도입하여 형광을 증진시킬 수 있는 형광 화합물 및 상기 화합물의 제조방법 또는 상기 화합물의 포함하는 형광 진단 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 개발함으로써 하였다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서

X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO₃ ^- 및 -SO₃H 중에서 선택되며,

R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및

중에서 선택되고,

R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOOZ 및

중에서 선택되며,

R₃ 및 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOOZ 및

중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,

상기 식에서

n은 0 내지 6 중 하나의 정수이고,

m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,

p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,

q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,

r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,

Z는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C_0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C_0-6알킬아미닐기 및 아미노C_0-6알킬 중에서 선택된다.

본 발명에 따른 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 히드록시기로 치환된 트리아진을 링커로 도입함으로써 종래 구조에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되어 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 화합물과 종래 화합물의 형광세기의 대비결과를 그래프로서 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물과 종래 화합물의 형광세기의 대비결과를 수치를 이용한 표로서 나타낸 것이다.

본 발명의 형광 화합물은 종래에 사용되었던 염소로 치환된 트리아진을 포함하는 형광 화합물이 노이즈가 많고 형광 효율이 낮다는 점을 개선하기 위하여 발명된 것으로서, 상기 염소로 치환된 트리아진을 히드록시기로 치환된 트리아진을 시아닌계열의 화합물의 링커로서 도입한 것이다.

이하에서는 본 발명의 실시예를 이용하여, 본 발명의 형광 화합물 및 계면활성제 화합물의 제조방법 및 본 발명의 조성물의 형광효율 등을 구체적으로 살펴보도록 한다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물을 사용한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서

중에서 선택되고,

중에서 선택되며,

R₃ 및 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOOZ 및

중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,

상기 식에서

n은 0 내지 6 중 하나의 정수이고,

m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,

p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,

q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,

r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,

본 발명에서 제공하는 상기 화학식 1의 화합물은 생체물질을 표지하여 상기 생체물질을 검출하는 데에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공하는 형광 화합물이 생체물질을 표지할 때에는 생체물질에 존재하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 관능기와 결합함으로써 생체물질을 표지할 수 있다.

상기 <화학식 1>로 표시되는 형광 화합물을 표지하는 방법으로는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 <화학식 1>의 화합물과 상기 생체물질, 나노입자 또는 유기화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.

생체물질의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체물질의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체물질 표지용으로 사용하기에 적합하다.

상기 화학식 1에 포함되는 화합물의 제조방법을 설명한다.

실시예 1 : 본 발명에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물의 합성

(1) 화합물 3-1의 합성

1,3-디아미노프로판 (1,3-Diaminopropane) (20 g, 270 mmol, 7.96 eq)를 1,4-다이옥산 (1,4-dioxane) 70 ml 에 용해하였다. 디-터트-부틸 디카보네이트 (di-tert-butyl dicarbonate) (7.4 g, 33.9 mmol, 1 eq)를 1,4-dioxane 70 ml 에 용해한 후 1,3-diaminopropane 용액에 세류하고, 상온에서 일야교반 진행한 후 감압건조 하였다. 건조된 물질을 증류수에 용해한 후 여과하여 얻어진 여과액에 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride) 로 3회 추출하였다. 추출 후 얻어진 유기층을 감압건조 하여 화합물 3-1을 얻었다. (6 g, 91.5%)

R_f = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

(2) 화합물 3-2의 합성

화합물 3-1 (5.1 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 Acetone 150ml 와 증류수 50ml 혼합용액에 용해 후 4℃ 이하로 보관하였다. 시아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride, CNC) (5.4 g, 29.27 mmol, 1 eq) 를 Acetone 150 ml 에 완용한 후, 얼음 50g을 투입하여 4℃ 이하로 분산하였다. 화합물 3-1 용액을 CNC 용액에 세류한 후, 탄산수소나트륨 수용액 (2.46 g 탄산나트륨을 증류수 50ml에 완용) 을 세류한 후 4℃ 이하에서 2시간 반응을 진행하였다. 6-아미노헥사노익산 (6-Aminohexanoic acid, 1.42 g, 29.27 mmol, 1 eq)를 증류수 50ml 에 녹인 후 상기 반응액에 세류하였다. 탄산수소나트륨 수용액을 세류하여 상온에서 2시간 반응을 진행한 후, 40℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 한 후, 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 화합물 3-2 를 얻었다. (9 g, 73.8%)

