JP2023553709A - Ｐｈ応答性シアニン色素およびそのコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本発明は光学イメージングの分野に関する。より具体的には、ｐＨ応答性を特徴とする赤外～近赤外（６５０～９００ｎｍ）発光を有する一群のモノアルキル化シアニン色素およびその生物学的リガンドとのコンジュゲートに関する。本発明はまた、固形腫瘍の画像化または治療における光学的診断剤としてのこれらの化合物の使用、それらの調製方法、およびそれらを含む組成物に関する。本発明のモノアルキルシアニン色素は一般式（Ｉ）を有し、式中、Ｒ１およびＲ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｒ２およびＲ４は水素であるか、またはＲ１がＲ２と一緒になって、およびＲ３がＲ４と一緒になって、それぞれ、それらが結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ３Ｈで置換されていてもよい２個のアリール環を形成し、Ｒ５は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ２から選択される基で置換されていてもよいアルキルである。

Description

本発明は光学イメージングの分野に関する。より具体的には、蛍光がｐＨに応答する、赤色から近赤外（６５０～９００ｎｍ）で発光するモノアルキル化シアニン色素のファミリーの化合物、およびその生物学的リガンドとのコンジュゲートに関する。本発明はさらに、診断薬としてのこれらの化合物の使用、それらの調製方法およびそれらを含む組成物に関する。

色素は、光の励起によって特定の波長の光子を吸収し、量子効率に応じてそのエネルギーの一部を、通常はより長い波長で再放出する化学物質である。特にシアニン色素は、ポリメチン架橋にまたがり、２つの窒素原子の間に閉じ込められた非局在化電子系を特徴とする蛍光性有機分子である。これらの中には、好ましい光学的特性を持ち、毒性が低く、水性媒体への溶解性に優れたものがあり、生物医学イメージング用の造影剤として使用できる。赤から近赤外（６５０～９００ｎｍ）の発光を持つシアニン色素は、可視スペクトルの蛍光を持つ色素に比べて透過深度が深いため、生物医学イメージング用に特に有用である。バイオメディカルイメージングに使用される近赤外色素の中で、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は現在ヒトへの使用が承認されている唯一の医薬品である。ＩＣＧは、血漿蛋白との結合が強く（血液プール効果）、未結合画分は肝臓で速やかにクリアランスされるため、組織灌流の評価や血管造影の用途に日常的に使用されている（Cherrickら、J Clin Invest 1960; 39(4): 592-600)。さらにＩＣＧは、診断およびインターベンション（蛍光誘導手術）手技中の腫瘍イメージング用の治験薬としても試験されている(Tummers Q. et al., PlosOne 2015; 10(6): e0129766)。

過剰発現した腫瘍エピトープを標的とするキャリア部分（すなわち生体分子）に色素を結合させ、検出の感度と特異性を向上させる蛍光イメージング用造影剤の開発も進められている（Achilefu S. et al, J Med Chem 2002; 45, 2003-2015)。例えば、ＩＣＧは腫瘍標的化部分と結合しており、現在、術中腫瘍検出のための臨床試験で評価中である（Fidel J. et al., Cancer Res. 2015;15; 75(20): 4283-4291)。ＩＣＧは、固有の蛍光発光を持つ近赤外シアニン色素の一例である。ＩＣＧは血中投与後すでに励起により蛍光を発し、検出される蛍光強度はある組織における色素の蓄積速度の関数である。その結果、目的の組織、すなわち診断上関心のある特定の生理学的または病理学的特徴の影響を受けた組織から蛍光が放出される。

しかし、この方法の注意点は、色素が非特異的保持のために分布し蓄積する可能性のある非標的（バックグラウンド）組織から生じる蛍光強度が比較的高いことである。バックグラウンド領域から生じる高い蛍光強度は、画像コントラスト、すなわち標的組織の信号とバックグラウンド領域の信号との比を低下させ、検出感度の低下や偽陰性につながることにより、診断光学イメージング手順の品質に悪影響を及ぼす可能性がある。

固有の蛍光発光の限界を克服するために、ｐＨに依存して赤色から近赤外（６５０～９００ｎｍ）の蛍光発光を示す新しいクラスのシアニン色素が開発されている。特に、酸性ｐＨ（例えば、６．２－６．８未満）でのみ、これらの色素は完全に活性化され、蛍光を発する（ＯＮ）が、生理的ｐＨ（７．２－７．４）では最小限の蛍光発光（ＯＦＦ）しか示さない。がん組織は、健康な組織や血液（７．２～７．４）に比べて細胞外空間のｐＨが低い（６．２～６．８）ことが知られており、これは解糖代謝が高く（「ワールブルグ効果」として知られる）、その結果、膜ポンプを通じて高濃度のプロトンが押し出されるためである（Damaghi M. et al, Front Physiol. 2013; 4:370)。さらに、これらの色素の活性化は、特に色素が腫瘍細胞表面に発現するエピトープと結合する部位と結合している場合、細胞内で内在化し、エンドソーム（ｐＨ６．５～５．５）やリソソーム（ｐＨ５．５～４．５）などの酸性小器官内で輸送された後に起こりうる。

酸性ｐＨによって引き起こされる色素のこの特異的活性化は、腫瘍とバックグラウンドの比率を高め、腫瘍の可視化を改善する可能性がある。なぜなら、腫瘍の微小環境においてのみ、あるいは特異的受容体の過剰発現によって腫瘍細胞内に取り込まれた後にのみ、プローブは蛍光を発するようになり、シグナルが検出されるからである。理想的には、ｐＨが７．４である血液中や、同じレセプターによって媒介される細胞内在化がはるかに低い健康な組織中では、プローブの蛍光はほとんどオフになり、バックグラウンドシグナルは非常に低くなる。上記の理由から、このような「活性化可能な」（オンオフ可能な）色素は、病理学的領域のより良い検出を可能にし、生物医学的光学イメージング手順の質を向上させることができる。

ｐＨ感受性シアニンのいくつかの例が先行技術で報告されている。
例えば、ＷＯ００／７５２３７には、ｐＨ感受性シアニン色素のいくつかの例が記載されており、インドレニン上で非アルキル化またはモノアルキル化された、直鎖状のスリーメチン（Ｃｙ３）、ペンタメチン（Ｃｙ５）またはヘプタメチン（Ｃｙ７）骨格を有する新規化合物が開示されている。

Briggs M.他, Chem.Commun.2000, 2323-2324は、ｐＫａ７．５を示すｐＨ６～９の範囲でプロトン濃度に敏感なペンタメチンシアニン色素の例を報告している。

ＷＯ２００４／０３９８９４は、インドール塩基の異なる部位に官能基を有する異なるシアニン色素の調製に関する。特に、市販の色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（ＧＥヘルスケア）およびその誘導体を含むｐＨ依存性Ｃｙ５色素が記載されている。ｐＫａが約７．３のモノアルキル化ペンタメチン色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅを使用して粒子を標識し、細胞内在化を評価することも、Beletskii A. et al., BioTechniques 2005, 39: 894-897に開示されている。

Ｂｒｉｇｇｓらに開示されている化合物（左）とＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（右）の化学構造を以下に示す。

Lee H. et al., Bioconjug Chem.2011, 22(4): 777-784およびGilson R.ら、Mol. Pharmaceutics 2015, 12: 4237-4246は、非アルキル化環状ヘキセニルＣｙ７ｐＨ応答性色素とそのin vitroおよびin vivoでの応用を開示している。例えば、最初の文献には、それぞれ４．７および５．２のｐＫａを有する以下のクロロおよび安息香酸誘導体が報告されている：

化合物のｐＫａ値は極めて重要である。なぜなら、培地のｐＨがｐＫａ値に等しいとき（ｐＨ＝ｐＫａ）、色素分子の半分だけがプロトン化されて蛍光を発し、残りの半分は脱プロトン化されて消光するからである。したがって、ｐＫａが７．０を超えるｐＨ感受性色素は、生理的ｐＨ（７．２～７．４）ですでに高い蛍光発光（５０％以上）を示すことになり、その結果、バックグラウンド蛍光が高くなる可能性がある。「Ｂｒｉｇｇｓら」の論文に開示されている化合物やＣｙｐＨｅｒ５Ｅは、このようなｐＨ感受性シアニン色素の一例であり、蛍光発光特性が最適でない（すなわち、生理的ｐＨで高い発光を示す）ため、バックグラウンド蛍光が高くなる可能性がある。一方、ｐＫａ＜５．５のｐＨ感受性色素は、強酸性のｐＨ値でのみ高い蛍光発光（＞５０％）を示す。例えば、上述の化合物ＡおよびＢは、それぞれｐＨ３．７および４．２においてのみ９５％のプロトン化を達成する。このため、ｐＫａが５．５～７．０の範囲にあることを特徴とするｐＨ感受性色素を開発し、蛍光発光が生理的ｐＨでは最小であるが、弱酸性ｐＨでは高くなるようにすることが望ましい。

既知の色素に関連するその他の欠点は、Lee H. et al. 2011, 22(4): 777-784およびGilson R.ら, Mol. Pharmaceutics 2015, 12: 4237-4246に報告されている公知の色素は、ある種の不安定性（例えば、上記の論文では、各試験には新しく調製した色素の溶液を使用することが望ましいと述べられている）と、生物学的部位（すなわち分子ベクター）へのコンジュゲーションに有用な官能基でこれらの色素を誘導体化することが困難な場合があるという事実に代表される。例えば、Ｎ－アルキル化基が存在しないため、安息香酸上の１つのカップリング部位にしかコンジュゲートさせることができない。（Gilson R. et al., Mol.Pharmaceutics 2015, 12: 4237-4246)

そのため、適切な造影剤を見出すための幾つかの努力にもかかわらず、最適な蛍光効率、最適な物理化学的および生物学的特性を備え、生体の光学イメージング用に設計された改良型色素を見出す必要性が依然として存在する。生体の酸性ｐＨ条件下（例えば腫瘍環境下）においてのみ、適切な活性化と赤色から近赤外（６５０～９００ｎｍ）の蛍光発光を可能にするｐＫａの特徴を備えた色素が、生体への応用には望ましいであろう。

この必要性は、特に、分子エピトープまたは病理組織（例えば腫瘍）と特異的に結合する生体分子に色素を結合させる場合に最も重要である。本発明は、これらおよび他の必要性に対処するものである。

