KR101478505B1

KR101478505B1 - 비닐설폰기를 가지는 염료 화합물의 생체 분자 표지 방법

Info

Publication number: KR101478505B1
Application number: KR20110079332A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 정미라; 김남호; 정두영; 나종주
Original assignee: 주식회사 디케이씨코포레이션
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2011-08-10
Publication date: 2015-01-06
Also published as: KR20130017111A

Abstract

본 발명은 비닐설폰기를 가지는 염료 화합물의 생체 분자 표지 방법에 관한 것으로, 비닐설폰기를 가지는 염료 화합물의 용해 시 반드시 물을 사용하는 것을 특징으로 한다.

Description

비닐설폰기를 가지는 염료 화합물의 생체 분자 표지 방법{A process of labeling biomolecules by using dye compounds with vinylsulfone group}

본 발명은 비닐설폰기를 가지는 염료 화합물의 생체 분자 표지 방법에 관한 것이다.

일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 염료로는 미국 GE Healthcare사의 CyDye Fluors 제품군과 미국 Invitrogen사의 Alexa Fluors 제품군, 그리고 Biosearch Technologies사의 BHQ Quencher 제품군이 있으며, 이 외에도 다양한 색원체(chromophore)를 모체로 한 형광 염료 및 소광 염료가 판매되고 있다. 이러한 시판 제품들은 섬유용 염료의 개발 과정에서 도출되었던 색이나 빛을 가지는 기본 색원체의 화학 구조를 개질한 것이 대부분이다.

지금까지 알려진 형광 염료의 대표 색원체만 예시하면 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 아크리딘(acridines), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 등을 들 수 있으며, 주로 바이오 분야에서는 플로세인, 로다민, 시아닌 계열 색원체가 사용되고 있다.

한편, 빛을 흡수만 하는 소광 염료로는 주로 디아조기를 갖는 산성, 반응성, 염기성 염료에서 선택된 염료들이 깨끗하게 정제되어 사용되고 있으며 이들과 유사한 구조의 유도체들도 지속적으로 연구되고 있다.

바이오 분야에서는 상기의 염료와 생체물질을 결합시키기 위해서, 주로 펩타이드나 단백질의 N-말단 또는 라이신(lysine)의 아민(amine)기나 시스테인(cystein)의 티올(thiol)기와 결합할 수 있는 반응기(reactive group)를 사용하는데, 아민과 결합하는 경우에는 NHS로 통용되는 숙신이미틸 에스터(N-succinimidyl ester) 또는 이의 유도체가 가장 많이 도입되고, 티올과 결합하는 경우에는 말레이미드(maleimide) 또는 이의 유도체들이 가장 많이 도입되고 있다.

위와 같은 반응기 이외에도 많은 연구자들과 기업에서는 성능이 더 우수한 반응기 중간체를 설계하고 있지만, 대부분 생체 분자와의 반응 시간이 빠르고 결합 성능이 우수한 반면, 수용액 상태에서 안정하지 않고, 열에 취약하거나 반응 후에 이탈기가 떨어져 나가면서 부산물이 발생하는 것이 일반적이다.

생체 분자의 표지에 사용되는 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 표지 염료는 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 N,N-디메틸설폭사이드(DMSO)에 염료를 용해시킨 후에 사용하여, 카보네이트(carbonate) 완충액(buffer) 또는 포스페이트(phosphate) 완충액 상에서 염색이 이루어진다. 이때 완충액의 농도는 주로 0.1 M이고, 반응 온도는 다양하지만 상온의 경우가 일반적이다.

위와 같은 반응기 이외에도 많은 연구자들과 기업에서는 성능이 더 우수한 반응기 중간체를 설계하고 있지만, 대부분 생체 분자와의 반응 시간이 빠르고 결합 성능이 우수한 반면, 수용액 상태에서 안정하지 않고 열에 취약하거나 반응 후에 이탈기가 떨어져 나가면서 부산물이 발생하는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명은 단백질, 펩타이드 등의 생체 분자를 표지하기 위해 비닐설폰기를 가지는 염료를 사용하는 경우, 향상된 표지 수율을 얻도록 하기 위해서, 염료를 물 또는 수용액 버퍼에 녹여서 사용하는 것을 특징으로 하는 신규의 표지 방법을 제공한다.