R_f = 0.7 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

LC/MS, 계산치 C₁₇H₂₉ClN₆O₄ 416.91, 측정치 415.2

(3) 화합물 3-3의 합성

화합물 3-2 (3 g, 7.2 mmol, 1 eq)를 아세토니트릴 (Acetonitrile, ACN) 40ml 에 완용 후 증류수 40ml를 투입하였다. 그 후, 6N 염산수용액 20ml를 투입한 후, 60℃에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 감압건조 진행한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 3-3을 얻었다. (1.5 g, 69.8 %)

R_f = 0.4 (실리카겔, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 8 : 1)

LC/MS, 계산치 C₁₂H₂₂N₆O₃ 298.35, 측정치 297.3

실시예 2 : 본 발명에 포함되는 화합물을 제조하기 위한 개시 화합물 1-1의 합성

(1) 화합물 4-1 의 합성

에틸 2-메틸 아세토아세테이트(Ethyl 2-Methyl Acetoacetate) (29.2 ml, 0.203 mol, 1eq)와 21% 나트륨 이소라이드 용액(21% Sodium Ethoride Solution) (64 ml, 0.816 mol, 4 eq), 에틸 6-프로모헥사노에이트(Ethyl 6-Bromohexanoate) (34ml, 0.192 mol, 1 eq), 에탄올(Ethanol) (200 ml)을 첨가한 뒤 120℃에서 12시간동안 환류시켰다. 그 후 용매를 1M 염산을 이용하여 pH를 중성으로 중화시킨 뒤 클로로포름과 증류수를 이용하여 추출하였다. 추출한 용매를 감압 건조시킨 뒤 정상 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 화합물 4-1 를 얻었다. (36.8g, 63.4%)

R_f = 0.34 (Silicagel, 헥산/에틸 아세테이트 = 10:1 v/v)

(2) 화합물 4-2 의 합성

화합물 4-1 (13.7 g, 0.0486 mol, 1 eq)에 수산화나트륨 (6.2 g, 0.170 mol, 3.5 eq), 메탄올(Methanol) (47.2 ml), 증류수 (15.6 ml)을 첨가한 뒤 50℃에서 12시간동안 환류시켰다. 그 후 용매를 감압 건조한 뒤 1M 염산을 이용하여 pH를 1로 맞춘 뒤 에틸 아세테이트를 이용하여 추출 후 감압건조 하여 화합물 4-2 을 얻었다. (8.17g, 90.7%)

R_f = 0.05 (Silicagel, 헥산/에틸 아세테이트 = 10:1 v/v)

(3) 화합물 4-3 의 합성

화합물 4-2 (8.165 g, 0.0438 mol, 1 eq)에 p-하이드라지노벤젠설포닉 산(p-Hydrazinobenzensulfonic Acid Hemihydrate) (8.25 g, 0.0438 mol, 1 eq), 아세트산를 첨가한 뒤 120℃에서 5hr동안 환류시켰다. 이를 감압건조 시킨 뒤 정상 크로마토그래피법을 이용하여 정제한 후 감압건조 하여 화합물 4-3을 얻었다. (12.6g, 84.8%)

R_f = 0.51 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

(4) 화합물 4-4 의 합성

화합물 4-3 (12.57 g, 0.037 mol, 1 eq)에 아세트산 나트륨 (4.16 g, 0.061 mol, 1.65 eq), 1,3-프로판 설톤(1,3-Propane Sultone) (21.3ml, 0.243 mol, 6.57 eq), 아세토니트릴 (24.8 ml)을 첨가한 뒤 110℃에서 5시간동안 환류시켰다. 그 뒤 감압건조 한 뒤 역상 크로마토그래피법을 이용하여 정제한 후 감압건조하여 화합물 4-4를 얻었다. (12g, 70.6%)

R_f = 0.3 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

(5) 화합물 4-5 의 합성

화합물 4-1 (50g, 0.18 mol, 1 eq)에 소듐 아세테이트 (Sodium Acetate) (17.87 g, 0.216 mol, 1.2 eq), 1,3-프로판 설톤(1,3-Propane Sultone) (70.5 ml, 0.8 mol, 4.5 eq), 아세토니트릴 (42 ml)을 첨가하였다. 그 뒤 110℃에서 12시간동안 환류시킨 뒤 에틸 아세테이트를 이용하여 입자를 잡은 뒤 이를 건조시켜 화합물 4-5를 얻었다. (61g, 94%)

(6) 화합물 4-6 의 합성

화합물 4-5 (60 g, 0.166 mol, 1 eq)에 말론알데히드 디아닐리드 하이드로클로라이드 (Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride) (42.9 g, 0.166 mol, 1 eq), 트리에틸아민(Triethylamine) (2.3 ml, 0.016 mol, 0.1 eq), 아세트산 (551 ml)을 첨가한 뒤 140℃에서 가열환류 하였다. 그 후 에틸아세테이트를 이용하여 입자를 석출한 뒤 이를 건조시켰다. 정상 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 정제한 후 감압건조하여 화합물 4-6을 얻었다. (7.5g, 8.5%)