発明の要旨
本発明の技術分野は、バイオメディカル光学イメージングである。特に、本発明は、赤外～近赤外（６５０～９００ｎｍ）発光を有し、その蛍光が可溶化された媒体のｐＨに依存する新規モノアルキル化シアニン色素、およびその生物学的リガンドとのコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、診断薬としてのこれらの化合物の使用、それらの調製方法、およびそれらを含む組成物に関する。

一般に、本発明の目的は、光学イメージング用の造影剤として有用であり、上記の課題を解決することを目的とした、新規なｐＨ応答性モノアルキル化シアニン色素、または結合部位へのそれらの対応するコンジュゲートを提供することである。

特に、本明細書に記載の新規モノアルキル化シアニン誘導体は、生理的ｐＨでは最小限の蛍光を有し、弱酸性ｐＨで活性化されるため、健常組織や血液に比べて酸性度が高い生物学的領域でのみ蛍光シグナルを発生し、バックグラウンドシグナルを劇的に減少させる。

さらに、本発明のモノアルキル化シアニン色素およびそのコンジュゲートは、驚くべきことに、生物医学的イメージングの用途により適した５．５～７．０の範囲のｐＫａ値によって特徴付けられ、ｐＨのわずかな変化に対する非常に良好な応答性、先行技術の非アルキル化シアニン色素に対するより優れた安定性を備えている。

新しいシアニン色素は、結合部位として作用する適切な官能基を介して、適切な標的化部分に簡便にコンジュゲートさせることができ、したがって、分子イメージングのための非常に特異的で感度の高い造影剤を提供できる。

本発明のさらなる態様は、診断薬としての、特に、ヒトまたは動物の器官または組織の光学的イメージングにおける使用のための、光学的イメージングの方法における使用のための、このような色素に関し、ここでイメージングは、器官の断層イメージング、血管造影を含む器官機能のモニタリング、組織灌流イメージング、尿路イメージング、胆管イメージング、神経イメージング、術中癌同定、蛍光誘導手術、蛍光内視鏡検査、蛍光腹腔鏡検査、ロボット手術、開腹手術、レーザー手術である、尿路イメージング、胆管イメージング、神経イメージング、術中癌同定、蛍光ガイド下手術、蛍光内視鏡検査、蛍光腹腔鏡検査、ロボット手術、開腹手術、レーザーガイド下手術、光線力学療法、蛍光寿命イメージング、または光音響法もしくは超音波蛍光法である。

さらに本発明は、提供される色素、対応するコンジュゲートおよび／またはその薬学的に許容される塩の調製のための製造プロセス、ならびに診断剤の調製におけるそれらの使用に関する。

さらなる局面によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明の色素もしくは色素コンジュゲート化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤との混合物中に含む、薬学的に許容される組成物に関する。前記組成物は、特に、ヒトまたは動物の器官または組織の有用なイメージングを提供するための光学造影剤として有用である。

別の態様において、本発明は、本発明の化合物の有効用量の使用を含む光学イメージング技術の使用による身体器官、組織または領域の光学イメージングのための方法に関する。

本発明の特徴は、以下の詳細な説明および添付の図を参照することにより、より理解することができる。

図１は、変曲点からｐＫを計算するために、ｐＨ４．０からｐＨ８．０まで調製した各リン酸緩衝溶液のｐＨに対して、７８０ｎｍにおける本発明の代表的な化合物（化合物５）の極大吸収の値をグラフにプロットしたものである。

本発明の詳細な記載
したがって、本発明の第一の目的は、式（Ｉ）

［式中、
Ｗは、

で示される基または－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ６）－ＣＨ＝もしくは－Ｃ（Ｃｌ）＝であり、
ここでＲ６は、水素または塩素であり、
Ｒ７は、塩素または－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｙ、－アルキル－ＣＯＯＨおよび－アルキル－ＣＯＮＨ－Ｙから選択される基によって置換されていてもよいフェニルであり、
ここでＹは、－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、
＊は結合位置を表し、
Ｒ１およびＲ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｒ２およびＲ４は水素であるか、または
Ｒ１がＲ２と一緒になって、およびＲ３がＲ４と一緒になって、それぞれ、それらが結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ３Ｈで置換されていてもよい２個のアリール環を形成し、
Ｒ５は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ２から選択される基で置換されていてもよいアルキルである］
で示される化合物またはその薬学的に許容される塩の提供である。

本発明の別の目的は、式（ＩＩ）

［式中、
Ｗは、

で示される基または－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ６）－ＣＨ＝もしくは－Ｃ（Ｃｌ）＝であり、
ここでＲ６は、水素または塩素であり、
Ｒ８は、塩素または－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｙ、－アルキル－ＣＯＯＨ、－アルキル－ＣＯＮＨ－Ｙおよび－Ｒ１０から選択される基によって置換されていてもよいフェニルであり、
ここでＹは、－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された二価のアルキルであり、
Ｒ１０は、基－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔによって置換された二価のアルキルであり、ここでＳは、スペーサーであり、
Ｔは標的化部分であり、
ｍは０または１に等しい整数であり、そして
＊は結合位置を表し、
Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から選択され、Ｒ２およびＲ４が水素であるか、または
Ｒ１がＲ２と一緒になって、およびＲ３がＲ４と一緒になって、それぞれ、それらが結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ３Ｈで置換されていてもよい２個のアリール環を形成し、
Ｒ９は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、および－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択される基によって置換されていてもよいアルキルであり、ここで、Ｓ、Ｔおよびｍは上記と同意義であり、
少なくとも１つの基－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔが、Ｒ９またはＲ１０において存在する］
で示される対応するコンジュゲート色素、またはその薬学的に許容される塩に関する。

本発明はまた、合成変換工程によって式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を調製する方法にも関する。

本発明はまた、生物医学的光学イメージング用の蛍光プローブとして使用するための、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を包含する。

特に本発明は、５．５～７．０の範囲のｐＫａ値によって特徴付けられる、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を包含する。

定義
本明細書において、および特に規定がない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される。

用語「アルキル」は、脂肪族炭化水素基を指し、直鎖または分枝鎖であってもよく、鎖中に１～８個の炭素原子を有する。例えば、「Ｃ４アルキル」は、４個の炭素原子からなる直鎖または分枝鎖を意味する。同様に、「Ｃ１－Ｃ２０アルキル」は、１～２０個の炭素原子からなるアルキルである。好ましくは、特に指定がない限り、用語「アルキル」はＣ１－Ｃ６アルキルを指す。代表的で好ましいアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。特に指定のない限り、直鎖または分岐アルキルは一価の基であり、そうでない場合は、上記炭化水素基から２個以上の水素原子が取り除かれ、置換されている多価の基であってもよく、例えば、メチレン基、エチレン基、ｉｓｏ－プロピレン基などが挙げられる。

用語「二価のアルキル」は、上記炭化水素基から２個の水素原子が取り除かれ、置換されているアルキル基を指す。

ここで使用される「シクロアルキル」という用語は、その意味において、飽和（すなわち、シクロ脂肪族）炭素環からなり、例えば、「Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル」は、３～７個の炭素原子からなる飽和炭素環を表す。好適な例としては、Ｃ５－Ｃ７炭素環式環、例えばシクロヘキシル環が挙げられる。

用語「アリール」は、約６～１４個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子の芳香族単環式または多環式環系を指す。代表的なアリール基としては、フェニル、ナフチルまたはベンゾ縮合環が挙げられる。用語「ベンゾ縮合環」は、二環式芳香族系を形成する別の環に結合した炭素原子数６の芳香族単環式環を指す。

本明細書において、用語「保護基」（Ｐｇ）は、それが結合している基の機能を保持するために適合された保護基を指定する。具体的には、保護基は、アミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシルの機能を保持するために使用される。適切な保護基としては、例えばベンジル、カルボニル、例えばホルミル、９－フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、アルキル、例えばｔｅｒｔ－ブチルまたはトリフェニルメチル、スルホニル、アセチル基、例えばトリフルオロアセチル、ベンジルエステル、アリル、またはこのような機能の保護に一般的に使用される他の置換基が挙げられ、当業者に周知である（例えば、一般的な文献 T.W. Green and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4th Ed、第５章）。

さらに、本発明は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の所望の化合物またはその塩の調製に適した前駆体または中間体化合物も含んでなる。このような誘導体において、カルボン酸またはカルボキサミドなどの官能基は、上記で定義したような適切な保護基（Ｐｇ）、好ましくはアルキル基またはエステル基で保護できる。必要に応じて、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の調製中に、Ｙ基のヒドロキシル基も適切な保護基（Ｐｇ）で保護でき、従って、例えばアセトキシ基、アルコキシ基またはエステル基を形成する。

「カップリング試薬」とは、例えば、カルボキシル部分とアミノ部分との間のアミド結合の形成に使用される試薬を指す。この反応は、カルボキシル部分の活性化と、活性化されたカルボン酸によるアミノ基のアシル化という、連続した２つの工程からなる場合がある。このようなカップリング剤の非限定的な例は、以下からなる群から選択される：カルボジイミド、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）；ホスホニウム試薬、例えば、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタート－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）および３－（ジエトキシホスホリルオキシ）－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）；およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）などのアミニウム／ウロニウム－イモニウム試薬Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１－［１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデン－アミノオキシ）－ジメチルアミノ－モルホリノ］－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）およびフルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）または当業者に周知の他の化合物。

「活性化カルボン酸」という表現は、遊離カルボキシル基よりも求核攻撃を受けやすいカルボキシル基の誘導体を意味する；好適な誘導体としては、例えば酸無水物、チオエステル、ハロゲン化アシル、ＮＨＳエステルおよびスルホＮＨＳエステルが挙げられる。

さらに、「部位」または「残基」という用語は、直接または適切なリンカーおよび／またはスペーサーを介して、分子の残りの部分に適切に結合またはコンジュゲートした後の、所与の分子の残余部分を定義することを意図している。

標的化部分（Ｔ）
本発明によれば、標的化部分（Ｔ）は、生物学的標的に特定の選択性で結合し、身体の特定の組織または部分への造影剤の蓄積を促進する分子である。一般的には、生物学的システムで使用される天然または合成分子で表される。このような特異的結合は、例えば低分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、酵素基質、抗体またはそのフラグメント、アプタマーなどのリガンドが、目的の組織や細胞の表面に発現している特定の生物学的標的と相互作用することによって達成できる。