생체 분자의 표지를 위해 개발된 비닐설폰기를 가지는 염료 제품군의 경우, 기존의 제품인 NHS나 말레이미드를 갖는 염료들이 물과의 반응 때문에 생체 분자와의 반응 성능이 급격히 떨어진다는 점 때문에, DMF나 DMSO 등의 유기 용매에 녹여서 낮은 온도에서 사용 또는 냉동 상태에서 보관하여야 하는 단점을 보완할 수 있다.

본 발명에서는 이러한 비닐설폰기를 가지는 염료 제품군이 더욱 효과적으로 사용될 수 있도록 단백질, 펩타이드와의 표지 방법을 제공하며, 특히 염료를 물에 녹여서 사용할 경우에 표지 성능이 향상됨은 물론 유기 용매의 제거나 잔존 여부에 대해 고민하지 않아도 되어 실험자 입장에서 매우 수월하게 표지 반응을 진행할 수 있게 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 비닐설폰기를 포함하는 염료를 제1 용매에 용해하여 염료 용액을 수득하는 단계, (b) 생체분자를 제2 용매에 용해하여 생체분자 용액을 수득하는 단계, (c) 상기 염료 용액 및 상기 생체분자 용액을 혼합하고 반응을 진행하는 단계, (d) 상기 반응된 혼합액 내 용매를 회수하고 재용해시킨 후 여과하여 정제하는 단계를 포함하는 생체 분자 표지 방법이 제공된다.

일 구현예에 따르면, 상기 제1 용매는 물 또는 물로 희석된 희석용매이고, 상기 희석용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 이들 2종 이상의 혼합물을 물로 희석한 용매이다.

다른 구현예에 따르면, 상기 제2 용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올 아세토니트릴 또는 이들 2종 이상의 혼합물이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 비닐설폰기를 포함하는 염료의 예로는 하기 화학식으로 표현되는 염료를 들 수 있다. 우선, 하기 화학식 1로 표현되는 벤즈인도시아닌 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

상기 4개의 R₁은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이며; 상기 2개의 R₂는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R₃은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;

상기 R₄는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, 설폰산기, 설폰산염기, -CONH(CH₂)_L1SO₂CH=CH₂, -CONH-p-(C₆H₄)SO₂CH=CH₂ 또는 -CONH-m-(C₆H₄)SO₂CH=CH₂이고; 상기 L1은 1 내지 5의 정수이며;

상기 B는(CH₂)_L2, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고, 상기 L2는 1 내지 5의 정수이며; 상기 n은 1 내지 5의 정수이고; 상기 2개의 m은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

상기 화학식 1의 구체적인 화합물의 예에는 아래 열거한 벤즈인도시아닌 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

다음으로 하기 화학식 2로 표현되는 플로세인 계열 화합물 또는 이의 호변 이성질체 또는 이의 염을 들 수 있다.

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;

상기 X1 또는 X2 중 어느 하나는

이고 나머지 하나는 수소이며; 상기 B는(CH₂)_L, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고 상기 L은 1 내지 5의 정수이다.

상기 화학식 1의 구체적인 화합물의 예에는 아래 열거한 플로세인 계열 화합물 또는 이의 호변 이성질체 또는 이의 염을 들 수 있다.

다음으로 하기 화학식 2로 표현되는 로다민 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고; 상기 2개의 R4는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고;

상기 X1, X2, X3, X4 중 어느 하나는

또는

이며, 상기 A 또는 B는 서로 독립적으로(CH₂)_L, p-(C₆H₄), m-(C₆H₄)이고, 상기 L은 1 내지 5의 정수이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자이며;

혹은, 상기 화합물의 좌우에 위치한 R1과 R2의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제1 고리를 형성할 수 있고, 상기 제1 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이며;

또한, 상기 화합물 좌우에 위치한 R1'과 R4의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제2 고리를 형성할 수 있고, 상기 제2 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이다.