R_f = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

(7) 화합물 1-1 의 합성

화합물 4-4 (6.5 g, 0.014 mol, 1 eq)과 화합물 4-6 (7.5 g, 0.014 mol, 1 eq) 을 트리에틸아민 (16.6ml, 0.12 mol, 8.5 eq) 과 무수 아세트산 (7.3ml), DMF (75ml) 혼합용액에 첨가한 뒤 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후 에틸 아세테이트를 이용하여 입자를 석출한 뒤 이를 건조하였다. 정상 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 정제한 후 감압건조하여 화합물 1-1을 얻었다. (250mg, 2%)

R_f = 0.4 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

LC/MS, 계산치 C₃₆H₄₄N₂Na₂O₁₄S₄ 902.98, 측정치 901

실시예 3 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 1-2의 합성

(1) 화합물 2-1의 합성

화합물 1-1 (100mg, 0.1165 mmol, 1 eq)과 TSTU (77 mg, 0.2563 mmol, 2.2 eq), 트리에틸아민 (125ul, 0.897mmol, 7.7eq)을 DMF 10 mL에 가한 후, 40분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조하여 화합물 2-1 을 얻었다. (111 mg, 100%)

Rf = 0.44 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

LC/MS, 계산치 C40H49N3O16S4 956.09, 측정치 954

(2) 화합물 1-2의 합성

화합물 2-1 (93mg, 97.1 umol, 1 eq)을 DMF 10 mL에 완용하였다. 화합물 3-3 (44 mg, 1546 umol, 1.5 eq)를 DMF 1 ml 에 완용 후 화합물 2-1 용액에 투여한 후, 휘니그베이스 125 ul, 10 eq)를 투입하여 상온에서 일야교반 진행하였다. 반응 확인 후, Ether를 투입하여 입자를 생성시키고, 여과 및 건조하였다. 얻어진 물질을 역상크로마토그래피를 사용하여 정제 후 감압건조하여 화합물 1-2를 얻었다. (95 mg, 85.9 %)

R_f = 0.35 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

LC/MS, 계산치 C₄₈H₆₆N₈O₁₆S₄ 1139.34, 측정치 1138.2

실시예 4 : 본 발명에 포함되는 화합물인 상기 1-2 화합물의 다른 합성방법

(1) 화합물 1-3의 합성

화합물 2-1 (553 mg, 580 umol, 1 eq)을 DMF 20 mL에 완용하였다. 화합물 3-2 (724 mg, 1.74 mmol, 3 eq)를 HCl 용액 (4M in Dioxane) 36 mL 에 완용한 후 1시간동안 교반한 후 감압건조하여 얻어진 물질을 DMF 20 mL를 넣어 다시 완용하였다. 화합물 2-1 용액에 화합물 3-2 용액을 투여한 후, 휘니그베이스 (505 uL. 5 eq)를 투입하여 상온에서 1시간동안 교반 진행하였다. 반응을 확인 후, Ether를 투입하여 입자를 생성시키고, 여과 및 건조 진행하였다. 얻어진 물질을 역상크로마트그래피를 사용하여 정제 후 감압건조하여 화합물 1-3을 얻었다. (490 mg, 73.0 %)

R_f = 0.34 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

LC/MS, 계산치 C₄₈H₆₅ClN₈O₁₅S₄ 1157.79, 측정치 1153.8

(2) 화합물 1-2의 다른 합성방법

화합물 1-3 (200 mg, 173 umol. 1 eq)에 ACN 10 mL 와 증류수 10 mL를 각각 투입하여 완용하였다. 그 후, 6N 염산수용액 5 mL를 투입한 후, 60℃ 에서 일야교반 진행하였다. 반응액을 동결건조 진행한 후, 역상컬럼을 진행하여 화합물 1-2를 얻었다. (122 mg, 61.9 %)

LC/MS, 계산치 C₄₈H₆₅ClN₈O₁₅S₄ 1157.79, 측정치 1153.8

실시예 5 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 2-2의 합성

화합물 2-1 (100mg, 0.088 mmol, 1 eq)과 TSTU (53 mg, 0.2563 mmol, 2 eq), 트리에틸아민 (27 mg, 0.263mmol, 3eq)을 DMF 10 mL에 가한 후, 40분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조하여 화합물 2-2 을 얻었다. (80 mg, 73.6%)

Rf = 0.40 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)

LC/MS, 계산치 C₅₂H₆₉N₉O₁₈S₄ 1236.41, 측정치 1234.0

실시예 6 내지 10 : 본 발명에 포함되는 화합물인 화합물 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 및 1-8의 합성

상기 실시예 1 내지 5에서 설명된 것과 유사한 방법으로, 실시예 6 내지 10를 진행하였다.