本発明の化合物の好適な生物学的標的は、例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のような上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体；ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体；ＣＡＩＸ、ＣＡＩＩまたはＣＡＸＩＩのような炭酸脱水酵素（ＣＡ）酵素；ＭＵＣ１のようなムチン糖タンパク質；ＧＬＵＴ－１のようなグルコーストランスポーター；ＮＨＥ１のようなナトリウム－水素アンチポーター；カルサイノエンブリオニック抗原（ＣＥＡ）のようなカルサイノエンブリオニック糖タンパク質；ケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）のようなケモカイン受容体；ＩＣＡＭ、ＥＰＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチンなどの細胞接着分子；肝細胞増殖因子ＨＧＦＲ（ｃ－ｍｅｔ）；トランスフェリン受容体；ＥＰＨＡ２などのエフリン受容体；ＦＲ－αなどの葉酸受容体；ＣＤ４４などのイアルロン酸結合糖タンパク質；ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３などのボンベシン受容体；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のようなＮ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸（ＮＡＡＧ）ペプチダーゼ；そして特に、インテグリンレセプター、例えばαvβ3、αvβ5、αvβ6またはα5β1インテグリンレセプターであり得る。

例えば、インテグリン受容体の標的化部分は、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）の配列からなる直鎖状または環状のペプチドで表される。このトリペプチドは受容体に対する結合特異性が高く、細胞膜に存在するインテグリン受容体ファミリーにリガンドとして認識される。実際、フィブロネクチンやビトロネクチンのような細胞外マトリックス糖タンパク質にもＲＧＤモチーフが同定されており、これらはこのＲＧＤモチーフを利用して細胞接着を仲介している。

したがって、例えばｃＲＧＤ、ｃＲＧＤｆＫ、ｃＲＧＤｙＫ、ｃＲＧＤｆＣ、ＲＧＤ－４ Ｃ、ＲＧＤ－２ Ｃ、ＡＨ１１１５８５、ＮＣ１００６９２、ＲＧＤ－Ｋ５（Kapp et al、Sci Rep, 2017, 7:3905）、またはそれらの類似体および誘導体は、細胞膜インテグリンが健常組織と比較してアップレギュレートされているがん組織を標的とする結合モチーフのよく知られた例である。

一実施形態では、本発明の化合物は、例えばすでに治療に使用されているモノクローナル抗体のような、他の低分子、ペプチド、タンパク質または抗体に結合させることができる。例えば化合物４ａ、５ａ、６ａ、７ａおよび８ａ（Wichertら、NatChem2015、7:241-249)のような薬物アセタゾラミド、またはそれらの類似体および誘導体を含む小分子は、酵素ＣＡＩＸを標的とする小分子の例である。ペプチドＧＥ１１（Li et al., FASEB J 2005, 19:1978-85に記載されている）および／またはペプチドＬ１（Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91:605-619に記載されている）などの直鎖状および環状ペプチドならびにペプチド模倣体、またはそれらの類似体および誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするペプチドの例である。タンパク質のうち、上皮成長因子（ＥＧＦ）の誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする小型タンパク質の例である。抗体のうち、パニツムマブとセツキシマブは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするモノクローナル抗体の一例である。

好ましくは、本発明のターゲティングリガンドは腫瘍細胞または組織を選択的に連結できる。特に、脳腫瘍、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、皮膚癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、口腔癌、肺癌、腎臓癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、大腸癌から選択される腫瘍に連結できる。加えて、ターゲティングリガンドは、原発とは異なる組織や臓器における上記の癌の転移性広がりを結びつけることができる。さらに、ターゲティングリガンドは、異なる組織や臓器の前新生物病変や異形成を結びつけることができる。

スペーサーＳ
本発明によれば、Ｓはスペーサーであり、任意に存在し、標的化部分を色素から分離する。スペーサーの存在は、標的化部分と色素が互いに不利に相互作用する危険性があるいくつかの実施形態に特に関連する。さらに、色素が比較的大きく、標的化部分への標的化部分の結合を妨害する可能性がある場合には、スペーサーの存在が必要になることもある。

スペーサーは、色素がターゲットから離れる方向になるように、フレキシブル（例えば単純なアルキル鎖）でもリジット（例えば、シクロアルキル鎖またはアリール鎖）でもよい。スペーサーはまた、生体内で造影剤として使用される式（ＩＩ）のコンジュゲートの薬物動態および代謝を修飾することができる。

親水性スペーサーは、血漿タンパク質との相互作用を軽減し、血液循環時間を短縮し、排出を促進することができる。例えば、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である場合、造影剤のin vivoでの薬物動態および血液クリアランス速度が変わることがある。このような実施形態において、スペーサーは、バックグラウンドの組織（すなわち、筋肉、血液）からの撮像剤のクリアランスを改善でき、したがって、高い標的対バックグラウンドコントラストにより、より良好な診断画像を与えることができる。さらに、親水性スペーサーの導入により、造影剤の排出が肝臓から腎臓に移行し、体内滞留が減少し得る。

したがって、好ましい一実施形態では、スペーサーは、Ｃ１－Ｃ２０アルキル基、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル基またはアリール基からなる親水性部分である。好ましくは、スペーサーは、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－からなる群から選択され、ｐは０～２０の整数である。好ましくは、ｐは２、６または１２である。

必要なければスペーサーは好ましくは存在せず、すなわちｍは０であり、Ｓは直接の結合を表す。

スペーサー、あるいはスペーサーが存在しない場合の標的化部分は、式（Ｉ）の化合物に、あるいはＲ５および／またはＲ７残基で連結して、式（ＩＩ）の化合物を形成することができる。Ｒ５／Ｒ７の連結基は、化学結合の形成によって色素を標的化部分に結合させるのに適したカルボン酸残基などの反応性官能基である。

例えば、アミン含有標的化部分（Ｔ）が、Ｒ５および／またはＲ７がカルボン酸で置換されたアルキルである式（Ｉ）の化合物とコンジュゲートされる場合、このカルボン酸は、活性化剤を用いてより反応性の形態に変換することにより、コンジュゲーションを実施する前に任意に活性化され、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたは混合無水物を形成する。次いで、式（ＩＩ）の対応する化合物を得るために、アミン含有標的化部分を得られた活性化酸で処理してアミド結合を形成する。通常、この反応は、水性緩衝液中、場合によりｐＨ８～９のＤＭＳＯまたはＤＭＦとの共溶媒中、またはＤＩＰＥＡ、ＴＥＡ、ＮＭＭなどの有機塩基を用いた有機溶媒中で行われる。

あるいは、「非活性化」カルボン酸を用いて直接コンジュゲーションを行うこともできる。

同様に、Ｒ５の連結基がカルボキサミド基である場合、適切な標的化部分を結合させる手順は類似しているが、一般にリンカーの活性化工程は必要なく、色素と標的化部分が直接処理される。

上記式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、キラル炭素原子と呼ばれる１つまたは複数の不斉炭素原子を有していてもよく、したがってジアステレオマーおよび光学異性体を生じ得る。特に規定しない限り、本発明はさらに、そのようなすべての可能なジアステレオマー、ならびにそれらのラセミ混合物、それらの実質的に純粋な分割されたエナンチオマー、すべての可能な幾何異性体、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む。

本発明はさらに、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＹの官能基、例えばスルホニル基、カルボキサミド基またはカルボン酸基が薬学的に許容される塩の形態であってもよい上記式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関する。

一実施形態において、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、ここで、Ｗは、－Ｃ（Ｃｌ）＝または－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ６）－ＣＨ＝であり、Ｒ５およびＲ９は、上記で定義したとおりであり、Ｒ１は、Ｒ２と一緒になって、およびＲ３は、Ｒ４と一緒になって、それらがそれぞれ結合している原子とともに、１個から４個の－ＳＯ３Ｈ基で置換されていてもよい２個のベンゾ縮合環を形成し、それぞれ以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）で表される：

［式中、Ｒ１１～Ｒ１８の各々は、独立して、水素または－ＳＯ３Ｈである］。

別の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、
ここで、Ｗはそれぞれ基

または

であり、Ｒ５およびＲ７～Ｒ９は上記で定義した通りであり、Ｒ１はＲ２と一緒になって、およびＲ３はＲ４と一緒になって、それらがそれぞれ結合している原子は、１～４個の－ＳＯ３Ｈ基で任意選択的に置換された２個のベンゾ縮合環を形成し、それぞれ以下の式（Ｉａ’）または（ＩＩａ’）で表される：

［式中、Ｒ１１～Ｒ１８の各々は、独立して、水素または－ＳＯ３Ｈである］。

一実施形態において、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、
ここで、Ｗは、それぞれ

または

で示される基であり、Ｒ１およびＲ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｙは－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、Ｒ２およびＲ４は水素であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は上記で定義した通りであり、それぞれ以下の式（Ｉｂ）または（ＩＩｂ）で表される：

さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、ここで、Ｗは、－Ｃ（Ｃｌ）＝、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝および－ＣＨ＝Ｃ（Ｃｌ）－ＣＨ＝から選択され、Ｒ１およびＲ３は、－Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｙは－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、Ｒ２およびＲ４は水素であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は上記で定義したとおりであり、それぞれ以下の式（Ｉｃ）または（ＩＩｃ）で表される：

一実施形態において、本発明は、Ｙが２～５個のヒドロキシル基で置換された直鎖状または分枝状のＣ１～Ｃ６アルキルである、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関する。

好ましい実施形態において、本発明は、Ｙが以下からなる群より選択される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関する。

より好ましくは、本発明は、Ｙが上記で定義した式（ｉｉ）の基である式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関する。

本発明の別の実施形態は、ｍが０であり、スペーサーＳが直接結合で表されるか、またはｍが１であり、スペーサーがＣ１－Ｃ２０アルキル基、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル基またはアリール基を含んでなる親水性部分である、式（ＩＩ）の化合物に関する。好ましくは、スペーサーは、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－から選択され、ｐは０～２０の整数である。好ましくは、ｐは２、６または１２である。