상기 화학식 3의 구체적인 화합물의 예에는 아래 열거한 로다민 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

다음으로 하기 화학식 4로 표현되는 시아닌 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

식 중에서,

R₁, R₁'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,

R₂, R₂', R₃ 및 R₃'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,

R₄는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH₂)_LSO₂CH=CH₂, -CONH-para-(C₆H₄)SO₂CH=CH₂또는 -CONH-meta-(C₆H₄)SO₂CH=CH₂이고,

B는 (CH₂)_l, para-(C₆H₄) 또는 meta-(C₆H₄)이고,

m, m'은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,

L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.

상기 화학식 4의 구체적인 화합물의 예에는 아래 열거한 시아닌 계열 화합물 또는 이의 염을 들 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 용매는 물이거나 또는 DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 중에서 선택된 유기용매와 물의 혼합용매인 것이 본 발명이 목적하는 효과를 새롭게 발현시킬 수 있거나 극대화할 수 있다는 점에서 바람직하며, 특히 상기 유기용매와 물의 혼합용매는 물과 유기용매가 1 : 0.5-1.5의 부피비로 혼합된 혼합용매가 본 발명이 목적하는 효과를 극대화하거나 또는 새롭게 발현시킬 수 있다는 점에서 바람직하다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 비닐설폰기를 포함하는 염료가 상기 화학식 1로 표현되는 벤즈인도시아닌 계열 화합물 또는 이의 염이거나, 또는 상기 화학식 4로 표현되는 시아닌 계열 화합물 또는 이의 염인 경우, 상기 제1 용매는 물인 것이 표지 수율, 표지 성능, 물 안정성, 미표지 염료 제거율 측면에서 바람직하다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 비닐설폰기를 포함하는 염료가 상기 화학식 2로 표현되는 플로세인 계열 화합물 또는 이의 호변 이성질체 또는 이의 염이거나, 또는 상기 화학식 3으로 표현되는 로다민 계열 화합물 또는 이의 염인 경우, 상기 제1 용매는 DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 중에서 선택된 유기용매와 물의 혼합용매인 것이 표지 수율, 표지 성능, 물 안정성, 미표지 염료 제거율 측면에서 바람직하다.

특히, 이 경우 상기 혼합용매는 물과 유기용매가 1 : 0.5-1.5의 부피비로 혼합된 혼합용매이고, 상기 유기용매는 DMF 또는 DMSO인 것이 pH 안정성, 고온 안정성 측면에서 바람직하다.

이와 같이, 본 발명에서는 기 개발되어 공개된 상기 비닐설폰기를 갖는 형광 염료 화합물들의 단백질, 펩타이드 등과의 표지 수율을 높이기 위한 방법으로 물에 녹여서 또는 물을 포함시켜 용해 후 생체 물질과의 표지 반응에 사용하는 방법을 고안하였으며 DMF 등 유기 용매에 녹여서 사용하는 방법보다 더 많이 표지가 이루어짐을 확인할 수 있었다. 또한, 초기 염료 용액의 농도를 매우 자유롭게 변화시킬 수 있고, 보관이 용이하며, 그리고 표지 다음의 단계인 염료의 제거 과정에서 유기 용매의 제거를 위해 칼럼 및 필터 등을 선택하는 데 있어 제한 사항이 없어 정제가 매우 용이하였다.

본 발명은 생체분자 연구자들이 비닐설폰기를 갖는 염료 화합물을 가지고 표지 실험을 수행할 때보다 효과적으로 염료를 다룰 수 있도록 신규의 표지 방법을 제시한다.

도 1은 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이다.