실시예 6. 화합물 1-4 의 합성

(110 mg, 80.9%)

R_f = 0.5 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 3:1 v/v)

실시예 7. 화합물 1-5 의 합성

(105 mg, 83.5%)

R_f = 0.45 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 3:1 v/v)

실시예 8. 화합물 1-6 의 합성

(90 mg, 71.0%)

R_f = 0.4 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 3:1 v/v)

실시예 9. 화합물 1-7 의 합성

(92 mg, 90.3%)

R_f = 0.6 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 3:1 v/v)

실시예 10. 화합물 1-8 의 합성

(53 mg, 70.5%)

R_f = 0.5 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 3:1 v/v)

상기 본 발명의 화합물에 포함되는 화합물 2-2와 본 발명의 화합물에 포함되지 않는 화합물 2-1의 동일 흡광 파장에서의 형광 수치를 비교예를 통하여 대비하였다.

비교예 1. 화합물 2-1 과 화합물 2-2 의 동일 흡광 파장에서의 형광 수치 비교

화합물 3-3에 나타나 있는 히드록시기로 치환된 트리아진을 링커로 도입에 의한 형광 세기의 증가 경향을 확인하기 위하여, 다음과 같은 비교실험을 진행하였다.

상온에서 PBS 5mL에 화합물 2-1 을 10mg/ml 의 농도로 DMF 에 녹인 후 5ul 을 추가하였고 이와 동일하게 PBS 5mL에 화합물 2-2 을 동일 농도로 5ul 을 추가하였다. 이 두 시료 2mL에 PBS 1mL씩 추가하여 흡광 측정하였고, 상기 화합물을 희석한 이후에도 형광을 측정하였다.

화합물 2-1에 화합물 3-3의 히드록시기로 치환된 트리아진 구조가 도입된 화합물인 화합물 2-2 의 경우, 단일 염료 형태일 때, 농도가 높아질수록 화합물 2-1과 비교하여 형광 강도가 높아짐이 확인되었다.

화합물 2-1에 히드록시기로 치환된 트리아진이 링커로서 도입될 경우에, 동일한 흡수 강도를 나타내는 농도에서, 최대 162% 이상의 형광 강도의 증가를 확인하였고, 이를 도 1 및 도2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에서 1/2 및 1/4의 수치는 최초 농도를 희석한 것을 나타낸다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 히드록시기로 치환된 트리아진을 도입한 형광 화합물은 동일한 농도에서 종래의 형광 화합물에 비하여 형광 강도 등 형광 효율이 높아서, 미량의 생체치료에서도 목적물질을 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명은 상기에서 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그 외에 다양한 생물학적, 화학적 분야에서 이용될 수 있고, 이러한 적용영역도 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

본 발명은 산업상 이용가능하다.

Claims

하기의 화학식 1로 표현되는 생체물질의 표지를 위한 형광 화합물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO₃ ^- 및 -SO₃H 중에서 선택되며,
R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및
중에서 선택되고,
R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOOZ 및
중에서 선택되며,
상기 R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 중 하나 이상은 반드시
으로 치환되나, R₃ 및 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n은 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
Z는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 비닐설포닐기 중에서 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광 화합물
하기의 화학식 1로 표현되는 형광 화합물을 포함하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물 :
<화학식 1>

상기 화학식 1에서
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO₃ ^- 및 -SO₃H 중에서 선택되며,
R₁ 및 R₂는 서로 동일하거나 각각 독립적으로 C_1-7알킬, C_8-18알킬, -(CH₂)_mSO₃ ^- , -(CH₂)_mSO₃H 및
중에서 선택되고,
R₃ 및 R₄는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C_1-7알킬, -(CH₂)_mCOOZ 및
중에서 선택되며,
상기 R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 중 하나 이상은 반드시
으로 치환되나, R₃ 및 R₄는 동시에 -(CH₂)_mCOOZ 및
중에서 선택되는 어느 하나는 아니고,
상기 식에서
n은 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 10 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
Z는 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 비닐설포닐기 중에서 선택된다.
제4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 각 화학식으로 표현되는 화합물 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 생체물질은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체물질을 검출하기 위한 형광 진단조성물