さらなる実施形態において、Ｔは、低分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、酵素基質、抗体またはそのフラグメント、およびアプタマーから選択される標的化部分である。

好ましくは、Ｔはペプチド、特にインテグリン受容体と相互作用する部分、例えばαｖβ３によって表される、αｖβ５、αｖβ６、α５β１などのインテグリン受容体、好ましくはαｖβ３インテグリン受容体と相互作用する部分である。

特に好ましいのは、Table Iaに列挙する式（Ｉ）の化合物およびTable Ibに列挙する式（ＩＩ）の関連するコンジュゲート化合物である。

本発明はまた、本明細書の以下に例示するように調製される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の合成方法に関し、これらの化合物は、場合により連結基を介して標的化部分とコンジュゲートした、赤外～近赤外（６５０～９００ｎｍ）発光を有する色素である。

従って、本発明は、哺乳動物（ヒトおよび動物）における診断用生物医学的用途のための光学造影剤として使用するための、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。好ましくは、撮像される哺乳類の被験者はヒトである。

好ましい実施形態において、本発明の化合物は、正常（健常）組織または異常（病理）組織、特に腫瘍、の検出における造影剤として使用するためのものである。

好ましくは、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、例えば血管造影、灌流造影、胆管造影および神経造影を含む造影法による、正常（健常）組織の検出に使用するためのものである。

さらなる好ましい実施形態において、本発明は、例えば原発性腫瘍病変、局所または遠隔転移、または前新生物病変、特に異形成および過形成などの異常（病的）組織の検出における使用のための、上記で定義された式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。特に、上記で定義した式（ＩＩ）の化合物は、好ましくは、個人の患者のガイド下手術における腫瘍マージンの検出および画定に使用される。好ましい使用は、前記腫瘍が、例えば、受容体、酵素、糖タンパク質、脂質ラフト、細胞表面に位置する膜貫通タンパク質、および血清、血漿または間質に存在する可溶性因子から選択される生物学的エピトープの過剰発現を示す腫瘍である場合である。好ましくは、前記生物学的エピトープは、ビトロネクチン、フィブロゲンおよび／またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に対するインテグリン受容体である。

本発明はまた、上記で定義した蛍光プローブとして使用するための式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供し、ここで腫瘍の検出および画定はＮＩＲ照射下で行われる。好ましくは、このような腫瘍の検出および画定は、そのような腫瘍組織を除去する外科的処置の前、最中、または後に実施される。蛍光ガイド下手術はそのような使用の一例である。

さらに、本発明は、炎症組織、線維化組織、虚血組織、または代謝速度が異常な組織の検出に使用するための、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。

本発明はまた、以下の工程を含む組織および細胞を画像化する方法において使用するための、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する：
ｉ）細胞または組織を式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物と接触させる；
ｉｉ）造影剤が吸収する波長で組織または細胞に照射する；
ｉｉｉ）蛍光カメラを用いて近赤外発光を検出する。

好ましくは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の造影剤と細胞または組織との接触は、局所的または局部的適用（例えば、スプレー、浸漬、軟膏、泡、クリームの塗布など）または全身的適用（経口または非経口投与）によって行われる。

本発明はさらに、上記で定義した式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩ）のコンジュゲート体、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む診断用医薬組成物に関する。

特に、本発明は、式（Ｉ）の色素またはその塩と、１つ以上の薬学的に許容される助剤、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物に関する。

あるいは、本発明は、Ｒ９および／またはＲ１０が上記で定義したＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔで置換されたアルキルである式（ＩＩ）のコンジュゲート、またはその塩、および１つ以上の薬学的に許容される助剤、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物に関する。

本発明の別の態様は、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を含んでなる診断キットに関する。さらに、キットは光学イメージングを実施するためのさらなる助剤を含むことができる。これらの助剤は、例えば、適切な緩衝液、容器、検出試薬、あるいは使用説明書である。キットは、好ましくは、本発明の化合物を静脈内投与するためのすべての材料を含む。

本発明の化合物は、撮像する前に、撮像される臓器または組織に全身的または局所的に投与し得る。例えば、化合物を静脈内投与できる。別の実施形態では、非経口的または経口投与することもできる。

組成物は、腫瘍、組織または臓器の所望の光学的画像を得るのに有効な用量で投与されるが、この用量は、使用される化合物、撮像の対象となる組織、使用する撮像装置などによって大きく変わり得る。

造影剤の正確な濃度は、実験条件や所望する結果によって異なるが、通常１ｎＭ～０．１ｍＭの範囲である。最適な濃度は、最小限のバックグラウンド蛍光で満足のいく結果が得られるまで、システマチックに変化させて決定する。

一旦投与されると、本発明の造影剤は、組織層を通過できる光、または他の形態のエネルギーに曝される。好ましくは、照射光の波長または波長帯域は、光増感剤の励起波長または波長帯域と一致し、非標的細胞や血液タンパク質を含む被験体の他の部分による吸収は低い。

通常、光学的シグナルは観察または機器による検出が可能であり、その応答は蛍光または光の強度、分布、寿命に関連する。

合成の説明
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物（そのまま、または生理学的に許容される塩の形態で）の調製は、本発明のさらなる目的である。本発明のシアニン色素および色素コンジュゲートは、例えば、以下のセクションおよび実験パートに記載の方法に従って調製することができる。

シアニン色素の調製に関する一般的な教示は、スルホインドシアニン色素の合成と標識に関するMujumdar R.B et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2): 105-111に記載されている。しかしながら、本発明のシアニン類は、当技術分野の化合物には存在しない特異的な官能基のパターンを特徴とし、そのためには適切な合成アプローチの設定が必要であった。実際、他の既知のシアニンとは異なり、本発明の化合物は、異なる方法で誘導体化される３つの官能基（カルボン酸基またはアミド基）を有し得るため、ほとんどの場合、所望の官能基に反応を誘導するために保護基の使用が必要である。

いくつかの保護基を除去するのに必要な高いｐＨと温度条件下でシアニンを操作すると、場合によってはポリメチン足場の安定性が損なわれ、色素の分解が顕著になるため、困難が生じることが知られている。

さらに、エステル基を脱保護する際にアミド基－ＣＯＮＨ－Ｙが加水分解や分解を受ける可能性があるため、さらなる障害に遭遇することがある（典型的には、アミド誘導体は高濃度のアルカリ性媒体中で加水分解される可能性がある（例えば、Yamanaら、Chem.Pharm。Bull., 1972, 20(5), 881-891)。

好ましい一実施形態では、Ｒ５またはＲ９の保護基はエステル基である。より好ましくは、エチルエステル基が有利に使用できる。

式（Ｉ）のシアニン色素の調製
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下のスキームに示す一連の合成工程を経て調製できる。シアニン色素の置換基や特定の足場によって、さまざまな合成ルートを選択できる。

例えば、Ｗが－シクロヘキセニル－Ｒ７であり、ここでＲ７は塩素であり、Ｒ１およびＲ３は水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｙが－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルである、式（Ｉｂ）のシアニンの場合、以下の一般的スキーム１に示される手順を適用できる。

従って、本発明の製法は以下の工程を含んでなる：
ａ）式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の５－置換－２，３，３－トリメチルインドレニン中間体の適量を、１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセンまたは２－クロロ－１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセンと反応させ、式（Ｉｂ）（式中、Ｒ７は塩素原子である）のシアニンを得る。

工程ａ）の反応は、ビスアニリド型またはビスアルデヒド型のＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬を用いて行うことができる（スキーム１に示すとおり）。反応は、例えばエタノール、メタノール、無水酢酸、酢酸または混合物のようないくつかの溶媒中で、トリメチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの種々の塩基を添加または添加せずに、混合物を４５℃～１２０℃の範囲の種々の温度で数時間（典型的には２～２４時間）撹拌しながら行うことができる。

Ｒ１および／またはＲ３が独立して基－ＣＯＯＨである場合、式（Ｉｂ）の化合物をさらに誘導体化して、Ｒ１および／またはＲ３が基－ＣＯＮＨＹである式（Ｉｂ）の別の化合物を得ることができる。

この工程によれば、式（Ｉｂ）のカルボン酸から対応するカルボキサミドへの変換は、カルボキサミドの調製のために当該技術分野で広く知られている様々な方法および実験条件で行うことができる。一例として、カルボン酸をまず適当な活性化エステルに変換し、次にＮＨ４Ｃｌのようなアンモニウム塩と、好ましくはＨＢＴＵのようなカップリング剤の存在下で反応させることができる。

Ｒ１および／またはＲ３が－ＣＯＯＨである誘導体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）をポリヒドロキシル化アミンで誘導体化する場合、例えばＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＳＣおよびＤＣＣ－ＮＨＳから選択されるカップリング剤と、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭまたはピリジンなどの有機塩基とを、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルなどの溶媒中、室温で、３０分～数時間の範囲の適切な時間にわたって反応させる。このカルボン酸の誘導体化は、アルキル化インドレニンまたはインドールに対して、四級化の前に行うことができる。この場合、スルトンまたはブロモヘキサン酸によるアルキル化の前に、ポリヒドロキシル化アミンのヒドロキシル基をアセチルなどの適切な保護基で保護することが重要である。このアルキル化は、溶媒なし（ｎｅａｔ）で、または高沸点溶媒、例えばブチロニトリル、スルホラン、１，２－ジクロロベンゼン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシド中で行うことができ、溶液を高温、例えば９０℃～１８０℃で数時間、典型的には１２時間か～５日間撹拌することにより行うことができる。

Ｗが基－シクロヘキセニル－Ｒ７であり、Ｒ７が基－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｙ、－アルキル－ＣＯＯＨまたは－アルキル－ＣＯＮＨ－Ｙで置換されていてもよいフェニルであり、ここで、Ｙは、－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙから選択される、式（Ｉｂ）のシアニンに関する実施形態について、以下の一般的なスキーム２に報告されている手順を適用できる：

従って、本発明の製法は以下の工程を含んでなる：
ｂ）Ｎ－［（３－（アニリノメチレン）－２－クロロ－１－シクロヘキセン－１－イル）メチレン］アニリンを式（Ｖ）の適当なフェニルボロン酸と反応させて、式（ＶＩ）の対応する中間体を得る；および
ｃ）中間体（ＶＩ）を含んでなる混合物に、最初に中間体（ＩＶ）を添加し、次に中間体（ＩＩＩ）を添加して、上記で定義した式（Ｉｂ）の化合物を得る。