본 발명은 상기 화학식 1-4의 비닐설폰기를 갖는 형광 염료 화합물을 이용하여 아민기, 티올기, 또는 수산화기를 포함하는 생체 분자, 나노입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법(binding protocol)에 관한 것이다.

본 발명에서 제공하는 신규의 표지 방법은, 생체 분자, 즉 단백질, 펩타이드(peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 글라이코프로틴(glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에 적용될 수 있고, 바람직하게는 단백질, 펩타이드에 적용하는 것이 가장 적합하다.

상기 표지 방법에서의 가장 큰 차별점은 비닐설폰기를 가지는 염료를 물에 용해 또는 물에 희석한 후 사용하는 것이며, 단순히 수용성 염료를 물에 녹이는 의미가 아닌 표지 반응 수율을 극대화시키는 효과를 거둘 수 있다.

염료의 완벽한 용해 또는 희석 용액의 제조를 위해 물과 함께 사용될 수 있는 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

생체분자와의 표지 반응 시에는 생체 분자의 안정성을 유지하면서도 반응이 잘 이루질 수 있는 반응 용매를 선택할 수 있으며, pH 5-12의 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액, DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴 외에도 적합한 용매가 선택될 수 있으며, 바람직하게는 1M 또는 0.1M pH 9의 카보네이트 완충액이 사용될 수 있다.

표지 대상이 되는 생체 분자는 고형 또는 PBS 및 그 생체 분자를 안정하게 다룰 수 있는 완충액에 희석되어 제공될 수 있으며, 이 경우 상기의 반응 용매를 생체 분자의 안정성 및 표지 반응 수율을 고려하여 전체 부피의 10-100%가 되도록 조절할 수 있다.

펩타이드나 나노입자 등의 경우에는 완벽한 용해 및 분산 안정성을 위해서 유기 용매에 용해시키거나 분산하는 경우가 있으며 이 경우 반응 수율을 올리기 위해서 1-10 당량 내외의 유기 베이스를 사용할 수 있으며 주로 DIPEA(N, N-diisoprpylethylamine), TEA(triethylamine)등이 사용되지만 이에 한정하는 것은 아니다.

항원, 단클론, 다클론 항체를 포함하는 단백질의 경우에는 PBS 또는 단백질의 안정성을 위해서 수용성 버퍼 등에 희석되어 제공되는 경우가 대부분이며, 이 경우에는 pH 7.4-10.5의 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액이 사용될 수 있으며 전체 부피의 10-100%가 되도록 넣을 수 있으며, 바람직하게는 1M pH 9.0 카보네이트 완충액을 전체 부피의 10% 또는 0.1M pH 9.0 완충액을 전체 부피의 10-100% 넣는 것이나 생체 물질에 따라 다양한 방법으로 시도될 수 있다.

실시예

이하에서는 실시예 및 비교예 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

분자량 분석을 위해 이용한 MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다. 합성된 염료와 펩타이드의 정제를 위해 Agilent사의 HPLC(high pressure liquid chromatography) 1100/1200 series를 사용하였다. 이 HPLC 시스템의 구성은 degasser(Agilent G1379A), quat pump(Agilent G1311A), automatic liquid sampler(Agilent G1313A), thermostatted column compartment(Agilent G1316A), diode array detector(Agilent G1315B), fluorescence detector(Agilent G1321A), analyt fraction collector(Agilent G1364A) 등으로 구성되었다. Column은 250x10mm, 10micron 규격의 Phenomenex사 제품(Jupiter 10u C18 300A, 00G-4055-N0)을 사용하였다. 용매는 Acetonitrile(HPLC grade, J.T. Baker, 9017-03) 과 3차 증류수를 사용하였다. 정제된 물질의 동결건조를 위해 일신 사의 FD8512 freeze dryer를 사용하였다.

겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치(mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply(Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels(Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10-20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)를 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액(running buffer) 및 로딩 완충액(loading buffer)은 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다.