工程ｂ）は、酢酸パラジウム、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムなどのパラジウム触媒、および炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの無機塩基の存在下、エタノール、メタノール、水またはそれらの混合溶媒などの複数の溶媒中で、混合物を７０℃～１００℃の範囲の種々の温度で数時間（典型的には２時間）撹拌しながら反応を行うことができる。

工程ｃ）の反応は、エタノールまたはメタノールなどのいくつかの溶媒中で段階的に行うことができ、最初にｂ）で調製した修飾されたＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬と非アルキル化インドレニン（ＩＶ）を少量の酢酸の存在下または非存在下で加え、溶液を５０～８０℃で数時間（典型的には４時間）撹拌する。次に、アルキル化インドレニン（ＩＩＩ）をエタノールまたはメタノールなどの有機溶媒に溶解した後、場合により、ピリジン、トリエチルアミン、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムなどの塩基を添加する。暗赤色の溶液は５０～８０℃で数時間、典型的には４～９６時間撹拌し得る。

Ｗが、－Ｃ（Ｃｌ）＝、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝および－ＣＨ＝Ｃ（Ｃｌ）－ＣＨ＝から選択され、Ｒ１およびＲ３が、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｙが、－ＳＯ３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルである、式（Ｉｃ）のシアニンに関する実施形態については、以下の一般的なスキーム３に示す手順を使用できる。

従って、本発明の製法は以下の工程を含んでなる：
ｄ）式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の５－置換－２，３，３－トリメチルインドレニン中間体の適量を、ビサニリド塩酸塩形態（ＶＩＩ）の対応するＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬と反応させて、式（Ｉｃ）の対応する化合物を得る。

工程ｄ）の反応は、エタノール、メタノール、酢酸、無水酢酸またはそれらの混合物などの溶媒中で行うことができる。反応は、インドール（ＩＩＩ）と（ＩＶ）の両方を同時に添加するか、または酢酸と無水酢酸の混合物中で５０～７０℃で数時間撹拌しながらまずＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬を活性化し、次いで一方のインドール、典型的には非アルキル化インドール（ＩＶ）を添加し、５０～７０℃で数時間撹拌しながら行うことができる。対応するヘミシアニンは、例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの有機溶媒中で沈殿させ、次いでエタノール、メタノール、ジメチルホルムアミドなどの別の有機溶媒に溶解することにより単離し、トリエチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムなどの塩基の存在下、５０～１００℃で数時間撹拌しながら、第二のインドール、典型的にはアルキル化されたインドール（ＩＩＩ）と反応させる。

Ｗが式（Ｉ）で定義される通りであり、Ｒ１がＲ２とともに、およびＲ３がＲ４とともに、それらがそれぞれ結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ３Ｈ基で置換されていてもよいベンゾ縮合環を形成する、式（Ｉａ）のシアニンに関する実施形態については、以下の一般的スキーム４に示される手順を適用できる：

従って、本発明の製法は以下の工程を含んでなる：
ｅ）式（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）の５－置換－２，３，３－トリメチルベンゾインドレニン中間体の適量を、ビサニリド塩酸塩形態（Ｘ）の対応するＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬と反応させて、式（Ｉｄ）の対応する化合物を得る。

工程ｅ）の反応は、Ｒ１１～Ｒ１８置換基の極性に応じて、少量の水を添加して、または添加せずに、エタノール、メタノール、酢酸、無水酢酸またはそれらの混合物などの溶媒中で実施できる。中間体（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）の溶液を、ＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬（Ｘ）およびピリジン、トリエチルアミン、酢酸ナトリウムなどの塩基の存在下、７０～１００℃の範囲の高温にて数時間、典型的には一晩撹拌する。その後、粗製物を有機溶媒で沈殿させ、沈殿法またはフラッシュクロマトグラフィーで精製する。

それらすべての実施形態において、Ｒ５および／またはＲ１／Ｒ３の官能基は、場合により、合成の間に、１つ以上の適切な保護基で保護でき、保護基はその後の工程で除去する必要がある。工程ａ）～ｄ）で得られた生成物は、例えばT.W. Green and P.G.M.WutＳ, Protective GroupＳ in Organic ＳyntheＳiＳ, Wiley, N.Y. 2007, 4th Ed., Ch. 5に記載されている公知の手順に従って脱保護できる。

式（ＩＩ）のコンジュゲート化合物の調製
式（Ｉ）のシアニン誘導体またはその塩は、式（ＩＩ）の対応する化合物を得るために、場合によりスペーサーを挿入して、適切な標的化部分とコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションは、例えば、化合物のカルボン酸基と標的化部分の求核残基との直接の、または場合によりスペーサーを介したカップリング、あるいは、カップリングの前に事前にカルボン酸基を反応性の高い基（例えばＮＨＳのようなエステル）に変換する活性化によって、当技術分野で公知の種々の手順に従って実施することができる。

上述の工程に従って調製された式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が異性体の混合物として得られる場合、慣用の技術を用いて式（Ｉ）または（ＩＩ）の単一の対応する異性体に分離することは本発明の範囲内である。

最終的な化合物は、慣用の手順、例えばクロマトグラフィーおよび／または結晶化、塩形成などを用いて単離・精製できる。

上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、薬学的に許容される塩に変換できる。上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、その後、薬学的に許容される担体または希釈剤とともに製剤化して、医薬組成物とすることができる。

実験パート
以下に記載される本発明およびその特定の実施形態は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定するものとみなされるものではない。これらは、本発明をどのように実施できるかを示すものであり、本発明の範囲を限定することなく例示することを意図している。

材料と設備
合成に使用した市販の試薬はすべてＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈおよびＴＣＩから入手し、さらに精製することなく使用した。ｃ（ＲＧＤｆＫ）はＡｐｅｘＢｉｏまたはＢａｃｈｅｍから購入した。すべての反応を、ＨＰＬＣ（Agilent mod. 1100/1200）と、各種波長に設定した吸収検出器（カラムYMC-Triart Phenyl, 250 x 4.6 mm/Ｓ-5μm/12 nm)を備えたＨＰＬＣ－ＭＳ(アジレントmod.1260、四重極LC/MＳD Mod.6120）で追跡した。精製は、プレパックドシリカＣ１８カートリッジ（Biotage（登録商標）またはPhenomenex)、または分取YMC-Triart Phenylカラムを用いた自動精製システム(CombiFlaＳh（登録商標）Rf+)でのフラッシュクロマトグラフィー、または分取ＨＰＬＣにより行った。吸光度、励起および発光値は、測定を高速化するためにウェルプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ）で評価した。

個々のアミノ酸残基の略号は慣用的なものである：例えば、ＡＳｐまたはＤはアスパラギン酸、ＧｌｙまたはＧはグリシン、ＡｒｇまたはＲはアルギニンである。本明細書で言及するアミノ酸は、特に断りのない限り、Ｌ－体であると理解されたい。

実施例１：化合物１の合成

中間体（２）の調製
マグネティックスターラーで撹拌しながら、コンデンサーを取り付けた丸底フラスコ内で４－ヒドラジノ安息香酸（１５ｇ，９８．６ｍｍｏｌ）、メチルイソプロピルケトン（２１．１ｍＬ，１９７．２ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１６．２ｇ，１９７．２ｍｍｏｌ）の混合物に氷酢酸（２２５ｍＬ）を加えた。オレンジ色の懸濁液を還流加熱し、暗褐色の溶液とした。３時間後、反応は完了し、溶媒を減圧下で濃縮し、残留物をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３（３ｘ１００ｍＬ）の飽和溶液で抽出した。有機相は生成物のほとんどを含んでいた。水相をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で再抽出し、すべての有機相を合わせた。有機相全体を減圧下で濃縮し、酢酸エチル／石油エーテル３：１（１３５ｍＬ）で結晶化し、固体（２０．４３ｇ）を得た。最初の固体を濾過し、母液を濃縮し、ＥｔＯＡｃ／ＰＥ１：１．５（２５ｍＬ）の溶液で再度結晶化させ、高純度の第２の固体を得、これを先の固体と合わせ、真空下で乾燥させ、１３．３１ｇ、収率６６％を得た。

中間体（３）の調製
マグネティックスターラーで攪拌しながら、コンデンサーを取り付けた丸底フラスコ内で、中間体（２）（３．７ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）をブチロニトリル（１２ｍＬ）に懸濁した。次に、２，４－ブタンスルトン（２．０９ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を加えた。オレンジ色の懸濁液を還流下で加熱し、暗褐色の溶液とした。４２時間後、反応は完了した。溶液を室温まで冷却し、マグネティックスターラーで攪拌しながら１１０ｍＬのアセトンを加えた。２時間後、固体を濾別し、３５℃で一晩真空乾燥した（６．０３ｇ、収率９８％）。
２７０ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度：９５．１％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋３４１．０．

化合物1の合成
窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（１）（９１．６０ｍｇ，０．３８６ｍｍｏｌ，米国特許第７，４０８，０６２号に記載のとおりに調製）と中間体（２）（１００．０ｍｇ，０．２９５ｍｍｏｌ）を５０℃でＥｔＯＨ（４０ｍＬ）に溶解し、２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサアルデヒド（５０．８６ｍｇ，０．２９５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃に加熱し、窒素気流下で撹拌した。赤色の出発混合物は、反応２分後に赤紫色になった。５０℃で２０時間後、反応を停止した。粗混合物を真空下で乾燥させ、最小量の水に溶解した。次に、１Ｍの塩酸１ｍＬを加え（混合物のｐＨ１．９２）、粗製物を、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いて、充填済ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＡＱＣ１８球状シリカカラム（４０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗緑色の固体（５０．５５ｍｇ、収率２４．０％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９７．３％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７１５．２．

実施例２：化合物２の合成

中間体（５）の調製
窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（１）（１．００ｇ，３．８３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、ヨードエタン（２．０２ｍＬ，２５．１ｍｍｏｌ）を室温で加えた。オレンジ色の混合物を１３０℃で５時間磁気撹拌した。１３０℃で１時間後、反応混合物は濃いピンク色になった。５時間後、粗製の固体を２０ｍＬの冷ジエチルエーテルに懸濁し、分散液を３０分間撹拌下に置いた。固体を濾過し、冷ジエチルエーテルで洗浄し、さらに冷アセトンに懸濁した。分散液を３０分間攪拌下に維持した後、濾過した。固体を１．５ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、濃縮溶液を５０ｍＬの冷アセトンに滴下した。分散液を１時間撹拌下に維持した後、濾過し、得られた固体を冷アセトンで洗浄した。最後に、粗製の赤色固体をプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵＬＴＲＡ、６０ｇ）を用い０．０１％ギ酸／アセトニトリル勾配で精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、ピンク色の固体（２９７．４ｍｇ、収率２９．０％）を得た。２７０ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度：９７．６％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋２６８．８．

中間体（６）の調製
窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（５）（２３２．４ｍｇ，０．８６９ｍｍｏｌ）および（２）（２３１．５ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（６５ｍＬ）に溶解し、２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサアルデヒド（１５０．１ｍｇ，０．８６９ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を５０℃に加熱し、窒素気流下で撹拌した。黄色の出発混合物は、反応開始３０分後に赤色になった。５０℃で２０時間後、反応を停止し、溶媒を減圧下で留去した。精製は、ミリＱ水－アセトニトリルグラジエントを用い、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵＬＴＲＡ、６０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで行った。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗緑色の固体（１９．５５ｍｇ、収率３．８％）を得た。５２０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９８．９％、７８０ｎｍで２０．５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋６０７．２．

化合物２の合成
窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（６）（１３．５ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解した。Ｄ－グルカミン（９．６４ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１５．５μＬ，０．０８９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２１．１ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）を加えた。暗赤色の溶液を室温で５時間マグネティックスターラーで攪拌した後、冷ジエチルエーテル（６０ｍＬ）を加えた。分散液を２時間攪拌した後、－２０℃で４８時間保存した。得られた固体を濾過し、冷ジエチルエーテルで洗浄し、ＭｅＯＨに溶解し、真空下で乾燥させた。得られた緑色固体を、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用い、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、１２ｇ）にて精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗緑色の固体（１９．９２ｍｇ）を得た。５２０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７７０．３．

実施例３：化合物３の合成

丸底フラスコ内で、化合物１（３３．１６ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ５ｍＬに溶解した。次に、Ｄ－グルカミン（１６．８５ｍｇ，０．０９２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３５．３６ｍｇ，０．０９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３２．１μＬ、０．１８４ｍｍｏｌ）を、室温で紫色の溶液に加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。５０ｍＬの冷ジエチルエーテルを懸濁液に加え、沈殿物をろ過した。次に、紫色の固体を、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用い、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵＬＴＲＡ、３０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮した。粉末をミリＱ水に再溶解し、溶液を凍結乾燥し、紫色の固体（３５．０ｍｇ、収率８６．６％）を得た。５１０ｎｍと２５４ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８７８．

実施例４：化合物４の合成
中間体（７）の調製

窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、Ｎ－［（３－（アニリノメチレン）－２－クロロ－１－シクロヘキセン－１－イル）メチレン］アニリン一塩酸塩（７２．７ｍｇ，０．２０２ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ１：２の脱気混合物５０ｍＬに溶解した。４－カルボキシフェニルホウ酸（６０．４ｍｇ，０．３６４ｍｍｏｌ）、Ｐｄテトラキス（３５．０ｍｇ，０．０３０３ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（３８．５ｍｇ，０．３６４ｍｍｏｌ）を室温で黄色溶液に加えた。混合物を８０℃に加熱し、窒素気流下で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、粗製物をミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いたプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵＬＴＲＡ、３０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。中間体（７）を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮した。粉末をミリＱ水に再溶解し、溶液を凍結乾燥して、明るいオレンジ色の固体を得た（５０．７ｍｇ、収率７５．３％）。４１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋３３４．１．

中間体（８）の調製

圧力反応容器内で、中間体（１）（１．０２ｇ，４．２６ｍｍｏｌ）を５ｍＬのスルホランに懸濁し、６－ブロモヘキサン酸エチル（１．１４ｍｌ，６．３９ｍｍｏｌ）を室温で懸濁液に加えた。褐色の懸濁液を９０℃で７０時間加熱した。冷酢酸エチル（１０ｍＬ）を懸濁液に加え、沈殿物をろ過した。その後、赤色固体を、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いたプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、１２０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物３を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮した。粉末をミリＱ水に再溶解し、溶液を凍結乾燥し、赤色固体を得た（２８５ｍｇ、収率１７．５％）。２７０および２５４ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋３８２．１．

中間体（９）の調製

窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（７）（２０．１ｍｇ，０．０６０２ｍｍｏｌ）を２ｍＬの脱気無水エタノールに溶解した。次に、無水ＥｔＯＨ（２ｍＬ）中の中間体（１）（１４．４ｍｇ，０．０６０２ｍｍｏｌ）の溶液と酢酸（２０μＬ）を、窒素気流下、５０℃で黄色溶液に滴加した。黄色の溶液は数分加熱すると赤色になり、温度が上昇すると淡褐色になった。４時間後、中間体（８）（２２．９ｍｇ，０．０６０２ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。この溶液を５０℃で９６時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、粗製物をミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いたプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵＬＴＲＡ、３０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。中間体（９）を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮した。粉末をミリＱ水に再溶解し、溶液を凍結乾燥して、紫青色の固体を得た（８．２ｍｇ、収率１６％）。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９８．７％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８４３．２．

中間体（１０）の調製

丸底フラスコ内で、中間体（９）（４ｍｇ，０．００４７４ｍｍｏｌ）を室温にて１．５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次に、タウリン、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡを紫色の溶液に加えた。混合物を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。混合物に冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加えた。沈殿物を濾過し、ミリＱ水に再溶解し、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いて、プレパックＣ１８シリカカラム（ＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄ、５ｇ）で精製した。中間体（１０）を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して紫青色の固体（３．５ｍｇ、収率７８％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９８．４％、７８０ｎｍでの純度：７５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９５０．１．

化合物４の合成

丸底フラスコ内で、中間体（１０）（３．５ｍｇ，０．００３６８ｍｍｏｌ）を５ｍＬのミリＱ水に溶解し、１ＭのＮａＯＨを加えてｐＨを１１に調整した。加水分解は、ｐＨ１１、４０℃にて、１ＭのＮａＯＨの自動添加（ＤｏＳｉｍａｔとｐＨメーターの組み合わせ）によって行った。２時間後、１Ｍの塩酸を加えてｐＨを７に調整した。プレパックＣ１８シリカカートリッジ（ＲｅｄｉＳｅｐＧｏｌｄ、５ｇ）にて、Ｈ２Ｏ（１０ＣＶ）を溶離液として混合物を脱塩してＮａＣｌを除去し、ＭｅＯＨ（５ＣＶ）を用いて生成物を回収した。溶出液を減圧下で蒸留し、凍結乾燥して紫青色の固体を得た（２．６ｍｇ、収率７６％）。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９２２．１．

実施例５：化合物５の合成
中間体（１１）の調製

窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（８）（１１０．５ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）と中間体（１）（９０．０ｍｇ，０．３７７ｍｍｏｌ）を５０℃でＥｔＯＨ（２０ｍＬ）に溶解した。次に、ＡｃＯＮａ（２３．８ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）と２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサアルデヒド（５０．０ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃に加熱し、窒素気流下で２０時間撹拌した。溶媒を真空下で乾燥させ、得られた固体をミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、３０ｇ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗紫色の固体（５７．６５ｍｇ、収率２１．９％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９９．９％、２５４ｎｍで９３．３％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７５７．３５．

化合物５の合成
中間体（１１）（５７．６５ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。この溶液を０．１ＭＮａＯＨ（０．５４８ｍＬ）でｐＨ１１にし、４０℃で加熱し、ｐＨメーターと連動したＤｏＳｉｍａｔで０．１ＭＮａＯＨを自動添加し、ｐＨを１１に一定に保った。８時間後に反応を停止し、６．６２６ｍＬのＮａＯＨを加えた。混合物を室温まで冷却し、１Ｍ塩酸（１．０ｍＬ）で中和し、真空下で蒸留した。その後、粗製物をミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いて、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、６０ｇ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗緑色の固体を得た（３１．９ｍｇ、収率５７．５％）。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９９．９％、２５４ｎｍで９６．７％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７２９．３．

実施例６：化合物６の合成
中間体（１３）の調製

窒素雰囲気下で乾燥させた丸底フラスコ内で、中間体（１）（９０．０ｍｇ，０．３７７ｍｍｏｌ）を５０℃でＥｔＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサアルデヒド（５０．０ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、混合物を５０℃に加熱し、窒素気流下で１．５時間撹拌した。中間体（１２）（１００．３ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃に加熱し、窒素気流下でさらに１３．５時間撹拌した。次いで、他の中間体（１２）（３０．１ｍｇ，０．０８７ｍｍｏｌ）を加え、９時間加熱した後に反応を停止した。粗製の混合物を真空下で乾燥させ（１８２．０ｍｇ）、さらに精製することなく次の工程に使用した。

中間体（１４）の調製
丸底フラスコに粗製の中間体（１３）（１８２．０ｍｇ，理論値０．２５２ｍｍｏｌ）を５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、Ｄ－グルカミン（９１．３ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１９１．６ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１５８．０μＬ、０．９０７ｍｍｏｌ）を、室温で溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌した後、冷ジエチルエーテル（７０ｍＬ）を加えた。分散液を１２時間撹拌し、溶媒をデカントし、得られた固体を冷ジエチルエーテルで洗浄し、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックしたＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、６０ｇ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空留去し、凍結乾燥し、暗緑色の固体（１１４．０ｍｇ、中間体（１２）からの収率４４％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９９．４％、７５６ｎｍで４０．０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８８４．４８．