- 5 x running buffer 제조

· 3 g Tris(Trizma base, Sigma)

· 14.4 g Glycine(Sigma)

· 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관

- 5 x loading buffer 제조

· 0.6 mL의 1 M Tris(Trizma base, Sigma)

· 5 mL의 50% 글리세롤(glycerol)

· 2 mL의 10% SDS

· 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올(mercaptanethanol)

· 1.9 mL 10% 증류수(bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)

특별한 명기가 없는 한, 염료는(주)디케이씨코포레이션사의 Flamma Fluors P 시리즈 제품군을 사용하였고, 그 외에 필요한 시약 및 단백질은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 펩타이드는 일반적으로 알려진 고상 합성법으로 제조되었거나 주로 펩트론사(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.

비교예 1a: 표지 수율 측정(FPI-774와 Apopep-1 펩타이드)

비닐설폰 염료, FPI-774 50 mg(MW: 1098.25 g/mol, 4.55 x 10^-5mol)을 증류수 5 mL에 녹이고, 당량의 Apopep-1 펩타이드(sequence: CQRPPR, MW: 755.89 g/mol, 4.55 x 10^-5mol) 34.4 mg를 3.44 mL의 0.1 M pH 9.0 카보네이트 버퍼에 용해시켜 각각 준비하였다. 염료 및 펩타이드 용액을 혼합하고, 1-2시간 동안 25 ℃에서 반응시켰다.

30 ℃에서 rotary evaporator를 이용하여 용매를 회수하고 증류수를 500 μL씩 넣어주면서 녹였다. 모두 녹으면 0.50 μm PTFE syringe filter(Advantec, DISMIC-25JP)로 여과하고, HPLC용 vial(Agilent 5182-0714) 에 옮겨 담아 HPLC 정제를 준비였다.

HPLC 정제는 gradient 방식으로 1시간에 걸쳐 3차 증류수와 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC grade)을 이용해 3 mL/min 유속으로 진행하였다. gradient time table을 예시하면 아래와 같다.

Time( min )	H ₂ O (%)	ACN (%)
5	100	0
10	95	5
15	90	10
20	85	15
25	85	15
30	80	20
35	80	20
40	75	25
45	75	25
50	70	30
55	65	35
60	60	40

HPLC를 사용한 정제가 끝나면 light absorbance가 제일 큰 구간, 즉 HPLC에서 나온 액체 중에 가장 진한 것들만 모아서 동결건조하여 녹색의 고체입자를 얻었다(수율 38%). Maldi-Tof M/S, 계산치 C₇₆H₁₀₃N₁₆O₂₃S₆ ^-1801.11, 측정치 1801.

비교예 2a: 표지 수율 측정(FPG-456와 PSP-1 펩타이드)

비닐설폰 염료, FPG-456 50 mg(MW: 495.5 g/mol, 1.01 x 10^-4mol)을 증류수 2.5 mL 및 2.5 mL의 DMF에 녹이고, 당량의 PSP-1 펩타이드(sequence: CLSYYPSYC, MW: 1098.25 g/mol, 1.01 x 10^-4mol) 110.8 mg를 11 mL의 DMF에 용해시켜 각각 준비하였다. 염료 및 펩타이드 용액을 혼합하고, 염료 용액 및 펩타이드 용액의 혼합된 부피만큼(약 16 mL) 0.1 M pH 9.5 포스페이트 버퍼를 추가하고, 1-2시간 동안 25 ℃에서 반응시켰다.

30 ℃에서 rotary evaporator를 이용하여 용매를 회수하고 증류수를 500 μL씩 넣어주면서 녹였다. 잘 녹지 않는 경우 PBS 또는 아세토니트릴을 추가하여 진행하였다. 모두 녹으면 0.50 μm PTFE syringe filter로 여과하고, HPLC용 vial에 옮겨 담아 HPLC 정제를 준비하였다.