化合物６の合成
中間体（１４）（１１４．０ｍｇ，０．１２９ｍｍｏｌ）を６０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、１ｍＬのＥｔＯＨを加えた。この溶液を１ＭＮａＯＨ（０．４３２ｍＬ）でｐＨ１１にし、４０℃で加熱した。ｐＨメーターと連動したＤｏＳｉｍａｔで１ＭＮａＯＨを自動添加し、ｐＨを１１に一定に保った。加水分解は４．５時間後に完了し、６．６２６ｍＬのＮａＯＨを加えた。混合物を室温まで冷却し、２Ｍ塩酸（１．５ｍＬ）で中和し、真空下で蒸留した。その後、粗製物を、ミリＱ水－アセトニトリル勾配を用い、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ、６０ｇ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥し、暗緑色の固体（７０．６２ｍｇ、収率６４％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９９．４％、２５４ｎｍで９３．９．０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８５６．９０．

実施例７：化合物７の合成
中間体（１５）の調製

丸底フラスコ内で、中間体（２）（１．０１ｇ，４．９７ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（２．２３ｇ，６．９４ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．７３ｍＬ，９．９５ｍｍｏｌ）を加えた。その結果、Ｄ－グルカミン（１．２６０ｍｇ，６．９５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２．５時間撹拌した。冷ジエチルエーテルを添加して固体を沈殿させこれをろ取してＭｅＯＨに溶解し、真空下で乾燥させた後、水－アセトニトリル勾配を用いたプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵｌｔｒａ１２０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で濃縮した。バッチを凍結乾燥し、白色固体を得た（１．７５ｇ、収率９５．９％）。２７０ｎｍでのＨＰＬＣ－ＭＳ純度：１００％；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋３６７．０。

中間体（１６）の調製

丸底フラスコ内で、中間体（１５）（１３２．５６ｍｇ，０．３６１８ｍｍｏｌ）を４５ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解し、Ｎ－［（３－（アニリノメチレン）－２－クロロ－１－シクロヘキセン－１－イル）メチレン］アニリン一塩酸塩（１００ｍｇ，０．２７８３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を５０℃で４時間加熱した。次いで、中間体（１２）（９６．４１ｍｇ，０．２７８３ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解して加えた。混合物を５０℃で２４時間加熱した。不斉シアニンへの変換率を最大にするために、中間体（１２）（４８．５８ｍｇ，０．１４０２ｍｍｏｌ）の２回目の添加を行い、溶液をさらに４８時間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、真空下で蒸留して粗製の中間体（１６）を得、これをさらに精製することなく次の反応に用いた。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：５９．９％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８４８．４．

中間体（１７）の調製

丸底フラスコ内で、粗製の中間体（１６）（２４６ｍｇ，０．２９０ｍｍｏｌｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）を２０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、ＨＡＴＵ（２２０．２ｍｇ，０．５７９ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１８１μＬ，１．０４２ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、Ｄ－グルカミン（１０５ｍｇ，０．５７９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。冷ジエチルエーテルを加えて紫色の固体を沈殿させ、これをろ取し、冷溶媒で２回洗浄した後、水－アセトニトリル勾配を用いたプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵｌｔｒａ１２０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で蒸留し、凍結乾燥し、紫色の固体（７０．０ｍｇ、化合物２からの収率２５％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ－ＭＳ純度：１００％；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１０１１．４。

化合物７の合成

中間体（１７）（３０．００ｍｇ，０．０２９６ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの溶液Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ７：３に溶解した。この溶液を１ＭのＮａＯＨでｐＨ１１にし、４０℃で加熱し、ｐＨメーターと連動したＤｏＳｉｍａｔで１ＭのＮａＯＨを自動添加してｐＨを１１に一定に保った。加水分解は２時間後に完了し、０．５４２ｍＬの１ＭＮａＯＨを加えた。混合物を室温まで冷却し、０．１Ｍ塩酸で中和した後、真空下で蒸留し、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵｌｔｒａ３０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、粗製物を得た。純粋な生成物を含む分画を合わせ、真空下で濃縮し、凍結乾燥して紫色の固体（１５．０ｍｇ、収率５１．５％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ－ＭＳ純度：１００％；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９８３．３。

実施例８：化合物８の合成
中間体（１８）の調製

ＵＳ７，４０８，０６２Ｂ２に記載の手順で得られた中間体（１）（１０．０ｇ，０．０３６ｍｏｌ）をスルホラン（２０．０ｇ）に懸濁した。次に６－ブロモ－ヘキサン酸（９．０ｇ，０．０４６ｍｏｌ）を加え、混合物を１００℃で７２時間加熱した。混合物を冷却し、アセトン（１５０ｍＬ）を加え、得られた固体をろ過した。固体をアセトンで３回洗浄し、６０℃で４時間真空乾燥した。得られた固体をアセトニトリル（１５０ｍＬ）に分散させ、６５℃で１時間撹拌した後、熱いままろ過した。回収した固体を冷アセトニトリルで洗浄した後、６０℃で４時間真空乾燥し、１４．０ｇ、９１％（ＨＰＬＣ面積）で得た。収率８２％。

化合物８の合成
１００ｍＬ容の四つ口フラスコ内で、グルタルアルデヒドジアニル塩酸塩（０．２４ｇ，０．８４ｍｍｏｌ）、酢酸（６．８５ｇ）および無水酢酸（２５．２ｇ）を入れた。溶液を６０℃で２時間加熱した後、中間体（１）（０．２２６ｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を加え、さらに３時間加熱した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、攪拌下、酢酸イソプロピル（３５０ｍＬ）に滴下した。固体をろ過し、酢酸イソプロピルで洗浄した後、４０℃で１時間真空乾燥した（０．２１ｇ）。
別の１００ｍＬ四つ口フラスコ内で、中間体（１８）（０．２５ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）および酢酸ナトリウム（０．０６５ｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を入れた。この懸濁液を６０℃で加熱し、透明な溶液を得た。次いで、無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中のヘミシアニン（０．２１，０．４８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、反応混合物を６０℃で６時間加熱した。次いで、冷却し、攪拌しながら、酢酸イソプロピル（３５０ｍＬ）に滴下した。固体を濾過し、酢酸イソプロピル－メタノールの勾配を用いて溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で濃縮し、３３ｍｇの紫色の固体を得た（収率７％）。

実施例９：化合物９の合成

中間体（２１）および（２２）は、特許出願ＵＳ２０１３／０４５４８８Ａ１に記載されている方法で調製した。中間体（２１）（９．５５ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、丸底フラスコ内でＭｅＯＨ（２ｍＬ）に懸濁した。次いで、ＶｉｌＳｍｅｉｅｒ試薬ジアニリド体（３．０２ｍｇ，０．０１０３ｍｍｏｌ）および中間体（２２）（５ｍｇ，０．０１０３ｍｍｏｌ）を加えた後、ベンゾインドール類の可溶化に必要な水（２００μＬ）およびピリジン（２５０μＬ）を加えた。その後、溶液を９０℃で一晩加熱した。混合物を真空下で濃縮し、氷浴で冷却しながら冷ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で沈殿させた。青色の沈殿物を濾過し、水に溶解し、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳｆａｒＣ１８１２ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、真空下で濃縮し、０．８７ｍｇの青色固体を得た（収率９．１％）。６５０ｎｍでのＨＰＬＣ－ＭＳ純度：８８％；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９２２．９。

実施例１０：化合物１０の合成

窒素雰囲気下、丸底フラスコ内で化合物５（１０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ５ｍＬに溶解した。次に、ＴＢＴＵ（４．４ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（６．７μＬ，０．０３８３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した後、乾燥ＤＭＦ５ｍＬ中のｃ（ＲＧＤｆＫ）トリフルオロ酢酸（９．８ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。混合物を室温で一晩撹拌した後、氷浴中で冷ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）を加えて沈殿させた。紫色の沈殿物をろ取し、冷ジエチルエーテルで２回洗浄した。次いで、水／アセトニトリル２：１の混合溶媒に溶解し、水－アセトニトリル勾配を用い、プレパックＣ１８シリカカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰＵｌｔｒａ１２ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮し、凍結乾燥し、青色の固体（９ｍｇ、収率５０％）を得た。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９９．３％；ＭＳ：［Ｍ－Ｈ］－１３１４．３。

実施例１１：化合物１１の合成

中間体（１９）の調製
４０ｍＬ容のガラス製の遠心チューブ内で、化合物６（１５．６０ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、ＴＳＴＵ（１０．９ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（４μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）を、室温で紫色の溶液に加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。その後、冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を溶液に加えた。懸濁液を４０００ｒｐｍで５５分間遠心した。その後、ジエチルエーテルをデカントし、チューブ壁に付着した紫色の固体を得た。この粗製の化合物は、それ以上精製することなく次の工程に使用した。

化合物１１の合成
中間体（１９）を入れた同じ４０ｍＬ容の遠心ガラスチューブに、ｐＨ９のホウ酸緩衝液８ｍＬ中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（１４ｍｇ，０．０２０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で加えた。紫色の混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、混合物のｐＨを１Ｍ塩酸の添加により７に調整し、粗製物を、ＹＭＣｔｒｉａｒｔ－ｐｈｅｎｙｌカラムにて、０．１％ギ酸／アセトニトリル勾配を用いた分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、濃縮し、１０ＣＶの水を用いプレパックドシリカＣ１８カラム（ＧＥ、５ｇ）にて脱塩して過剰のギ酸を除去し、５ＣＶのＭｅＯＨを用いて生成物を回収した。最終の溶液を減圧下で蒸留し、得られた粉末をミリＱ水に溶解し、溶液を凍結乾燥して、明るい紫色の固体を得た（６．５ｍｇ、収率２５％）。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：１００％、２５４ｎｍで８９．３％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４４１．４．

実施例１２：化合物１２の合成

中間体（２０）の調製
４０ｍＬ容のガラス製遠心チューブ内で、化合物７（１０．３ｍｇ，０．０１０５ｍｍｏｌ）を２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。次いで、ＴＳＴＵ（６．３ｍｇ，０．０２１０ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（２．３μＬ，０．０２１０ｍｍｏｌ）を室温で紫色の溶液に加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。その後、４０ｍＬの冷ジエチルエーテルを溶液に加えた。懸濁液を４０００ｒｐｍで５５分間遠心分離し、ジエチルエーテルをデカントし、チューブ壁に付着した紫色の固体を得た。この粗製物は、それ以上精製することなく次の反応に使用した。

化合物１２の合成
同じ４０ｍＬ容の遠心チューブ内で、中間体（２０）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、６ｍＬのホウ酸緩衝液（ｐＨ９）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（８．３ｍｇ，０．０１１６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で加えた。その後、紫色の混合物を室温で１時間撹拌した。混合物のｐＨを、０．５Ｍ塩酸を加えて６．７に調整した。水を減圧下で留去し、粗製物をミリＱ水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ＣＬＡＲＩＣＥＰ、４０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、減圧下で濃縮した。粉末をミリＱ水に再溶解し、溶液を凍結乾燥し、明るい紫色の固体を得た（４．６ｍｇ、化合物７からの収率２７．９％）。５１０ｎｍでのＨＰＬＣ純度：９７．８％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５６９．５．

実施例１３：光学特性
各化合物について、分析的および光学的特性評価を行った。合成したすべての染料とそのコンジュゲートを、ＨＰＬＣ－ＭＳにより広範囲に特性評価したところ、最終純度は高い値を示した。一例として、代表的な化合物５の２５４ｎｍ、５１０ｎｍ（中性ｐＨにおける最大吸収）および７８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ面積から算出した純度を以下のTable IIに示す。

光学的特性評価は、Ｓｐａｒｋ（登録商標）マルチモードマイクロプレートリーダーを用い、特定の９６ウェルプレートで、リン酸バッファーで緩衝化した蛍光体の吸光度、励起および発光スペクトルを、３～８の範囲のいくつかのｐＨで記録した。特に、式（Ｉ）の代表的な化合物および式（ＩＩ）のコンジュゲートの吸光度、励起および発光の極大波長Table IIIに示す。

本発明の化合物は、約６２０ｎｍ～約７９０ｎｍの範囲での吸収極大を特徴とし、標的化部分とコンジュゲートさせた場合でも約６５０ｎｍ～９００ｎｍの範囲の蛍光発光を示す。

ｐＫ評価
ｐＨの変化に対する吸光度と発光の変化の分析から、補間曲線の変曲点として本発明の色素のｐＫａを算出することが可能であった。
実験に使用したｐＨ緩衝液はすべてリン酸塩系緩衝液で、各ｐＨポイントはｐＨメーターで正確にチェックした。まず、シアニン粉末を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶かした後、この母液１０μＬを、リン酸と水酸化ナトリウムを目的のｐＨになるように適宜混合して予め調製した各種ｐＨのリン酸緩衝液１ｍｌに加えた。次いで、希釈したシアニン緩衝液をサンプリングし、９６ウェルプレート（吸光度測定用は透明、発光測定用は暗色）に移し、分析を行った。各溶液について、活性型の最大吸光度（例えば化合物５では７８０ｎｍ）の値を溶液のｐＨに対してプロットすると、多項式の３次曲線が得られ、その変曲点はシアニンのｐＫａ値に対応した。このような曲線の一例を、代表的な化合物５について図１に示す（変曲点のｐＫａ値は５．９である）。
さらに、活性型の極大値（例えば化合物５の８０４ｎｍ）における発光の値をｐＨに対してプロットした同様の曲線が得られ、ｐＫａの値が同じであることが確認された（第２のデータ源から得られた結果）。参考化合物Ａで得られたｐＫａ値もTable IVに示す。

各種ｐＨにおける残留蛍光
本発明のいくつかの代表的な化合物について、ｐＨ３（強酸性）で収集した最大蛍光に対する各種ｐＨ（５、６、７．５）での蛍光の比率を計算し、結果を以下のTable Vに示した。結果を非アルキル化参照化合物Ａについて計算した値とも比較した。

これらの結果は、５．５～７．０、特に５．８～６．５の範囲の本発明化合物の高いｐＫａが、ｐＨ５および６、すなわち腫瘍細胞外環境および細胞内エンドソームをより特徴づけるｐＨ値での蛍光発光を改善し、in vitroおよびin vivoでより検出しやすいシグナルを提供できることを示している。例えば、ｐＨ５と６では、基準化合物Ａの約２倍から８倍の蛍光シグナルを示した。逆に、生理的ｐＨ（約７．４）での蛍光は非常に低く、バックグラウンドシグナルが低減し得る。

参考文献
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8．WO2004/039894
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10．Lee H. et al., Bioconjug Chem. 2011, 22(4): 777-784
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13．Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7:3905
14．Wichert et al., Nat Chem 2015, 7: 241-249
15．Li et al., FASEB J 2005, 19:1978-85
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18．Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5), 881-891
19．US 7,408,062 B2
20．US 2013/045488 A1

Claims (15)

1. 式（Ｉ）
   

   

   ［式中、
   Ｗは、
   

   

   で示される基または－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ６）－ＣＨ＝もしくは－Ｃ（Ｃｌ）＝であり、
   Ｒ６は、水素または塩素であり、
   Ｒ７は、塩素または－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｙ、－アルキル－ＣＯＯＨおよび－アルキル－ＣＯＮＨ－Ｙから選択される基によって置換されていてもよいフェニルであり、
   Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、
   ＊は結合位置を表し、
   Ｒ１およびＲ３は、水素、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から独立して選択され、Ｒ２およびＲ４は水素であるか、または
   Ｒ１がＲ２と一緒になって、およびＲ３がＲ４と一緒になって、それぞれ、それらが結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ_３Ｈで置換されていてもよい２個のアリール環を形成し、
   Ｒ５は、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ_２から選択される基で置換されていてもよいアルキルである］
   で示される化合物またはその薬学的に許容される塩。
2. 式（Ｉａ’）
   

   

   ［式中、Ｒ５およびＲ７は、請求項１において定義されるとおりであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立して、－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである］
   で示される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
3. 式（Ｉｂ）
   

   

   ［式中、Ｒ５およびＲ７は、請求項１において定義されるとおりであり、Ｒ１およびＲ３は、独立して、－Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から選択され、Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルである］
   で示される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
4. 式（Ｉｃ）
   

   

   ［式中、
   Ｗは、－Ｃ（Ｃｌ）＝、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝および－ＣＨ＝Ｃ（Ｃｌ）－ＣＨ＝から選択され、
   Ｒ１およびＲ３は、独立して、－Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群より選択され、
   Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、
   Ｒ５は請求項１において定義される通りである］
   で示される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
5. 式（ＩＩ）
   

   

   ［式中、
   Ｗは、
   

   

   で示される基または－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ６）－ＣＨ＝もしくは－Ｃ（Ｃｌ）＝であり、
   Ｒ６は、水素または塩素であり、
   Ｒ８は、塩素または－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｙ、－アルキル－ＣＯＯＨ、－アルキル－ＣＯＮＨ－Ｙまたは－Ｒ１０から選択される基によって置換されていてもよいフェニルであり、
   Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された二価のアルキルであり、
   Ｒ１０は、基－ＣＯＮＨ－（Ｓ）_ｍ－Ｔによって置換された二価のアルキルであり、
   Ｓは、スペーサーであり、
   Ｔは標的化部分であり、
   ｍは０または１に等しい整数であり、
   ＊は結合位置を表し、
   Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群から選択され、Ｒ２およびＲ４が水素であるか、または
   Ｒ１がＲ２と一緒になって、およびＲ３がＲ４と一緒になって、それぞれ、それらが結合している原子と一緒になって、１～４個の－ＳＯ_３Ｈで置換されていてもよい２個のアリール環を形成し、
   Ｒ９は、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、および－ＣＯＮＨ－（Ｓ）_ｍ－Ｔから選択される基によって置換されていてもよいアルキルであり、ここで、Ｓ、Ｔおよびｍは上記と同意義であり、
   少なくとも１つの基－ＣＯＮＨ－（Ｓ）_ｍ－Ｔが、Ｒ９またはＲ１０において存在する］
   で示される、請求項１において定義される化合物のコンジュゲート。
6. 式（ＩＩａ’）
   

   

   ［式中、Ｒ８およびＲ９は、請求項５において定義されるとおりであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立して、－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである］
   で示される、請求項５に記載の式（ＩＩ）の化合物。
7. 式（ＩＩｂ）
   

   

   ［式中、
   Ｒ１およびＲ３は、独立して、－Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群より選択され、
   Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、
   Ｒ８およびＲ９は、請求項５において定義される通りである］
   で示される、請求項５に記載の式（ＩＩ）の化合物。
8. 式（ＩＩｃ）
   

   

   ［式中、
   Ｗは、－Ｃ（Ｃｌ）＝、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝および－ＣＨ＝Ｃ（Ｃｌ）－ＣＨ＝から選択され、
   Ｒ１およびＲ３は、独立して、－Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－Ｙからなる群より選択され、
   Ｙは、－ＳＯ_３Ｈまたは少なくとも２つのヒドロキシル基で置換された二価のアルキルであり、
   Ｒ９は、請求項５において定義される通りである］
   で示される、請求項５に記載の式（ＩＩ）の化合物。
9. Ｔが、低分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、酵素基質、抗体またはそのフラグメント、およびアプタマーからなる群から選択される標的化部分である、請求項５～８のいずれかに記載の式（ＩＩ）の化合物。
10. Ｔがインテグリン受容体と相互作用する部分である、請求項９に記載の式（ＩＩ）の化合物。
11. 哺乳動物における生物医学的光学イメージングに適用するための蛍光プローブとして使用するための、請求項１～４のいずれかにおいて定義される式（Ｉ）の化合物または請求項５～８のいずれかにおいて定義される式（ＩＩ）の化合物。
12. イメージングへの適用が、原発性腫瘍病変、局所もしくは遠隔転移、または前新生物病変を含む異常組織の検出に向けられるものであり、ＮＩＲ照射下で行われる、請求項１１に記載の使用のための式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物。
13. 請求項１～４のいずれかにおいて定義される式（Ｉ）の化合物または請求項５～８のいずれかにおいて定義される式（ＩＩ）の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
14. 請求項１～４のいずれかにおいて定義される少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または請求項５～８のいずれかにおいて定義される少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物を、さらなる助剤と共に含む、生物医学的光学イメージングを実施するための診断キット。
15. 以下の工程を含む組織および細胞を画像化する方法において使用するための、請求項１～４のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物または請求項５～８のいずれかに定義される式（ＩＩ）の化合物：
    ｉ）細胞または組織を、請求項１～４のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物または請求項５～８のいずれかに定義される式（ＩＩ）の化合物と接触させる；
    ｉｉ）造影剤が吸収する波長で組織または細胞に照射する；
    ｉｉｉ）蛍光カメラを用いて近赤外発光を検出する。

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