상기 실시예 1의 방법을 참고하여 정제 및 동결건조하면 노란색의 고체입자를 얻었다(수율 16%). Maldi-Tof M/S, 계산치 C₇₅H₈₈N₁₆O₂₃S₃ 1593.75, 측정치 1614.4(M+Na⁺)
비교예 1-2: 표지 수율 측정
상기 비교예 1a에서 FPI-774을 증류수에 용해하는 대신에 DMF에 용해하는 것을 제외하고는 비교예 1a와 동일하게 실험을 진행하였으며(비교예 1), 상기 비교예 2a에서 FPG-456을 증류수와 DMF 1:1 혼합용매에 용해하는 대신에 DMF에 용해하는 것을 제외하고는 비교예 2a와 동일하게 실험을 진행하였다(비교예 2).

그 결과, 비교예 1과 2에서 노란색의 고체입자 수율이 위 비교예 1a와 2a에 비하여 각각 15% 및 22% 낮아짐을 확인하였다.

삭제

비교예 3, 비교예 3a, 실시예 3': 표지 성능 비교

지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 Amershame^TM LMW Calibration 키트(17-0446-01)의 1개의 팩(pack) 중 1개의 바이알(vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b(phosphorylase b)(97 kD, 67 μg), 알부민(albumin)(66 kD, 83 μg), 오발부민(ovalbumin)(45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈(carbonic anhydrase)(30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터(trypsin inhibitor)(20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민(α-lactalbumin)(14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있는 것을 준비하였다.

상온(20 ℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 2개의 바이알에 각각 250 μL의 pH 9.0, 0.1 M 카보네이트 완충액을 가하여 용해시키고, 1개의 vial에서 9개의 e-튜브에 25 μL씩을 분취하여 총 18개의 단백질 용액을 준비하였다(25 μg protein / 25 μL buffer, 6.9x10^-5 μmol in 25 μL buffer solution).

플로세인 계열 FPG-456(①), 시아닌 계열 FPR-552(②), 로다민 계열 FPR-553(③), 로다민 계열 FPR-560(④), 벤즈인도시아닌 계열 FPR-581(⑤), 시아닌 계열 FPR-648(⑥), 벤즈인도시아닌 계열 FPR-675(⑦), 시아닌 계열 FPI-749(⑧), 벤즈인도시아닌 계열 FPI-774(⑨)를 각각 1 mg씩을 e-tube에 넣고 각각 (i) 100 μL의 DMF에 녹인 것 9개(비교예 3), (ii) 증류수에 용해시킨 6개 염료용액(②, ⑤, ⑥, ⑦, ⑧, ⑨)(비교예 3a), (iii) 증류수와 DMF의 1:1 혼합용매에 용해시킨 3개 염료용액(①, ③, ④)을 준비하였다(실시예 3').

DMF에 용해한 염료 용액 9개를 1 μL씩을 분취하여 앞서의 단백질이 들어 있는 9개의 e-튜브에 넣고 볼텍스(vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 증류수 또는 증류수와 DMF의 1:1 혼합용매에 용해한 염료 용액 9개도 같은 방법으로 반응시켰다.

상기 각각의 반응액을 5X 로딩 버퍼를 6 μL를 넣은 후 15 μL를 분취하여 DMF에 염료를 녹인 군과 증류수 또는 증류수와 DMF의 1:1 혼합용매에 녹인 군으로 나누어 2장의 겔에 로딩(loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 1에 나타내었다. 전기영동은 125 V에서 2시간 동안 진행하였다.

도 1의 왼쪽은 염료를 DMF에 용해시킨 것이고, 오른쪽은 염료를 증류수 또는 증류수와 DMF 혼합용매에 용해시킨 것이다. 육안으로도 단백질별로 염색된 강도를 확인할 수 있으며 증류수 또는 증류수와 DMF 혼합용매에 염료를 녹여서 표지한 것이 우수한 표지 성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 4a 및 5a: 표지 성능 및 안정성 등 비교
위 비교예 3a에서 증류수에 용해시킨 6개 염료(②, ⑤, ⑥, ⑦, ⑧, ⑨)에 대해서 증류수 대신에 증류수와 DMF의 1:1 혼합용매에 용해하는 점을 제외하고는 비교예 3a와 동일하게 실험을 진행하였으며(비교예 4a), 또한 위 실시예 3'에서 증류수와 DMF의 1:1 혼합용매에 용해시킨 3개의 염료(①, ③, ④) 증류수에 용해하는 점을 제외하고는 실시예 3'과 동일하게 실험을 진행하였다(비교예 5a).
그리고 나서 육안으로 관찰한 결과, 비교예 4a와 5a의 염색강도가 비교예 3에 비해서는 향상되었으나, 비교예 3a와 실시예 3' 각각에 비해서는 표지 성능이 떨어짐을 확인하였다.
뿐만 아니라, 비교예 3a와 실시예 3'의 경우와는 달리 비교예 4a와 5a의 경우에는 반응 후 이탈기가 부분적으로 분리되어 소량이나마 부산물이 발생하거나 또는 염료 석출의 문제가 발생할 수 있음을 확인하였다.

한편, 비교예 3의 경우에는 동결건조에 의해서 용매를 제거할 수 없어 다른 용매의 사용 또는 농도 재설정이 불가능한 반면, 위 비교예 3a, 실시예 3', 비교예 4a, 비교에 5a의 경우에는 소량의 용매를 동결건조에 의해서도 용이하게 제거할 수 있어 추후 다른 용매를 사용하거나 농도를 재설정할 수 있음을 확인하였다.

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Claims

비닐설폰기를 포함하는 염료를 제1 용매에 용해하여 염료 용액을 수득하는 단계,
생체분자를 제2 용매에 용해하여 생체분자 용액을 수득하는 단계,
상기 염료 용액 및 상기 생체분자 용액을 혼합하고 반응을 진행하는 단계,
상기 반응된 혼합액 내 용매를 회수하고 재용해시킨 후 여과하여 정제하는 단계를 포함하는 생체 분자 표지 방법으로서;
상기 제1 용매는 DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 중에서 선택된 유기용매와 물의 혼합용매이며;
상기 제2 용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, DMF, DMSO, 메탄올, 에탄올 아세토니트릴 또는 이들 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 생체 분자 표지 방법으로서,
상기 비닐설폰기를 포함하는 염료는 하기 화학식 3으로 표현되는 로다민 계열 화합물 또는 이의 염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 표지 방법:
[화학식 3]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고; 상기 2개의 R4는 서로 같거나 상이하며 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며; 상기 R3은 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택되고;
상기 X1, X2, X3, X4 중 어느 하나는
또는
이며, 상기 A 또는 B는 서로 독립적으로 (CH2)L, p-(C6H4), m-(C6H4)이고, 상기 L은 1 내지 5의 정수이고; X1, X2, X3, X4 중 나머지 3개는 수소 또는 할로겐 원자이며;
혹은, 상기 화합물의 좌우에 위치한 R1과 R2의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제1 고리를 형성할 수 있고, 상기 제1 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이며;
또한, 상기 화합물 좌우에 위치한 R1'과 R4의 두 쌍 중 어느 한 쌍 또는 좌우 두 쌍 모두 서로 융합하여 1개의 질소 및 4~6개의 탄소 원자가 골격을 이루는 제2 고리를 형성할 수 있고, 상기 제2 고리는 비치환되었거나 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기, 카르복시기, 카르복실산 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 중에서 선택된 치환기에 의해서 치환된 포화 또는 불포화 고리이다.
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제1항에 있어서, 상기 화학식 3으로 표현되는 로다민 계열 화합물 또는 이의 염은 하기 열거된 화합물 또는 이의 염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 표지 방법:

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제1항에 있어서, 상기 유기용매와 물의 혼합용매는 물과 유기용매가 1 : 0.5-1.5의 부피비로 혼합된 혼합용매인 것을 특징으로 하는 생체 분자 표지 방법.
제5항에 있어서, 상기 제1 용매는 DMF와 물의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 생체 분자 표지 방법.
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